Wykorzystanie sekwencji zatrzymania SecM jako narzędzia do izolowania polipeptydów związanych z rybosomami

Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie SEC TED 70 s związanych z rybosomami, powstających kompleksów łańcuchowych lub RNC wytwarzanych podczas translacji w systemie bezkomórkowym in vitro. Osiąga się to poprzez wprowadzenie 17-aminokwasowej sekwencji zatrzymującej SEC M do końca C genu będącego przedmiotem zainteresowania i sklonowanie jej poniżej promotora transkrypcji T 7. Następnie mRNA jest transkrybowane za pomocą reakcji transkrypcji in vitro, a następnie oczyszczane.

Następnie oczyszczone mRNA jest poddawane translacji w systemie ekstraktu S 30 E coli z radioaktywnymi aminokwasami w celu znakowania zsyntetyzowanego białka lub powstającego polipeptydu. Wreszcie, drugie powstające kompleksy łańcuchowe związane z rybosomami Mr.Ed są izolowane przez sacharozę, gradient, wirowanie i frakcjonowanie. Ostatecznie można uzyskać wyniki pokazujące, że powstające łańcuchy są stabilnie związane z rybosomem 70 s za pomocą analizy elektroforezy żelowej znakowanych polipeptydów wyizolowanych z frakcji gradientowych.

Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak zastosowanie mRNA pozbawionego kodonu podstawowego, jest to, że zapewnia ona z wysoką wydajnością przyłączenie powstającego łańcucha polipeptydowego do rybosomu 70 s podczas translacji i późniejszego etapu wirowania. Dodatkowo, w przeciwieństwie do technologii no stop Cordon, metoda ta może być stosowana z niemal równą skutecznością zarówno w systemie in vitro, jak i in vivo. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie translacyjnego fałdowania białek, takie jak to, jak wcześnie podczas translacji mogą powstawać różne produkty pośrednie fałdowania translacyjnego, a także pomóc w analizie ich struktury przy użyciu struktury bezpośredniej lub pośredniej.

Podejścia sondujące i oznaczające Ta technika może nam pomóc w rozszyfrowaniu szlaku fałdowania białek w rybosomie. W tym protokole opisaliśmy izolację powstających łańcuchów krystalicznych bine gamma B związanych z rybosomami o pełnej długości. Ale ta technika może być wykorzystana do wyizolowania choroby wariów praktycznie każdego interesującego białka.

Ta strategia może być również przyjęta do izolacji ściętych łańcuchów polipeptydowych natin skóry właściwej Es. Ogólnie rzecz biorąc, osoby nowe w tej metodzie mogą mieć problemy podczas etapu wirowania w gradiencie sacharozy. Jednak dla pierwszego doświadczenia nie powinno to stanowić problemu. Zdecydowaliśmy się wykorzystać drugą sekwencję przeciągania do wyizolowania powstających polipeptydów krystalicznych gamma B związanych z 70 jako rybosom po początkowych, mniej udanych próbach, które obejmowały użycie mRNA pozbawionego kordonu stop.

Druga technika nie była w stanie zapewnić stabilności RNC podczas kolejnych etapów wirowania z taką samą wydajnością, jak technika polegająca na zastosowaniu sekwencji zatrzymania SECM. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ etapy obejmujące przygotowanie gradientu i separację RNC mogą być trudne do nauczenia się i wymagają pewnego poziomu wiedzy specjalistycznej, aby zapewnić powtarzalne wyniki Demonstracja postawy będzie udziałem absolwenta z mojego laboratorium w celu przeprowadzenia transkrypcji i translacji in vitro. Zacznij od interesującego genu, który jest klonowany do dowolnego plazmidu opartego na T seven i/lub SP six w celu wygenerowania powstających kompleksów łańcuchowych rybosomów lub RNC.

Przedłuż koniec C docelowego polipeptydu, dodając sekwencję indukującą zatrzymanie z M, aby zapewnić, że fragment polipeptydu wydostanie się z tunelu rybosomalnego. Dodaj elastyczny, bogaty w glicynę syryjski łącznik między białkiem a sekwencją zatrzymania SEC M, aby przygotować się do transkrypcji in vitro, enzymu ograniczającego użytkownika, który przetnie dół otwartej ramki odczytu, aby zlinearyzować matrycę DNA, przeprowadzić elektroforezę żelową AROS w celu sprawdzenia całkowitego trawienia próbki. Po sprawdzeniu optymalnego stężenia DNA należy użyć zestawu do transkrypcji o wysokiej wydajności zgodnie z instrukcjami producenta do syntezy informacyjnego RNA.

Użyj wytrącania chlorku litu, aby oczyścić mRNA. Następnie uruchom próbkę na żelu akrylowym lub arosowym, aby zweryfikować jego czystość. Do tłumaczenia in vitro.

Używając układu E. coli w wodzie wolnej od nukleaz, dodać jednomilimolową mieszaninę aminokwasów minus metionina 10 jednostek inhibitora rybonukleazy 20, mikrokiury 35 s metioniny, 20 mikrolitrów mieszaniny reakcyjnej, 24 mikrolitry buforu do rekonstytucji i 24 mikrolitry e. coli. Lizat. Podgrzej reakcję, inkubując ją w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez pięć minut. Następnie dodaj jeden do dwóch mikrogramów mRNA i inkubuj przez dodatkowe 10 do 15 minut w temperaturze 30 stopni Celsjusza.

Zatrzymaj reakcję, umieszczając ją na lodzie, aby wyizolować powstające kompleksy łańcuchowe związane z rybosomami 70 s lub nc. Ułóż reakcję translacji na 4,5 mililitra gradientu sacharozy od pięciu do 30% w 20-milimolowych hałdach. Wodorotlenek potasu pH 7,5 15 milimolowy octan magnezu, 100 milimolowy octan potasu i jedna milimolowa wirówka DTT przy 41 000 obr./min przez dwie godziny w czterech stopniach Celsjusza po odwirowaniu, frakcjonować gradient sacharozy za pomocą programowalnego systemu gradientu gęstości i detektora absorbancji ustawionego na 254 nanometry.

Zbierz frakcje zawierające rybosomy 70 s do dalszej analizy w celu ustalenia, czy rozszerzone białko SEC M pozostaje przyłączone do rybosomu 70 s. Wytrącić białko w każdej frakcji gradientowej, dodając kwas trójchlorooctowy. Następnego dnia inkubować próbki przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza, odwirować próbki w temperaturze 14 000 razy G przez 15 minut w celu osadzenia białka, przemyć granulki w stosunku cztery do jednego acetonu do jednego milimolowego trisa, HCL pH 7,6.

Wysuszyć granulki na powietrzu, a następnie ponownie zawiesić je w buforze ładowania strony SDS. Rozwiąż próbki za pomocą strony tris Trice SDS, a następnie utrwal i wysusz żele i poddaj je automatycznej radiografii i obrazowaniu fosfologicznemu, jak pokazano tutaj. Po translacji in vitro rybosomy 70 S wyizolowano za pomocą sacharozy, gradientu, wirowania i frakcjonowania, aby zapewnić, że krystaliczne białko gamma B pozostaje stabilnie związane z rybosomem.

70 s zawierających frakcje połączono, odsolono, wymieniono bufor i poddano dodatkowej rundzie wirowania w gradiacji sacharozy. Przedstawione tutaj wyniki sugerują, że SEC M może skutecznie indukować zatrzymanie translacyjne krystalicznych RNC gamma B. Po opanowaniu technika ta może być wykonana w ciągu jednego dnia roboczego, z wyjątkiem analizy powstającego łańcucha za pomocą elektroforezy żelowej, która zwykle obejmuje etap wytrącania TCA przez noc.

Podczas próby tej procedury oczywiście bardzo ważne jest, aby uniknąć zanieczyszczenia RNA na każdym etapie. Zanieczyszczenie RNS może wpływać na wydajność translacyjną ekstraktu i prowadzić do uwolnienia powstającego polipeptydu z 70. rybosomu. Po tej procedurze można uzyskać NAST i polipeptydy z góry określonych lanxess, stabilnie związane z 70. rybosomem w zależności od ostatecznego celu.

Kompleksy te mogą być wykorzystywane do różnych celów, takich jak oznaczanie potwierdzenia powstających łańcuchów związanych z rybosomem przy użyciu podejść bezpośrednich i pośrednich, takich jak NMR lub fre, lub czynnika testowego i wiązania liganda po jego opracowaniu. Technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się biologią strukturalną i fałdowaniem białek w celu zbadania potwierdzenia istnienia białek o pełnej długości związanych z rybosomem, a także produktów pośrednich translacyjnych fałdowania COT. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przygotować i wyizolować powstający polipeptyd, stabilnie związany z rybosomem 70 s, który może być dalej wykorzystany do odpowiedzi na różne pytania w dziedzinie translacyjnego fałdowania białek.

Nie zapominaj, że praca z izotopami promieniotwórczymi i znakowanymi aminokwasami, takimi jak na przykład A 35 metionina, wymaga specjalnych środków ostrożności i zawsze powinna być brana pod uwagę podczas wykonywania tej procedury.