Name: Wykorzystanie sekwencji zatrzymania SecM jako narzędzia do izolowania polipeptydów związanych z rybosomami (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-19T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 42 s
Description: Naucz się izolować kompleksy rybosomowo-polipeptydowe z użyciem sekwencji SecM w systemie E. coli. Ta metoda umożliwia badanie dynamiki translacji i składania białek na rybosomach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta została sfinansowana z grantu RGP0024 programu Human Frontier Science Program.

1. Przygotowanie matrycy DNA i transkrypcja in vitro
<ol>
 <li>Gen będący przedmiotem zainteresowania jest klonowany w dowolnym plazmidzie z promotorem T7 i/lub np. SP6. Aby uzyskać interesujące nas RNC, koniec C-końcowy docelowego polipeptydu zostaje wydłużony poprzez dodanie sekwencji indukującej zatrzymanie SecM FXXXXWIXXXXGIRAGP7. Aby zapewnić, że fragment polipeptydu będzie wystawał z tunelu rybosomalnego, część C-końcowa docelowego białka musi zostać wydłużona o co najmniej 30 aminokwasów12-14. Pomiędzy białkiem a sekwencją zatrzymania SecM można wprowadzić elastyczny linker bogaty w glicynę i serynę, aby uniknąć ewentualnych ograniczeń konformacyjnych.</li>
 <li>Do transkrypcji in vitro matrycowe DNA powinno zostać zlinearyzowane za pomocą enzymu restrykcyjnego tnącego poniżej ramki odczytu (ORF). Należy zweryfikować pełną linearyzację plazmidowego DNA, przeprowadzając elektroforezę produktu trawienia restrykcyjnego na żelu agarozowym.</li>
 <li>Zlinearyzowany plazmid jest następnie wykorzystywany w reakcji transkrypcji in vitro. Można przetestować różne stężenia matrycowego DNA, aby określić optymalne stężenie DNA wymagane do transkrypcji in vitro. Zazwyczaj przy użyciu zestawu MEGAscript High yield Transcription Kit firmy Ambion (Ambion/Life Technologies, Grand Island, NY), 1 μg zlinearyzowanego DNA daje 40-60 μg mRNA. Transkrypcję in vitro przeprowadza się zgodnie z instrukcją producenta (Ambion/Life Technologies, Grand Island, NY).</li>
 <li>Po transkrypcji in vitro mRNA jest oczyszczane poprzez wytrącanie chlorkiem litu zgodnie z instrukcją producenta (zestaw MEGAscript High yield Transcription Kit firmy Ambion, Ambion/Life Technologies, Grand Island, NY).</li>
 <li>Integralność mRNA jest następnie weryfikowana za pomocą elektroforezy na żelach akrylamidowych lub agarozowych.</li>
</ol>
2. Translacja in vitro
W celu przeprowadzenia translacji in vitro z wykorzystaniem zestawu RTS 100 E. coli HY Kit (5 Prime, Gaithersburg, MD) należy postępować zgodnie z poniższymi krokami:
<ol>
 <li>Przygotować 100 μl reakcji translacji in vitro zgodnie z instrukcją producenta. W skrócie: do wody wolnej od nukleaz dodać 24 μl mieszaniny aminokwasów bez metioniny (1 mM), 10 jednostek inhibitora rybonukleazy (Invitrogen/Life Technologies, Grand Island, NY), 20 μCi radioaktywnej [35S]-metioniny (MP Biomedicals, Solon, OH), 20 μl mieszanki reakcyjnej, 24 μl buforu do rekonstytucji oraz 24 μl lizatu E. coli.</li>
 <li>Inkubować reakcję w temperaturze 30 °C przez 5 min w celu wstępnego ogrzania układu translacyjnego. Do reakcji translacji dodać 1-2 μg mRNA i inkubować w 30 °C przez 10-15 min.</li>
 <li>Zatrzymać reakcję, umieszczając próbkę na lodzie.</li>
</ol>
3. Izolacja nowo powstałego polipeptydu z reakcji translacji in vitro
<ol>
 <li>Aby wyizolować RNC, reakcję translacji nanosi się na 4,5 ml gradientu sacharozy 5-30% w 20 mM HEPES-KOH pH 7,5, 15 mM MgCl2, 100 mM octanu potasu, 1 mM DTT i wiruje przy użyciu rotora Beckman Coulter SW55-Ti z prędkością 41 000 rpm, 4 °C przez 2 h.</li>
 <li>Po wirowaniu gradient sacharozy jest frakcjonowany w celu wyizolowania różnych populacji rybosomów i powiązanych z nimi łańcuchów powstających. Separację monitoruje się za pomocą programowalnego systemu gradientu gęstości ISCO z ciągłym zapisem przy 254 nm przy użyciu detektora absorbancji ISCO UA-6.</li>
 <li>Frakcję(e) zawierające rybosomy 70S zbiera się i poddaje dalszej analizie, zależnie od celu eksperymentu.</li>
</ol>
4. Obserwacja białka związanego z rybosomem za pomocą elektroforezy SDS-PAGE w układzie Tris-tricine
Aby sprawdzić, czy rozszerzone białko SecM pozostaje przytwierdzone do rybosomu 70S, zebrano frakcje gradientu i poddano je następującym zabiegom:
<ol>
 <li>Białka w każdej frakcji wytrącono poprzez dodanie kwasu trichlorooctowego (TCA) do stężenia końcowego 10% i inkubowano w temperaturze 4 °C przez noc.</li>
 <li>Po nocnej inkubacji próbki odwirowano przy 14,000 X g przez 15 min w celu wytrącenia białek w formie osadu. Po wirowaniu usunięto supernatant, a osad przemyto dwukrotnie roztworem Aceton: 1 mM Tris-HCl pH 7.6 (4:1). Osad wysuszono na powietrzu, a następnie rozpuszczono w buforze do ładowania SDS-PAGE.</li>
 <li>Przetworzoną próbkę rozdzielono i przeanalizowano za pomocą Tris-tricine SDS-PAGE.</li>
 <li>Po elektroforezie żele utrwalono, wysuszono w próżniowej suszarce do żeli i poddano autoradiografii. Rozkład nowo syntetyzowanych polipeptydów obserwowano przy użyciu obrazowania fosforycznego.</li>
</ol>
5. Reprezentatywne wyniki
W niniejszej pracy przedstawiamy eksperyment opisujący izolację pełnowymiarowej wołowej Gamma-B krystaliny stabilnie związanej z rybosomem 70S. Rycina 1 przedstawia etapy izolacji kompleksów RNC Gamma-B krystaliny wołowej. Koniec C-końcowy Gamma-B krystaliny został wydłużony o łącznie 32 aminokwasy, aby zapewnić wypchnięcie pełnowymiarowego białka z tunelu rybosomalnego; obejmuje to również sekwencję zatrzymującą SecM umieszczoną na samym końcu C-końcowym polipeptydu fuzyjnego. Po translacji in vitro rybosomy 70S wyizolowano za pomocą wirowania w gradiencie sacharozy (Rycina 2.1). Aby zapewnić stabilne wiązanie białka z rybosomem, frakcje zawierające 70S połączono, odsolono, poddano wymianie buforu i kolejnej rundzie wirowania w gradiencie sacharozy (Rycina 2.2). Wynik przedstawiony na Rycynie 2 wyraźnie sugeruje, że SecM może skutecznie indukować zatrzymanie translacji kompleksów RNC Gamma-B krystaliny.
<img alt="In vitro transcription and translation diagram; mRNA synthesis, ribosome protein isolation, centrifugation." src="/files/ftp_upload/4027/4027fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1"> 
Rysunek 1. Schematyczne wyjaśnienie etapów izolacji RNC. Koniec C-końcowy krystaliny gamma-B bydlęcej został przedłużony o sekwencję 32 aminokwasów. Te przedłużone regiony C-końcowe zawierają również sekwencję zatrzymującą SecM. Krystalina gamma-B z sekwencją SecM została sklonowana w plazmidzie pIVEX 2.3 (opartym na T7). Dla in vitro transkrypcja matryca DNA została zlinearyzowana za pomocą XbaI. Zlinearyzowaną matrycę wykorzystano następnie do in vitro transkrypcja. Sekwencja T7 w matrycy DNA jest rozpoznawana przez polimerazę RNA T7, która transkrybuje gen Gamma-B krystaliny znajdujący się za promotorem T7. mRNA oczyszczono metodą wytrącania chlorkiem litu. Oczyszczone mRNA wykorzystano następnie do translacji in vitro. Po inkubacji reakcję translacji naniesiono na gradient sacharozy 5-30% i odwirowano w wirówce z rotorem Beckman Coulter SW55-Ti przy 41 000 obr./min. 4 °C przez 2 godz.
<img alt="Schemat gradientu sacharozy, rozdzielenie podjednostek rybosomalnych, absorbancja przy 254 nm, analiza białek." src="/files/ftp_upload/4027/4027fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Izolacja kompleksów RNC Gamma-B krystaliny bydlęcej stabilnie związanych z rybosomem 70S. 1 μg mRNA zmieszano w 100 μl mieszaniny reakcyjnej systemu ekstraktu S30 E. coli, zgodnie z opisem w sekcji protokołu, z 20 μCi [35S]-metioniną i inkubowano w 30 °C przez 15 min. Po inkubacji reakcję translacji nałożono na gradient sacharozy 5-30% w 20 mM HEPES-KOH pH 7,5, 15 mM MgCl2, 100 mM octanu potasu, 1 mM DTT i odwirowano w rotorze Beckman Coulter SW55-Ti przy 41 000 rpm, 4 °C przez 2 h. Po sedymentacji w zależności od prędkości gradient został rozładowany i uzyskano profil rybosomów. Dane zarejestrowano za pomocą programu PeakTrak (system frakcjonowania gradientowego gęstości ISCO). Zebrano frakcje, białko wytrącono TCA i rozdzielono w żelu PAGE Tris-Tricine 16,5% T, 6% C15. Żel wysuszono i poddano autoradiografii. Po ekspozycji żel przeskanowano za pomocą skanera obrazującego Typhoon 9410. Rycina 2.1 pokazuje, że pełnowartościowa Gamma-B krystalina znajduje się w frakcjach rybosomów 70S. Zatem sekwencja zatrzymująca SecM umożliwia izolację stabilnych kompleksów RNC Gamma-B krystaliny bydlęcej. Dane na Rycynie 2.2 wyraźnie wskazują, że wyizolowane kompleksy RNC są rzeczywiście stabilne. W obecnym doświadczeniu frakcje 70S po pierwszej rundzie wirowania w gradiencie sacharozy połączono, a sacharozę usunięto za pomocą jednostki filtra odśrodkowego Amicon Ultra-4 (Millipore), po czym dokonano wymiany buforu na roztwór zawierający 20 mM HEPES-KOH pH 7,5, 15 mM MgCl2, 100 mM octanu potasu, 1 mM DTT. Próbkę tę poddano dodatkowej rundzie wirowania w gradiencie sacharozy 5-30% i ufrakcjonowano. Każdą frakcję poddano obróbce i analizie analogicznie jak na Rycynie 2.1.

<ol><li>Fedorov, A. N., Baldwin, T. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cotranslational+protein+folding%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Cotranslational protein folding.</a> J. Biol. Chem. 272, 32715-32718 (1997).</li>
<li>Hardesty, B., Kramer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding+of+a+nascent+peptide+on+the+ribosome%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Nucleic+Acid+Res.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Folding of a nascent peptide on the ribosome.</a> Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 66, 41-66 (2001).</li>
<li>Kramer, G., Boehringer, D., Ban, N., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ribosome+as+a+platform+for+co-translational+processing%2C+folding+and+targeting+of+newly+synthesized+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The ribosome as a platform for co-translational processing, folding and targeting of newly synthesized proteins.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 16, 589-597 (2009).</li>
<li>Komar, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pause+for+thought+along+the+co-translational+folding+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem.+Sci%22%5BJournal%5D)">A pause for thought along the co-translational folding pathway.</a> Trends Biochem. Sci. 34, 16-24 (2009).</li>
<li>Cabrita, L. D., Dobson, C. M., Christodoulou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+folding+on+the+ribosome%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Protein folding on the ribosome.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 20, 33-45 (2010).</li>
<li>Oliver, D., Norman, J., Sarker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+Escherichia+coli+secA+by+cellular+protein+secretion+proficiency+requires+an+intact+gene+X+signal+sequence+and+an+active+translocon%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Regulation of Escherichia coli secA by cellular protein secretion proficiency requires an intact gene X signal sequence and an active translocon.</a> J. Bacteriol. 180, 5240-5242 (1998).</li>
<li>Nakatogawa, H., Ito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ribosomal+exit+tunnel+functions+as+a+discriminating+gate%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The ribosomal exit tunnel functions as a discriminating gate.</a> Cell. 108, 629-636 (2002).</li>
<li>Nakatogawa, H., Ito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secretion+monitor%2C+SecM%2C+undergoes+self-translation+arrest+in+the+cytosol%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Secretion monitor, SecM, undergoes self-translation arrest in the cytosol.</a> Mol. Cell. 7, 185-192 Forthcoming.</li>
<li>Muto, H., Nakatogawa, H., Ito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+but+non+polypeptide+prolyl-tRNA+functions+in+the+A+site+for+SecM-mediated+ribosomal+stall%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded but non polypeptide prolyl-tRNA functions in the A site for SecM-mediated ribosomal stall.</a> Mol. Cell. 22, 545-552 (2006).</li>
<li>Cabrita, L. D., Hsu, S. T., Launay, H., Dobson, C. M., Christodoulou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+ribosome-nascent+chain+complexes+produced+in+vivo+by+NMR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Probing ribosome-nascent chain complexes produced in vivo by NMR spectroscopy.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 22239-22244 (2009).</li>
<li>Eichmann, C., Preissler, S., Riek, R., Deuerling, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cotranslational+structure+acquisition+of+nascent+polypeptides+monitored+by+NMR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Cotranslational structure acquisition of nascent polypeptides monitored by NMR spectroscopy.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107, 9111-9116 (2010).</li>
<li>Kolb, V. A., Makeyev, E. V., Spirin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+activity+of+the+ribosome-bound+nascent+polypeptide%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Enzymatic activity of the ribosome-bound nascent polypeptide.</a> FEBS Lett. 378, 166-170 (1996).</li>
<li>Ban, N., Nissen, P., Hansen, J., Moore, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complete+atomic+structure+of+the+large+ribosomal+subunit+at+2.4+%C3%85+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The complete atomic structure of the large ribosomal subunit at 2.4 Å resolution.</a> Science. 289, 905-920 (2000).</li>
<li>Voss, N. R., Gerstein, M., Steitz, T. A., Moore, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+geometry+of+the+ribosomal+polypeptide+exit+tunnel%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The geometry of the ribosomal polypeptide exit tunnel.</a> J. Mol. Biol. 360, 893-906 (2006).</li>
<li>Schägger, H., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tricine-sodium+dodecyl+sulfate-polyacrylamide+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+proteins+in+the+range+from+1+to+100+kDa%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa.</a> Anal. Biochem. 166, 368-379 (1987).</li>
<li>Komar, A. A., Kommer, A., Krasheninnikov, I. A., Spirin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cotranslational+folding+of+globin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Cotranslational folding of globin.</a> J. Biol. Chem. 272, 10646-10651 (1997).</li>
<li>Keiler, K. C., Waller, P. R., Sauer, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+a+peptide+tagging+system+in+degradation+of+proteins+synthesized+from+damaged+messenger+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Role of a peptide tagging system in degradation of proteins synthesized from damaged messenger RNA.</a> Science. 271, 990-993 (1996).</li>
<li>Evans, M. S., Ugrinov, K. G., Frese, M. A., Clark, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homogeneous+stalled+ribosome+nascent+chain+complexes+produced+in+vivo+or+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Homogeneous stalled ribosome nascent chain complexes produced in vivo or in vitro.</a> Nat. Methods. 2, 757-762 (2005).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Aby uzyskać powtarzalne wyniki, kluczowe jest zachowanie odpowiedniej jakości i stężenia komponentów stosowanych do transkrypcji i translacji in vitro. Wykorzystaliśmy dostępne komercyjnie ekstrakty do transkrypcji i translacji in vitro, które przy ostrożnym obchodzeniu się z nimi dają wydajne i powtarzalne rezultaty. Jakość mRNA może wpływać na translację, dlatego przed użyciem mRNA do translacji in vitro najwyższej wagi ma sprawdzenie jego integralności. Czas inkubacji w procesie translacji <...

<table><tbody><tr><td>Zestaw do transkrypcji o wysokiej wydajności MEGAscript T7</td><td>Ambion</td><td>AM1333</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw RTS 100 E.coli HY</td><td>5 Prime</td><td>2401100</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitor rybonukleazy</td><td>Invitrogen</td><td>15518012</td><td></td></tr><tr><td>Znacznik Trans [&lt;sup&gt;35&lt;/sup&gt;S]</td><td>MP Biomedicals</td><td>0151006</td><td></td></tr><tr><td>Odwirnik Amicon Ultra-4</td><td>Millipore</td><td>UFC801008</td><td></td></tr><tr><td>Autoradiografia na fosforze magazynującym</td><td>GE Healthcare</td><td>Obrazownik Typhoon 9410 w trybie zmiennym</td><td></td></tr><tr><td>Systemy frakcjonowania w gradiencie gęstości</td><td>Teledyne Isco, Inc.</td><td>Programowalny system gradientu gęstości ISCO</td><td></td></tr><tr><td>Wirowanie w gradiencie sacharozy</td><td>Beckman Coulter</td><td>Ultracentryfuga preparatywna Optima L-90 K</td><td></td></tr></tbody></table>

wykorzystanie sekwencji zatrzymującej secm jako narzędzia do izolacji polipeptydów związanych z rybosomami

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Szeroko zakrojone badania dostarczyły licznych dowodów sugerujących, że zwijanie białek w komórce jest procesem kotranslacyjnym1-5. Jednak dokładna ścieżka, jaką podąża łańcuch polipeptydowy podczas zwijania kotranslacyjnego, aby osiągnąć swoją funkcjonalną formę, wciąż pozostaje zagadką. Aby zrozumieć ten proces i określić dokładną konformację produktów pośrednich zwijania kotranslacyjnego, niezbędne jest opracowanie technik umożliwiających izolację RNC przenoszących powstające łańcuchy o określonych rozmiarach, co pozwoli na ich dalszą analizę strukturalną.
SecM (monitor sekrecji) jest białkiem E. coli składającym się ze 170 aminokwasów, które reguluje ekspresję położonej poniżej ATP-azy SecA (napędzającej sekrecję) w operonie secM-secA6. Nakatogawa i Ito odkryli pierwotnie, że sekwencja o długości 17 aminokwasów (150-FSTPVWISQAQGIRAGP-166) w regionie C-końcowym białka SecM jest wystarczająca i niezbędna do spowodowania zatrzymania elongacji SecM w pozycji Gly165, co prowadzi do powstania peptidylu-glycylu-tRNA stabilnie związanego z miejscem P rybosomu7-9. Co ważniejsze, stwierdzono, że tę 17-aminokwasową sekwencję można połączyć z końcem C praktycznie każdego pełnowymiarowego i/lub skróconego białka, co umożliwia produkcję RNC niosących nasadzone łańcuchy o określonej wielkości7. Zatem w przypadku połączenia lub wstawienia sekwencji zatrzymującej SecM do białka docelowego, dochodzi do przerwania elongacji łańcucha polipeptydowego i powstają stabilne RNC zarówno in vivo w komórkach E. coli, jak i in vitro w systemie bezkomórkowym. Do izolacji RNC wykorzystuje się następnie wirowanie w gradiencie sacharozy.
Wyizolowane kompleksy RNC mogą być wykorzystane do analizy cech strukturalnych i funkcjonalnych produktów pośrednich zwijania kotranslacyjnego. Ostatnio technika ta została z powodzeniem zastosowana w celu uzyskania informacji na temat struktury kilku nascentnych łańcuchów związanych z rybosomem10,11. W niniejszej pracy opisujemy izolację kompleksów RNC wołowej Gamma-B krystaliny połączonej z SecM, wytworzonych w systemie translacji in vitro.

Opisujemy tutaj technikę, która jest obecnie rutynowo stosowana do izolacji stabilnie związanych kompleksów powstającego łańcucha rybosomalnego (RNCs). Technika ta wykorzystuje odkrycie, że sekwencja „zatrzymująca” SecM o długości 17 aminokwasów może wstrzymać elongację translacji w systemie prokariotycznym (E. coli), gdy zostanie wstawiona do niemal każdego białka (lub połączona z jego końcem C).

Wykorzystanie sekwencji zatrzymującej SecM jako narzędzia do izolacji polipeptydów związanych z rybosomami

Szeroko zakrojone badania dostarczyły licznych dowodów sugerujących, że fałdowanie białek w komórce jest procesem kotranslacyjnym1-5. Jednakże dokładna ścieżka ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest izolacja kompleksów łańcucha powstającego związanych z rybosomami 70 s (RNC), produkowanych podczas translacji w systemie bezkomórkowym in vitro, przy użyciu SEC TED 70. Osiąga się to poprzez wprowadzenie 17-aminokwasowej sekwencji zatrzymującej SEC M na koniec C-końcowy badanego genu i sklonowanie go poniżej promotora transkrypcyjnego T7. Następnie mRNA jest transkrybowane w reakcji transkrypcji in vitro, a następnie poddawane oczyszczaniu.Następnie oczyszczone mRNA jest translacyjne w systemie ekstraktu S 30 E. coli z radioaktywnymi aminokwasami w celu znakowania syntetyzowanego białka lub powstającego polipeptydu. Na koniec kompleksy powstających łańcuchów związanych z drugim rybosomem Mr.Ed są izolowane poprzez wirowanie w gradiencie sacharozy i frakcjonowanie. Ostatecznie, dzięki analizie elektroforezą w żelu znakowanych polipeptydów wyizolowanych z frakcji gradientu, można uzyskać wyniki wykazujące, że powstające łańcuchy są stabilnie związane z rybosomem 70 s.Główną zaletą tej techniki w stosunku do istniejących metod, takich jak zastosowanie mRNA pozbawionego kodonu stop, jest to, że zapewnia ona wysoką wydajność przywiązania powstającego łańcucha polipeptydowego do rybosomu 70 s podczas translacji i późniejszego etapu wirowania. Ponadto, w przeciwieństwie do technologii bez kodonu stop, metodę tę można stosować z niemal równą wydajnością zarówno w systemach in vitro, jak i in vivo. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu translacyjnego zwijania białek, takie jak moment formowania się różnych pośrednich struktur zwijania podczas translacji, a także pomóc w analizie ich struktury za pomocą bezpośrednich lub pośrednich metod strukturalnych.Metody badania i określania. Technika ta może pomóc w odczytaniu ścieżki fałdowania białek na rybosomie. W niniejszym protokole opisaliśmy izolację pełnowymiarowych łańcuchów nascentnych białka gamma-B krystalicznego związanych z rybosomem 70 s. Metoda ta może jednak zostać wykorzystana do izolacji wariantów niemal każdego białka będącego przedmiotem zainteresowania.Tę strategię można również zastosować do izolacji skróconych łańcuchów polipeptydowych natin z derm Es. Zazwyczaj osoby początkujące w tej metodzie mogą napotkać trudności podczas etapu wirowania w gradiencie sacharozy. Jednak dla doświadczonych badaczy nie powinno to stanowić problemu. Po wstępnych, mniej udanych próbach, w których wykorzystano mRNA pozbawione kodonu stop, zdecydowaliśmy się zastosować drugą sekwencję hamującą w celu izolacji rodzących się polipeptydów kryształiny gamma B związanych z rybosomem 70S.Późniejsza technika nie zapewniała stabilności RNC podczas kolejnych etapów wirowania z taką samą wydajnością, jak technika wykorzystująca sekwencję zatrzymującą SECM. Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ etapy obejmujące przygotowanie gradientu oraz oddzielanie RNC mogą być trudne do opanowania i wymagają pewnego poziomu doświadczenia, aby zapewnić powtarzalne wyniki. Demonstrację przeprowadzi student studiów doktoranckich z mojego laboratorium. Aby przeprowadzić transkrypcję i translację in vitro, należy rozpocząć od genu zainteresowania sklonowanego do dowolnego plazmidu opartego na T7 i/lub SP6 w celu wygenerowania kompleksów rybosom-łańcuch nowo powstającego białka, czyli RNC.Wydłuż koniec C docelowego polipeptydu, dodając sekwencję indukującą zatrzymanie z M, aby zapewnić, że fragment polipeptydu zostanie wypchnięty z tunelu rybosomalnego. Dodaj elastyczny linker bogaty w glicynę i serynę pomiędzy białkiem a sekwencją zatrzymania SEC M w celu przygotowania do transkrypcji in vitro; użyj enzymu restrykcyjnego, który przetnie DNA w regionie poniżej otwartej ramki odczytu, aby zlinearyzować matrycę DNA. Przeprowadź elektroforezę w żelu agarozowym, aby potwierdzić pełne trawienie próbki. Po zweryfikowaniu optymalnego stężenia DNA, użyj zestawu do transkrypcji o wysokiej wydajności zgodnie z instrukcjami producenta, aby zsyntetyzować mRNA.W celu oczyszczenia mRNA należy zastosować wytrącanie chlorkiem litu. Następnie należy przeprowadzić elektroforezę próbki na żelu akryloamidowym lub agarozowym, aby zweryfikować jej czystość. Do translacji in vitro.Wykorzystując system E. coli w wodzie wolnej od nukleaz, należy dodać 1 mM mieszaninę aminokwasów bez metioniny, 10 jednostek inhibitora rybonukleazy, 20 µCi 35S-metioniny, 20 µL mieszaniny reakcyjnej, 24 µL buforu do rekonstytucji oraz 24 µL lizatu E. coli. Reakcję należy podgrzać, inkubując ją w temperaturze 30 °C przez 5 minut. Następnie należy dodać od 1 do 2 µg mRNA i inkubować przez kolejne 10 do 15 minut w temperaturze 30 °C.Zatrzymaj reakcję, umieszczając ją w lodzie, aby wyizolować kompleksy 70 S rybosomu z przyłączonymi nowo powstającymi łańcuchami białkowymi (nc). Nałóż reakcję translacji na 4,5 ml gradientu sacharozy od 5 do 30% w 20 mM HEPES, wodorotlenku potasu pH 7,5, 15 mM magnezu, 100 mM octanu potasu i 1 mM DTT. Wiruj przy 41 000 RPM przez dwie godziny w temperaturze 4 °C. Po wirowaniu rozdziel gradient sacharozy, używając programowalnego systemu gradientu gęstości i detektora absorbancji ustawionego na 254 nm.Zebrać frakcje zawierające rybosomy 70 s do dalszej analizy w celu ustalenia, czy wydłużone białko SEC M pozostaje przyłączone do rybosomu 70 s. Wytrącić białko w każdej frakcji gradientu poprzez dodanie kwasu trójchlorooctowego. Inkubować próbki przez noc w temperaturze czterech stopni Celsius, a następnego dnia odwirować próbki przy 14 000 ×g przez 15 minut, aby otrzymać osad białkowy, a następnie przemyć osady w stosunku czterech do jednego acetonu do 1 mM Tris-HCl pH 7,6.Osady wysuszyć na powietrzu, a następnie ponownie zawiesić w buforze do ładowania na żel SDS-PAGE. Próbki rozdzielić za pomocą elektroforezy SDS-PAGE w układzie Tris-Tris, następnie żele utrwalić, wysuszyć i poddać autoradiografii oraz obrazowaniu fosfoprotein, zgodnie z przedstawioną procedurą. Po translacji in vitro rybosomy 70 S wyizolowano za pomocą wirowania w gradiencie sacharozy i frakcjonowania, aby upewnić się, że białko krystaliczne gamma B pozostaje stabilnie związane z rybosomem.Frakcje zawierające 70 s połączono, odsolono, poddano wymianie buforowej, a następnie poddano dodatkowej rundzie wirowania w gradiencie sacharozy. Przedstawione tutaj wyniki sugerują, że SEC M może skutecznie indukować zatrzymanie translacji RNC krystaliny gamma B. Po opanowaniu ta technika może zostać wykonana w ciągu jednego dnia roboczego, z wyjątkiem elektroforezy żelowej łańcuchów nascentnych, która zazwyczaj obejmuje nocny etap precypitacji TCA.Podczas przeprowadzania tej procedury kluczowe jest unikanie kontaminacji RNA na każdym etapie. Kontaminacja RNA może wpłynąć na wydajność translacji ekstraktu i doprowadzić do uwolnienia nowo powstałego polipeptydu z rybosomu 70S. Postępując zgodnie z tą procedurą, w zależności od celu końcowego, można uzyskać NAST oraz polipeptydy o określonej długości, stabilnie związane z rybosomem 70S.Kompleksy te mogą być wykorzystywane do różnych celów, takich jak określanie konformacji łańcuchów nascennych związanych z rybosomem za pomocą metod bezpośrednich i pośrednich, np. NMR lub FRET, lub badanie wiązania czynników i ligandów po ich opracowaniu. Technika ta utorowała drogę badaczom z dziedziny biologii strukturalnej i fałdowania białek do badania konformacji pełnowymiarowych białek związanych z rybosomem, a także produktów pośrednich fałdowania kotranslacyjnego. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak przygotować i wyizolować nascenny polipeptyd stabilnie związany z rybosomem 70 S, który może być dalej wykorzystywany do odpowiedzi na różne pytania z dziedziny translacyjnego fałdowania białek.Należy pamiętać, że praca z izotopami promieniotwórczymi i znakowanymi aminokwasami, takimi jak na przykład metionina-35, wymaga szczególnych środków ostrożności, które muszą być zawsze uwzględniane podczas wykonywania tej procedury.

using-secm-arrest-sequence-as-tool-to-isolate-ribosome-bound

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Korzystanie z sekwencji aresztu SecM jako narzędzia do izolowaniu polipeptydów związanych z rybosomami

Niniejszy artykuł opisuje protokół ekstrakcji rybosomów translacyjnych z komórek eukariotycznych. Po ekstrakcji rybosomy są rozdzielane na monosomy i polirybosomy za pomocą frakcjonowania w gradiencie sacharozy, co pozwala na analizę różnych populacji rybosomalnych. W związku z tym metoda ta stanowi złoty standard w badaniu regulacji translacji.

Analiza profilu polirybosomów eukariotycznych

Główną przeszkodą w analizach biochemicznych rybosomów zawierających powstające peptydylo-tRNA była obecność innych rybosomów w tych samych próbkach — rybosomów niezaangażowanych w translację konkretnej analizowanej sekwencji mRNA. Opracowaliśmy prostą metodologię pozwalającą na wyłączną puryfikację rybosomów zawierających interesujące nas powstające peptydylo-tRNA.

Izolacja rybosomów translacyjnych zawierających peptydylo-tRNA do analiz funkcjonalnych i strukturalnych

Opisano technikę identyfikacji miejsc zatrzymania translacji na mRNA. Procedura ta opiera się na izolacji nowo powstających polipeptydów gromadzących się na rybosomach podczas translacji in vitro docelowego mRNA, a następnie na analizie wielkości łańcuchów nascentnych przy użyciu denaturującej elektroforezy żelowej.

Izolacja związanych z rybosomami nowo powstałych polipeptydów in vitro w celu identyfikacji miejsc pauzy translacyjnej wzdłuż mRNA

Oczyszczanie powinowactwa oznaczonych białek w połączeniu ze spektrometrią mas (APMS) to potężna metoda systematycznego mapowania sieci interakcji białek i badania mechanistycznych podstaw procesów biologicznych. W tym miejscu opisujemy zoptymalizowaną procedurę APMS opartą na powinowactwie do peptydów sekwencyjnych (SPA) opracowaną dla bakterii Escherichia coli, która może być stosowana do izolowania i charakteryzowania stabilnych kompleksów wielobiałkowych do niemal jednorodności, nawet...

Identyfikacja kompleksów białkowych w Escherichia coli za pomocą sekwencyjnego oczyszczania powinowactwa peptydów w połączeniu z tandemową spektrometrią mas

Ten protokół ilustruje istotne modyfikacje frakcjonowania polirybosomów w celu zbadania translatomii próbek OUN in vivo. Umożliwia globalną ocenę regulacji translacji i transkrypcji poprzez izolację i porównanie całkowitego RNA z frakcjami RNA związanymi z rybosomami.

In vivo (in vivo) Badanie translatomii ośrodkowego układu nerwowego przez frakcjonowanie polirybosomów

Rybosomy odgrywają kluczową rolę w syntezie białek. Frakcjonowanie polirybosomów (polisomów) za pomocą wirowania w gradiencie gęstości sacharozy umożliwia bezpośrednie określenie wydajności translacji poszczególnych mRNA w skali całego genomu. Ponadto metoda ta może być stosowana do analizy biochemicznej czynników związanych z rybosomami i polisomami, takich jak białka opiekuńcze i cząsteczki sygnałowe.

Frakcjonowanie polisomów i analiza translatomiów ssaków w skali całego genomu

Opisano procedurę tandemowej izolacji RNA (TRIP) w celu odzyskania endogennie utworzonych kompleksów mRNA-białko. W szczególności kompleksy RNA-białko są sieciowane in vivo, poliadenylowane RNA są izolowane z ekstraktów z kulkami oligo(dT), a poszczególne mRNA są wychwytywane za pomocą zmodyfikowanych oligonukleotydów antysensownych RNA. Białka związane z mRNA są wykrywane za pomocą analizy immunoblot.

Procedura izolacji tandemowego RNA oparta na oligonukleotydach w celu odzyskania eukariotycznych kompleksów mRNA-białko

Tutaj opisujemy etapy pobierania próbek i przygotowania do sekwencji RIBO u bakterii. Sekwencjonowanie bibliotek przygotowanych zgodnie z tymi wytycznymi daje wystarczające dane do kompleksowej analizy bioinformatycznej. Prezentowany przez nas protokół jest prosty, wykorzystuje standardowy sprzęt laboratoryjny i od lizy do uzyskania bibliotek mija siedem dni.

RIBO-seq w bakteriach: protokół pobierania próbek i przygotowania biblioteki do sekwencjonowania NGS

Ten protokół opisuje, jak wygenerować profil polisomowy bez użycia automatycznych kreatorów gradientów lub systemów frakcjonowania gradientów.

Profilowanie polisomów bez kreatorów gradientów i systemów frakcjonowania

Interakcje kotranslacyjne odgrywają kluczową rolę w modyfikacjach powstających łańcuchów, celowaniu, składaniu i ścieżkach montażu. W tym miejscu opisujemy selektywne profilowanie rybosomów, metodę bezpośredniej analizy in vivo tych interakcji w modelu eukarionta Saccharomyces cerevisiae.

Globalna identyfikacja sieci oddziaływań kotranslacyjnych poprzez selektywne profilowanie rybosomów

AviTag-specific Location-restricted Illumination-enhanced Biotinylation (ALIBi) to nowoczesna optogenetycznie aktywowana metoda opracowana w celu znakowania i oczyszczania powinowaczo-afinicznego subkomórkowych populacji rybosomów dla sekwencjonowania i analizy proteomicznej w dalszym biegu.

Izolacja subpopulacji rybosomów subkomórkowych na podstawie rekombinowanego oznaczenia peptydowego tag-specyficznej lokalizacji ograniczonej iluminacji zwiększonej biotynilacją

Naucz się izolować kompleksy rybosomowo-polipeptydowe z użyciem sekwencji SecM w systemie E. coli. Ta metoda umożliwia badanie dynamiki translacji i składania białek na rybosomach.

Wykorzystanie sekwencji zatrzymującej SecM jako narzędzia do izolacji polipeptydów związanych z rybosomami

Przeglądaj więcej filmów