Wykorzystanie sekwencji zatrzymującej SecM jako narzędzia do izolacji polipeptydów związanych z rybosomami

Ogólnym celem niniejszej procedury jest izolacja kompleksów łańcucha powstającego związanych z rybosomami 70 s (RNC), produkowanych podczas translacji w systemie bezkomórkowym in vitro, przy użyciu SEC TED 70. Osiąga się to poprzez wprowadzenie 17-aminokwasowej sekwencji zatrzymującej SEC M na koniec C-końcowy badanego genu i sklonowanie go poniżej promotora transkrypcyjnego T7. Następnie mRNA jest transkrybowane w reakcji transkrypcji in vitro, a następnie poddawane oczyszczaniu.

Następnie oczyszczone mRNA jest translacyjne w systemie ekstraktu S 30 E. coli z radioaktywnymi aminokwasami w celu znakowania syntetyzowanego białka lub powstającego polipeptydu. Na koniec kompleksy powstających łańcuchów związanych z drugim rybosomem Mr.Ed są izolowane poprzez wirowanie w gradiencie sacharozy i frakcjonowanie. Ostatecznie, dzięki analizie elektroforezą w żelu znakowanych polipeptydów wyizolowanych z frakcji gradientu, można uzyskać wyniki wykazujące, że powstające łańcuchy są stabilnie związane z rybosomem 70 s.

Główną zaletą tej techniki w stosunku do istniejących metod, takich jak zastosowanie mRNA pozbawionego kodonu stop, jest to, że zapewnia ona wysoką wydajność przywiązania powstającego łańcucha polipeptydowego do rybosomu 70 s podczas translacji i późniejszego etapu wirowania. Ponadto, w przeciwieństwie do technologii bez kodonu stop, metodę tę można stosować z niemal równą wydajnością zarówno w systemach in vitro, jak i in vivo. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu translacyjnego zwijania białek, takie jak moment formowania się różnych pośrednich struktur zwijania podczas translacji, a także pomóc w analizie ich struktury za pomocą bezpośrednich lub pośrednich metod strukturalnych.

Metody badania i określania. Technika ta może pomóc w odczytaniu ścieżki fałdowania białek na rybosomie. W niniejszym protokole opisaliśmy izolację pełnowymiarowych łańcuchów nascentnych białka gamma-B krystalicznego związanych z rybosomem 70 s. Metoda ta może jednak zostać wykorzystana do izolacji wariantów niemal każdego białka będącego przedmiotem zainteresowania.

Tę strategię można również zastosować do izolacji skróconych łańcuchów polipeptydowych natin z derm Es. Zazwyczaj osoby początkujące w tej metodzie mogą napotkać trudności podczas etapu wirowania w gradiencie sacharozy. Jednak dla doświadczonych badaczy nie powinno to stanowić problemu. Po wstępnych, mniej udanych próbach, w których wykorzystano mRNA pozbawione kodonu stop, zdecydowaliśmy się zastosować drugą sekwencję hamującą w celu izolacji rodzących się polipeptydów kryształiny gamma B związanych z rybosomem 70S.

Późniejsza technika nie zapewniała stabilności RNC podczas kolejnych etapów wirowania z taką samą wydajnością, jak technika wykorzystująca sekwencję zatrzymującą SECM. Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ etapy obejmujące przygotowanie gradientu oraz oddzielanie RNC mogą być trudne do opanowania i wymagają pewnego poziomu doświadczenia, aby zapewnić powtarzalne wyniki. Demonstrację przeprowadzi student studiów doktoranckich z mojego laboratorium. Aby przeprowadzić transkrypcję i translację in vitro, należy rozpocząć od genu zainteresowania sklonowanego do dowolnego plazmidu opartego na T7 i/lub SP6 w celu wygenerowania kompleksów rybosom-łańcuch nowo powstającego białka, czyli RNC.

Wydłuż koniec C docelowego polipeptydu, dodając sekwencję indukującą zatrzymanie z M, aby zapewnić, że fragment polipeptydu zostanie wypchnięty z tunelu rybosomalnego. Dodaj elastyczny linker bogaty w glicynę i serynę pomiędzy białkiem a sekwencją zatrzymania SEC M w celu przygotowania do transkrypcji in vitro; użyj enzymu restrykcyjnego, który przetnie DNA w regionie poniżej otwartej ramki odczytu, aby zlinearyzować matrycę DNA. Przeprowadź elektroforezę w żelu agarozowym, aby potwierdzić pełne trawienie próbki. Po zweryfikowaniu optymalnego stężenia DNA, użyj zestawu do transkrypcji o wysokiej wydajności zgodnie z instrukcjami producenta, aby zsyntetyzować mRNA.

W celu oczyszczenia mRNA należy zastosować wytrącanie chlorkiem litu. Następnie należy przeprowadzić elektroforezę próbki na żelu akryloamidowym lub agarozowym, aby zweryfikować jej czystość. Do translacji in vitro.

Wykorzystując system E. coli w wodzie wolnej od nukleaz, należy dodać 1 mM mieszaninę aminokwasów bez metioniny, 10 jednostek inhibitora rybonukleazy, 20 µCi 35S-metioniny, 20 µL mieszaniny reakcyjnej, 24 µL buforu do rekonstytucji oraz 24 µL lizatu E. coli. Reakcję należy podgrzać, inkubując ją w temperaturze 30 °C przez 5 minut. Następnie należy dodać od 1 do 2 µg mRNA i inkubować przez kolejne 10 do 15 minut w temperaturze 30 °C.

Zatrzymaj reakcję, umieszczając ją w lodzie, aby wyizolować kompleksy 70 S rybosomu z przyłączonymi nowo powstającymi łańcuchami białkowymi (nc). Nałóż reakcję translacji na 4,5 ml gradientu sacharozy od 5 do 30% w 20 mM HEPES, wodorotlenku potasu pH 7,5, 15 mM magnezu, 100 mM octanu potasu i 1 mM DTT. Wiruj przy 41 000 RPM przez dwie godziny w temperaturze 4 °C. Po wirowaniu rozdziel gradient sacharozy, używając programowalnego systemu gradientu gęstości i detektora absorbancji ustawionego na 254 nm.

Zebrać frakcje zawierające rybosomy 70 s do dalszej analizy w celu ustalenia, czy wydłużone białko SEC M pozostaje przyłączone do rybosomu 70 s. Wytrącić białko w każdej frakcji gradientu poprzez dodanie kwasu trójchlorooctowego. Inkubować próbki przez noc w temperaturze czterech stopni Celsius, a następnego dnia odwirować próbki przy 14 000 ×g przez 15 minut, aby otrzymać osad białkowy, a następnie przemyć osady w stosunku czterech do jednego acetonu do 1 mM Tris-HCl pH 7,6.

Osady wysuszyć na powietrzu, a następnie ponownie zawiesić w buforze do ładowania na żel SDS-PAGE. Próbki rozdzielić za pomocą elektroforezy SDS-PAGE w układzie Tris-Tris, następnie żele utrwalić, wysuszyć i poddać autoradiografii oraz obrazowaniu fosfoprotein, zgodnie z przedstawioną procedurą. Po translacji in vitro rybosomy 70 S wyizolowano za pomocą wirowania w gradiencie sacharozy i frakcjonowania, aby upewnić się, że białko krystaliczne gamma B pozostaje stabilnie związane z rybosomem.

Frakcje zawierające 70 s połączono, odsolono, poddano wymianie buforowej, a następnie poddano dodatkowej rundzie wirowania w gradiencie sacharozy. Przedstawione tutaj wyniki sugerują, że SEC M może skutecznie indukować zatrzymanie translacji RNC krystaliny gamma B. Po opanowaniu ta technika może zostać wykonana w ciągu jednego dnia roboczego, z wyjątkiem elektroforezy żelowej łańcuchów nascentnych, która zazwyczaj obejmuje nocny etap precypitacji TCA.

Podczas przeprowadzania tej procedury kluczowe jest unikanie kontaminacji RNA na każdym etapie. Kontaminacja RNA może wpłynąć na wydajność translacji ekstraktu i doprowadzić do uwolnienia nowo powstałego polipeptydu z rybosomu 70S. Postępując zgodnie z tą procedurą, w zależności od celu końcowego, można uzyskać NAST oraz polipeptydy o określonej długości, stabilnie związane z rybosomem 70S.

Kompleksy te mogą być wykorzystywane do różnych celów, takich jak określanie konformacji łańcuchów nascennych związanych z rybosomem za pomocą metod bezpośrednich i pośrednich, np. NMR lub FRET, lub badanie wiązania czynników i ligandów po ich opracowaniu. Technika ta utorowała drogę badaczom z dziedziny biologii strukturalnej i fałdowania białek do badania konformacji pełnowymiarowych białek związanych z rybosomem, a także produktów pośrednich fałdowania kotranslacyjnego. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak przygotować i wyizolować nascenny polipeptyd stabilnie związany z rybosomem 70 S, który może być dalej wykorzystywany do odpowiedzi na różne pytania z dziedziny translacyjnego fałdowania białek.

Należy pamiętać, że praca z izotopami promieniotwórczymi i znakowanymi aminokwasami, takimi jak na przykład metionina-35, wymaga szczególnych środków ostrożności, które muszą być zawsze uwzględniane podczas wykonywania tej procedury.