Wizualizacja mRNA zlokalizowanych w retikulum endoplazmatycznym w komórkach ssaków

Celem tej procedury jest wizualizacja informacyjnego RNA, który jest związany z retikulum endoplazmatycznym lub er. Osiąga się to poprzez uprzednie posiewanie komórek hodowli tkankowych ssaków na szkiełkach nakrywkowych. Drugim etapem procedury jest potraktowanie komórek buforem ekstrakcyjnym w celu usunięcia cytoplazmatycznego mRNA niezwiązanego z er.

Kolejnymi krokami są szybkie utrwalenie komórek i wybarwienie mRNA poprzez fluorescencyjną hybrydyzację in situ. Ostatnim krokiem jest zobrazowanie, a następnie ilościowe określenie ilości fluorescencji związanej z er. Ostatecznie wyniki mogą pokazać, w jaki sposób mRNA są związane z powierzchnią tej organelli w różnych warunkach.

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania biologiczne komórki, takie jak to, czy mRNA kodujące białka wydzielnicze mogą być utrzymywane na powierzchni ER, niezależnie od rybosomów lub syntezy białek. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ obejmuje kilka skomplikowanych etapów manipulacji komórkowej. Wysiewanie komórek hodowli tkankowej na szkiełkach nakrywkowych traktowanych kwasem przez co najmniej jeden dzień przed eksperymentem kosztuje siedem, a ze względu na OS komórki są odpowiednim wyborem, ponieważ mają wysoką produkcję białek i dobrze zdefiniowane ER.

Jeśli badany jest egzogenny Mr NA, należy przetransfekować komórki jeden dzień po wysiewie, a następnie inkubować komórki przez dodatkowe 18 godzin, aby umożliwić MR. Wyrażenie NA. W dniu eksperymentu. Aby osiągnąć wysoką wydajność ekstrakcji, komórki nie powinny przekraczać 80% płynności CO na szkiełku nakrywkowym, aby wykryć, czy mRNA oddziałują z ER niezależnie od translacji, komórki mogą być traktowane środkami, które zakłócają interakcję między rybosomami a mRNA przy tych czynnikach lub kontrolują pożywki do komórek 30 minut przed ekstrakcją.

W tym przypadku stosuje się inhibitory translacji, czystą Mycynę i Homo Harrington in lub HHT. Rozpocznij od podgrzania świeżo przygotowanego roztworu ekstrakcyjnego zawierającego toninę dig i bufor roboczy jednego XCHO do 37 stopni Celsjusza. Ustaw blok grzewczy na 40 stopni Celsjusza i włóż odwrócony metalowy blok, aby utworzyć płaską powierzchnię roboczą.

Zwilż metalowy blok wodą, a następnie pokryj go świeżym kawałkiem paraformy i wygładź wszelkie pęcherzyki za pomocą rękawiczek bez RNA i niestrzępiących się chusteczek. Następnie, dla każdej pary szkiełek nakrywkowych, przygotuj płytkę z sześcioma dołkami do mycia i mocowania komórek do czterech dołków. Dodaj dwa mililitry podgrzanego buforu CHO do dwóch ostatnich studzienek.

Dodać dwa mililitry roztworu utrwalającego. Następnie przechowuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aż będzie potrzebna. Na bloku grzewczym umieść 100 mikrolitrów kropli roztworu ekstrakcyjnego na każdy szkiełko nakrywkowe komórek, które mają być przetworzone.

Teraz za pomocą kleszczy jubilerskich podnieś szkiełko nakrywkowe pokryte komórkami i zanurz je w pierwszym i drugim dołku zawierającym bufor CHO. To zmywa podłoże wzrostowe. Następnie szybko zetrzyj nadmiar bufora z tylnej strony szkiełka nakrywkowego.

I na krótko umieść komórkę szkiełka nakrywkowego stroną do dołu na roztworze ekstrakcyjnym. Po 10 sekundach przenieś stronę z komórką szkiełka nakrywkowego do bufora utrwalającego, gdzie powinna pozostać przez co najmniej 15 minut. Etap ekstrakcji komórek jest niezbędny do usunięcia całego mRNA z tworzywa sztucznego cyop, które nie jest związane z ER.

Ponadto należy przygotować kontrolny szkiełko nakrywkowe, w którym komórki są mocowane bez ekstrakcji. Krok po fiksacji. Umyj te niewyekstrahowane komórki kontrolne dwukrotnie PBS, a następnie przepuść do PBS i TRITTON X 100.

Chociaż nie jest to wymagane, wyekstrahowane komórki należy również przemyć tym samym roztworem PBS i Triton, aby zmniejszyć fluorescencję tła po przesiąknięciu komórek. Umyj szkiełka dwukrotnie za pomocą PBS, aby usunąć utrwalacz i detergent. Następnie umyj szkiełka dwukrotnie 60% fide w jednorazowym buforze cytrynianu sodu lub SSC.

Jeśli jednak do barwienia wszystkich komórek zostanie użyta sonda rybna oligo DT, poli mRNA obniży poziom fide do 25%Następnie przygotuj bufor hybrydyzacyjny z sondą rybną. Rozcieńczyć sondę ryb podstawowych do 0,2 mikromola w tym samym stężeniu fide w buforze hybrydyzacyjnym. Teraz przygotuj komorę do barwienia.

Napełnij dno 150-milimetrowej szalki Petriego wodą. Następnie unieś kawałek paraformu na wodzie i odwróć naczynie do góry nogami. Folia para będzie przylegać do dna naczynia w miarę ucieczki wody.

Jeśli są jakieś pęcherzyki powietrza, usuń je rękawiczkami i niestrzępiącymi się chusteczkami dla każdego szkiełka nakrywkowego, odpipetuj 100 mikrolitrów roztworu hybrydyzacyjnego zawierającego rybę Sondę na folię para. Teraz umieść szkiełko nakrywkowe stroną z komórką do dołu na roztworze. Na koniec inkubuj komorę przez pięć do 24 godzin w ciepłej, wilgotnej komorze.

Zanim skończy się czas barwienia ryb, przygotuj obszar mycia wolny od RNA, bardziej wyrównaj płaską powierzchnię wodą i przykryj ją paskami param. Usuń wszelkie pęcherzyki powietrza za pomocą rękawiczek i chusteczek higienicznych. Po zakończeniu barwienia przenieś komorę do obszaru roboczego dla każdego szkiełka nakrywkowego Odpipetuj jeden mililitr buforu do płukania na obszar mycia.

Folia para, aby przenieść szkiełka nakrywkowe: Najpierw odpipetować pół mililitra buforu do płukania ryb w pobliżu krawędzi każdego szkiełka nakrywkowego. Ciecz zostanie wciągnięta pod szkiełko nakrywkowe przez działanie kapilarne. Następnie za pomocą kleszczy wyjmij szkiełka nakrywkowe z komory i umieść je na kroplach buforu do mycia.

I poczekaj pięć minut. Powtórz tę technikę prania jeszcze trzy razy. Używając świeżych jednomililitrowych kropli buforu do mycia na obszarze mycia.

W międzyczasie wyczyść szkiełka 70% etanolem i wysusz je niestrzępiącymi się chusteczkami. Następnie na każde szkiełko nakrywkowe nałóż 25 mikrolitrów roztworu montażowego DPI na szkiełko Za pomocą kleszczyków podnieś szkiełko nakrywkowe i osusz jego tył niestrzępiącą się chusteczką, aby usunąć nadmiar buforu do mycia. Następnie przenieś stronę komórki szkiełka nakrywkowego skierowaną w dół na kroplę roztworu montażowego.

Gotowe preparaty można przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza do momentu zobrazowania kosztów. Siedem komórek, które zostały transfekowane plazmidami zawierającymi fosfatazę alkaliczną łożyska lub cytochrom P 4, 58 B, jeden, ekstrahowano toniną, a następnie utrwalono lub bezpośrednio utrwalono, aby określić procent tych mRNA, które są związane z ER. Fluorescencję niejądrową określono ilościowo w obu próbkach, a dla obu mRNA obliczono frakcję mRNA związanego z ER.

Około 60% frakcji cytoplazmatycznej było związane z ER w celu monitorowania związku ER tych transkryptów. Po dysocjacji rybosomów transfekowanych kosztach siedem komórek potraktowano pożywką kontrolną, pur MYCIN lub HHT, a następnie wyekstrahowano toninę i utrwalono mRNA. Barwienie wykazało, że mRNA A LPP, ale nie CYP eight P one, pozostało związane z ER po rozerwaniu rybosomów.

Kwantyfikacja mRNA potwierdziła tę obserwację i co ważne, wykazała, że poziom jądrowego mRNA był spójny we wszystkich próbkach. Dane te ujawniają, że podzbiór mRNA ukierunkowanych na ER, takich jak transkrypt A LPP, utrzymuje się na powierzchni ER po rozpadzie rybosomów. Korzystając z tego protokołu, możemy zacząć badać, w jaki sposób różne mRNA lokalizują się w różnych przedziałach subkomórkowych, takich jak siatka endoplazmatyczna w połączeniu z innymi testami stosowanymi do analizy eksportu jądrowego mRNA.

Procedura ta może być wykorzystana do zbadania początkowego kierowania nowo zsyntetyzowanych mRNA na powierzchnię er.