Name: Wizualizacja mRNA zlokalizowanych w retikulum endoplazmatycznym w komórkach ssaków (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: Poznaj metodę wizualizacji mRNA związanego z retikulum endoplazmatycznym w komórkach ssaków. Technika obejmuje selektywną permeabilizację błony komórkowej oraz hybrydyzację in situ.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty z Narodowej Rady Badań Naukowych i Inżynieryjnych Kanady dla X.A.C. i A.F.P.

1. Przygotowanie materiałów do ekstrakcji
<ol>
	<li>Przygotowanie komórek
	<ol>
		<li>Hodowla tkankowa komórek nasiennych na szkiełkach nakrywkowych poddanych działaniu kwasu przez co najmniej jeden dzień przed eksperymentem. Używamy COS-7 lub U2OS, ponieważ te dwie linie komórkowe wykazują solidną produkcję wydzielanego białka i mają dobrze zdefiniowany ER. Należy pamiętać, że aby osiągnąć wysoką wydajność ekstrakcji, komórki nie powinny przekraczać 80% konfluencji na szkiełku nakrywkowym w dniu eksperymentu.</li>
		<li>Jeśli badany jest konkretny egzogenny mRNA, komórki są transfekowane dzień po wysiewie plazmidami zawierającymi gen będący przedmiotem zainteresowania przy użyciu standardowych protokołów transfekcji. Następnie komórki mogą wyrażać mRNA przez co najmniej 18 godzin przed ekstrakcją.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Leczenie komórek inhibitorami translacji
	<ol>
		<li>Aby przetestować wpływ nienaruszonych rybosomów na utrzymanie asocjacji mRNA z ER, komórki można leczyć inhibitorami translacji, które zakłócają asocjację rybosomów z mRNA11.</li>
		<li>Inhibitory inicjacji translacji, takie jak homoharringtonyna (HHT), paktamycyna lub 2-(4-metylo-2,6-dinitroanilino)-N-metylopropiamid (MDMP), zapobiegają asoomom asomotów przed asosumacją z transkryptem, jednocześnie umożliwiając zaangażowanym rybosomom zakończenie translacji12-14. Ponieważ szybkość translacji dla większości białek w komórkach ssaków wynosi 5 aminokwasów na sekundę, niezależnie od użycia kodonów lub długości mRNA15, leczenie trwające 30 minut powinno usunąć rybosomy z wiadomości z otwartymi ramkami odczytu o długości nawet 27 000 nukleotydów (kodowanie dla białek o długości nawet 9 000 aminokwasów).</li>
		<li>Inhibitory, takie jak puromycyna, sprzyjają przedwczesnemu wyrzucaniu powstającego łańcucha, a tym samym zaburzają polisomy12. Jednak, aby całkowicie przerwać asocjację rybosomów traktowanych puromycyną z mRNA, chelatory magnezu, takie jak EDTA, muszą zostać dodane do buforu ekstrakcji digitoniny11.</li>
		<li>W tym eksperymencie komórki są traktowane 200 μM puromycyną, 5 μM HHT lub pożywką kontrolną przez 30 minut przed ekstrakcją.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie buforu do ekstrakcji digitoniny. Aby uwidocznić mRNA zlokalizowane w ER bez niedrożności wolnych (tj. cytoplazmatycznych, niezwiązanych z ER) transkryptów, selektywnie przenikamy do komórki digitoninę, glikozyd steroidowy, który oddziałuje preferencyjnie z 3β-hydroksysterolami. W niskich stężeniach digitonina selektywnie przenika przez części błony komórkowej, powodując "nieszczelność"16. Natomiast błona ER i otoczka jądrowa, które są ubogie w cholesterol, pozostają nienaruszone16,17.
	<ol>
		<li>Digitonina (Sigma Aldrich) w proszku rozpuszcza się w wodzie destylowanej o stężeniu 5% wagowo-objętościowym, a roztwór podstawowy dzieli się na małe objętości i przechowuje w temperaturze -20 °C. Z naszego doświadczenia wynika, że wielokrotne cykle zamrażania i rozmrażania zmniejszają wydajność rozpuszczonej digitoniny.</li>
		<li>Roztwór podstawowy składający się z 10 razy buforu CHO (1 x roztwór roboczy o stężeniu: 115 mM KAc, 25 mM HEPES pH 7,4, 2,5 mM MgCl2, 2 mM EGTA i 150 mM sacharozy) przygotowuje się z odczynnikami wolnymi od RNaz i przechowuje w temperaturze -20 °C. Roztwór roboczy (1x bufor CHO) przygotowuje się przez rozcieńczenie roztworu podstawowego wodą wolną od RNaz i może być przechowywany w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Ekstrakcja digitoniny
<ol>
	<li>Przygotowanie roztworów ekstrakcyjnych
	<ol>
		<li>Blok grzewczy o płaskiej powierzchni jest wstępnie podgrzewany do 40 °C i utrzymywany w tej temperaturze przez cały czas ekstrakcji.</li>
		<li>Aby utworzyć płaską powierzchnię roboczą, która jest wolna od RNazy, blok grzewczy zwilża się niewielką ilością wody i pokrywa świeżym kawałkiem parafilmu M (Bemis Company, Inc). Pęcherzyki powietrza między arkuszem parafilmu a blokiem grzewczym są wygładzane za pomocą rękawic i chusteczek nawilżanych bez RNaz (VWR).</li>
		<li>1x bufor CHO jest podgrzewany do 37 °C przez inkubację w łaźni wodnej.</li>
		<li>Płytki 6-dołkowe służą do mycia i utrwalania komórek. Każdy rząd 3 dołków służy do jednego szkiełka nakrywkowego. Do pierwszych dwóch studzienek w rzędzie dodaje się 2 ml podgrzanego buforu CHO. Do ostatniej studzienki dodaje się 2 ml roztworu utrwalającego (PBS + 4% paraformaldehydu (Electron Microscope Sciences)). Tackę tę można przechowywać w inkubatorze w temperaturze 37 °C do czasu, gdy komórki będą gotowe do ekstrakcji.</li>
		<li>Roztwór do ekstrakcji digitoniny przygotowuje się przez rozcieńczenie podstawowego roztworu digitoniny do 0,025% ciepłym buforem CHO tuż przed użyciem. Ponownie należy zauważyć, że w przypadku komórek traktowanych puromycyną bufor ekstrakcyjny musi dodatkowo zawierać 20 mM EDTA, aby skutecznie rozbić rybosomy11. Krople 100 μl roztworu ekstrakcyjnego umieszcza się na pokrytym parafilmem bloku grzewczym bezpośrednio przed ekstrakcją.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ekstrakcja digitoniny i utrwalanie komórek
	<ol>
		<li>Wyjąć komórki z inkubatora w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Podczas procesu ekstrakcji szkiełka nakrywkowe są manipulowane za pomocą kleszczy jlerowskich. Za pomocą kleszczy podnieś szkiełko nakrywkowe i zanurz je w pierwszym, a następnie w drugim dołku zawierającym bufor CHO w celu wypłukania pożywki wzrostowej.</li>
		<li>Szybko zetrzyj nadmiar buforu z tylnej strony szkiełka nakrywkowego za pomocą chusteczki kimwipe i natychmiast umieść szkiełko nakrywkowe, stroną z komórkami skierowanymi w dół, na roztworze ekstrakcyjnym.</li>
		<li>Po 10 sekundach podnieś szkiełko nakrywkowe kleszkami i natychmiast przenieś je stroną z komórką skierowaną do góry do studzienki zawierającej 4% bufor utrwalający paraformaldehyd.</li>
		<li>Pozostawić próbkę do inkubacji w utrwalaczu przez co najmniej 15 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie niewyekstrahowanych komórek kontrolnych. Aby określić całkowitą ilość mRNA w cytoplazmie, dobrym pomysłem jest przygotowanie niewyekstrahowanej próbki kontrolnej.
	<ol>
		<li>Komórki wyhodowane na szkiełkach nakrywkowych przygotowuje się jak powyżej (patrz sekcja 2.2), z wyjątkiem tego, że etap ekstrakcji digitoniny (2.2.3) jest pomijany.</li>
		<li>Po utrwaleniu niewyekstrahowane komórki muszą być przepuszczalne w PBS + 0,1% Triton X-100 przez 15 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Barwienie RYB
<ol>
	<li>Projektowanie sond do fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ
	<ol>
		<li>Pierwotna sekwencja mRNA zainteresowanego jest składana za pomocą oprogramowania do przewidywania struktury drugorzędowej RNA, takiego jak RNAstructure 5.018. Fałdy mRNA są oceniane wizualnie w celu zidentyfikowania regionu około 50 nukleotydów, który jest wolny od głównych struktur drugorzędowych.</li>
		<li>Odwrotny dopełniacz tego regionu jest syntetyzowany za pomocą fluoroforu Alexa546 przymocowanego do końca 5' sondy (zakupionego od Integrated DNA Technologies).</li>
		<li>Sondę rozcieńcza się wodą wolną od RNaz do stężenia podstawowego 100 μM, które można przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Barwienie za pomocą sond FISH
	<ol>
		<li>Należy zauważyć, że chociaż komórki ekstrahowane digitoniną nie wymagają dalszej przepuszczalności, traktowanie tych utrwalonych próbek 2 ml 0,1% Triton X-100 rozcieńczonego w PBS przez 15 minut w temperaturze pokojowej przed barwieniem FISH, pomaga zmniejszyć sygnał tła.</li>
		<li>Szkiełka są następnie dwukrotnie myte PBS w celu usunięcia wszelkich pozostałości paraformaldehydu lub Triton X-100.</li>
		<li>Komórki są następnie dwukrotnie przemywane 25% do 60% formamidu w 1X buforze cytrynianu sodu (150 mM NaCl i 15 mM cytrynianu sodu). Ogólnie rzecz biorąc, w przypadku specyficznych sond FISH o długości 50-60 nukleotydów stosuje się 60% formamidu, ale w przypadku barwienia poli(A) mRNA za pomocą sondy oligo(dT) FISH poziom formamidu jest obniżony do 25%.</li>
		<li>Aby przygotować komorę barwienia, dno szalki Petriego o średnicy 150 mm pokrywa się wodą, a na wodzie unosi się kawałek parafilmu. Woda jest usuwana poprzez odwrócenie naczynia, dzięki czemu parafilm przylega do dna naczynia. Pęcherzyki powietrza są ręcznie usuwane za pomocą chusteczek kimwipe.</li>
		<li>Dla każdego szkiełka nakrywkowego, które ma być zabarwione, należy odpipetować 100 μl kropli roztworu hybrydyzacyjnego zawierającego sondę FISH będącą przedmiotem zainteresowania na parafilm w komorze barwienia. Podstawową sondę FISH rozcieńcza się 25% do 60% formamidu w buforze hybrydyzacyjnym (1x SSC, 100 mg/ml siarczanu dekstranu, 1 mg/ml tRNA drożdży, 5mM kompleksu rybozydu wanadylu, 25-60% formamidu) do stężenia roboczego 0,2 μM. Należy pamiętać, że ilość formamidu powinna być zoptymalizowana dla konkretnej używanej sondy i występuje w tym samym stężeniu, co w buforze płuczącym SSC (patrz krok 3.3.3).</li>
		<li>Szkiełko nakrywkowe umieszcza się stroną z komórkami do dołu na roztworze FISH w komorze barwienia i inkubuje przez 5-24 godziny w temperaturze 37 °C w wilgotnej komorze, takiej jak inkubator do hodowli tkankowych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Mycie i montaż poplamionych próbek
	<ol>
		<li>Aby przygotować obszar mycia wolny od RNaz, połóż pasek parafilmu na równej, płaskiej powierzchni, takiej jak stół laboratoryjny. Aby upewnić się, że parafilm jest płaski, zwilż równą powierzchnię, umieść parafilm na wierzchu i ręcznie usuń wszelkie pęcherzyki powietrza za pomocą chusteczek kimwipes.</li>
		<li>Komorę barwienia wyjmuje się z inkubatora i umieszcza na płaskiej, równej powierzchni. Szkiełka nakrywkowe są następnie unoszone na wodzie przez pipetowanie około 500 μl buforu płuczącego FISH w pobliżu krawędzi każdego szkiełka nakrywkowego. Roztwór zostanie wciągnięty między szkiełko nakrywkowe a parafilm poprzez działanie kapilarne.</li>
		<li>Na każde szkiełko nakrywkowe pipetuje się 1 ml buforu do przemywania (1x SCC z 25-60% formamidem, patrz krok 3.3.3) na parafilm obszaru mycia (patrz krok 3.4.1).</li>
		<li>Za pomocą kleszczy szkiełka nakrywkowe wyjmuje się z komory barwienia, a każdy z nich umieszcza się na kropli buforu do płukania i inkubuje w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Proces prania powtarza się 3 razy.</li>
		<li>Szkiełka szklane myje się 70% etanolem i suszy chusteczkami kimwipes.</li>
		<li>Na każde szkiełko nakrywkowe pipetuje się 25 μl roztworu montażowego (DAPI Fluoromount G, Southern Biotech). Należy zauważyć, że ten roztwór zawiera 4',6-diamidyno-2-fenyloindol (DAPI), który barwi DNA i pozwala na wizualizację jąder.</li>
		<li>Za pomocą kleszczyków i chusteczek kimwipe suszy się tylną część szkiełka nakrywkowego, a nadmiar buforu do płukania FISH jest usuwany bez suszenia próbki. Każde szkiełko nakrywkowe jest następnie umieszczane stroną komórki skierowaną w dół, na kropli roztworu montażowego.</li>
		<li>Zamontowane próbki są następnie etykietowane i mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Obrazowanie i kwantyfikacja
<ol>
	<li>Obrazowania
	<ol>
		<li>Mikroskop epifluorescencyjny służy do obrazowania komórek po barwieniu FISH. Transfekowaną komórkę można odróżnić od nietransfekowanych komórek za pomocą jasnego sygnału fluorescencji w odpowiednim kanale. Idealnie byłoby, gdyby każde pozyskane pole zawierało również nietransfekowaną komórkę, która zostanie wykorzystana do określenia fluorescencji tła do oceny ilościowej.</li>
		<li>Dla każdego pola pozyskiwane są obrazy kanału FISH i DAPI. Ponadto, jeśli komórki są współbarwione markerami białkowymi, uzyskuje się również obraz kanału immunofluorescencji. Należy pamiętać, że ekstrakcja digitoniny może być również wykorzystana do wizualizacji rybosomów i białek związanych z ER11.</li>
		<li>Aby zapewnić możliwość porównania intensywności fluorescencji między polami, czas ekspozycji dla każdego kanału powinien pozostać stały dla każdego zestawu doświadczeń.</li>
		<li>Ponownie, aby zapewnić możliwość porównania intensywności fluorescencji między komórkami na różnych szkiełkach nakrywkowych, codzienne zmiany intensywności epiluminescencji lub zaniku sygnału FISH powinny zostać zminimalizowane poprzez obrazowanie wszystkich szkiełek nakrywkowych podczas jednego posiedzenia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kwantyfikacji. Aby określić ilościowo ilość mRNA, która jest zlokalizowana na ER, używamy oprogramowania Nikon NIS Element. Można jednak użyć innego oprogramowania do analizy obrazu, takiego jak ImageJ.
	<ol>
		<li>Korzystając z narzędzia do analizy obrazu NIS ELEMENT firmy Nikon, obrzeża komórki i jądro są przedstawiane jako oddzielny region zainteresowania (ROI).</li>
		<li>Dla każdego ROI intensywność fluorescencji (IT dla całkowitej intensywności ogniwa i IN dla intensywności jądrowej) oraz obszar (AT i AN) są rejestrowane i eksportowane do arkusza kalkulacyjnego Excel.</li>
		<li>Dla każdego obrazu intensywność fluorescencji tła (IB) jest określana poprzez rejestrację intensywności komórki nietransfekowanej. Jeśli analizowane są poziomy mRNA poli(A), wybierany jest obszar wolny od komórek.</li>
		<li>Całkowitą ilość fluorescencji ER (w wyekstrahowanych komórkach) lub cytoplazmatycznej (w komórkach niewyekstrahowanych) oblicza się według wzoru: 
		[AT][I T - IB]- [AN][ IN - IB]</li>
		<li>Intensywność barwienia jądrowego można również obliczyć i wykorzystać jako kontrolę wewnętrzną między różnymi zabiegami. Ponieważ jądra nie są dotknięte traktowaniem digitoniną17 lub rozerwaniem rybosomów11, ilość jądrowego mRNA powinna pozostać stała między każdym z tych zabiegów. Do obliczenia fluorescencji jądrowej stosuje się następujący wzór: 
		[An][ IN - IB]</li>
		<li>Procent cytoplazmatycznego mRNA, który jest ukierunkowany na ER, można obliczyć, biorąc średnią fluorescencję ER 30-40 wyekstrahowanych komórek (patrz 4.2.4) podzieloną przez średnią fluorescencję cytoplazmatyczną z 30-40 niewyekstrahowanych komórek (ponownie patrz 4.2.4). Bardzo ważne jest, aby wyekstrahowane i niewyekstrahowane komórki były przygotowywane, barwione i obrazowane równolegle.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Walter, P., Ibrahimi, I., Blobel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translocation+of+proteins+across+the+endoplasmic+reticulum.+I.+Signal+recognition+protein+%28SRP%29+binds+to+in-vitro-assembled+polysomes+synthesizing+secretory+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Translocation of proteins across the endoplasmic reticulum. I. Signal recognition protein (SRP) binds to in-vitro-assembled polysomes synthesizing secretory protein.</a> J. Cell Biol. 91, 545-550 (1981).</li>
<li>Walter, P., Blobel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translocation+of+proteins+across+the+endoplasmic+reticulum.+II.+Signal+recognition+protein+%28SRP%29+mediates+the+selective+binding+to+microsomal+membranes+of+in-vitro-assembled+polysomes+synthesizing+secretory+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Translocation of proteins across the endoplasmic reticulum. II. Signal recognition protein (SRP) mediates the selective binding to microsomal membranes of in-vitro-assembled polysomes synthesizing secretory protein.</a> J. Cell Biol. 91, 551-556 (1981).</li>
<li>Grlich, D., Prehn, S., Hartmann, E., Kalies, K. U., Rapoport, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mammalian+homolog+of+SEC61p+and+SECYp+is+associated+with+ribosomes+and+nascent+polypeptides+during+translocation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A mammalian homolog of SEC61p and SECYp is associated with ribosomes and nascent polypeptides during translocation.</a> Cell. 71, 489-503 (1992).</li>
<li>Grlich, D., Rapoport, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+translocation+into+proteoliposomes+reconstituted+from+purified+components+of+the+endoplasmic+reticulum+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Protein translocation into proteoliposomes reconstituted from purified components of the endoplasmic reticulum membrane.</a> Cell. 75, 615-630 (1993).</li>
<li>Milcarek, C., Penman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane-bound+polyribosomes+in+HeLa+cells%3A+association+of+polyadenylic+acid+with+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Membrane-bound polyribosomes in HeLa cells: association of polyadenylic acid with membranes.</a> J. Mol. Biol. 89, 327-338 (1974).</li>
<li>Lande, M. A., Adesnik, M., Sumida, M., Tashiro, Y., Sabatini, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+association+of+messenger+RNA+with+microsomal+membranes+in+human+diploid+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Direct association of messenger RNA with microsomal membranes in human diploid fibroblasts.</a> J. Cell Biol. 65, 513-528 (1975).</li>
<li>Cardelli, J., Long, B., Pitot, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+association+of+messenger+RNA+labeled+in+the+presence+of+fluoroorotate+with+membranes+of+the+endoplasmic+reticulum+in+rat+liver%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Direct association of messenger RNA labeled in the presence of fluoroorotate with membranes of the endoplasmic reticulum in rat liver.</a> J. Cell Biol. 70, 47-58 (1976).</li>
<li>Adesnik, M., Lande, M., Martin, T., Sabatini, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retention+of+mRNA+on+the+endoplasmic+reticulum+membranes+after+in+vivo+disassembly+of+polysomes+by+an+inhibitor+of+initiation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Retention of mRNA on the endoplasmic reticulum membranes after in vivo disassembly of polysomes by an inhibitor of initiation.</a> J. Cell Biol. 71, 307-313 (1976).</li>
<li>Kruppa, J., Sabatini, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Release+of+poly+A%28%2B%29+messenger+RNA+from+rat+liver+rough+microsomes+upon+disassembly+of+bound+polysomes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Release of poly A(+) messenger RNA from rat liver rough microsomes upon disassembly of bound polysomes.</a> J. Cell Biol. 74, 414-427 (1977).</li>
<li>Adesnik, M., Maschio, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Segregation+of+specific+classes+of+messenger+RNA+into+free+and+membrane-bound+polysomes%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Segregation of specific classes of messenger RNA into free and membrane-bound polysomes.</a> Eur. J. Biochem. 114, 271-284 (1981).</li>
<li>Cui, X. A., Zhang, H., Palazzo, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p180+Promotes+the+Ribosome-Independent+Localization+of+a+Subset+of+mRNA+to+the+Endoplasmic+Reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">p180 Promotes the Ribosome-Independent Localization of a Subset of mRNA to the Endoplasmic Reticulum.</a> PLoS Biol. 10, e1001336(2012).</li>
<li>Pestka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitors+of+ribosome+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Inhibitors of ribosome functions.</a> Annu. Rev. Microbiol. 25, 487-562 (1971).</li>
<li>Fresno, M., Jimnez, A., Vzquez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+translation+in+eukaryotic+systems+by+harringtonine%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Inhibition of translation in eukaryotic systems by harringtonine.</a> Eur. J. Biochem. 72, 323-330 (1977).</li>
<li>Weeks, D. P., Baxter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+inhibition+of+peptide-chain+initiation+by+2-%284-methyl-2%2C6-dinitroanilino%29-N-methylpropionamide%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Specific inhibition of peptide-chain initiation by 2-(4-methyl-2,6-dinitroanilino)-N-methylpropionamide.</a> Biochemistry. 11, 3060-3064 (1972).</li>
<li>Ingolia, N. T., Lareau, L. F., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+profiling+of+mouse+embryonic+stem+cells+reveals+the+complexity+and+dynamics+of+mammalian+proteomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Ribosome profiling of mouse embryonic stem cells reveals the complexity and dynamics of mammalian proteomes.</a> Cell. 147, 789-802 (2011).</li>
<li>Lerner, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partitioning+and+translation+of+mRNAs+encoding+soluble+proteins+on+membrane-bound+ribosomes%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Partitioning and translation of mRNAs encoding soluble proteins on membrane-bound ribosomes.</a> RNA. 9, 1123-1137 (2003).</li>
<li>Adam, S. A., Marr, R. S., Gerace, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+protein+import+in+permeabilized+mammalian+cells+requires+soluble+cytoplasmic+factors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Nuclear protein import in permeabilized mammalian cells requires soluble cytoplasmic factors.</a> J. Cell Biol. 111, 807-816 (1990).</li>
<li>Reuter, J. S., Mathews, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAstructure%3A+software+for+RNA+secondary+structure+prediction+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">RNAstructure: software for RNA secondary structure prediction and analysis.</a> BMC Bioinformatics. 11, 129(2010).</li>
<li>Lcuyer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analysis+of+mRNA+localization+reveals+a+prominent+role+in+organizing+cellular+architecture+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Global analysis of mRNA localization reveals a prominent role in organizing cellular architecture and function.</a> Cell. 131, 174-187 (2007).</li>
<li>Lcuyer, E., Yoshida, H., Krause, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+implications+of+mRNA+localization+pathways+in+cellular+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Global implications of mRNA localization pathways in cellular organization.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 21, 409-415 (2009).</li>
<li>Gueroussov, S., Tarnawsky, S. P., Cui, X. A., Mahadevan, K., Palazzo, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+mRNA+nuclear+export+kinetics+in+mammalian+cells+by+microinjection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Analysis of mRNA nuclear export kinetics in mammalian cells by microinjection.</a> J Vis Exp. 46, e2387(2010).</li>
</ol>

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Lokalizacja mRNA w różnych miejscach subkomórkowych, poprzez interakcję transkryptów z białkami lokalizującymi mRNA, jest powszechnym zjawiskiem ważnym dla prawidłowego sortowania białek do ich ostatecznego miejsca przeznaczenia oraz dla precyzyjnego dostrojenia ekspresji genów do lokalnych wymagań regionu subkomórkowego19,20.
Korzystając z opisanego tutaj testu, ponownie przyjrzeliśmy się pytaniu, czy mRNA, które kodują białka wydzielnicze, mogą być utrzymywane na ER w obecności lu...

U eukariontów, mRNA kodujące wydzielane i błonowe białka mogą być kierowane do ER kotranslacyjnie przez cząsteczkę rozpoznającą sygnał1,2 i mogą być utrzymywane na ER poprzez bezpośrednie interakcje między rybosomami i translokonami podczas translacji3,4. Jednak to, czy mRNA mogą być celowane i utrzymywane na ER niezależnie od rybosomów lub translacji, było do niedawna niejasne. Wcześniejsze badania miały na celu ustalenie, czy istnieje niezależny od translacji związek mRNA z ER przy użyciu technik frakcjonowania komórkowego. Ponieważ trudne warunki chemiczne były wymagane do oddzielenia rybosomów od pęcherzyków pochodzących z ER, co może zakłócić potencjalnie delikatne asocjację mRNA-ER, badania te były niejednoznaczne, dostarczając dowodów na5-8 i przeciwko9,10 niezależnemu od rybosomii zakotwiczeniu mRNA w ER.
Aby obejść te problemy, opracowaliśmy protokół do izolowania i obrazowania mRNA związanych z ER. Procedura ta obejmuje łagodny zabieg ekstrakcji, który skutecznie usuwa całą zawartość cytoplazmatyczną komórki (w tym mRNA niezwiązane z ER), zachowując jednocześnie morfologię ER i wszystkie powiązane z nią cząsteczki. Korzystając z tego protokołu, wykazaliśmy, że podzbiór mRNA jest ukierunkowany, a następnie utrzymywany na ER niezależnie od rybosomów lub translacji11.

wizualizacja mrna zlokalizowanych w retikulum endoplazmatycznym w komórkach ssaków

Visualization of Endoplasmic Reticulum Localized mRNAs in Mammalian Cells

U eukariontów większość informacyjnych RNA (mRNA), które kodują wydzielane i błonowe białka, jest zlokalizowana na powierzchni retikulum endoplazmatycznego (ER). Jednak wizualizacja tych mRNA może być wyzwaniem. Jest to szczególnie ważne, gdy tylko ułamek mRNA jest związany z ER, a ich dystrybucja do tej organelli jest utrudniona przez nieukierunkowane (tj. "wolne") transkrypty. W celu monitorowania mRNA związanych z ER opracowaliśmy metodę, w której komórki są traktowane krótką ekspozycją na roztwór do ekstrakcji digitoniny, który selektywnie przenika przez błonę plazmatyczną, a tym samym usuwa zawartość cytoplazmatyczną, zachowując jednocześnie integralność ER. Gdy ta metoda jest połączona z fluorescencyjną hybrydyzacją in situ (FISH), można wyraźnie uwidocznić mRNA związane z ER za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Korzystając z tego protokołu, można ocenić stopień asocjacji ER dla masowych transkryptów poli(A) lub specyficznych mRNA, a nawet określić ilościowo. W tym procesie można użyć tego testu do zbadania natury oddziaływań mRNA-ER.

Aby określić procent mRNA związanego z ER, komórki COS-7, które zostały transfektowane plazmidami zawierającymi fosfatazę alkaliczną łożyska (ALPP) lub cytochrom P450-8B1 (CYP8B1), poddano albo ekstrakcji digitoniną, a następnie fiksacji, albo bezpośredniej fiksacji (patrz Rysunek 1, porównaj „Unextracted Ctrl” z „Extracted Ctrl”). Ilościowo określono fluorescencję pozajądrową w obu próbkach i obliczono frakcję mRNA związanego z ER (Rysunek 2). Nasze d...

Tutaj opisujemy metodę wizualizacji mRNA związanych z retikulum endoplazmatycznym w komórkach hodowli tkanek ssaków. Technika ta polega na selektywnej przepuszczalności błony plazmatycznej digitoniną w celu usunięcia zawartości cytoplazmatycznej, a następnie fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ w celu wykrycia masowych mRNA poli(A) lub specyficznych transkryptów.

Wizualizacja mRNA zlokalizowanych w retikulum endoplazmatycznym w komórkach ssaków

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum ...

Celem tej procedury jest wizualizacja informacyjnego RNA, który jest związany z retikulum endoplazmatycznym lub er. Osiąga się to poprzez uprzednie posiewanie komórek hodowli tkankowych ssaków na szkiełkach nakrywkowych. Drugim etapem procedury jest potraktowanie komórek buforem ekstrakcyjnym w celu usunięcia cytoplazmatycznego mRNA niezwiązanego z er.Kolejnymi krokami są szybkie utrwalenie komórek i wybarwienie mRNA poprzez fluorescencyjną hybrydyzację in situ. Ostatnim krokiem jest zobrazowanie, a następnie ilościowe określenie ilości fluorescencji związanej z er. Ostatecznie wyniki mogą pokazać, w jaki sposób mRNA są związane z powierzchnią tej organelli w różnych warunkach.Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania biologiczne komórki, takie jak to, czy mRNA kodujące białka wydzielnicze mogą być utrzymywane na powierzchni ER, niezależnie od rybosomów lub syntezy białek. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ obejmuje kilka skomplikowanych etapów manipulacji komórkowej. Wysiewanie komórek hodowli tkankowej na szkiełkach nakrywkowych traktowanych kwasem przez co najmniej jeden dzień przed eksperymentem kosztuje siedem, a ze względu na OS komórki są odpowiednim wyborem, ponieważ mają wysoką produkcję białek i dobrze zdefiniowane ER.Jeśli badany jest egzogenny Mr NA, należy przetransfekować komórki jeden dzień po wysiewie, a następnie inkubować komórki przez dodatkowe 18 godzin, aby umożliwić MR. Wyrażenie NA. W dniu eksperymentu. Aby osiągnąć wysoką wydajność ekstrakcji, komórki nie powinny przekraczać 80% płynności CO na szkiełku nakrywkowym, aby wykryć, czy mRNA oddziałują z ER niezależnie od translacji, komórki mogą być traktowane środkami, które zakłócają interakcję między rybosomami a mRNA przy tych czynnikach lub kontrolują pożywki do komórek 30 minut przed ekstrakcją.W tym przypadku stosuje się inhibitory translacji, czystą Mycynę i Homo Harrington in lub HHT. Rozpocznij od podgrzania świeżo przygotowanego roztworu ekstrakcyjnego zawierającego toninę dig i bufor roboczy jednego XCHO do 37 stopni Celsjusza. Ustaw blok grzewczy na 40 stopni Celsjusza i włóż odwrócony metalowy blok, aby utworzyć płaską powierzchnię roboczą.Zwilż metalowy blok wodą, a następnie pokryj go świeżym kawałkiem paraformy i wygładź wszelkie pęcherzyki za pomocą rękawiczek bez RNA i niestrzępiących się chusteczek. Następnie, dla każdej pary szkiełek nakrywkowych, przygotuj płytkę z sześcioma dołkami do mycia i mocowania komórek do czterech dołków. Dodaj dwa mililitry podgrzanego buforu CHO do dwóch ostatnich studzienek.Dodać dwa mililitry roztworu utrwalającego. Następnie przechowuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aż będzie potrzebna. Na bloku grzewczym umieść 100 mikrolitrów kropli roztworu ekstrakcyjnego na każdy szkiełko nakrywkowe komórek, które mają być przetworzone.Teraz za pomocą kleszczy jubilerskich podnieś szkiełko nakrywkowe pokryte komórkami i zanurz je w pierwszym i drugim dołku zawierającym bufor CHO. To zmywa podłoże wzrostowe. Następnie szybko zetrzyj nadmiar bufora z tylnej strony szkiełka nakrywkowego.I na krótko umieść komórkę szkiełka nakrywkowego stroną do dołu na roztworze ekstrakcyjnym. Po 10 sekundach przenieś stronę z komórką szkiełka nakrywkowego do bufora utrwalającego, gdzie powinna pozostać przez co najmniej 15 minut. Etap ekstrakcji komórek jest niezbędny do usunięcia całego mRNA z tworzywa sztucznego cyop, które nie jest związane z ER.Ponadto należy przygotować kontrolny szkiełko nakrywkowe, w którym komórki są mocowane bez ekstrakcji. Krok po fiksacji. Umyj te niewyekstrahowane komórki kontrolne dwukrotnie PBS, a następnie przepuść do PBS i TRITTON X 100.Chociaż nie jest to wymagane, wyekstrahowane komórki należy również przemyć tym samym roztworem PBS i Triton, aby zmniejszyć fluorescencję tła po przesiąknięciu komórek. Umyj szkiełka dwukrotnie za pomocą PBS, aby usunąć utrwalacz i detergent. Następnie umyj szkiełka dwukrotnie 60% fide w jednorazowym buforze cytrynianu sodu lub SSC.Jeśli jednak do barwienia wszystkich komórek zostanie użyta sonda rybna oligo DT, poli mRNA obniży poziom fide do 25%Następnie przygotuj bufor hybrydyzacyjny z sondą rybną. Rozcieńczyć sondę ryb podstawowych do 0,2 mikromola w tym samym stężeniu fide w buforze hybrydyzacyjnym. Teraz przygotuj komorę do barwienia.Napełnij dno 150-milimetrowej szalki Petriego wodą. Następnie unieś kawałek paraformu na wodzie i odwróć naczynie do góry nogami. Folia para będzie przylegać do dna naczynia w miarę ucieczki wody.Jeśli są jakieś pęcherzyki powietrza, usuń je rękawiczkami i niestrzępiącymi się chusteczkami dla każdego szkiełka nakrywkowego, odpipetuj 100 mikrolitrów roztworu hybrydyzacyjnego zawierającego rybę Sondę na folię para. Teraz umieść szkiełko nakrywkowe stroną z komórką do dołu na roztworze. Na koniec inkubuj komorę przez pięć do 24 godzin w ciepłej, wilgotnej komorze.Zanim skończy się czas barwienia ryb, przygotuj obszar mycia wolny od RNA, bardziej wyrównaj płaską powierzchnię wodą i przykryj ją paskami param. Usuń wszelkie pęcherzyki powietrza za pomocą rękawiczek i chusteczek higienicznych. Po zakończeniu barwienia przenieś komorę do obszaru roboczego dla każdego szkiełka nakrywkowego Odpipetuj jeden mililitr buforu do płukania na obszar mycia.Folia para, aby przenieść szkiełka nakrywkowe: Najpierw odpipetować pół mililitra buforu do płukania ryb w pobliżu krawędzi każdego szkiełka nakrywkowego. Ciecz zostanie wciągnięta pod szkiełko nakrywkowe przez działanie kapilarne. Następnie za pomocą kleszczy wyjmij szkiełka nakrywkowe z komory i umieść je na kroplach buforu do mycia.I poczekaj pięć minut. Powtórz tę technikę prania jeszcze trzy razy. Używając świeżych jednomililitrowych kropli buforu do mycia na obszarze mycia.W międzyczasie wyczyść szkiełka 70% etanolem i wysusz je niestrzępiącymi się chusteczkami. Następnie na każde szkiełko nakrywkowe nałóż 25 mikrolitrów roztworu montażowego DPI na szkiełko Za pomocą kleszczyków podnieś szkiełko nakrywkowe i osusz jego tył niestrzępiącą się chusteczką, aby usunąć nadmiar buforu do mycia. Następnie przenieś stronę komórki szkiełka nakrywkowego skierowaną w dół na kroplę roztworu montażowego.Gotowe preparaty można przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza do momentu zobrazowania kosztów. Siedem komórek, które zostały transfekowane plazmidami zawierającymi fosfatazę alkaliczną łożyska lub cytochrom P 4, 58 B, jeden, ekstrahowano toniną, a następnie utrwalono lub bezpośrednio utrwalono, aby określić procent tych mRNA, które są związane z ER. Fluorescencję niejądrową określono ilościowo w obu próbkach, a dla obu mRNA obliczono frakcję mRNA związanego z ER.Około 60% frakcji cytoplazmatycznej było związane z ER w celu monitorowania związku ER tych transkryptów. Po dysocjacji rybosomów transfekowanych kosztach siedem komórek potraktowano pożywką kontrolną, pur MYCIN lub HHT, a następnie wyekstrahowano toninę i utrwalono mRNA. Barwienie wykazało, że mRNA A LPP, ale nie CYP eight P one, pozostało związane z ER po rozerwaniu rybosomów.Kwantyfikacja mRNA potwierdziła tę obserwację i co ważne, wykazała, że poziom jądrowego mRNA był spójny we wszystkich próbkach. Dane te ujawniają, że podzbiór mRNA ukierunkowanych na ER, takich jak transkrypt A LPP, utrzymuje się na powierzchni ER po rozpadzie rybosomów. Korzystając z tego protokołu, możemy zacząć badać, w jaki sposób różne mRNA lokalizują się w różnych przedziałach subkomórkowych, takich jak siatka endoplazmatyczna w połączeniu z innymi testami stosowanymi do analizy eksportu jądrowego mRNA.Procedura ta może być wykorzystana do zbadania początkowego kierowania nowo zsyntetyzowanych mRNA na powierzchnię er.

visualization-endoplasmic-reticulum-localized-mrnas-mammalian

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Wizualizacja zlokalizowanego w retikulum endoplazmatycznym mRNA w komórkach ssaków

Wizualizacja transportu RNA in vivo jest realizowana poprzez mikroiniekcję fluorescencyjnie znakowanych transkryptów RNA do oocytów Xenopus, a następnie za pomocą mikroskopii konfokalnej.

Wizualizacja lokalizacji RNA w oocytach Xenopus

In situ frakcjonowanie subkomórkowe komórek ssaków na szkiełkach podstawowych do mikroskopu umożliwia wizualizację lokalizacji białek.

In situ frakcjonowanie subkomórkowe adherentnych i nieadherentnych komórek ssaków

Opisujemy metody obrazowania, których używamy do badania dystrybucji i ruchliwości transfekowanych białek fluorescencyjnych rezydujących w retikulum endoplazmatycznym (ER) za pomocą konfokalnego obrazowania żywych komórek. Analizujemy również ultrastrukturalnie wpływ ich ekspresji na architekturę tego przedziału subkomórkowego.

Wizualizacja subdomen retikulum endoplazmatycznego w hodowanych komórkach

Wiele mRNA kodujących białka mitochondrialne jest związanych z zewnętrzną błoną mitochondriów. Opisujemy procedurę frakcjonowania subkomórkowego mającą na celu wyizolowanie mitochondriów drożdży wraz z powiązanymi z nimi mRNA i rybosomami. Protokół ten można zastosować do komórek hodowanych w różnych warunkach w celu ujawnienia mechanizmów lokalizacji mRNA i zlokalizowanej translacji w pobliżu mitochondriów.

Izolacja mRNA związanych z mitochondriami drożdży w celu zbadania mechanizmów zlokalizowanej translacji

Tutaj opisujemy procedurę wizualizacji i ilościowego określania z dużą czułością endogennych interakcji między retikulum endoplazmatycznym a mitochondriami w komórkach stałych. Protokół zawiera zoptymalizowany test ligacji zbliżeniowej in situ ukierunkowany na receptor 1,4,5-trifosforanu inozytolu / białko regulowane glukozą 75 / zależny od napięcia kanał anionowy / kompleks cyklofiliny D na granicy faz błony związanej z mitochondriami.

Badanie interakcji retikulum endoplazmatycznego i mitochondriów za pomocą testu ligacji zbliżeniowej in situ w komórkach utrwalonych

Tutaj prezentujemy protokół wielokolorowej lokalizacji pojedynczych białek błonowych w organellach żywych komórek. Do przyłączania fluoroforów stosuje się białka samoznakujące. Białka, znajdujące się w różnych przedziałach błonowych tych samych organelli, mogą być lokalizowane z precyzją ~18 nm.

Wielobarwna mikroskopia lokalizacyjna białek jednobłonowych w organellach żywych komórek ssaków

Tutaj prezentujemy protokół do wizualizacji, wykrywania, analizy i śledzenia endogennego transportu mRNA w żywej komorze jajowej Drosophila melanogaster za pomocą latarni molekularnych, mikroskopii konfokalnej z wirującym dyskiem i oprogramowania do analizy open-source.

Wizualizacja i śledzenie endogennych mRNA w żywych komorach jajowych Drosophila melanogaster

Przedstawiamy protokół do badania rozkładu mitochondriów i retikulum endoplazmatycznego w całych komórkach po modyfikacji genetycznej za pomocą korelacyjnej mikroskopii elektronowej światła i objętości, w tym barwienia peroksydazą askorbinianową 2 i peroksydazy chrzanowej, seryjnego cięcia komórek z i bez genu docelowego w tej samej sekcji oraz seryjnego obrazowania za pomocą mikroskopii elektronowej.

Obrazowanie mitochondriów i retikulum endoplazmatycznego za pomocą korelacyjnej mikroskopii świetlnej i objętościowej

Potrzeba nowych podejść do badania miejsc kontaktu z błoną (MCS) wzrosła ze względu na rosnące zainteresowanie badaniem tych struktur komórkowych i ich składników. W tym miejscu przedstawiamy protokół, który integruje wcześniej dostępne technologie mikroskopowe w celu identyfikacji i ilościowego określenia kompleksów białkowych wewnątrz organelli i między organellami, które znajdują się w MCS.

Wizualizacja i kwantyfikacja endogennych interakcji białek wewnątrz organelli w miejscach kontaktu ER-mitochondria za pomocą testów ligacji zbliżeniowej

W momencie gdy komórki osiągają konfluencję, należy je poddać subkulturze lub pasażowaniu. Niniejszy film zaprezentuje procedurę subkultury komórek adherentnych oraz zawiesinowych.

Trypsynizacja i pasażowanie komórek ssaczych

Poznaj metodę wizualizacji mRNA związanego z retikulum endoplazmatycznym w komórkach ssaków. Technika obejmuje selektywną permeabilizację błony komórkowej oraz hybrydyzację in situ.

Wizualizacja mRNA zlokalizowanych w retikulum endoplazmatycznym w komórkach ssaków

Przeglądaj więcej filmów