Analiza odcisków palców u nóg tworzenia kompleksu inicjacji translacji na mRNA ssaków

Ogólnym celem tej analizy odcisków palców u nóg jest obserwacja tworzenia się kompleksu inicjacji translacji na mRNA ssaków. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie translacji mRNA, takie jak inicjacja translacji za pośrednictwem IRES. Główną zaletą tej techniki jest to, że można przeprowadzić szczegółową analizę tworzenia się kompleksu inicjującego translację na określonym mRNA.

Zbierz reakcje transkrypcyjne w celu transkrypcji RNA z matryc DNA amplifikowanych PCR, kodując XIAP IRES RNA lub jego mutanty. Następnie dodaj dwie jednostki DNazy wolnej od RNaz, aby usunąć matrycę DNA do każdej 20 mikrolitrowej reakcji RNA. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut.

Następnie rozcieńczyć RNA potraktowane DNazą wodą wolną od nukleaz do końcowej objętości 110 mikrolitrów. Następnie dodaj 110 mikrolitrów kwaśnego fenolu, aby rozpocząć oczyszczanie RNA. Wirować próbki przez pięć sekund i odwirowywać przy 20 000 x g przez trzy minuty w temperaturze pokojowej.

Bardzo ważne jest, aby rozcieńczyć RNA lub CDNA przed ekstrakcją fenolu. Jeśli objętość jest zbyt mała, trudno będzie fizycznie odzyskać fazę wodną, a ostateczny plon będzie niski. Następnie ostrożnie przenieś 100 mikrolitrów fazy wodnej zawierającej RNA do nowej probówki do mikrowirówki.

Dodać 10 mikrolitrów 3 M octanu sodu o pH 5,5 i wymieszać próbki. Następnie dodaj trzy objętości 100% etanolu, aby wytrącić RNA i wirować próbki przez pięć sekund. Inkubować przez noc w temperaturze 20 stopni Celsjusza.

Następnego dnia odwirować próbki o masie 20 000 x g przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i odrzucić supernatant. Następnie umyj granulat 500 mikrolitrami lodowatego 70% etanolu i powtórz wirowanie. Ostrożnie zassać jak najwięcej supernatantu bez usuwania osadu.

Następnie suszyć granulki na powietrzu przez pięć do 10 minut. Zawiesić osad w wodzie wolnej od nukleaz do końcowego stężenia 0,5 mikrograma na mikrolitr. Aby rozpocząć test odciskania palca u nogi, dodaj 15 mikrolitrów lizatu retikulocytów królika niepoddanego działaniu nukleazy do każdej 1,5 mililitrowej probówki mikrowirówkowej, która reprezentuje RNA XIAP IRES typu dzikiego i jego mutanty.

Dodaj inhibitor RNazy, ATP i GMP-PNP do każdej probówki. Inkubować w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez pięć minut. Następnie dodaj jeden mikrolitr odpowiedniego RNA do każdej z probówek i inkubuj w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez dodatkowe pięć minut.

W okresie inkubacji dodać DTT i spermidynę do buforu do odcisku palca. Następnie dodaj 22 mikrolitry buforu do odcisków palców u nóg do każdej z probówek i inkubuj w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez trzy minuty. Następnie dodaj 0,5 mikrolitra podkładu do odcisków palców oznaczonych barwnikiem IR i inkubuj reakcję na lodzie przez 10 minut.

Następnie dodaj dwa mikrolitry dNTP, dwa mikrolitry octanu magnezu i jeden mikrolitr odwrotnej transkryptazy wirusa mieoloblastozy ptaków. Doprowadź końcową objętość do 50 mikrolitrów za pomocą bufora do odcisków palców. Następnie pozwól na przedłużenie podkładu przez 45 minut w temperaturze 30 stopni Celsjusza.

Bardzo ważne jest również dodanie octanu magnezu do reakcji odcisku palca, bez której odwrotna transkryptaza nie będzie działać optymalnie. Następnie dodaj 200 mikrolitrów wody wolnej od nukleaz. Dodaj 250 mikrolitrów 25:24:1 fenol:chloroform:alkohol izoamylowy, pH 8,0, aby rozpocząć oczyszczanie cDNA.

Po wirowaniu próbek przez pięć sekund odwirować próbki w temperaturze 20 000 x g w temperaturze pokojowej przez trzy minuty. Następnie ostrożnie przenieś fazę wodną zawierającą DNA do nowej probówki do mikrowirówki. Następnie dodaj trzy objętości 100% etanolu, aby wytrącić DNA i wirować przez pięć sekund.

Inkubować przez noc w temperaturze 20 stopni Celsjusza. Następnego dnia odwirować probówki o stężeniu 20 000 x g przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i wyrzucić supernatant. Następnie umyj osad DNA 500 mikrolitrami lodowatego 70% etanolu i odwiruj przy 20 000 x g przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Odessać jak najwięcej supernatantu, uważając, aby nie usunąć osadu. Następnie suszyć granulki na powietrzu przez pięć do 10 minut. Rozpuść osad DNA w sześciu mikrolitrach wody wolnej od nukleaz

Następnie dodaj trzy mikrolitry barwnika ładującego formamid. Użyj zestawu do sekwencjonowania, aby przygotować drabinkę sekwencjonowania dideoksynukleotydów ze starterem do odciskania palców u nóg i konstruktem DNA kodującym XIAP IRES RNA. Następnie wymieszaj sześć mikrolitrów każdej reakcji sekwencjonowania z trzema mikrolitrami barwnika ładującego formamid.

Po oczyszczeniu i zmontowaniu płytek wlej żel i włóż grzebień. Po polimeryzacji żelu zmontuj aparat sekwencjonujący i napełnij zbiorniki 1x TBE. Następnie uruchom pod napięciem 1500 woltów przez 15 minut, aż do osiągnięcia temperatury 55 stopni Celsjusza.

Podgrzewać wszystkie próbki z barwnikiem formamidowym do 85 stopni Celsjusza przez pięć minut. Następnie załaduj jeden mikrolitr każdej próbki na 6% żel do sekwencjonowania poliakryloamidu i uruchom żel pod napięciem 1500 woltów przez osiem godzin. Na koniec odczytaj pasma w czasie rzeczywistym za pomocą obrazowania fluorescencyjnego.

Metoda ta pokazuje, że potwierdzenie RNA ma kluczowe znaczenie dla tworzenia kompleksu inicjującego translację. Odwrotna transkrypcja kompleksu rybosomów mRNA XIAP daje typowe odciski palców od 17 do 19 nukleotydów poniżej AUG. Mutant 5'PPT wykazuje upośledzone tworzenie odcisków palców.

Jednak po transkrypcji za pomocą 5'cap dochodzi do powstania kompleksu inicjacyjnego. Podobnie, mutant 3'PPT również wykazuje upośledzone tworzenie odcisków palców. Jednak transkrypcja z 5'cap prowadzi do tworzenia kompleksu inicjacyjnego.

Podwójny mutant PPT zawierający zarówno mutacje 5'PPT, jak i 3'PPT jest w stanie utworzyć kompleks inicjacyjny bez 5'cap. Tworzenie odcisków palców u nóg jest silnie upośledzone dla mutanta kodonu start przy braku RRL i GMP-PNP oraz ogona Poly A. Produkty CDNA są porównywane z drabinką sekwencjonowania dideoksynukleotydów.

Ludzka beta globina, czyli mRNA HBB, nie wykazuje odcisku palca u nogi przy braku 5'cap. Jednak kompleks inicjacyjny powstaje na zamkniętym 5'UTR HBB, dając odciski palców od 16 do 18 nukleotydów poniżej AUG. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu trzech dni, w tym przygotowanie matryc transkrypcyjnych in vitro i RNA, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.

Zgodnie z tą procedurą można przeprowadzić inne metody, takie jak sondowanie strukturalne, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak drugorzędowa struktura typu dzikiego lub zmutowanych wariantów IRES. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się translacją mRNA do zbadania translacji za pośrednictwem IRES in vitro. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykonywać odciski palców u stóp mRNA ssaków i analizować tworzenie kompleksów inicjujących translację.

Nie zapominaj, że kwas-fenol, fenol:chloroform:alkohol izoamylowy i akryloamid mogą być bardzo niebezpieczne. Podczas stosowania tych odczynników należy nosić odpowiednie środki ochrony osobistej.