Name: Analiza odcisków palców u nóg tworzenia kompleksu inicjacji translacji na mRNA ssaków (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 37 s
Description: Poznaj analizę odcisków palców u nóg tworzenia kompleksu inicjacji translacji na mRNA ssaków. Ta technika pozwala szczegółowo badać mechanizmy translacji zależne od czapki i IRES.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została sfinansowana przez Radę Nauk Przyrodniczych i Inżynierii Kanady-Discovery Grant (RGPIN-2017-05463), Kanadyjską Fundację na rzecz Innowacji-John R. Evans Leaders Fund (35017), Campus Alberta Innovates Program oraz Ministerstwo Rozwoju Gospodarczego i Handlu Alberty.

UWAGA: RNA jest bardzo podatne na degradację przez rybonukleazy (RNazy). Podejmij standardowe środki ostrożności, aby utrzymać RNA w stanie nienaruszonym. Często zmieniaj rękawice. Używaj filtrowanych końcówek do pipet, plastikowych naczyń niezawierających nukleaz i chemikaliów wolnych od nukleaz na wszystkich etapach protokołu. Do wszystkich roztworów należy używać wody wolnej od nukleaz lub uzdatnionej pirowęglanem dietylu (DEPC).
1. Przygotowanie roztworów
<ol>
	<li>Przygotuj bufor do odcisków palców: 20 mM Tris-HCl (pH 7,6), 100 mM KOAc, 2,5 mM Mg(OAc)2, 5% (w/v) sacharozy, 2 mM ditiotreitol (DTT) i 0,5 mM spermidyny.
	<ol>
		<li>Przechowywać naziemną telewizję cyfrową i spermidynę w jednorazowych podwielokrotnościach w temperaturze -20 °C, aby uniknąć powtarzających się cykli zamrażania i rozmrażania. 
		UWAGA: DTT i spermidynę należy dodać do bufora do odcisków palców u nóg bezpośrednio przed użyciem. Roztwór pozbawiony naziemnej telewizji cyfrowej i spermidyny można przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować podwielokrotności 85 mM imidodifosforanu 5'-guanylilu (GMP-PNP) i 91 mM trifosforanu adenozyny (ATP). Przechowywać podwielokrotności w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Przygotuj 450 ml mieszanki żelu mocznikowego 6% poliakryloamid i 7M: 67,5 ml 40% akryloamidu: bis-akryloamidu (19:1), 189 g mocznika, 112,5 ml 5x TBE (tris/boran/kwas tylenodiaminotetraoctowy (EDTA)) i 120 ml wody. Rozpuścić mocznik przez ogrzanie w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C lub na gorącej płycie, mieszając. Przefiltrować roztwór (np. filtr próżniowy nitrocelulozy 0,2 μm). 
	UWAGA: Roztwór można przechowywać w temperaturze 4 °C przez co najmniej jeden miesiąc. 
	Uwaga: Akrylamid monomeryczny jest neurotoksyną, która może być wchłaniana przez skórę. Zachowaj szczególną ostrożność, aby uniknąć kontaktu ze skórą (tj. noś rękawice, fartuch laboratoryjny i okulary ochronne). Z poliakrylamidem należy również obchodzić się ostrożnie, ponieważ polimeryzacja może nie przebiegać do 100% zakończenia.</li>
	<li>Przygotuj barwnik obciążający formamid: 95% formamidu, 18 mM EDTA, 0,025% (w/v) dodecylosiarczan sodu (SDS), 0,025% (w/v) błękit bromofenolowy, 0,025% (w/v) cyjanol ksylenowy. Przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Rozpuścić 1 nmol startera (5' CTCGATATGTGCATCTGTA; 5' na końcu znakowanym IRDye 800) w 100 μl wody do uzyskania stężenia roboczego 10 pmol/μL. Przechowywać w temperaturze -20 °C w jednorazowych porcjach (około 10 μl), chronić przed światłem.</li>
</ol>
2. Przygotowanie mRNA
<ol>
	<li>Amplifikacja matryc DNA do syntezy mRNA w drodze reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) z odpowiednich matryc (tj. genomowego DNA lub plazmidowego DNA, w zależności od przypadku). Użyć polimerazy DNA o wysokiej wierności zgodnie z instrukcjami producenta, w następujących warunkach reakcji (35 cykli): stopienie, 98 °C, 10 s; wyżarzanie, 53 °C, 20 s; rozszerzać, 72 °C, 30 s. 
	UWAGA: Starter do przodu (5' AAGCTTAATACGACTATAG) zawiera sekwencję promotora T7, aby umożliwić transkrypcję RNA; odwrócony starter (5' T51GAATTCGGATCCGACCGTGG) zawiera 51 reszt tyminy, aby zapewnić ogon poli-A dla transkrybowanego RNA. Należy pamiętać, że RNA może być również transkrybowane in vitro z plazmidowego DNA.</li>
	<li>Użyj odpowiedniego zestawu do transkrypcji in vitro RNA zawierającego IRES lub RNA z czapeczką z matrycy DNA. Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta. Przygotować próbkę RNA w standardowych objętościach reakcyjnych 20 μl. Traktować nowo zsyntetyzowany RNA 2 jednostkami DNazy wolnej od RNaz przez 30 minut w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Rozcieńczyć RNA poddane działaniu DNazy do 110 μl wodą bez nukleaz, dodać 110 μl kwaśnego fenolu, wirować 5 s i wirować przez 3 minuty przy 20 000 x g w temperaturze pokojowej. Usunąć 100 μl fazy wodnej do nowej probówki do mikrofuge o pojemności 1,5 ml, dodać 10 μl 3 M octanu sodu i przemieszać 2 s. Dodać 3 objętości 100% etanolu, wirować 5 s i wytrącić RNA w temperaturze -20 °C przez noc.</li>
	<li>Wirować przy >20 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant. Przemyć granulat 500 μl lodowatego etanolu o stężeniu 70% (v/v) i powtórzyć wirowanie. Zassać jak najwięcej supernatantu i suszyć osad na powietrzu przez 5 - 10 minut. Uważaj, aby nie usunąć granulki.</li>
	<li>Zawiesić RNA w odpowiedniej objętości wody wolnej od nukleaz, aby uzyskać stężenie robocze 0,5 μg/μl. Można go przechowywać w temperaturze -80 °C lub natychmiast zużyć.</li>
</ol>
3. Reakcja odcisku palca u nogi
<ol>
	<li>Wymieszaj 15 μl lizatu retikulocytów królika (RRL, nie traktowany nukleazą), 1 μl (40 jednostek) inhibitora RNazy, 1 μl 91 mM ATP (1,82 mM końcowy) i 1 μl 85 mM GMP-PNP (1,7 mM końcowy) w probówce do mikrofuge o pojemności 1,5 ml. Inkubować w temperaturze 30 °C przez 5 min. 
	UWAGA: RRL powinien być podawany do jednorazowego użytku, aby uniknąć powtarzającego się zamrażania i rozmrażania. Krytyczna kontrola to reakcja, w której brakuje RRL, w celu wyjaśnienia naturalnych przerw w odwrotnej transkrypcji spowodowanych drugorzędową strukturą RNA. Dodaj bufor do odciskania palców, aby zastąpić RRL dla tej kontroli. </li>
	<li>Dodać 0,5 μg (1 μl) RNA i inkubować w temperaturze 30 °C przez 5 minut.</li>
	<li>Dodać 22 μl buforu do odcisków palców u nóg i inkubować w temperaturze 30 °C przez 3 minuty.</li>
	<li>Dodać 0,5 μl (5 pmol) startera znakowanego IRDye i inkubować na lodzie przez 10 minut.</li>
	<li>Dodać 2 μl 25 mM dNTP (końcowe stężenie: 1 mM każdy), 2 μL 100 mM Mg(OAc)2, 1 μl odwrotnej transkryptazy wirusa mieloblastozy ptaków (AMV-RT) i 3,5 μl buforu do odcisków palców u stóp. Ostateczna objętość to 50 μL.</li>
	<li>Inkubować reakcję w temperaturze 30 °C przez 45 minut.</li>
	<li>Dodać 200 μl wody wolnej od nukleaz i natychmiast ekstrahować 250 μl alkoholu fenolo-chloroformowego o proporcji 25:24:1 (pH około 8,0). Wirować 5 s i wirować przy 20 000 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej. Usunąć fazę wodną do nowej probówki do mikrofuge o pojemności 1,5 ml, dodać 3 objętości 100% etanolu, wirować 5 s i wytrącać w temperaturze -20 °C przez noc.</li>
	<li>Wirować przy >20 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant. Przemyj osad DNA 500 μl lodowatego etanolu o stężeniu 70% (v/v). Wirować przy >20 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Odessać jak najwięcej supernatantu i suszyć granulki na powietrzu przez 5 - 10 minut. Uważaj, aby nie usunąć granulki.</li>
	<li>Rozpuść osad w 6 μl wody wolnej od nukleaz i dodaj 3 μl barwnika ładującego formamid.</li>
</ol>
4. Sekwencjonowanie reakcji
<ol>
	<li>Użyj matrycy DNA z 2.1 i startera znakowanego IRDye z kroku 3.4 dla standardowych reakcji sekwencjonowania, używając dideoksynukleotydów (ddNTP) jako terminatorów łańcucha. Użyj odpowiedniego zestawu do sekwencjonowania DNA i postępuj zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Zmieszać 6 μl każdej reakcji sekwencjonowania z 3 μl barwnika ładującego formamid.</li>
</ol>
5. Przygotowanie żelu sekwencjonującego i elektroforeza
UWAGA: Ten protokół wykorzystuje żel fluorescencyjny i żel o wymiarach 21 cm x 23 cm x 0,2 mm, ale może być dostosowany do innych sekwenserów lub rozmiarów żelu, jeśli jest to wymagane.
<ol>
	<li>Dokładnie wyczyść przekładki 0,2 mm oraz krótkie (23 × 25 cm) i długie (30 × 25 cm) szklane płytki 100% etanolem. Suszyć na powietrzu.</li>
	<li>Zmieszać 30 ml 6% mieszanki żelu mocznikowego poliakryloamid-7M z 200 μl 10% (w/v) nadsiarczanu amonu (APS) i 20 μl tetrametyloetylenodiaminy (TEMED). Wlej żel, uważając, aby nie powstały bąbelki, i włóż grzebień żelowy "ząb rekina". Pozostawić żel do polimeryzacji przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Zmontuj aparaturę do sekwencjonowania i napełnij zbiorniki 1x TBE.</li>
	<li>Uruchomić przez 15 minut przy napięciu 1500 V, aż do osiągnięcia optymalnej temperatury 55 °C.</li>
	<li>Podgrzewać próbkę i mieszaninę barwnika ładującego (z etapów 3.9 lub 4.2) do temperatury 85 °C przez 5 minut. Załadować 1 μl na żel sekwencyjny.</li>
	<li>Uruchom żel pod napięciem 1500 V przez 8 godzin. Maszyna będzie odczytywać pasma w czasie rzeczywistym.</li>
	<li>Zdemontuj aparaturę i wyrzuć żel akrylowy oraz działający bufor.</li>
</ol>

<ol><li>Holcik, M., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15803138">Translational control in stress and apoptosis.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).</li>
<li>Lacerda, R., Menezes, J., Romao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((More+than+just+scanning%3A+the+importance+of+cap-independent+mRNA+translation+initiation+for+cellular+stress+response+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">More than just scanning: the importance of cap-independent mRNA translation initiation for cellular stress response and cancer.</a> Cell Mol Life Sci. 74 (9), 1659-1680 (2017).</li>
<li>Sharma, D. K., Bressler, K., Patel, H., Balasingam, N., Thakor, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Eukaryotic+Initiation+Factors+during+Cellular+Stress+and+Cancer+Progression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">Role of Eukaryotic Initiation Factors during Cellular Stress and Cancer Progression.</a> J Nucleic Acids. 2016, 8235121(2016).</li>
<li>Gebauer, F., Hentze, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+translational+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of translational control.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 5 (10), 827-835 (2004).</li>
<li>Anthony, D. D., Merrick, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+40+S+and+80+S+complexes+with+mRNA+as+measured+by+sucrose+density+gradients+and+primer+extension+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Analysis of 40 S and 80 S complexes with mRNA as measured by sucrose density gradients and primer extension inhibition.</a> J Biol Chem. 267 (3), 1554-1562 (1992).</li>
<li>Hartz, D., McPheeters, D. S., Traut, R., Gold, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extension+inhibition+analysis+of+translation+initiation+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Extension inhibition analysis of translation initiation complexes.</a> Methods Enzymol. 164, 419-425 (1988).</li>
<li>Shirokikh, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+ribosome-mRNA+complexes+at+different+translation+stages%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of ribosome-mRNA complexes at different translation stages.</a> Nucleic Acids Res. 38 (3), 15(2010).</li>
<li>Thakor, N., Holcik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IRES-mediated+translation+of+cellular+messenger+RNA+operates+in+eIF2alpha-+independent+manner+during+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">IRES-mediated translation of cellular messenger RNA operates in eIF2alpha- independent manner during stress.</a> Nucleic Acids Res. 40 (2), 541-552 (2012).</li>
<li>Liwak, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+suppressor+PDCD4+represses+internal+ribosome+entry+site-mediated+translation+of+antiapoptotic+proteins+and+is+regulated+by+S6+kinase+2%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Tumor suppressor PDCD4 represses internal ribosome entry site-mediated translation of antiapoptotic proteins and is regulated by S6 kinase 2.</a> Mol Cell Biol. 32 (10), 1818-1829 (2012).</li>
<li>Thakor, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+mRNA+recruits+the+ribosome+via+eIF3-PABP+bridge+to+initiate+internal+translation%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biol%22%5BJournal%5D)">Cellular mRNA recruits the ribosome via eIF3-PABP bridge to initiate internal translation.</a> RNA Biol. , 1-15 (2016).</li>
<li>Thoma, C., Bergamini, G., Galy, B., Hundsdoerfer, P., Hentze, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+IRES-mediated+translation+of+the+c-myc+and+BiP+mRNAs+by+the+poly%28A%29+tail+is+independent+of+intact+eIF4G+and+PABP%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Enhancement of IRES-mediated translation of the c-myc and BiP mRNAs by the poly(A) tail is independent of intact eIF4G and PABP.</a> Mol Cell. 15 (6), 925-935 (2004).</li>
<li>Baird, S. D., Lewis, S. M., Turcotte, M., Holcik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+search+for+structurally+similar+cellular+internal+ribosome+entry+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A search for structurally similar cellular internal ribosome entry sites.</a> Nucleic Acids Res. 35 (14), 4664-4677 (2007).</li>
<li>Merrick, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+that+a+single+GTP+is+used+in+the+formation+of+80+S+initiation+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Evidence that a single GTP is used in the formation of 80 S initiation complexes.</a> J Biol Chem. 254 (10), 3708-3711 (1979).</li>
<li>Arnaud, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+New+34-Kilodalton+Isoform+of+Human+Fibroblast+Growth+Factor+2+Is+Cap+Dependently+Synthesized+by+Using+a+Non-AUG+Start+Codon+and+Behaves+as+a+Survival+Factor%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A New 34-Kilodalton Isoform of Human Fibroblast Growth Factor 2 Is Cap Dependently Synthesized by Using a Non-AUG Start Codon and Behaves as a Survival Factor.</a> Mol Cell Biol. 19 (1), 505-514 (1999).</li>
<li>Dmitriev, S. E., Pisarev, A. V., Rubtsova, M. P., Dunaevsky, Y. E., Shatsky, I. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+48S+translation+preinitiation+complexes+into+80S+initiation+complexes+as+revealed+by+toeprinting%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Conversion of 48S translation preinitiation complexes into 80S initiation complexes as revealed by toeprinting.</a> FEBS Lett. 533 (1-3), 99-104 (2003).</li>
<li>Faye, M. D., Graber, T. E., Holcik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+selective+mRNA+translation+in+mammalian+cells+by+polysome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Assessment of selective mRNA translation in mammalian cells by polysome profiling.</a> J Vis Exp. (92), e52295(2014).</li>
<li>Duncan, C. D. S., Mata, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+cycloheximide+on+the+interpretation+of+ribosome+profiling+experiments+in+Schizosaccharomyces+pombe%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Effects of cycloheximide on the interpretation of ribosome profiling experiments in Schizosaccharomyces pombe.</a> Sci Rep. 7 (1), 10331(2017).</li>
<li>Beck, H. J., Janssen, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+Translation+Initiation+Regulation+Mechanism+in+Escherichia+coli+ptrB+Mediated+by+a+5%27-Terminal+AUG%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Novel Translation Initiation Regulation Mechanism in Escherichia coli ptrB Mediated by a 5'-Terminal AUG.</a> J Bacteriol. 199 (14), (2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnego konfliktu interesów.

Odcisk palca u nogi jest potężną techniką bezpośredniego pomiaru zdolności interesującego RNA do wspierania tworzenia kompleksów inicjujących translację w ściśle kontrolowanych warunkach. Protokół ten opisuje uproszczoną technikę odciskania palców u stóp RNA ssaków. Lizat retikulocytów królika (RRL) jest używany jako wygodne źródło rybosomów, eIF, inicjującego tRNA i czynników transakcyjnych IRES (ITAF). Eksperymentator podaje wybrane przez siebie RNA, a także może uzupełnić reakcję odcisku palca u nogi o określ...

Ponieważ tłumaczenie zużywa najwięcej energii komórkowej, ma sens, że tłumaczenie jest ściśle regulowane1. I odwrotnie, rozregulowanie translacji - i wynikające z tego zmiany w produkcji białek - jest często obserwowane w stanach stresowych i chorobowych, takich jak rak1,2. Główną zaletą kontroli translacyjnej jest szybkość, z jaką komórki mogą zmieniać swoje białko wyjściowe, aby reagować na różne bodźce3. Regulacja translacji stanowi zatem ważny mechanizm, który może wpływać na przeżycie i śmierć komórki1,2,3. Spośród etapów translacji, inicjacja jest najbardziej uregulowana i złożona3. Krótko mówiąc, większość eukariotycznych mRNA zawiera kap o długości 5 stópi 7G, który prawie zawsze jest niezbędny do ich translacji. Inicjacja zależna od czapeczki wymaga eukariotycznych czynników inicjacji eIF4E, eIF4A i eIF4G (kompleks rozpoznawania kapu) do interakcji z końcem 5' mRNA. Kompleks rybosomów preinicjacyjnych 43S, który zawiera tRNA i eIF3 związany z eIF2, jest rekrutowany do końca 5' mRNA poprzez interakcję eIF4G z eIF3. Uważa się, że kompleks preinicjacyjny skanuje mRNA, wspomagany przez eIF4A (helikazę RNA) do momentu zlokalizowania kodonu start (AUG). Następnie tworzy się kompleks inicjacyjny 48S, a tRNA jest dostarczane do miejsca P rybosomu. Wreszcie, podjednostki rybosomów 60S i 40S są łączone, tworząc kompleks inicjacyjny 80S, po którym następuje wydłużenie translacji1,3,4. W przeciwieństwie do tego, wewnętrzne miejsca wejścia rybosomów (IRES) omijają wymóg czapki 5', rekrutując podjednostkę rybosomalną 40S bezpośrednio do kodonu inicjacyjnego3. Fizjologiczne warunki stresu osłabiają globalną translację mRNA ze względu na modyfikacje kluczowych ogólnych czynników inicjacji eukariotycznej (eIF). Jednak niekanoniczne mechanizmy inicjacji translacji pozwalają na selektywną translację niektórych mRNA, które często kodują białka odpowiedzi na stres, a rozregulowanie niekanonicznej inicjacji translacji jest związane ze stanami chorobowymi, takimi jak rak1,2. Dyskretne elementy regulatorowe RNA, takie jak komórkowe IRES, pozwalają na translację takich mRNA2,3.
Szczególnie interesującym aspektem kontroli translacyjnej jest zrozumienie mechanizmów kanonicznej kontra niekanonicznej translacji danego mRNA. Odcisk palca u nogi to technika, która pozwala na szczegółowe badanie mechanistyczne inicjacji translacji określonych RNA in vitro. Ogólnym celem odcisku palca u nogi jest ocena zdolności interesującego RNA do zarodkowania tworzenia kompleksu inicjującego translację z rybosomem w różnych warunkach, w celu określenia, które sekwencje, elementy strukturalne lub czynniki pomocnicze są wymagane do skutecznej inicjacji translacji. Na przykład rekrutacja rybosomów może być utrudniona w przypadku braku czapeczki 5', ale stymulowana przez obecność IRES.
Zasada tej techniki polega na transkrypcji in vitro interesującego RNA, inkubacji go w obecności ekstraktów komórkowych zawierających składniki translacji (lub oczyszczonych składników), aby umożliwić tworzenie się kompleksów inicjacyjnych i odwrotną transkrypcję RNA za pomocą określonego startera. Stabilne kompleksy RNA-rybosom spowodują zatrzymanie odwrotnej transkrypcji na krawędzi 3' rybosomu - tak zwany 'odcisk palca'5,6,7.
W tym protokole, podjednostki rybosomalne, eIFs, tRNA i czynniki transaktywne IRES (ITAFs) są wygodnie dostarczane przez lizat retikulocytów królika (RRL). Kolejną zaletą tego protokołu jest użycie znakowanego fluorescencyjnie startera i fluorescencyjnego żelu obrazującego zamiast startera znakowanego radioaktywnie. Eliminuje to dodatkowe czynności, w tym znakowanie radioaktywnie podkładu, a także suszenie żelu i wystawianie go na działanie intensyfikującego ekranu. Pasma fluorescencyjne są rejestrowane w czasie rzeczywistym, podczas pracy żelu, co pozwala na uzyskanie większej rozdzielczości. Jako przykład użyto tutaj nieograniczonego inhibitora białka apoptozy sprzężonego z chromosomem X (XIAP) IRES RNA, chociaż za pomocą tej techniki można również analizować mRNA z ograniczonym rdzeniem8.
W przeciwieństwie do analizy zachodniej, która mierzy końcowy wynik procesu translacji w lizatach komórkowych, odcisk palca u nogi jest podejściem in vitro do pomiaru tworzenia kompleksu inicjującego translację na RNA. To redukcjonistyczne podejście pozwala na bardzo szczegółowe badanie substratów lub czynników, które regulują inicjację translacji (np. mRNA z czapeczką lub bez niej, struktura IRES, obecność lub brak ogona poli-A, dostarczanie określonych czynników białkowych itp.). W związku z tym odcisk palca u nogi może być wykorzystany do badania różnych trybów translacji8 lub wpływu struktur mRNA, takich jak IRESes, na syntezę białek9,10.

<table><tbody><tr><td>DEPC (pirowęglan dietylu)</td><td>Sigma</td><td>D5758-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Baza TRIS, Ultrapure</td><td>JT Baker</td><td>4109-01</td><td></td></tr><tr><td>KOAc (octan potasu)</td><td>Bio Basic</td><td>PB0438</td><td></td></tr><tr><td>Mg(OAc)2 (tetrahydrat octanu magnezu)</td><td>Bio Basic</td><td>MB0326</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza, klasa biologii molekularnej</td><td>Calbiochem</td><td>573113-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Spermidyna</td><td>Sigma</td><td>85558</td><td></td></tr><tr><td>GMP-PNP (hydrat soli trisodowej 5&prime;-[&beta,&gamma;-imido]trifosforanu guanozyny) 0,1 M roztwór</td><td>Sigma</td><td>G0635</td><td></td></tr><tr><td>ATP (adenozyno-5&-trifosforan), roztwór 100 mM Sigma</td><td></td><td>A6559</td><td></td></tr><tr><td>19:1 Akrylamid: bis-akrylamid, 40%</td><td>Bio Basic</td><td>A0006</td><td></td></tr><tr><td>Mocznik</td><td>Bio Basic</td><td>UB0148</td><td></td></tr><tr><td>500 ml jednostki filtracyjne do butelek, 0,2 i mikro; m</td><td>Sarstedt</td><td>83.1823.101</td><td></td></tr><tr><td>Formamid</td><td>Sigma</td><td>F9037-100ML</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (sól disodowa, dihydrat)</td><td>Bio Basic</td><td>EB0185</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Bio Basic</td><td>SB0485</td><td></td></tr><tr><td>Błękit bromofenolowy</td><td>Bio Basic</td><td>BDB0001</td><td></td></tr><tr><td>Cyjanol ksylenowy FF</td><td>Bio Basic</td><td>XB0005</td><td></td></tr><tr><td>MEGAskrót T7 zestaw do transkrypcji</td><td>Ambion</td><td>AM1354</td><td></td></tr><tr><td>mMESSAGE mMACHINE Zestaw do transkrypcji T7</td><td>Ambion</td><td>AM1344</td><td></td></tr><tr><td>Kwas Fenol:Chloroform (5:1)</td><td>Ambion</td><td>AM9722</td><td></td></tr><tr><td>25:24:1 Fenol:Chloroform:Alkohol izoamylowy</td><td>Invitrogen</td><td>15593-049</td><td></td></tr><tr><td>Lizat retikulocytów królika (RRL). NIE powinien być traktowany nukleazą.</td><td>Zielone Hektary, USA</td><td></td><td>Skontaktuj się z Green Hectares, poproś o 1:1 RRL:water</td></tr><tr><td>RiboLock RNaza Inhibitor (40 U/&micro; L)</td> <td>Thermo Fisher</td><td>E00382</td><td></td></tr><tr><td>100 mM dNTPs</td><td>Invitrogen</td><td>56172, 56173, 56174, 56175</td><td>Wymieszaj równe części na zapas 25 mM każda.</td></tr><tr><td>AMV-RT, 10 U/&mikro; L</td> Zestaw do sekwencjonowania DNA <td>Promega</td><td>M5101</td><td></td></tr><tr><td>Sequenase Version 2.0</td><td>Thermo Fisher</td><td>707701KT</td><td></td></tr><tr><td>Model 4200 IR2 Analizator DNA</td><td>LI-COR</td><td></td><td>Produkt został wycofany</td></tr><tr><td>z produkcji APS (Nadsiarczan amonu)</td><td>Bio Basic</td><td>AB0072</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Bio Basic</td><td>TB0508</td><td></td></tr><tr><td>Phusion Polimeraza o wysokiej wierności</td><td>Nowość Anglia Biolabs</td><td>M0530</td><td></td></tr><tr><td>Turbo Dnase</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM2238</td><td></td></tr></tbody></table>

analiza odcisków palców u nóg tworzenia kompleksu inicjacji translacji na mrna ssaków

Toeprinting Analysis of Translation Initiation Complex Formation on Mammalian mRNAs

Inicjacja translacji jest etapem ograniczającym szybkość syntezy białek i stanowi kluczowy punkt, w którym komórki regulują produkcję białka. Regulacja syntezy białek jest kluczem do komórkowej odpowiedzi na stres, a rozregulowanie ma kluczowe znaczenie dla wielu stanów chorobowych, takich jak rak. Na przykład, chociaż stres komórkowy prowadzi do zahamowania globalnej translacji poprzez osłabienie inicjacji zależnej od czapeczki, niektóre białka odpowiedzi na stres są selektywnie translowane w sposób niezależny od czapeczki. Dyskretne elementy regulatorowe RNA, takie jak wewnętrzne miejsca wejścia rybosomów w komórkach (IRES), umożliwiają translację tych specyficznych mRNA. Identyfikacja takich mRNA i charakterystyka ich mechanizmów regulacyjnych była kluczowym obszarem biologii molekularnej. Odcisk palca u nogi to metoda badania struktury i funkcji RNA w odniesieniu do inicjacji translacji. Celem badania jest ocena zdolności transkrybowanego RNA in vitro do tworzenia stabilnych kompleksów z rybosomami w różnych warunkach, w celu określenia, które sekwencje, elementy strukturalne lub czynniki dodatkowe są zaangażowane w wiązanie rybosomów - prekursor skutecznej inicjacji translacji. Wraz z innymi technikami, takimi jak analiza zachodnia i profilowanie polisomów, odcisk palca u nogi pozwala na solidną charakterystykę mechanizmów regulacji inicjacji translacji.

Opisaliśmy wcześniej zdolność IRES XIAP do wspierania niezależnej od czapeczki inicjacji translacji in vitro8,10. Metoda toeprintingu była kluczową techniką służącą do zbadania szczegółów mechanistycznych kompleksu inicjacji IRES XIAP. Konstrukt DNA kodujący mRNA zawierający IRES XIAP (Rycyna 1A) został poddany transkrypcji in vitro i analizie toeprintingowej. Warian...

Toeprinting ma na celu zmierzenie zdolności transkrybowanego RNA in vitro do tworzenia kompleksów inicjujących translację z rybosomami w różnych warunkach. Protokół ten opisuje metodę odciskania palca RNA ssaków i może być stosowany do badania translacji zarówno zależnej od czapeczki, jak i sterowanej przez IRES.

Analiza odcisków palców u nóg tworzenia kompleksu inicjacji translacji na mRNA ssaków

Translation initiation is the rate-limiting step of protein synthesis and represents a key point at which cells regulate their protein output. Regulation ...

Ogólnym celem tej analizy odcisków palców u nóg jest obserwacja tworzenia się kompleksu inicjacji translacji na mRNA ssaków. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie translacji mRNA, takie jak inicjacja translacji za pośrednictwem IRES. Główną zaletą tej techniki jest to, że można przeprowadzić szczegółową analizę tworzenia się kompleksu inicjującego translację na określonym mRNA.Zbierz reakcje transkrypcyjne w celu transkrypcji RNA z matryc DNA amplifikowanych PCR, kodując XIAP IRES RNA lub jego mutanty. Następnie dodaj dwie jednostki DNazy wolnej od RNaz, aby usunąć matrycę DNA do każdej 20 mikrolitrowej reakcji RNA. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut.Następnie rozcieńczyć RNA potraktowane DNazą wodą wolną od nukleaz do końcowej objętości 110 mikrolitrów. Następnie dodaj 110 mikrolitrów kwaśnego fenolu, aby rozpocząć oczyszczanie RNA. Wirować próbki przez pięć sekund i odwirowywać przy 20 000 x g przez trzy minuty w temperaturze pokojowej.Bardzo ważne jest, aby rozcieńczyć RNA lub CDNA przed ekstrakcją fenolu. Jeśli objętość jest zbyt mała, trudno będzie fizycznie odzyskać fazę wodną, a ostateczny plon będzie niski. Następnie ostrożnie przenieś 100 mikrolitrów fazy wodnej zawierającej RNA do nowej probówki do mikrowirówki.Dodać 10 mikrolitrów 3 M octanu sodu o pH 5,5 i wymieszać próbki. Następnie dodaj trzy objętości 100% etanolu, aby wytrącić RNA i wirować próbki przez pięć sekund. Inkubować przez noc w temperaturze 20 stopni Celsjusza.Następnego dnia odwirować próbki o masie 20 000 x g przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i odrzucić supernatant. Następnie umyj granulat 500 mikrolitrami lodowatego 70% etanolu i powtórz wirowanie. Ostrożnie zassać jak najwięcej supernatantu bez usuwania osadu.Następnie suszyć granulki na powietrzu przez pięć do 10 minut. Zawiesić osad w wodzie wolnej od nukleaz do końcowego stężenia 0,5 mikrograma na mikrolitr. Aby rozpocząć test odciskania palca u nogi, dodaj 15 mikrolitrów lizatu retikulocytów królika niepoddanego działaniu nukleazy do każdej 1,5 mililitrowej probówki mikrowirówkowej, która reprezentuje RNA XIAP IRES typu dzikiego i jego mutanty.Dodaj inhibitor RNazy, ATP i GMP-PNP do każdej probówki. Inkubować w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez pięć minut. Następnie dodaj jeden mikrolitr odpowiedniego RNA do każdej z probówek i inkubuj w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez dodatkowe pięć minut.W okresie inkubacji dodać DTT i spermidynę do buforu do odcisku palca. Następnie dodaj 22 mikrolitry buforu do odcisków palców u nóg do każdej z probówek i inkubuj w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez trzy minuty. Następnie dodaj 0,5 mikrolitra podkładu do odcisków palców oznaczonych barwnikiem IR i inkubuj reakcję na lodzie przez 10 minut.Następnie dodaj dwa mikrolitry dNTP, dwa mikrolitry octanu magnezu i jeden mikrolitr odwrotnej transkryptazy wirusa mieoloblastozy ptaków. Doprowadź końcową objętość do 50 mikrolitrów za pomocą bufora do odcisków palców. Następnie pozwól na przedłużenie podkładu przez 45 minut w temperaturze 30 stopni Celsjusza.Bardzo ważne jest również dodanie octanu magnezu do reakcji odcisku palca, bez której odwrotna transkryptaza nie będzie działać optymalnie. Następnie dodaj 200 mikrolitrów wody wolnej od nukleaz. Dodaj 250 mikrolitrów 25:24:1 fenol:chloroform:alkohol izoamylowy, pH 8,0, aby rozpocząć oczyszczanie cDNA.Po wirowaniu próbek przez pięć sekund odwirować próbki w temperaturze 20 000 x g w temperaturze pokojowej przez trzy minuty. Następnie ostrożnie przenieś fazę wodną zawierającą DNA do nowej probówki do mikrowirówki. Następnie dodaj trzy objętości 100% etanolu, aby wytrącić DNA i wirować przez pięć sekund.Inkubować przez noc w temperaturze 20 stopni Celsjusza. Następnego dnia odwirować probówki o stężeniu 20 000 x g przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i wyrzucić supernatant. Następnie umyj osad DNA 500 mikrolitrami lodowatego 70% etanolu i odwiruj przy 20 000 x g przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Odessać jak najwięcej supernatantu, uważając, aby nie usunąć osadu. Następnie suszyć granulki na powietrzu przez pięć do 10 minut. Rozpuść osad DNA w sześciu mikrolitrach wody wolnej od nukleaz.Następnie dodaj trzy mikrolitry barwnika ładującego formamid. Użyj zestawu do sekwencjonowania, aby przygotować drabinkę sekwencjonowania dideoksynukleotydów ze starterem do odciskania palców u nóg i konstruktem DNA kodującym XIAP IRES RNA. Następnie wymieszaj sześć mikrolitrów każdej reakcji sekwencjonowania z trzema mikrolitrami barwnika ładującego formamid.Po oczyszczeniu i zmontowaniu płytek wlej żel i włóż grzebień. Po polimeryzacji żelu zmontuj aparat sekwencjonujący i napełnij zbiorniki 1x TBE. Następnie uruchom pod napięciem 1500 woltów przez 15 minut, aż do osiągnięcia temperatury 55 stopni Celsjusza.Podgrzewać wszystkie próbki z barwnikiem formamidowym do 85 stopni Celsjusza przez pięć minut. Następnie załaduj jeden mikrolitr każdej próbki na 6% żel do sekwencjonowania poliakryloamidu i uruchom żel pod napięciem 1500 woltów przez osiem godzin. Na koniec odczytaj pasma w czasie rzeczywistym za pomocą obrazowania fluorescencyjnego.Metoda ta pokazuje, że potwierdzenie RNA ma kluczowe znaczenie dla tworzenia kompleksu inicjującego translację. Odwrotna transkrypcja kompleksu rybosomów mRNA XIAP daje typowe odciski palców od 17 do 19 nukleotydów poniżej AUG. Mutant 5'PPT wykazuje upośledzone tworzenie odcisków palców.Jednak po transkrypcji za pomocą 5'cap dochodzi do powstania kompleksu inicjacyjnego. Podobnie, mutant 3'PPT również wykazuje upośledzone tworzenie odcisków palców. Jednak transkrypcja z 5'cap prowadzi do tworzenia kompleksu inicjacyjnego.Podwójny mutant PPT zawierający zarówno mutacje 5'PPT, jak i 3'PPT jest w stanie utworzyć kompleks inicjacyjny bez 5'cap. Tworzenie odcisków palców u nóg jest silnie upośledzone dla mutanta kodonu start przy braku RRL i GMP-PNP oraz ogona Poly A. Produkty CDNA są porównywane z drabinką sekwencjonowania dideoksynukleotydów.Ludzka beta globina, czyli mRNA HBB, nie wykazuje odcisku palca u nogi przy braku 5'cap. Jednak kompleks inicjacyjny powstaje na zamkniętym 5'UTR HBB, dając odciski palców od 16 do 18 nukleotydów poniżej AUG. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu trzech dni, w tym przygotowanie matryc transkrypcyjnych in vitro i RNA, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.Zgodnie z tą procedurą można przeprowadzić inne metody, takie jak sondowanie strukturalne, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak drugorzędowa struktura typu dzikiego lub zmutowanych wariantów IRES. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się translacją mRNA do zbadania translacji za pośrednictwem IRES in vitro. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykonywać odciski palców u stóp mRNA ssaków i analizować tworzenie kompleksów inicjujących translację.Nie zapominaj, że kwas-fenol, fenol:chloroform:alkohol izoamylowy i akryloamid mogą być bardzo niebezpieczne. Podczas stosowania tych odczynników należy nosić odpowiednie środki ochrony osobistej.

toeprinting-analysis-translation-initiation-complex-formation-on

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Główną przeszkodą w analizach biochemicznych rybosomów zawierających powstające peptydylo-tRNA była obecność innych rybosomów w tych samych próbkach — rybosomów niezaangażowanych w translację konkretnej analizowanej sekwencji mRNA. Opracowaliśmy prostą metodologię pozwalającą na wyłączną puryfikację rybosomów zawierających interesujące nas powstające peptydylo-tRNA.

Izolacja rybosomów translacyjnych zawierających peptydylo-tRNA do analiz funkcjonalnych i strukturalnych

Tutaj opisujemy metodę analizy zmian w inicjacji translacji mRNA komórek eukariotycznych w odpowiedzi na warunki stresu. Metoda ta opiera się na rozdzielaniu prędkości na gradientach sacharozy rybosomów translujących z rybosomów nietranslujących.

Analiza inicjacji translacji w warunkach stresowych za pomocą profilowania polisomów

Ten protokół ilustruje istotne modyfikacje frakcjonowania polirybosomów w celu zbadania translatomii próbek OUN in vivo. Umożliwia globalną ocenę regulacji translacji i transkrypcji poprzez izolację i porównanie całkowitego RNA z frakcjami RNA związanymi z rybosomami.

In vivo (in vivo) Badanie translatomii ośrodkowego układu nerwowego przez frakcjonowanie polirybosomów

Rybosomy odgrywają kluczową rolę w syntezie białek. Frakcjonowanie polirybosomów (polisomów) za pomocą wirowania w gradiencie gęstości sacharozy umożliwia bezpośrednie określenie wydajności translacji poszczególnych mRNA w skali całego genomu. Ponadto metoda ta może być stosowana do analizy biochemicznej czynników związanych z rybosomami i polisomami, takich jak białka opiekuńcze i cząsteczki sygnałowe.

Frakcjonowanie polisomów i analiza translatomiów ssaków w skali całego genomu

Ten manuskrypt opisuje metodę wizualizacji i ilościowego określania zlokalizowanych zdarzeń translacji w subkomórkowych przedziałach. Podejście zaproponowane w tym manuskrypcie wymaga podstawowego systemu obrazowania konfokalnego i odczynników oraz jest szybkie i opłacalne.

Immunofluorescencja ilościowa do pomiaru globalnej translacji zlokalizowanej

Tutaj opisujemy składanie kompleksów elongacyjnych polimerazy II (Pol II) wymagających jedynie krótkich syntetycznych oligonukleotydów DNA i RNA oraz oczyszczonego Pol II. Kompleksy te są przydatne do badania mechanizmów leżących u podstaw kotranskrypcyjnego przetwarzania transkryptów związanych z kompleksem elongacyjnym Pol II.

Sztuczne kompleksy elongacyjne polimerazy II RNA do analizy zdarzeń przetwarzania kotranskrypcyjnego RNA

Śledzenie indywidualnych zdarzeń translacji pozwala na badania kinetyczne w wysokiej rozdzielczości mechanizmów translacji zależnych od czapek. Tutaj demonstrujemy test pojedynczej cząsteczki in vitro oparty na obrazowaniu interakcji między fluorescencyjnie znakowanymi przeciwciałami a powstającymi peptydami znakowanymi epitopami. Metoda ta umożliwia jednocząsteczkową charakterystykę kinetyki inicjacji i wydłużania peptydów podczas aktywnej translacji in vitro zależnej od kapu.

Test obrazowania pojedynczych cząsteczek in vitro do analizy kinetyki translacji zależnej od czapeczki

Ten protokół opisuje test reporterowy do badania regulacji translacji mRNA w pojedynczych oocytach podczas dojrzewania in vitro.

Definiowanie programu translacji mRNA matki podczas dojrzewania in vitro przy użyciu testu reporterowego pojedynczego oocytu

Prezentujemy technikę szybkiej stabilizacji kompleksów translacyjnych (biosyntezy białek) za pomocą sieciowania formaldehydem w żywych komórkach drożdży i ssaków. Podejście to umożliwia analizę przejściowych produktów pośrednich i dynamicznych interakcji RNA-białko. Usieciowane kompleksy mogą być wykorzystywane w wielu dalszych zastosowaniach, takich jak metody profilowania oparte na głębokim sekwencjonowaniu, mikroskopia i spektrometria mas.

Szybkie utrwalanie in vivo i izolacja kompleksów translacyjnych z komórek eukariotycznych

Tutaj opisujemy protokoły rozbijania komórek ssaków poprzez mielenie w stanie stałym w temperaturze kriogenicznej, wytwarzanie ekstraktu komórkowego z powstałego proszku komórkowego i izolowanie interesujących kompleksów białkowych poprzez wychwytywanie powinowactwa na paramagnetycznych kulkach w skali mikronowej sprzężonych z przeciwciałami.

Wychwytywanie powinowactwa do kompleksu białkowego z komórek ssaków poddanych mieleniu w kriomerze

Poznaj analizę odcisków palców u nóg tworzenia kompleksu inicjacji translacji na mRNA ssaków. Ta technika pozwala szczegółowo badać mechanizmy translacji zależne od czapki i IRES.

Analiza odcisków palców u nóg tworzenia kompleksu inicjacji translacji na mRNA ssaków

Przeglądaj więcej filmów