Name: Matryca optrodowa do jednoczesnej modulacji optogenetycznej i elektrycznego zapisu neuronowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 36 s
Description: Poznaj system optrodowy LED do jednoczesnej stymulacji optogenetycznej i rejestracji elektrofizjologicznej u myszy transgenicznych. Ta metoda umożliwia badanie odpowiedzi neuronowych związanych z zachowaniem.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez Convergent Technology R&D Program for Human Augmentation przez National Research Foundation of Korea (NRF), finansowane przez Ministerstwo Nauki i ICT (NRF-2019M3C1B8090805) i wspierane przez grant National Research Foundation of Korea (NRF) finansowany przez rząd Korei (MSIT) (nr 2019R1A2C1088909). Dziękujemy laboratorium Seung-Hee Lee na Wydziale Nauk Biologicznych, KAIST, Daejeon, Korea, za uprzejme dostarczenie transgenicznych myszy.

Opieka nad zwierzętami oraz procedury chirurgiczne zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (IACUC) na Ewha Womans University (nr 20-029).
1. Przygotowanie matrycy optrodowej (Rycina 1 i Rysunek 2)
<ol>
	<li>Mocowanie światłowodów do matrycy mikrosoczewek.
	<ol>
		<li>Usuń powłokę pasywacyjną ze światłowodu i potnij go na odcinki o długości 5 mm za pomocą precyzyjnego przecinaka do światłowodów.</li>
		<li>Zanurz światłowód w przezroczystej żywicy UV, a następnie umieść światłowody na matrycy mikrosoczewek.</li>
		<li>Utwardź żywicę za pomocą lampy UV.</li>
		<li>Przymocuj matrycę mikrosoczewek do obudowy wydrukowanej w technologii 3D za pomocą żywicy epoksydowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyrównywanie drutów wolframowych powlekanych perfluoroalkoksydem (PFA).
	<ol>
		<li>Przylutuj 4 odcinki drutów wolframowych PFA o długości 30 mm oraz 1 srebrny drut do 5-pinowego gniazda żeńskiego o skoku 1,27 mm. Drut srebrny wykorzystaj jako elektrodę odniesienia.</li>
		<li>Podłącz gniazdo żeńskie o skoku 1,27 mm do przedwzmacniacza głowicy (headstage).</li>
		<li>Ostrożnie przeprowadź druty wolframowe przez otwory w silikonie (Rysunek 1B>, aby ułatwić precyzyjne wyrównanie elektrod wolframowych.</li>
		<li>Przytnij wyrównane druty wolframowe tak, aby były o 1 mm krótsze od długości światłowodu.</li>
		<li>Przymocuj złącze do obudowy wydrukowanej w technologii 3D za pomocą żywicy epoksydowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieszczanie diod LED
	<ol>
		<li>Umieść diodę LED w obudowie wydrukowanej w technologii 3D.</li>
		<li>Podłącz diodę LED do obwodu sterującego generującego modulację szerokości impulsu (PWM). 
		UWAGA: Impuls PWM jest generowany przez mikrokontroler.</li>
		<li>Ze względu na szumy indukowane przez obwód sterujący LED, należy upewnić się, że elektrody rejestrujące znajdują się w odległości 50 mm od obwodu sterującego LED.</li>
		<li>Zmierz natężenie światła na końcu końcówki światłowodu za pomocą fotodiody.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zanurz elektrody wolframowe i światłowody w alkoholu na 15 min. Następnie zanurz system w sterylnej wodzie dejonizowanej (D.I water) i wysterylizuj tlenkiem etylenu.</li>
</ol>
2. Operacja implantacji (Rysunek 3 i Rysunek 4)
UWAGA: Podczas operacji należy przestrzegać zasad techniki sterylnej.
<ol>
	<li>Przygotuj zwierzęta transgeniczne, które zostały zmodyfikowane genetycznie w celu ekspresji światłoczułych białek opsyn w konkretnym typie komórek neuronalnych. 
	UWAGA: W niniejszym badaniu wykorzystano samca transgenicznej myszy w wieku 2 miesięcy, wykazującego ekspresję kanałorodopsyny-2 (ChR2) w neuronach dodatnich dla kinazy białkowej II zależnej od Ca2+/kalmoduliny (mysz CaMKIIα::ChR2)41.</li>
	<li>Zanurz mysz w narkozie, podając dootrzewnowo koktajl ketaminy z ksylazyną – mieszaninę ketaminy (100 mg/kg) i ksylazyny (10 mg/kg).
	<ol>
		<li>Sprawdzaj stan znieczulonego zwierzęcia co 30 min, monitorując ruchy wibrysów oraz reakcję na uciśnięcie łapy.</li>
		<li>W razie potrzeby pogłębienia narkozy wstrzyknij koktajl ketaminy z ksylazyną w połowie dawki początkowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wygol skórę głowy i umieść znieczuloną mysz w aparacie stereotaktycznym. 
	UWAGA: Przeprowadź chirurgiczne przygotowanie skóry i obłóż zwierzę sterylnymi materiałami. Przygotowanie skóry obejmuje usunięcie owłosienia, a następnie oczyszczenie skóry środkami przeciwdrobniczymi.
	<ol>
		<li>Ustaw głowę w aparacie stereotaktycznym i wprowadź pręty uszne do kanałów słuchowych.</li>
		<li>Wycentruj głowę myszy w aparacie stereotaktycznym, wielokrotnie luzując i dokręcając pręty uszne w celu precyzyjnego ustawienia.</li>
		<li>Umieść pręt do siekaczy tak, aby górne siekacze zahaczyły o przednią wewnętrzną krawędź.</li>
		<li>Wyreguluj pręt do siekaczy, aby ustawić jego wysokość, a następnie dokręć zacisk nosowy na pysku.</li>
		<li>Włącz wcześniej wbudowaną w aparat stereotaktyczny matę grzewczą, aby utrzymać temperaturę ciała na poziomie 37 °C podczas wszystkich procedur chirurgicznych.</li>
		<li>Wprowadź sondę termiczną do odbytnicy myszy w celu regulacji homeotermicznej. 
		UWAGA: Należy sprawdzić stabilność prętów usznych, delikatnie chwytając i kołysząc pyszkiem. Pręty uszne muszą zostać ponownie wyregulowane, jeśli pyszczek przemieszcza się lateralnie o więcej niż ~4 mm.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przykryj oczy wazeliną (patrz Tabela materiałów), aby zapobiec ich wysychaniu.</li>
	<li>Wstrzyknij 1% lidokainy w skórę głowy. Unieś skórę głowy pęsetą, zabezpiecz przestrzeń do iniekcji i wstrzyknij lidokainę pod skórę.</li>
	<li>Wykonaj nacięcie strzałkowe za pomocą skalpela i cienkich nożyczek. Odciągnij naciętą skórę mikroklemą, aby zwiększyć widoczność pola operacyjnego. 
	UWAGA: Długość nacięcia wynosi &lt;1 cm powyżej bregmy i krawędzi ogonowej kości międzyparietalnej.</li>
	<li>Usuń okostną za pomocą patyczków bawełnianych. W przypadku krwawienia przyżeg zespół czaszki za pomocą elektrokoagulatora Bovie, aby zamknąć naczynia krwionośne.</li>
	<li>Oczyść czaszkę solą fizjologiczną i zaznacz miejsca kraniotomii za pomocą ramienia manipulatora: hipokamp w osi przednio-tylnej (AP) −1.8 do −2.8 mm, w osi przyśrodkowej-bocznej (ML) 0.5-2.5 mm oraz w osi grzbietowo-brzusznej (DV) −1 do −2 mm. 
	UWAGA: Biorąc pod uwagę grubość czaszki myszy, wprowadź macierz optrodową na głębokość -1.2 do -2.2 mm od odsłoniętego obszaru mózgu. Z uwagi na przebieg dróg hipokampa, komórki piramidowe pola CA3 przesyłają aksony do CA1. Dlatego włókna światłowodowe są o 1 mm dłuższe niż elektrody rejestrujące, tak aby światłowody znajdowały się w CA3, a elektrody rejestrujące w CA1.</li>
	<li>Wywierć otwór nad móżdżkiem i wprowadź śrubę uziemiającą. Wkręć śrubę uziemiającą na głębokość 0.5 mm za pomocą wkrętaka precyzyjnego, aż dotrze ona do górnej części móżdżku. 
	UWAGA: Należy zapewnić ciasne osadzenie śruby, która posłuży jako elektroda uziemiająca i struktura wsporcza w celu maksymalizacji długoterminowej stabilności implantacji, ponieważ zwiększa ona trójwymiarową powierzchnię przylegania cementu dentystycznego.</li>
	<li>Wywierć otwór w zaznaczonym obszarze i usuń fragment czaszki pęsetą.</li>
	<li>Zegnij końcówkę igły 26 G zgodnie z ruchem wskazówek zegara o 120° i odsłoń obszar mózgu, wprowadzając igłę ściętą stroną skierowaną do góry. Należy uważać, aby nie uszkodzić mózgu i naczyń krwionośnych.</li>
	<li>Oczyść odsłonięty mózg solą fizjologiczną, aby wypłukać pył kostny i zanieczyszczenia.</li>
	<li>Zamocuj macierz optrodową w ramieniu manipulatora i zbliż ją do odsłoniętego obszaru. 
	UWAGA: Podczas umieszczania urządzenia ponowne przeliczenie obszaru docelowego od bregmy może zwiększyć dokładność pozycjonowania.</li>
	<li>Powoli wprowadź macierz optrodową i połącz śrubę uziemiającą ze srebrnym drutem podłączonym do systemu42. 
	UWAGA: W tym procesie macierz musi być sztywno zamocowana do ramienia manipulatora, aby zminimalizować chwianie się i zapobiec uszkodzeniu mózgu w wyniku mikroruchów podczas wprowadzania. Wprowadzanie należy przeprowadzać powoli, z 10-minutową przerwą, aby uwzględnić obrzęk mózgu, który mógł zostać uciśnięty po insercji. Dla uzyskania wysokiej jakości stosunku sygnału do szumu oraz liczby separowalnych jednostek pojedynczych zaleca się prędkość wprowadzania do tkanki mózgowej poniżej 1 µm/s42.</li>
	<li>W przypadku krwawienia wywrzyj bezpośredni ucisk na krwawiące miejsca suchym patyczkiem bawełnianym lub zastosuj kauteryzację. Nie przechodź do kolejnych kroków, dopóki krwawienie nie zostanie całkowicie zatrzymane.</li>
	<li>Wprowadź gąbkę żelową między odsłonięty mózg a urządzenie, aby chronić tkankę przed bezpośrednim kontaktem z substancjami chemicznymi. 
	UWAGA: Gąbka żelowa wspomaga również hemostazę i utrzymuje wilgotność mózgu.</li>
	<li>Wytrzyj czaszkę patyczkami bawełnianymi, aby maksymalnie usunąć wilgoć, i przejdź do następnego etapu mocowania.</li>
	<li>Ostrożnie nałóż cement dentystyczny na czaszkę, aby zamocować urządzenie i przykryć gąbkę żelową. Przed całkowitym utwardzeniem cementu dentystycznego oddziel skórę głowy, jeśli przywarła do cementu. Odciągnij naciętą skórę pęsetą, aby przykryć stwardniały cement i zaszyj skórę głowy. Następnie zwolnij urządzenie z ramienia manipulatora. 
	UWAGA: Upewnij się, że cement dentystyczny nie przykleił się do skóry i pokrywa jedynie obszar czaszki. W miarę wzrostu skóry cement może zostać odepchnięty, co w konsekwencji doprowadzi do wypadnięcia urządzenia. Stworzy to krytyczny problem w długoterminowych eksperymentach in vivo.</li>
</ol>
3. Rekonwalescencja i pielęgnacja implantu
<ol>
	<li>Wyjąć mysz z zestawu stereotaktycznego.</li>
	<li>Podać roztwór karprofenu za pomocą igły 26 G. Wstrzyknąć jednokrotnie przed operacją oraz 12 h (następnego ranka w przypadku operacji popołudniowej) i 24 h po operacji w celu zmniejszenia bólu. 
	UWAGA: Stężenie leku w butelce wynosi 50 mg/mL, a lek jest przechowywany w temperaturze 4 °C. Karprofen jest lepki i wymaga rozcieńczenia w wodzie sterylnej w stosunku 1:10. Jeśli zachowana zostanie sterylność, roztwór można przechowywać do 4 tygodni. Aby utrzymać skuteczność leku, roztwór karprofenu należy wstrzykiwać w odstępach 12 h.</li>
	<li>Umieścić mysz na macie grzewczej i sprawdzić, czy prawidłowo budzi się z narkozy. 
	UWAGA: Zwierzę nie może pozostać bez nadzoru, dopóki nie odzyska wystarczającej świadomości.</li>
	<li>Usunąć nici chirurgiczne 7–10 dni po operacji.</li>
	<li>Pozostawić zwierzę do rekonwalescencji na 1 tydzień. Monitorować spożycie pokarmu i wody w czasie rekonwalescencji. Podawać lek przeciwbólowy i sprawdzać pod kątem objawów dyskomfortu lub bólu. 
	UWAGA: Zwierzęta po operacji nie mogą przebywać z innymi zwierzętami do czasu pełnego wyzdrowienia.
	<ol>
		<li>W okresie rekonwalescencji codziennie ważyć mysz, aby kontrolować zmiany masy ciała. Uśmiercić mysz (patrz sekcja 6) w przypadku utraty 20% masy ciała w porównaniu do zwierząt kontrolnych dopasowanych pod względem wieku i płci.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Stymulacja optogenetyczna i rejestracja elektrofizjologiczna
<ol>
	<li>Zpodaj myszy znieczulenie i umieść ją w aparacie stereotaktycznym.</li>
	<li>Ustaw parametry stymulacji.
	<ol>
		<li>Ustaw cykl pracy impulsu świetlnego na 4% i częstotliwość na 10 Hz43. Zaprogramuj stymulację świetlną na 2 s (20 impulsów) podczas rejestracji sygnałów neuronalnych.</li>
		<li>Użyj prądu 50 mA, aby uzyskać natężenie światła 3 mW/mm2 na końcówce włókna optycznego. Zmierz moc światła za pomocą fotodiody i watomierza, a następnie podziel moc światła przez powierzchnię czoła włókna optycznego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zdejmij plastikową osłonę i zamocuj górną część zawierającą system dostarczania światła z wielorazową diodą LED i układami elektronicznymi.</li>
	<li>Podłącz przedwzmacniacz headstage do wszczepionego złącza 5-pinowego.</li>
	<li>Uruchom oprogramowanie do rejestracji sygnałów neuronalnych.</li>
	<li>Skonfiguruj filtry w oprogramowaniu. Użyj filtra pasmowo-przepustowego w zakresie 0,1-20 kHz oraz filtra notch na 60 Hz. Ustaw częstotliwość próbkowania wzmacniacza na 20 kHz.</li>
	<li>Przed rozpoczęciem rejestracji sprawdź, czy wykrywane są sygnały impulsowe (spike'y) neuronów. 
	UWAGA: Redukcja szumów jest istotna, ponieważ sygnały neuronalne są bardzo słabe. Jeśli poziom szumów będzie zbyt wysoki, sygnały neuronalne mogą zostać przez nie zamaskowane i stać się niewidoczne. Aby zredukować szum, zastosuj odpowiednie uziemienie i ekranowanie przed falami elektromagnetycznymi.</li>
	<li>Po sprawdzeniu sygnału zarejestruj sygnały neuronalne bez stymulacji świetlnej w celu uzyskania pomiaru bazowego.</li>
	<li>Dostarcz światło LED i jednocześnie rejestruj odpowiedzi neuronalne (Rycina 5 i Rycina 6). 
	​UWAGA: Po przeprowadzeniu stymulacji kolejny eksperyment stymulacyjny musi zostać wykonany po przerwie wynoszącej co najmniej 5 min, aby aktywność neuronalna wywołana poprzednią stymulacją nie wpływała na następny pomiar.</li>
</ol>
5. Analiza danych
<ol>
	<li>Wczytaj pozyskane dane za pomocą programu MATLAB.</li>
	<li>Uzyskaj aktywność pojedynczych neuronów, wykorzystując algorytm sortowania impulsów (spike sorting) „Wave-Clus“44,45. Wykryj impulsy w każdym kanale, stosując próg amplitudy zgodnie z równaniem (1)45. 
	Próg = 5 × median <img alt="Formuła ułamka |x|/0,6745 w ilustracji wyrażenia matematycznego." src="/files/ftp_upload/63460/63460eq01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie 1"> (1) 
	​Gdzie x to sygnał przefiltrowany filtrem pasmowym.
	<ol>
		<li>Aby zainstalować program „Wave-Clus”, skorzystaj z linku do pobierania znajdującego się w Tabeli materiałów.</li>
		<li>Aby otworzyć graficzny interfejs użytkownika (GUI), wpisz wave_clus w wierszu poleceń programu MATLAB.</li>
		<li>Użyj funkcji Get_spikes('filename.ext') dla rozszerzenia pliku przygotowanego do detekcji impulsów. Następnie uruchom Do_clustering('filename_spikes.mat') w celu sortowania impulsów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Policz posortowane impulsy przed, w trakcie i po stymulacji światłem, stosując określone przedziały czasowe (time bins). Do analizy wykorzystaj przedziały czasowe 0,2 s oraz 2 s.</li>
	<li>Przedstaw na wykresie liczbę impulsów z każdego kanału rejestracji. 
	UWAGA: Obliczono i naniesiono na wykres średnią wraz ze standardowym błędem średniej (SEM) danych z wyników 8 powtórzeń eksperymentu.</li>
</ol>
6. Eutanazja
<ol>
	<li>Po zakończeniu wszystkich eksperymentów uśmierć mysz poprzez inhalację dwutlenkiem węgla (CO2).</li>
	<li>Bez wcześniejszego napełniania komory umieść mysz w przezroczystej komorze do eutanazji, bez dopływu CO2 i/lub wycieków.</li>
	<li>Włącz dopływ gazu CO2 i wypieraj powietrze z prędkością 30–50% objętości powietrza w komorze do eutanazji na minutę. 
	UWAGA: Do butli z gazem CO2 musi być podłączony przepływomierz, aby zapewnić, że szybkość wypierania powietrza wynosi 30–50% objętości komory do eutanazji na minutę.</li>
	<li>Obserwuj uśmiercaną mysz pod kątem ustania oddechu i zmiany koloru oczu. 
	UWAGA: Przewidywany czas eutanazji wynosi zazwyczaj od 10 do 15 min.</li>
	<li>Po zaobserwowaniu oznak śmierci wyjmij mysz z komory do eutanazji.</li>
	<li>Aby zakończyć procedurę eutanazji, zweryfikuj zgon, potwierdzając zatrzymanie oddechu i akcji serca.</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Zweryfikowano możliwość jednoczesnej stymulacji optogenetycznej i zapisu elektrofizjologicznego systemu (ryc. 6). Duże skoki podczas stymulacji świetlnej to artefakty fotoelektryczne występujące w tym samym czasie co stymulacja światłem (ryc. 6A). Jest to wyraźnie widoczne w powiększonym widoku przebiegu w czerwonym przerywanym prostokącie (Rysunek 6A). Jak pokazano na rysunku 6A, artefakty fotoelektryc...

Rejestrowanie i kontrolowanie aktywności neuronalnej jest niezbędne do zrozumienia, jak funkcjonuje mózg w sieci neuronowej i na poziomie komórkowym. Konwencjonalne metody zapisu elektrofizjologicznego obejmują zacisk krosowy1,2,3,4 za pomocą mikropipety i zapis zewnątrzkomórkowy za pomocą elektrod mikroneuronowych5,6,7,8. Jako metoda neuromodulacji, stymulacja elektryczna jest często stosowana do bezpośredniej stymulacji ogniskowego obszaru mózgu poprzez bezpośrednią lub pośrednią depolaryzację komórek neuronalnych. Jednak metoda elektryczna nie jest w stanie rozróżnić typów komórek neuronalnych do rejestracji lub stymulacji, ponieważ prądy elektryczne rozchodzą się we wszystkich kierunkach.
Jako rozwijająca się technologia, optogenetyka zapoczątkowała nową erę w zrozumieniu, jak działa układ nerwowy9,10,11,12,13,14,15,16. Istotą technik optogenetycznych jest wykorzystanie światła do kontrolowania aktywności wrażliwych na światło białek opsyny ulegających ekspresji w genetycznie zmodyfikowanych komórkach. W ten sposób optogenetyka umożliwia zaawansowaną modulację lub monitorowanie genetycznie wybranych komórek w skomplikowanych obwodach neuronowych14,17. Szersze zastosowanie podejścia optogenetycznego wymusiło jednoczesną rejestrację neuronalną w celu bezpośredniego potwierdzenia neuromodulacji optycznej. Dlatego niezwykle cenne byłoby zintegrowane urządzenie z funkcjami sterowania oświetleniem i nagrywania16,18,19,20,21,22,23,24,25.
Istnieją ograniczenia tradycyjnej, laserowej stymulacji optogenetycznej, która wymaga nieporęcznego i drogiego systemu dostarczania światła26,27,28,29,30. W związku z tym niektóre grupy badawcze zastosowały sondy krzemowe oparte na μLED, aby zminimalizować rozmiar systemu dostarczania światła31,32,33,34. Istnieje jednak ryzyko termicznego uszkodzenia mózgu spowodowanego bezpośrednim kontaktem z diodami μLED ze względu na niską wydajność konwersji energii diod LED. Falowody świetlne, takie jak światłowody, SU-8 i tlenoazotek krzemu (SiON), zostały zastosowane w celu uniknięcia uszkodzeń termicznych30,35,36,37,38,39. Jednak ta strategia ma również wadę ze względu na niską wydajność sprzężenia między źródłami światła a falowodami.
Matryca mikrosoczewek została wcześniej wprowadzona w celu zwiększenia efektywności sprzężenia światła między diodami LED a światłowodami40. W oparciu o technologie systemów mikroelektromechanicznych (MEMS) do stymulacji optycznej i rejestracji elektrycznej w mikroskali opracowano system optrodowy40. Układ mikrosoczewek pomiędzy diodą LED a światłowodami zwiększył wydajność świetlną o 3,13 dB. Jak pokazano na rysunku Rysunek 1, układ światłowodów 2x2 jest wyrównany na układzie mikrosoczewek 4x4, a dioda LED jest umieszczona poniżej układu mikrosoczewek. Światłowody 2x2 są montowane zamiast 4x4, aby zmniejszyć uszkodzenia mózgu. Układ elektrod wolframowych jest umieszczony w sąsiedztwie układu optrodowego za pomocą krzemu przez otwory do zapisu elektrofizjologicznego (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1B).
System składa się z górnej części jednorazowej i odłączanej części dolnej. Górna jednorazowa część, która obejmuje matrycę światłowodową, matrycę mikrosoczewek i matrycę elektrod wolframowych, jest przeznaczona do trwałego wszczepienia do mózgu w celu eksperymentów in vivo. W dolnej części znajduje się źródło światła LED i zewnętrzna linia zasilająca, którą można łatwo zdemontować i ponownie wykorzystać do innego eksperymentu na zwierzętach. Dołączana plastikowa osłona chroni jednorazową część po wyjęciu zdejmowanej części.
Wykonalność systemu jest weryfikowana poprzez wszczepienie do mózgów transgenicznych myszy eksprymujących rodopsynę kanałową-2 (ChR2) w neuronach Ca2+/kinazy białkowej zależnej od kalmoduliny II-dodatnich (Mysz CaMKIIα::ChR2). Elektrody rejestrujące wykorzystano do rejestrowania aktywności neuronalnej poszczególnych neuronów podczas optycznej stymulacji neuronów.

<table><tbody><tr><td>Złącze 5-pinowe</td><td>NW3</td><td>HD127K</td><td>raster 1,27 mm (0,050")</td></tr><tr><td>Bovie</td><td>Fine Science Tools(FST)</td><td>18010-00</td><td>Zestaw do kauteryzacji wysokotemperaturowej</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do akwizycji danych</td><td>Intan Technologies, LLC</td><td>Oprogramowanie karty interfejsu USB</td><td>Praca z płytą interfejsu USB RHD</td></tr><tr><td>Dental Cement</td><td>Lang Dental Manufacturing Company, Inc.</td><td>1223CLR</td><td>Użyj płynu Jet i proszku w pakiecie do naprawy protez strumieniowych</td></tr><tr><td>Ramię manipulatora cyfrowego</td><td>Stoelting Co.</td><td>51904/51906</td><td>Lewy, prawy każdy cyfrowy ramię manipulatora, 3-osiowe, dodatkowa</td></tr><tr><td>pianka żelowa</td><td>Cutanplast</td><td>Standard (70*50*10 mm)</td><td>Sterylna, wchłanialna gąbka żelatynowa z efektem hemostatycznym</td></tr><tr><td>Przedwzmacniacz czołowy</td><td>Intan Technologies, LLC</td><td></td>#C3314 <td>16-kanałowe nagrywanie RHD Headstages</td></tr><tr><td>Poduszka grzewcza</td><td>Stoelting Co.</td><td>53800R</td><td>Stoelting Ocieplacz na gryzonie X1 z podkładką grzewczą dla szczurów</td></tr><tr><td>LED</td><td>OSLON</td><td>GB CS8PM1.13</td><td>&lambda; typ. 470 nm, Kąt widzenia 80 &deg;, Napięcie przewodzenia 2.85 V</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks, Inc.</td><td>R2019a</td><td></td></tr><tr><td>Mikro zacisk</td><td>SURGIWAY</td><td>12-1002-04</td><td>Typ prosty, Serre-fine DIEFFENBACH droite 3,5 cm</td></tr><tr><td>Światłowód</td><td>Thorlabs, Inc.</td><td>FT200UMT</td><td>0,39 NA, &Oslash; 200 &mikro; m Rdzeń Światłowód wielomodowy, wysoki OH dla</td></tr><tr><td>drutu wolframowego powlekanego PFA</td> 300 - 1200 nm <td>System AM</td><td>Zamówienie niestandardowe Typ</td><td>pręta, &Oslash; 101.6 &mu; m (.004")</td></tr><tr><td>Fotodioda</td><td>Thorlabs</td><td>S121C</td><td></td></tr><tr><td>miernik mocy</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>PM100D</td><td></td></tr><tr><td>Precyzyjny tasak</td><td>FITEL</td><td>S326</td><td>Narzędzie do krajalnicy włókien</td></tr><tr><td>Prism</td><td>GraphPad</td><td>5.01 wersja</td><td></td></tr><tr><td>Skalpel</td><td>Feather&trade;</td><td>#20</td><td>Ostrze skalpela z uchwytem skalpela o długości 100 mm Śruba</td></tr> ze <tr><td></td><td>stali nierdzewnej</td><td>Nasa Korea</td><td>średnica: 1,2 mm, długość: 3 mm</td></tr><tr><td>Srebrny drut</td><td>Nilaco Corporation</td><td>AG-401265</td><td>&Oslash; 200 &micro; m</td></tr><tr><td>Stereotaxic Fxrame</td><td>Stoelting Co.</td><td>51500D</td><td>Cyfrowy nowy standard stereotaktyczny szew dla szczurów i myszy</td></tr><tr><td></td><td>ETHICON</td><td>W9106</td><td>rozmiar szwu: 4-0, długość: 75 cm, średnica drutu: 4-0</td></tr><tr><td>Wazelina</td><td>Unilever PLC</td><td>Oryginalna</td><td>100% czysta wazelina naftowa</td></tr><tr><td>Wave_Clus</td><td>nie</td><td>dotyczy</td><td></td></tr></tbody></table> nie dotyczy https://github.com/csn-le/wave_clus

matryca optrodowa do jednoczesnej modulacji optogenetycznej i elektrycznego zapisu neuronowego

Optrode Array for Simultaneous Optogenetic Modulation and Electrical Neural Recording

W ciągu ostatniej dekady, optogenetyka stała się podstawowym narzędziem do badania sygnalizacji neuronalnej ze względu na jej unikalną zdolność do selektywnej modulacji lub monitorowania neuronów. Ponieważ określone typy komórek neuronalnych mogą być genetycznie modyfikowane w celu ekspresji białek opsyny, optogenetyka umożliwia stymulację optyczną lub hamowanie wybranych neuronów. W systemie optycznym dla optogenetyki dokonano kilku postępów technologicznych. Niedawno zaproponowano połączenie falowodu optycznego do dostarczania światła z zapisem elektrofizjologicznym w celu jednoczesnego monitorowania reakcji neuronalnych na stymulację lub hamowanie optogenetyczne. W tym badaniu opracowano wszczepialną matrycę optrodową (światłowody 2x2) z wbudowanymi elektrodami wielokanałowymi. 
Jako źródło światła zastosowano diodę elektroluminescencyjną (LED), a mikrofabrykowany układ mikrosoczewek został zintegrowany, aby zapewnić wystarczającą moc światła na końcu światłowodów. System optrode array składa się z części jednorazowego użytku i części wielokrotnego użytku. Część jednorazowa posiada światłowody i elektrody, natomiast część wielokrotnego użytku posiada diodę LED i obwody elektroniczne do sterowania światłem i przetwarzania sygnałów neuronowych. Nowatorski projekt wszczepialnego systemu matrycy optycznej został przedstawiony w dołączonym filmie jako dodatek do procedury operacji implantacji optrodowej, optogenetycznej stymulacji światłem i elektrofizjologicznego zapisu neuronowego. Wyniki eksperymentów in vivo z powodzeniem wykazały zablokowane w czasie skoki nerwowe wywołane przez bodźce świetlne z neuronów pobudzających hipokampa myszy.

System optrody został pomyślnie wykonany w sposób zapewniający wystarczającą moc światła do aktywacji docelowych neuronów. Precyzyjne wyrównanie elektrod wolframowych osiągnięto dzięki mikrofabrykowanemu krzemowi za pomocą otworów. Zmierzona intensywność światła na końcówce światłowodu wynosiła 3,6 mW/mm2 przy przyłożonym prądzie 50 mA. Mikrosoczewka zwiększyła wydajność świetlną o 3,13 dB. Dzięki zastosowaniu matrycy mikrosoczewek, która poprawia sprzężenie światła, przyłożony prąd stanowi około połowy prądu ...

Tutaj prezentujemy metodę wytwarzania systemu optycznego ze światłowodami do dostarczania światła i matrycą elektrod do rejestracji neuronowej. Eksperymenty in vivo na transgenicznych myszach z ekspresją rodopsyny-2 pokazują wykonalność systemu do jednoczesnej stymulacji optogenetycznej i zapisu elektrofizjologicznego.

Matryca optrodowa do jednoczesnej modulacji optogenetycznej i elektrycznego zapisu neuronowego

During the last decade, optogenetics has become an essential tool for the investigation of neural signaling due to its unique capability of selective ...

Protokół ten obejmuje wytwarzanie w systemie optrodowym do jednoczesnej stymulacji optogenetycznej i rejestracji elektrofizjologicznej. Proponowany system oparty na diodach LED zwiększa wydajność sprzężenia światła dzięki układowi mikrosoczewek. Źródło światła LED ma prostszą konfigurację oświetlenia niż laserowe źródło światła, dzięki czemu system można łatwo zastosować w systemie bezprzewodowym.Optogenetyka jest techniką ścieżki do zrozumienia patologii chorób neurologicznych i mechanizmów leczenia. Optogenetyka może być stosowana w leczeniu urazów rdzenia kręgowego, padaczki, choroby Parkinsona i choroby Alzheimera. Nasze urządzenie oparte na diodach LED może być dalej wdrażane jako system bezprzewodowy z kilkoma zaletami, takimi jak niska złożoność systemu, opłacalność i niskie zużycie energii.Najpierw podłącz żeńskie złącze o rastrze 1,27 milimetra do przedwzmacniacza stopnia głównego. Umieść diodę LED w obudowie wydrukowanej w 3D. Zmierz natężenie światła na końcu końcówki światłowodu za pomocą fotodiody.Zanurz elektrody wolframowe i światłowody w alkoholu na 15 minut i wysusz je na powietrzu. Ogol skórę głowy i umieść znieczuloną mysz w ramce stereotaktycznej. Umieść głowę w ramie stereotaktycznej i włóż nauszniki do ujścia.Włącz termiczną poduszkę grzewczą wbudowaną w ramkę stereotaktyczną i utrzymuj temperaturę ciała na poziomie 37 stopni Celsjusza przez cały czas trwania zabiegów chirurgicznych. Wyreguluj pręt nacinający do ustawienia wysokości pręta nacinającego i dokręć nos clamp do pyska. Przykryj oczy wazeliną, aby zapobiec wysuszeniu.Podnieś skórę w głowie za pomocą kleszczy, zabezpiecz miejsce do wstrzyknięcia i wstrzyknij 1% lidokainę pod skórę głowy. Wykonaj nacięcie strzałkowe za pomocą skalpela i drobnych nożyczek. Przytrzymaj naciętą skórę za pomocą mikrozacisku, aby poszerzyć widoczność pola operacyjnego.Usuń okostną za pomocą bawełnianych wacików. Jeśli wystąpi krwawienie, kauteryzuj czaszkę za pomocą bovie, aby uszczelnić naczynia krwionośne. Oczyść czaszkę solą fizjologiczną i zaznacz miejsca kraniotomii za pomocą ramienia manipulatora.Wywierć otwór nad móżdżkiem i włóż do ziemi. Za pomocą precyzyjnej włóż uziemiającą na głębokość 0,5 milimetra, aż dotrze do górnej części móżdżku. Wywierć zaznaczony obszar i usuń kawałek czaszki za pomocą kleszczy.Zegnij końcówkę igły o rozmiarze 26 zgodnie z ruchem wskazówek zegara pod kątem 120 stopni i odsłoń obszar mózgu, wkładając skośną stronę igły skierowaną do góry. Zamocuj matrycę opcjonalną w ramieniu manipulatora i zbliż się do odsłoniętego obszaru. Powoli włóż matrycę opcrodową i podłącz uziemiającą do srebrnego przewodu dołączonego do systemu.Włóż piankę żelową między odsłonięty mózg a urządzenie, aby chronić substancje chemiczne przed bezpośrednim kontaktem z mózgiem. Ostrożnie nałóż cement dentystyczny na czaszkę, aby zamocować urządzenie i przykryć piankę żelową. Zanim cement dentystyczny całkowicie stwardnieje, oddziel skórę głowy, jeśli jest przymocowana do cementu dentystycznego.Pociągnij naciętą skórę kleszczami, aby pokryć stwardniały cement dentystyczny i zszyć skórę głowy. Umieść znieczuloną mysz w ramce stereotaktycznej. Ustaw przepis na impuls świetlny na 4% cykl pracy w częstotliwości 10 Hz.Ustaw stymulację światłem na dwie sekundy podczas nagrywania neuronowego. Zdejmij plastikową osłonę i przymocuj górną część systemów dostarczania światła za pomocą diody LED wielokrotnego użytku w obwodach. Podłącz przedwzmacniacz stopnia głównego do wbudowanego pięciopinowego złącza.Otwórz oprogramowanie i skonfiguruj filtry oprogramowania. Następnie kliknij i ustaw częstotliwość próbkowania wzmacniacza. Następnie kliknij zmień przepustowość.Ustaw dolne pasmo wzmacniacza i górne pasmo wzmacniacza. Sprawdź oprogramowanie Filtr górnoprzepustowy DAC. Otwórz Spike Scope i sprawdź sygnały neuronowe za pomocą progu napięcia.Kliknij przycisk Zatrzymaj i zacznij nagrywać. Załaduj pozyskane dane za pomocą MATLAB i sprawdź surowe dane. Następnie uruchom kod sortowania spajków, który zawiera algorytm clust fal.Sprawdź posortowane spajki na wykresie rastrowym. Teraz narysuj skoki liczenia i sprawdź wywołane skoki podczas stymulacji świetlnej. Rysunek pokazuje całe zarejestrowane formy fal z dokładnymi warunkami, w tym dwie sekundy światła w środku.Liczba wywołanych pojedynczych impulsów neuronalnych po każdym impulsie stymulacji świetlnej znacznie wzrosła w porównaniu z linią bazową z różnymi przedziałami czasowymi wynoszącymi dwie sekundy i 0,2 sekundy. Rysunek przedstawia histogram skoku dla każdego kanału przed, w trakcie i po stymulacji światłem. Rysunek wstawki wskazuje lokalizację wszczepionej matrycy optrodowej.Co więcej, powiększona wersja pokazuje histogram spajka z 100-milisekundowym przedziałem czasu. Niebieski pasek reprezentuje czas, w którym dioda LED była włączona, aby zarejestrować odpowiedź. Aby zminimalizować szum artefaktu spowodowany procesem prądu sterującego diodą LED, system powinien być zaprojektowany tak, aby zapewnić wystarczającą odległość między ścieżką sygnału elektrycznego a obwodem LED.Proponowany system optrodowy oparty na diodach LED może badać różne sygnalizacje neurologiczne związane z zachowaniami zwierząt, ponieważ może dostarczać stymulację optogenetyczną i rejestrować wywołane reakcje neurologiczne. Matryca optrodowa LED jest kompatybilna z bezprzewodowym interfejsem optogenetycznym, który może być używany w badaniach na zwierzętach w swobodnym ruchu.

optrode-array-for-simultaneous-optogenetic-modulation-electrical

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Opisano procedurę optogenetycznej manipulacji aktywnością neuronów piramidowych kory mózgowej przy jednoczesnym monitorowaniu elektroencefalogramu, elektromiogramu oraz stężenia mleczanu w mózgu. Rejestracje eksperymentalne są przeprowadzane u myszy z podłączonymi przewodami podczas spontanicznych cykli snu i czuwania. Sprzęt do optogenetyki został zbudowany w naszym laboratorium; sprzęt pomiarowy jest dostępny w sprzedaży.

Symultaniczna elektroencefalografia, pomiar stężenia mleczanu w czasie rzeczywistym i optogenna manipulacja aktywnością neuronalną w korze mózgowej gryzoni

Ten film przedstawia metodę jednoczesnego obrazowania i rejestrowania aktywności elektrycznej z transgenicznych wycinków mózgu, które zawierają specyficzne dla neuronów białka fluorescencyjne. Procedura polega na utrzymywaniu wycinka mózgu w komorze perfuzyjnej z napowietrzonym sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym, użyciu źródła światła do wzbudzenia komórek znakowanych fluorescencyjnie oraz rejestrowaniu sygnałów elektrycznych za pomocą wielokanałowej sondy i zacisku krosowego.

Jednoczesne optyczne i elektrofizjologiczne monitorowanie komórek neuronalnych w wycinkach mózgu

Ten film demonstruje procedurę badania efektywności synaptycznej w bocznej korze śródwęchowej (LEC) poprzez optogenetyczną stymulację aksonów przyśrodkowej kory przedczołowej (mPFC) i rejestrowanie odpowiedzi neuronów piramidowych w LEC. Metoda ta łączy zapisy patch-clamp z aktywacją synaptyczną przez stymulację światłem w celu zbadania plastyczności synaptycznej.

Stymulacja optogenetyczna i elektrofizjologiczny zapis zdarzeń synaptycznych w wycinkach mózgu szczura

Niedawny rozwój narzędzi neuronauki, które łączą genetykę i optykę, określany jako "optogenetyka", umożliwia kontrolę nad aktywnością obwodów neuronowych z niespotykanym dotąd poziomem rozdzielczości przestrzennej i czasowej. W tym miejscu przedstawiamy protokół integracji zapisu in vivo z manipulacją optogenetyczną genetycznie zdefiniowanych podzbiorów neuronów przedczołowych korowych i podkostnych neuronów piramidowych.

Metoda wysokiej wierności optogenetycznej kontroli pojedynczych neuronów piramidowych in vivo

Różne powłoki elektrod wpływają na wydajność rejestracji neuronowej poprzez zmiany właściwości elektrochemicznych, chemicznych i mechanicznych. Porównanie elektrod in vitro jest stosunkowo proste, jednak porównanie odpowiedzi in vivo jest zwykle skomplikowane ze względu na różnice w odległości między elektrodami a neuronami oraz między zwierzętami. Ten artykuł zawiera solidną metodę porównywania elektrod do rejestracji neuronowej.

Metoda systematycznej oceny elektrochemicznej i elektrofizjologicznej elektrod rejestrujących działanie neuronów

Optogenetyka stała się potężnym narzędziem do wykorzystania w eksperymentach neuronauki behawioralnej. Protokół ten oferuje przewodnik krok po kroku po projektowaniu i konfiguracji systemów laserowych oraz zapewnia pełny protokół przeprowadzania wielokrotnych i jednoczesnych stymulacji optogenetycznych in vivo zgodnych z większością paradygmatów testów behawioralnych gryzoni.

In vivo (in vivo) Stymulacja optogenetyczna ośrodkowego układu nerwowego gryzoni

Tutaj opisujemy naszą strategię uzyskiwania stabilnych, dobrze izolowanych pojedynczych nagrań jednostkowych ze zidentyfikowanych interneuronów hamujących w znieczulonej korze myszy. Neurony wyrażające ChR2 są identyfikowane na podstawie ich reakcji na niebieskie światło. Metoda wykorzystuje standardowy zewnątrzkomórkowy sprzęt rejestrujący i służy jako niedroga alternatywa dla obrazowania wapnia lub wizualnie sterowanego łatania.

Przewodnik po jednojednostkowym zapisie in vivo z optogenetycznie zidentyfikowanych korowych interneuronów hamujących

Ta praca wprowadza metodę niezawodnego wykonywania optogenetycznego zapisu pojedynczej jednostki z obudzonej myszy za pomocą specjalnie wykonanej szklanej optrody.

Optogenetyka Identyfikacja typu neuronalnego za pomocą szklanej optrody u obudzonych myszy

Opracowaliśmy uproszczone i opłacalne podejście do produkcji elektrod i przeprowadziliśmy zapisy sygnałów w wielu regionach u swobodnie poruszających się myszy. Wykorzystanie optogenetyki, wraz z elektrofizjologią wieloregionalną i rejestracją sygnału wapnia, umożliwiło ujawnienie aktywności neuronalnej w różnych regionach w modelu rozpalania napadów.

Zintegrowana metoda tworzenia elastycznych i wygodnych optymór elektrofizjologicznych do wieloregionalnego zapisu in vivo

Tutaj prezentujemy dwa protokoły do rejestracji mikro-elektrokortykografii o wysokiej gęstości (μEcoG) u szczurów i myszy, w tym metody chirurgiczne, implantacyjne i rejestracyjne. Zapisy μECoG są wykonywane w połączeniu z zapisem laminarnej politrody w korze słuchowej szczura lub z optogenetycznym manipulowaniem aktywnością neuronalną w korze somatosensorycznej myszy.

Wieloskalowe badania przetwarzania kory mózgowej poprzez integrację politrod laminarnych i optogenetyki z mikroelektrokortykografią u gryzoni

Ten protokół zapewnia zintegrowaną metodę, która obejmuje dostarczenie wirusowe, implantację optrodu, indukcję fototrombotyczną, jednoczesne rejestrowanie aktywności astrocytów i neuronów oraz optogenetyczną stymulację astrocytów. Ta zintegrowana metoda ma na celu zapewnienie jednoczesnego badania relacji astrocyt-neuron na wszystkich etapach przewlekłych udaru niedokrwiennego.

Zintegrowana metoda modelowania udaru fototrombotycego i in vivo rejestracji optrodem aktywności neuronowej i astrocytów u myszy wykonujących zachowania

Poznaj system optrodowy LED do jednoczesnej stymulacji optogenetycznej i rejestracji elektrofizjologicznej u myszy transgenicznych. Ta metoda umożliwia badanie odpowiedzi neuronowych związanych z zachowaniem.

Matryca optrodowa do jednoczesnej modulacji optogenetycznej i elektrycznego zapisu neuronowego

Przeglądaj więcej filmów