Name: Izolacja i analiza funkcjonalna śródbłonka tętniczego miąższu mózgu myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 40 s
Description: Poznaj izolację śródbłonka tętniczek miąższu mózgu myszy do badań regulacji przepływu krwi mózgowej. Metoda umożliwia analizę sygnałowania wewnątrzkomórkowego w żywych komórkach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie zostało wsparte grantami z National Institutes of Health (R00AG047198 & R56AG062169 EJB; R00HL140106 do PWP) oraz Alzheimer's Association (AZRGD-21-805835 do PWP). Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i niekoniecznie reprezentują one oficjalne poglądy National Institutes of Health lub Alzheimer's Association.

<ol><li>Fernandez-Klett, F., Offenhauser, N., Dirnagl, U., Priller, J., Lindauer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericytes+in+capillaries+are+contractile+in+vivo%2C+but+arterioles+mediate+functional+hyperemia+in+the+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Pericytes in capillaries are contractile in vivo, but arterioles mediate functional hyperemia in the mouse brain.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (51), 22290-22295 (2010).</li>
<li>Longden, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capillary+K%2B-sensing+initiates+retrograde+hyperpolarization+to+increase+local+cerebral+blood+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Capillary K+-sensing initiates retrograde hyperpolarization to increase local cerebral blood flow.</a> Nature Neuroscience. 20 (5), 717-726 (2017).</li>
<li>Kelleher, R. J., Soiza, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+of+endothelial+dysfunction+in+the+development+of+Alzheimer%27s+disease%3A+Is+Alzheimer%27s+a+vascular+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Cardiovascular+Disease%22%5BJournal%5D)">Evidence of endothelial dysfunction in the development of Alzheimer's disease: Is Alzheimer's a vascular disorder.</a> American Journal of Cardiovascular Disease. 3 (4), 197-226 (2013).</li>
<li>Hakim, M. A., Behringer, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+Alzheimer%27s+disease+progressively+alters+sex-dependent+KCa+and+sex-independent+KIR+channel+function+in+cerebrovascular+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Alzheimers+Disease%22%5BJournal%5D)">Development of Alzheimer's disease progressively alters sex-dependent KCa and sex-independent KIR channel function in cerebrovascular endothelium.</a> Journal of Alzheimers Disease. 76 (4), 1423-1442 (2020).</li>
<li>Pires, P. W., Earley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroprotective+effects+of+TRPA1+channels+in+the+cerebral+endothelium+following+ischemic+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22elife%22%5BJournal%5D)">Neuroprotective effects of TRPA1 channels in the cerebral endothelium following ischemic stroke.</a> elife. 7, 35316(2018).</li>
<li>Mughal, A., Harraz, O. F., Gonzales, A. L., Hill-Eubanks, D., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PIP2+improves+cerebral+blood+flow+in+a+mouse+model+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Function%22%5BJournal%5D)">PIP2 improves cerebral blood flow in a mouse model of Alzheimer's disease.</a> Function. 2 (2), (2021).</li>
<li>Zhao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacologically+reversible+zonation-dependent+endothelial+cell+transcriptomic+changes+with+neurodegenerative+disease+associations+in+the+aged+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Pharmacologically reversible zonation-dependent endothelial cell transcriptomic changes with neurodegenerative disease associations in the aged brain.</a> Nature Communications. 11 (1), 4413(2020).</li>
<li>Peters, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid-beta+disrupts+unitary+calcium+entry+through+endothelial+NMDA+receptors+in+mouse+cerebral+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Amyloid-beta disrupts unitary calcium entry through endothelial NMDA receptors in mouse cerebral arteries.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. , (2021).</li>
<li>De Silva, T. M., Modrick, M. L., Dabertrand, F., Faraci, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+cerebral+arteries+and+parenchymal+arterioles+with+aging%3A+Role+of+rho+kinase+2+and+impact+of+genetic+background%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Changes in cerebral arteries and parenchymal arterioles with aging: Role of rho kinase 2 and impact of genetic background.</a> Hypertension. 71 (5), 921-927 (2018).</li>
<li>Fontaine, J. T., Rosehart, A. C., Joutel, A., Dabertrand, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HB-EGF+depolarizes+hippocampal+arterioles+to+restore+myogenic+tone+in+a+genetic+model+of+small+vessel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Ageing+and+Development%22%5BJournal%5D)">HB-EGF depolarizes hippocampal arterioles to restore myogenic tone in a genetic model of small vessel disease.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 192, 111389(2020).</li>
<li>Pires, P. W., Dabertrand, F., Earley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+cannulation+of+cerebral+parenchymal+arterioles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Isolation and cannulation of cerebral parenchymal arterioles.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (111), e53835(2016).</li>
<li>Rosehart, A. C., Johnson, A. C., Dabertrand, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+pressurized+hippocampal+capillary-parenchymal+arteriole+preparation+for+functional+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Ex vivo pressurized hippocampal capillary-parenchymal arteriole preparation for functional study.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (154), e60676(2019).</li>
<li>Hakim, M. A., Behringer, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+measurements+of+intracellular+calcium+and+membrane+potential+in+freshly+isolated+and+intact+mouse+cerebral+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Simultaneous measurements of intracellular calcium and membrane potential in freshly isolated and intact mouse cerebral endothelium.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (143), e58832(2019).</li>
<li>Hakim, M. A., Chum, P. P., Buchholz, J. N., Behringer, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+alters+cerebrovascular+endothelial+GPCR+and+K%2B+channel+function%3A+Divergent+role+of+biological+sex%5BTitle%5D)+AND+%22Journals+of+Gerontology%2C+Series+A%3A+Biological+Sciences+and+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Aging alters cerebrovascular endothelial GPCR and K+ channel function: Divergent role of biological sex.</a> Journals of Gerontology, Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 75 (11), 2064-2073 (2020).</li>
<li>Behringer, E. J., Hakim, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+interaction+among+KCa+and+TRP+channels+for+cardiovascular+physiology%3A+Modern+perspectives+on+aging+and+chronic+disease%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Functional interaction among KCa and TRP channels for cardiovascular physiology: Modern perspectives on aging and chronic disease.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (6), 1380(2019).</li>
<li>Marrelli, S. P., Eckmann, M. S., Hunte, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+endothelial+intermediate+conductance+KCa+channels+in+cerebral+EDHF-mediated+dilations%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Role of endothelial intermediate conductance KCa channels in cerebral EDHF-mediated dilations.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 285 (4), 1590-1599 (2003).</li>
<li>Hannah, R. M., Dunn, K. M., Bonev, A. D., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+SKCa+and+IKCa+channels+regulate+brain+parenchymal+arteriolar+diameter+and+cortical+cerebral+blood+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Endothelial SKCa and IKCa channels regulate brain parenchymal arteriolar diameter and cortical cerebral blood flow.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 31 (5), 1175-1186 (2011).</li>
<li>Hakim, M. A., Buchholz, J. N., Behringer, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+dynamics+of+isolated+cerebral+and+skeletal+muscle+endothelial+tubes%3A+Differential+roles+of+G-protein-coupled+receptors+and+K%2B+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacological+Research+and+Perspectives%22%5BJournal%5D)">Electrical dynamics of isolated cerebral and skeletal muscle endothelial tubes: Differential roles of G-protein-coupled receptors and K+ channels.</a> Pharmacological Research and Perspectives. 6 (2), 00391(2018).</li>
<li>Hakim, M. A., Behringer, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methyl-beta-cyclodextrin+restores+KIR+channel+function+in+brain+endothelium+of+female+Alzheimer%27s+disease+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Alzheimers+Disease+Reports%22%5BJournal%5D)">Methyl-beta-cyclodextrin restores KIR channel function in brain endothelium of female Alzheimer's disease Mice.</a> Journal of Alzheimers Disease Reports. 5 (1), 693-703 (2021).</li>
<li>Behringer, E. J., Shaw, R. L., Westcott, E. B., Socha, M. J., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+impairs+electrical+conduction+along+endothelium+of+resistance+arteries+through+enhanced+Ca2%2B-activated+K%2B+channel+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis+Thrombosis+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Aging impairs electrical conduction along endothelium of resistance arteries through enhanced Ca2+-activated K+ channel activation.</a> Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 33 (8), 1892-1901 (2013).</li>
<li>Attems, J., Jellinger, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+overlap+between+vascular+disease+and+Alzheimer%27s+disease--lessons+from+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Medicine%22%5BJournal%5D)">The overlap between vascular disease and Alzheimer's disease--lessons from pathology.</a> BMC Medicine. 12, 206(2014).</li>
<li>Fisher, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+arterial+lesions+underlying+lacunes%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">The arterial lesions underlying lacunes.</a> Acta Neuropathologica. 12 (1), 1-15 (1968).</li>
<li>Behringer, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+and+electrical+signaling+in+arterial+endothelial+tubes%3A+New+insights+into+cellular+physiology+and+cardiovascular+function%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Calcium and electrical signaling in arterial endothelial tubes: New insights into cellular physiology and cardiovascular function.</a> Microcirculation. 24 (3), (2017).</li>
<li>Dunn, K. M., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurovascular+signaling+in+the+brain+and+the+pathological+consequences+of+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Neurovascular signaling in the brain and the pathological consequences of hypertension.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 306 (1), 1-14 (2014).</li>
<li>Cipolla, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+pressure-induced+tone+in+rat+parenchymal+arterioles+vs.+middle+cerebral+arteries%3A+role+of+ion+channels+and+calcium+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">Increased pressure-induced tone in rat parenchymal arterioles vs. middle cerebral arteries: role of ion channels and calcium sensitivity.</a> Journal of Applied Physiology. 117 (1), 53-59 (2014).</li>
<li>Cipolla, M. J., Smith, J., Kohlmeyer, M. M., Godfrey, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SKCa+and+IKCa+Channels%2C+myogenic+tone%2C+and+vasodilator+responses+in+middle+cerebral+arteries+and+parenchymal+arterioles%3A+effect+of+ischemia+and+reperfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">SKCa and IKCa Channels, myogenic tone, and vasodilator responses in middle cerebral arteries and parenchymal arterioles: effect of ischemia and reperfusion.</a> Stroke. 40 (4), 1451-1457 (2009).</li>
<li>Chen, Y. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signal+profiles+in+vascular+endothelium+from+Cdh5-GCaMP8+and+Cx40-GCaMP2+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Vascular+Research%22%5BJournal%5D)">Calcium signal profiles in vascular endothelium from Cdh5-GCaMP8 and Cx40-GCaMP2 mice.</a> Journal of Vascular Research. 58 (3), 159-171 (2021).</li>
<li>Bando, Y., Sakamoto, M., Kim, S., Ayzenshtat, I., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+evaluation+of+genetically+encoded+voltage+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Comparative evaluation of genetically encoded voltage indicators.</a> Cell Reports. 26 (3), 802-813 (2019).</li>
<li>Pires, P. W., Sullivan, M. N., Pritchard, H. A., Robinson, J. J., Earley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unitary+TRPV3+channel+Ca2%2B+influx+events+elicit+endothelium-dependent+dilation+of+cerebral+parenchymal+arterioles%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Unitary TRPV3 channel Ca2+ influx events elicit endothelium-dependent dilation of cerebral parenchymal arterioles.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 309 (12), 2031-2041 (2015).</li>
<li>Behringer, E. J., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuning+electrical+conduction+along+endothelial+tubes+of+resistance+arteries+through+Ca2%2B-activated+K%2B+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Tuning electrical conduction along endothelial tubes of resistance arteries through Ca2+-activated K+ channels.</a> Circulation Research. 110 (10), 1311-1321 (2012).</li>
<li>Behringer, E. J., Socha, M. J., Polo-Parada, L., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+conduction+along+endothelial+cell+tubes+from+mouse+feed+arteries%3A+confounding+actions+of+glycyrrhetinic+acid+derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Electrical conduction along endothelial cell tubes from mouse feed arteries: confounding actions of glycyrrhetinic acid derivatives.</a> British Journal of Pharmacology. 166 (2), 774-787 (2012).</li>
<li>Thomsen, M. S., Routhe, L. J., Moos, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+vascular+basement+membrane+in+the+healthy+and+pathological+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+of+Blood+Flow+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">The vascular basement membrane in the healthy and pathological brain.</a> Journal of Cerebral of Blood Flow and Metabolism. 37 (10), 3300-3317 (2017).</li>
<li>Jambusaria, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+heterogeneity+across+distinct+vascular+beds+during+homeostasis+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22elife%22%5BJournal%5D)">Endothelial heterogeneity across distinct vascular beds during homeostasis and inflammation.</a> elife. 9, 51413(2020).</li>
<li>Diaz-Otero, J. M., Garver, H., Fink, G. D., Jackson, W. F., Dorrance, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+is+associated+with+changes+to+the+biomechanical+properties+of+the+posterior+cerebral+artery+and+parenchymal+arterioles%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Aging is associated with changes to the biomechanical properties of the posterior cerebral artery and parenchymal arterioles.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 310 (3), 365-375 (2016).</li>
<li>Chen, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+endothelial+cells+are+exquisite+sensors+of+age-related+circulatory+cues%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Brain endothelial cells are exquisite sensors of age-related circulatory cues.</a> Cell Reports. 30 (13), 4418-4432 (2020).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Coraz więcej dowodów sugeruje, że choroby naczyń mózgowych (CVD), starzenie się i choroba Alzheimera są silnie ze sobą powiązane i są aktualnym tematem badań nad demencją 4,8,14,21. Jest więc oczywiste, że badania sieci naczyniowo-mózgowej miałyby szeroki wpływ na zdrowie, a jednocześnie wymagałyby ciągłych szeroko zakrojonych badań w stanach chorobowych. Od ponad 50 lat podkreśla się ogólne zn...

Tętniczki miąższowe bezpośrednio dostarczają niezbędny tlen i składniki odżywcze do mózgu1. Podczas interakcji z naczyniami włosowatymi, wysoce wazoaktywne tętniczki reagują na sygnalizację wsteczną inicjowaną przez kapilarne kanały jonowe, które wykrywają sygnały metaboliczne z określonych regionów neuronalnych2. W związku z tym, że miąższ mózgu był historycznie przedmiotem większości badań, teraz pojawiła się rola dysfunkcji śródbłonka w wyjaśnianiu mechanizmów patologicznych związanych z różnymi zaburzeniami naczyniowo-mózgowymi, które leżą u podstaw demencji (np. udar niedokrwienny, choroba Alzheimera)3,4,5,6. Śródbłonek jest integralną częścią perfuzji mózgu zgodnie z heterogenicznością genetyki, struktury i funkcji w wszystkich segmentach naczyniowych7. Tętnice Pial zostały szeroko przebadane ze względu na ich stosunkowo duży rozmiar, wysoki odcinkowy opór naczyniowy i rolę w dystrybucji przepływu krwi do leżącego poniżej mózgu8,9. W związku z tym lepsze zrozumienie mechanizmów śródbłonka tętniczek prawdopodobnie przyczyni się do lepszego zrozumienia regulacji przepływu krwi w mózgu w zdrowiu i chorobie w kierunku opracowania nowych schematów terapeutycznych.
Pojawiające się dowody podkreślają znaczenie badania tętniczek miąższowych w odniesieniu do różnych szlaków sygnałowych i chorób8,10. Jednak podejście to zostało ograniczone do użycia nienaruszonych preparatów tętniczki ciśnieniowej11 i/lub preparatów do tętniczek kapilarno-miąższowych (CaPA)12. Świeżo wyizolowane, natywne komórki śródbłonka tętniczek mózgowych pozbawione innych typów komórek i czynników zakłócających nie zostały zbadane, prawdopodobnie z powodu trudności technicznych w ich izolacji. W tym artykule rozwinięto poprzednią technikę podkreślającą izolację śródbłonka tętniczego tętniczego pialnego13, aby teraz niezawodnie i powtarzalnie izolować śródbłonek tętniczek miąższowych mózgu (szerokość: ~25 μm, długość: ~250 μm). Technika ta pomaga osiągnąć optymalną rozdzielczość elektrycznie i chemicznie sprzężonych komórek w ich indywidualnej orientacji i sieciach komórkowych.
Kluczowe interesujące szlaki obejmowały interakcję wewnątrzkomórkowej sygnalizacji Ca2+ ([Ca2+]i) oraz hiperpolaryzację potencjału błonowego (Vm)14,15—integralna z rozszerzeniem naczyń krwionośnych16—aby umożliwić krew wejście do naczyń włosowatych i dostarczenie tlenu i składników odżywczych do aktywnego miąższu17. Preparaty te pozwalają na elektrofizjologiczne zapisy kanałów jonowych, w tym kanałów przepuszczalnych dlaCa2+, przejściowego potencjału receptorowego (TRP) i K+ i/lub obrazowanie fluorescencyjne organelli wewnątrzkomórkowych w rurkach komórek śródbłonka w warunkach zbliżonych do fizjologicznych. Jest to odpowiednia technika dla badaczy zainteresowanych fizjologicznymi mechanizmami komórkowymi, które regulują kontrolę komórek śródbłonka nad dostarczaniem przepływu krwi do miąższu mózgu. Podsumowując, technika ta pomoże naukowcom lepiej zrozumieć podstawowe szlaki sygnałowe śródbłonka i komunikację sieciową tętniczek osadzonych w miąższu mózgu, jednocześnie odpowiadając na pytania związane z fizjologią i patologią naczyń mózgowych.

<table><tbody><tr><td>Wzmacniacze</td><td>Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA</td><td>Axoclamp 2B & Axoclamp 900A</td><td></td></tr><tr><td>Dźwiękowe monitory bazowe</td><td>Ampol US LLC, Sarasota, FL, USA&</td><td>nbsp; Chłodziarka kąpielowa BM-A-TM</td><td></td></tr><tr><td>(Isotemp 500LCU)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>13874647</td><td></td></tr><tr><td>Kapilary ze szkła borokrzemianowego (Pinning)</td><td>Warner Instruments</td><td>G150T-6</td><td></td></tr><tr><td>Kapilary ze szkła borokrzemianowego (elektrody Sharp)</td><td>Warner Instruments</td><td>GC100F-10</td><td></td></tr><tr><td>Kapilary ze szkła borokrzemianowego (Trituration)</td><td>World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA</td><td>1B100-4</td><td></td></tr><tr><td>BSA: Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2: Chlorek wapnia</td><td>Sigma</td><td>223506</td><td></td></tr><tr><td>kolagenaza (mieszanka typu H)</td><td>Sigma</td><td>C8051</td><td></td></tr><tr><td>Szkło nakrywkowe (2.4&nbsp; &czasy; &nbsp; 5.0&nbsp; cm)</td> <td>ThermoFisher Scientific</td><td>12-548-5M</td><td></td></tr><tr><td>Digitizer do pobierania danych</td><td>Urządzenia molekularne, Sunnyvale, CA, USA</td> Czasza preparcyjna <td>Digidata 1550A</td><td></td></tr><tr><td>(szklana Petri z dnem Sylgard z węgla drzewnego)</td> <td>Oprzyrządowanie systemów żywych, St. Albans City, VT, USA</td><td>DD-90-S-BLK</td><td></td></tr><tr><td>Ditioerytrytol</td><td>Sigma</td><td>D8255</td><td></td></tr><tr><td>DMSO: Dimetylosulfotlenek</td><td>Sigma</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Elastaza (trzustka świni)</td><td>Sigma</td><td>E7885</td><td></td></tr><tr><td>Endoplasmic Reticulum Tracker (ER-Tracker Red, BODIPY TR Glibenclamide)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>E34250</td><td></td></tr><tr><td>Światłowodowe źródła światła</td><td>&nbsp; Schott, Moguncja, Niemcy & KL200, Zeiss</td><td>Fostec 8375</td><td></td></tr><tr><td>Zawór sterujący przepływem Warner</td><td>Instruments</td><td>&nbsp; Interfejs systemu fluorescencji FR-50</td><td></td></tr><tr><td>, lampa ARC i zasilacz, hyperswitch i</td><td>urządzenia molekularne PMT, Sunnyvale, CA, USA</td><td>Kleszcze IonOptix Systems</td><td></td></tr><tr><td>(z cienką końcówką, zaostrzone)</td> <td>FST</td><td>Dumont #5 i Dumont #55</td><td></td></tr><tr><td>Function Generator</td><td>EZ Digital, Seul, Korea Południowa</td><td>FG-8002</td><td></td></tr><tr><td>Fura-2 AM dye</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA, USA</td><td>F14185</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>HCl: Kwas solny</td><td>ThermoFisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA)</td><td>A466250</td><td></td></tr><tr><td>Headstages</td><td>Molecular Urządzenia</td><td>HS-2A & HS-9A</td><td></td></tr><tr><td>HEPES: (Kwas 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowy)</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>Podgrzewacz roztworu w linii</td><td>Warner Instruments</td><td>SH-27B</td><td></td></tr><tr><td>KCl: Chlorek potasu</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2: Chlorek magnezu</td><td>Sigma</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>Microforge</td><td>Narishige, East Meadow, NY, USA</td><td>&nbsp; Mikromanipulator MF-900</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Siskiyou</td><td>&nbsp; Ściągacz do mikropipet MX10</td><td></td></tr><tr><td>(cyfrowy)</td><td>Sutter Instruments, Novato, CA, USA</td><td>Mikroskop P-97 lub P-1000</td><td></td></tr><tr><td>(odwrócony Nikon)</td><td>Nikon Instruments Inc, Melville, NY, USA</td><td>Mikroskop Ts2</td><td></td></tr><tr><td>(odwrócony Nikon)</td><td>Nikon Instruments Inc</td> Obiektywy mikroskopowe <td>Eclipse TS100</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Nikon Instruments Inc</td><td>20X (S-Fluor) i 40X (Plan Fluor)</td><td></td></tr><tr><td>Platforma mikroskopu (aluminium anodowane; średnica, 7.8&nbsp; cm)</td> <td>Warner Instruments</td> Stolik mikroskopowy <td>PM6 lub PH6</td><td></td></tr><tr><td>(aluminium)</td><td>Siskiyou, Grants Pass, OR, USA</td><td>8090P</td><td></td></tr><tr><td>Sterownik pompy mikrostrzykawkowej</td><td>World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA</td><td>SYS-MICRO4</td><td></td></tr><tr><td>MTA: sól trisodowa 2-metylotioadenozynodifosforanu</td><td>Tocris</td><td>1624</td><td></td></tr><tr><td>NaCl: Chlorek sodu</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>NaOH: Wodorotlenek sodu</td><td>Sigma</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>Barwienie jądrowe (odczynnik NucBlue Live ReadyProbes; Hoechst 33342)</td><td>Oscyloskop ThermoFisher Scientific</td><td>R37605</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Tektronix, Beaverton, Oregon, USA</td><td>&nbsp; TDS 2024B</td><td></td></tr><tr><td>Papaina</td><td>Sigma</td><td>P4762</td><td></td></tr><tr><td>Obiektywy z kontrastem fazowym</td><td>Nikon Instruments Inc</td><td>&nbsp;( Ph1 DL; 10X & 20X)</td><td></td></tr><tr><td>Barwnik błony plazmatycznej (CellMask Deep Red)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C10046</td><td></td></tr><tr><td>Komora do superfuzji z pleksiglasu</td><td>Warner Instruments, Camden, CT, USA</td><td>Nożyczki RC-27</td><td></td></tr><tr><td>(ostrza 3 mm i 7 mm)</td><td>Narzędzia do nauki precyzyjnej (lub FST), Foster City, CA, USA</td><td>Nożyczki Moria MC52 i 15000-00</td><td></td></tr><tr><td>(styl Vannas; 9.5&nbsp; mm & 3&nbsp; mm ostrzy)</td><td>World Precision Instruments</td><td>555640S, 14364</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskopy stereoskopowe</td><td>Zeiss, NY, USA</td><td>Stemi 2000 & 2000-C</td><td></td></tr><tr><td>Filtr strzykawkowy (0,22 &micro; m)</td> <td>Regulator temperatury ThermoFisher Scientific</td><td>722-2520</td><td></td></tr><tr><td>(dwukanałowy)</td><td>Warner Instruments</td><td>TC-344B lub C</td><td></td></tr><tr><td>System sterowania zaworami</td><td>Warner Instruments</td><td>VC-6</td><td></td></tr><tr><td>Stół do izolacji drgań</td><td>Produkcja techniczna, Peabody, MA, USA</td><td>&nbsp; Mikro-g</td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja i analiza funkcjonalna śródbłonka tętniczego miąższu mózgu myszy

Isolation and Functional Analysis of Arteriolar Endothelium of Mouse Brain Parenchyma

Przepływ krwi w mózgu jest przenoszony przez tętnice oporowe naczyniowe i znajdujące się poniżej tętniczki miąższowe. Opór naczyniowy w stanie ustalonym na przepływ krwi wzrasta wraz ze zmniejszaniem się średnicy od tętnic do tętniczek, które ostatecznie zasilają naczynia włosowate. Ze względu na ich mniejszy rozmiar i umiejscowienie w miąższu, tętniczki były stosunkowo słabo zbadane i miały mniejszą odtwarzalność wyników niż tętnice powierzchniowe. Niezależnie od tego, struktura i funkcja komórek śródbłonka tętniczek - integralna część fizjologii i etiologii przewlekłych chorób zwyrodnieniowych - wymaga szeroko zakrojonych badań. W szczególności pojawiające się dowody wskazują, że upośledzona funkcja śródbłonka poprzedza i nasila upośledzenie funkcji poznawczych i demencję.
W mikrokrążeniu miąższowym, funkcja kanału K+ w śródbłonku jest najmocniejszym bodźcem do precyzyjnego kontrolowania rozprzestrzeniania się rozszerzenia naczyń krwionośnych, aby promować wzrost przepływu krwi do obszarów aktywności neuronalnej. Niniejsza praca ilustruje udoskonaloną metodę świeżo izolowanej nienaruszonej i elektrycznie sprzężonej "rurek" śródbłonka (średnica, ~25 μm) z tętniczek miąższowych mózgu myszy. Śródbłonek tętnic jest zabezpieczany w warunkach fizjologicznych (37 °C, pH 7,4) w celu rozwiązania zmiennych eksperymentalnych, które obejmują funkcję kanału K + i ich regulację, w tym wewnątrzkomórkową dynamikę Ca2 +, zmiany potencjału błonowego i regulację lipidów błonowych. Wyraźną zaletą techniczną w porównaniu ze śródbłonkiem tętniczym jest zwiększona rozdzielczość morfologiczna wymiarów komórek i organelli (np. mitochondriów), co zwiększa użyteczność tej techniki. Zdrowa perfuzja mózgowa przez całe życie pociąga za sobą silną funkcję śródbłonka w tętniczkach miąższowych, bezpośrednio łącząc przepływ krwi z napędzaniem aktywności neuronalnej i glejowej w precyzyjnych obszarach anatomicznych mózgu. W związku z tym oczekuje się, że metoda ta znacznie poszerzy ogólną wiedzę na temat fizjologii naczyń krwionośnych i neurologii dotyczącej zdrowego i chorego mózgu.

Prezentacja protokołu została przedstawiona w Rysunek 1 z etapami wyizolowania rurek śródbłonkowych oraz wypreparowania arteriol jako Rysunek 2 i Rysunek 3odpowiednio. W niniejszym badaniu funkcję śródbłonka oceniano poprzez pomiar [Ca2+]i oraz Vm wykorzystując fotometrię z użyciem Fura-2 oraz elektrofizjologię z użyciem mikroelektrod (Rysunek 4A) w odpowiedzi na czynnik...

Intensywne przygotowanie nienaruszonych "rurek" śródbłonka mózgu myszy z tętniczek miąższowych mózgu jest zilustrowane do badania regulacji przepływu krwi w mózgu. Ponadto pokazujemy eksperymentalne mocne strony tego modelu badania śródbłonka do obrazowania fluorescencyjnego i pomiaru elektrofizjologii kluczowych szlaków sygnalizacji komórkowej, w tym zmian wewnątrzkomórkowych [Ca2+] i potencjału błonowego.

Izolacja i analiza funkcjonalna śródbłonka tętniczego miąższu mózgu myszy

Cerebral blood flow is conveyed by vascular resistance arteries and downstream parenchymal arterioles. Steady-state vascular resistance to blood flow ...

Metoda ta zapewni lepszy wgląd w funkcję śródbłonka tętniczek miąższowych, który bezpośrednio łączy śródbłonek śródczaszkowy z napędzaniem aktywności neuronalnej i glejowej w całym mózgu. Wyraźną przewagą techniczną nad śródbłonkiem tętniczki jest zwiększona rozdzielczość wymiarów morfologicznych oraz sygnalizacji wapniowej i elektrycznej między poszczególnymi komórkami śródbłonka śródmózgowego i ich odpowiednimi organellami. Początkowo izolacja i badanie śródbłonka śródmózgowego będzie bardzo trudne.Jednak możliwe jest opanowanie tej techniki przy dużej ilości praktyki, której towarzyszy cierpliwość i poświęcenie. Umyj wyizolowany mózg zimnym roztworem preparacyjnym w zlewce lub szalce Petriego, aby usunąć pozostałą krew z powierzchni mózgu. Umieść brzuszną stronę mózgu skierowaną do góry w komorze zawierającej zimny roztwór preparacyjny w celu wyizolowania tętniczek miąższowych.Aby wyizolować tętniczki miąższowe, zabezpiecz izolowany mózg stalowymi szpilkami w zimnym roztworze preparacyjnym na szalce Petriego zawierającej ponad 50-centymetrową powłokę z polimeru krzemowego nasączoną węglem drzewnym. Wytnij prostokąt tkanki mózgowej z obu półkul ostrymi i wyrównanymi nożyczkami preparacyjnymi wokół MCA, upewniając się, że górna część segmentu tkanki znajduje się poza punktem rozgałęzienia od okręgu Willisa. Przymocuj tkankę mózgową do naczynia z MCA skierowanym do góry za pomocą stalowych kołków.Ostrożnie wykonaj płytkie nacięcie w pobliżu szpilek i usuń pia małymi kleszkami, delikatnie złuszczając od jednego końca w kierunku drugiego. Ostrożnie zabezpiecz izolowaną pia z tętniczkami miąższowymi rozgałęzionymi od MCA w naczyniu za pomocą szpilek i ostrożnie wypreparuj tętniczki miąższowe. Odetnij wszelkie pozostałe dystalne gałęzie i upewnij się, że tętniczka jest czysta i nie ma przyczepionej tkanki.Użyj tej czystej, nienaruszonej tętniczki do trawienia enzymatycznego. Alternatywnie, pokrój każdą tętniczkę na dwie części w celu trawienia enzymatycznego, aby w razie potrzeby przygotować rurki śródbłonka. W celu częściowego wytrawienia segmentów tętniczek należy umieścić nienaruszone segmenty tętniczek w jednym mililitrze roztworu dysocjacyjnego w 10-mililitrowej szklanej probówce zawierającej papainę, ditioerytrytol, kolagenazę i elastazę.Inkubować segmenty tętniczek w temperaturze 34 stopni Celsjusza przez 10 do 12 minut. Aby wyizolować śródbłonek tętniczki, należy umieścić pipetę do wycierania dołączoną do iniektora mikrostrzykawki w roztworze dysocjacyjnym w komorze i umieścić ją blisko jednego końca strawionego segmentu naczynia. Ustaw szybkość w zakresie od jednego do trzech nanolitrów na sekundę na sterowniku pompy, aby uzyskać delikatne rozcieranie.Utrzymując powiększenie od 100X do 200X, wycofaj segment tętniczki do pipety, a następnie wstrzyknij, aby dysocjować przydanki i komórki mięśni gładkich. Dziel odcinek naczynia, aż wszystkie komórki mięśni gładkich zostaną zdysocjowane i tylko komórki śródbłonka pozostaną jako nienaruszona rurka. Za pomocą mikromanipulatorów zabezpiecz każdy koniec rurki śródbłonka na szklanym szkiełku nakrywkowym w komorze za pomocą pipet przypinających ze szkła borokrzemianowego Aby zmierzyć potencjał błony śródbłonka, patrząc przez obiektyw 4X, ostrożnie umieść ostrą końcówkę elektrody tuż nad komórką śródbłonka tętniczki w przepływającym roztworze soli fizjologicznej za pomocą mikromanipulatora.Stopniowo zwiększaj powiększenie do 400X i w razie potrzeby zmień położenie końcówki elektrody. Za pomocą mikromanipulatora delikatnie włóż końcówkę ostrej elektrody do jednej z komórek rurki śródbłonka i rozpocznij rejestrację VM za pomocą elektrometru. Gdy VM spoczynku śródbłonka ustabilizuje się z minus 30 do minus 40 miliwoltów, zastosuj pożądane środki farmakologiczne zgodnie z celem eksperymentalnym.Załaduj rurkę śródbłonka za pomocą urządzenia do śledzenia fluorescencji błony plazmatycznej lub pożądanych organelli w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 do 30 minut. Umyj komórki świeżym roztworem soli fizjologicznej superfuzyjnej i zobrazuj żywe komórki pod mikroskopem na długości fali wzbudzenia odpowiednich barwników. Funkcję śródbłonka oceniano, mierząc wewnątrzkomórkowy potencjał wapnia i błony w odpowiedzi na środek farmakologiczny MTA, silnego agonistę receptora purynergicznego w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Po zastosowaniu jednego mikromolowego MTA wewnątrzkomórkowe stężenie wapnia gwałtownie wzrasta z towarzyszącą hiperpolaryzacją. Co więcej, nienaruszony śródbłonek inkubowano w temperaturze 37 stopni Celsjusza za pomocą fluorescencyjnych trackerów w celu wizualizacji w celu zbadania morfologii komórek. Obrazowanie żywych komórek śródbłonka wykazało współbarwienie błony plazmatycznej i jąder.Błona plazmatyczna została wybarwiona razem z fluorescencyjnym barwnikiem retikulum endoplazmatycznego, przy czym obszary pozornego nakładania się ER w pobliżu błony plazmatycznej wydają się pomarańczowe. Eksperymentator powinien zachować ostrożność podczas sekcji i izolacji, aby uniknąć uszkodzenia tętniczek, ponieważ uszkodzona tętniczka na pewno nie da nienaruszonego śródbłonka. Po zabiegu komórki mogą być wykorzystane do utrwalonej immunohistochemii z przeciwciałami fluorescencyjnymi lub barwienia żywych komórek organelli i lipidów błonowych.Technika ta pozwoli na uzyskanie nowych informacji pozwalających zrozumieć mechanizmy leżące u podstaw przepływu krwi w mózgu na podstawowym poziomie fizjologii i wybrać przejścia w kierunku patologii do terapii.

isolation-functional-analysis-arteriolar-endothelium-mouse-brain

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ten film pokazuje izolację nienaruszonych naczyń z mózgu myszy, które tworzą barierę krew-mózg (BBB) wraz z neuronami i komórkami glejowymi. Wyizolowane naczynia mogą być wykorzystane jako model in vitro do zbadania ich roli w utrzymaniu homeostazy mózgu.

Izolowanie naczyń mózgowych myszy: protokół izolowania nienaruszonych naczyń z próbki mózgu myszy

Ten film demonstruje metodę izolowania przewodów śródbłonkowych od miąższu mózgu myszy. Dzięki połączeniu trawienia enzymatycznego i dysocjacji mechanicznej, proces ten daje nienaruszoną rurkę z komórkami śródbłonka.

Przygotowanie śródbłonka mózgowego z tętniczek miąższowych myszy

Źródło: Hakim, M. A.  i inni., Izolacja i analiza funkcjonalna śródbłonka tętniczego miąższu mózgu myszy. J. Vis. Exp. (2022). Ten film przedstawia analizę funkcjonalną śródbłonka tętniczki wyizolowanej z mózgu myszy. Przedstawiono w nim etapy pomiaru wewnątrzkomórkowego poziomu wapnia i potencjału błonowego, zarówno na początku badania, jak i w odpowiedzi na stymulację farmakologiczną.

Analiza dynamiki wapnia i zmian potencjału błonowego w śródbłonku tętniczym myszy

Komórki śródbłonka mikronaczyniowego mózgu (BMEC) są połączone specyficznymi białkami połączeniowymi, tworząc wysoce regulowaną barierę oddzielającą krew od ośrodkowego układu nerwowego (OUN), tak zwaną barierę krew-mózg (BBB). Izolacja pierwotnych mysich komórek śródbłonka mikronaczyniowego mózgu, jak omówiono w tym protokole, umożliwia szczegółowe badania in vitro bariery krew-mózg.

Izolacja pierwotnych mysich komórek śródbłonka mikronaczyniowego mózgu

Opisujemy protokół pozwalający na oczyszczenie przedziału naczyniowego mózgu myszy. Izolowane naczynia mózgowe obejmują komórki śródbłonka połączone ścisłymi połączeniami i otoczone ciągłą blaszką podstawną, perycyty, komórki mięśni gładkich naczyń krwionośnych, a także okołonaczyniowe błony astroglejowe.

Oczyszczanie naczyń mózgowych myszy

Ten manuskrypt opisuje prosty i powtarzalny protokół izolacji tętniczek śródmózgowych (grupa naczyń krwionośnych obejmujących tętniczki miąższowe, tętniczki penetrujące i tętniczki przedkapilarne) od myszy, do wykorzystania w miografii ciśnieniowej, immunofluorescencji, biochemii i badaniach molekularnych.

Izolacja i kaniulacja tętniczek miąższowych mózgu

Izolowane naczynia włosowate mózgu z ludzkiej tkanki mózgowej mogą być użyte jako model przedkliniczny do badania funkcji bariery w warunkach fizjologicznych i patofizjologicznych. Tutaj przedstawiamy zoptymalizowany protokół izolowania naczyń włosowatych mózgu od świeżej ludzkiej tkanki mózgowej.

Izolacja naczyń włosowatych mózgu ze świeżej ludzkiej tkanki mózgowej

Ten manuskrypt opisuje prosty protokół izolacji tętniczek od siatkówki szczura, który może być wykorzystany w badaniach elektrofizjologicznych, obrazowania wapnia i miografii ciśnieniowej.

Izolacja tętniczek siatkówki do badań fizjologii komórek ex vivo

Pokazane są tutaj protokoły (1) świeżo izolowania nienaruszonych "rurek" śródbłonka mózgu oraz (2) jednoczesnych pomiarów śródbłonka wapnia i potencjału błonowego podczas hiperpolaryzacji pochodzącej ze śródbłonka. Co więcej, metody te pozwalają na farmakologiczne dostrojenie wapnia w komórkach śródbłonka i sygnalizacji elektrycznej jako indywidualnych lub interaktywnych zmiennych eksperymentalnych.

Jednoczesne pomiary wewnątrzkomórkowego potencjału wapnia i błony w świeżo wyizolowanym i nienaruszonym śródbłonku mózgowym myszy

Niniejszy manuskrypt szczegółowo opisuje, jak izolować tętniczki i naczynia włosowate hipokampa od mózgu myszy oraz jak zwiększać w nich ciśnienie do miografii ciśnieniowej, immunofluorescencji, biochemii i badań molekularnych.

Przygotowanie tętniczki kapilarno-miąższowej hipokampa pod ciśnieniem do badania funkcjonalnego

Poznaj izolację śródbłonka tętniczek miąższu mózgu myszy do badań regulacji przepływu krwi mózgowej. Metoda umożliwia analizę sygnałowania wewnątrzkomórkowego w żywych komórkach.

Izolacja i analiza funkcjonalna śródbłonka tętniczego miąższu mózgu myszy

Przeglądaj więcej filmów