Izolacja i analiza funkcjonalna śródbłonka tętniczego miąższu mózgu myszy

Metoda ta zapewni lepszy wgląd w funkcję śródbłonka tętniczek miąższowych, który bezpośrednio łączy śródbłonek śródczaszkowy z napędzaniem aktywności neuronalnej i glejowej w całym mózgu. Wyraźną przewagą techniczną nad śródbłonkiem tętniczki jest zwiększona rozdzielczość wymiarów morfologicznych oraz sygnalizacji wapniowej i elektrycznej między poszczególnymi komórkami śródbłonka śródmózgowego i ich odpowiednimi organellami. Początkowo izolacja i badanie śródbłonka śródmózgowego będzie bardzo trudne.

Jednak możliwe jest opanowanie tej techniki przy dużej ilości praktyki, której towarzyszy cierpliwość i poświęcenie. Umyj wyizolowany mózg zimnym roztworem preparacyjnym w zlewce lub szalce Petriego, aby usunąć pozostałą krew z powierzchni mózgu. Umieść brzuszną stronę mózgu skierowaną do góry w komorze zawierającej zimny roztwór preparacyjny w celu wyizolowania tętniczek miąższowych.

Aby wyizolować tętniczki miąższowe, zabezpiecz izolowany mózg stalowymi szpilkami w zimnym roztworze preparacyjnym na szalce Petriego zawierającej ponad 50-centymetrową powłokę z polimeru krzemowego nasączoną węglem drzewnym. Wytnij prostokąt tkanki mózgowej z obu półkul ostrymi i wyrównanymi nożyczkami preparacyjnymi wokół MCA, upewniając się, że górna część segmentu tkanki znajduje się poza punktem rozgałęzienia od okręgu Willisa. Przymocuj tkankę mózgową do naczynia z MCA skierowanym do góry za pomocą stalowych kołków.

Ostrożnie wykonaj płytkie nacięcie w pobliżu szpilek i usuń pia małymi kleszkami, delikatnie złuszczając od jednego końca w kierunku drugiego. Ostrożnie zabezpiecz izolowaną pia z tętniczkami miąższowymi rozgałęzionymi od MCA w naczyniu za pomocą szpilek i ostrożnie wypreparuj tętniczki miąższowe. Odetnij wszelkie pozostałe dystalne gałęzie i upewnij się, że tętniczka jest czysta i nie ma przyczepionej tkanki.

Użyj tej czystej, nienaruszonej tętniczki do trawienia enzymatycznego. Alternatywnie, pokrój każdą tętniczkę na dwie części w celu trawienia enzymatycznego, aby w razie potrzeby przygotować rurki śródbłonka. W celu częściowego wytrawienia segmentów tętniczek należy umieścić nienaruszone segmenty tętniczek w jednym mililitrze roztworu dysocjacyjnego w 10-mililitrowej szklanej probówce zawierającej papainę, ditioerytrytol, kolagenazę i elastazę.

Inkubować segmenty tętniczek w temperaturze 34 stopni Celsjusza przez 10 do 12 minut. Aby wyizolować śródbłonek tętniczki, należy umieścić pipetę do wycierania dołączoną do iniektora mikrostrzykawki w roztworze dysocjacyjnym w komorze i umieścić ją blisko jednego końca strawionego segmentu naczynia. Ustaw szybkość w zakresie od jednego do trzech nanolitrów na sekundę na sterowniku pompy, aby uzyskać delikatne rozcieranie.

Utrzymując powiększenie od 100X do 200X, wycofaj segment tętniczki do pipety, a następnie wstrzyknij, aby dysocjować przydanki i komórki mięśni gładkich. Dziel odcinek naczynia, aż wszystkie komórki mięśni gładkich zostaną zdysocjowane i tylko komórki śródbłonka pozostaną jako nienaruszona rurka. Za pomocą mikromanipulatorów zabezpiecz każdy koniec rurki śródbłonka na szklanym szkiełku nakrywkowym w komorze za pomocą pipet przypinających ze szkła borokrzemianowego Aby zmierzyć potencjał błony śródbłonka, patrząc przez obiektyw 4X, ostrożnie umieść ostrą końcówkę elektrody tuż nad komórką śródbłonka tętniczki w przepływającym roztworze soli fizjologicznej za pomocą mikromanipulatora.

Stopniowo zwiększaj powiększenie do 400X i w razie potrzeby zmień położenie końcówki elektrody. Za pomocą mikromanipulatora delikatnie włóż końcówkę ostrej elektrody do jednej z komórek rurki śródbłonka i rozpocznij rejestrację VM za pomocą elektrometru. Gdy VM spoczynku śródbłonka ustabilizuje się z minus 30 do minus 40 miliwoltów, zastosuj pożądane środki farmakologiczne zgodnie z celem eksperymentalnym.

Załaduj rurkę śródbłonka za pomocą urządzenia do śledzenia fluorescencji błony plazmatycznej lub pożądanych organelli w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 do 30 minut. Umyj komórki świeżym roztworem soli fizjologicznej superfuzyjnej i zobrazuj żywe komórki pod mikroskopem na długości fali wzbudzenia odpowiednich barwników. Funkcję śródbłonka oceniano, mierząc wewnątrzkomórkowy potencjał wapnia i błony w odpowiedzi na środek farmakologiczny MTA, silnego agonistę receptora purynergicznego w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Po zastosowaniu jednego mikromolowego MTA wewnątrzkomórkowe stężenie wapnia gwałtownie wzrasta z towarzyszącą hiperpolaryzacją. Co więcej, nienaruszony śródbłonek inkubowano w temperaturze 37 stopni Celsjusza za pomocą fluorescencyjnych trackerów w celu wizualizacji w celu zbadania morfologii komórek. Obrazowanie żywych komórek śródbłonka wykazało współbarwienie błony plazmatycznej i jąder.

Błona plazmatyczna została wybarwiona razem z fluorescencyjnym barwnikiem retikulum endoplazmatycznego, przy czym obszary pozornego nakładania się ER w pobliżu błony plazmatycznej wydają się pomarańczowe. Eksperymentator powinien zachować ostrożność podczas sekcji i izolacji, aby uniknąć uszkodzenia tętniczek, ponieważ uszkodzona tętniczka na pewno nie da nienaruszonego śródbłonka. Po zabiegu komórki mogą być wykorzystane do utrwalonej immunohistochemii z przeciwciałami fluorescencyjnymi lub barwienia żywych komórek organelli i lipidów błonowych.

Technika ta pozwoli na uzyskanie nowych informacji pozwalających zrozumieć mechanizmy leżące u podstaw przepływu krwi w mózgu na podstawowym poziomie fizjologii i wybrać przejścia w kierunku patologii do terapii.