Izolacja i analiza funkcjonalna śródbłonka tętniczego miąższu mózgu myszy
11 marca 2022
Intensywne przygotowanie nienaruszonych "rurek" śródbłonka mózgu myszy z tętniczek miąższowych mózgu jest zilustrowane do badania regulacji przepływu krwi w mózgu. Ponadto pokazujemy eksperymentalne mocne strony tego modelu badania śródbłonka do obrazowania fluorescencyjnego i pomiaru elektrofizjologii kluczowych szlaków sygnalizacji komórkowej, w tym zmian wewnątrzkomórkowych [Ca2+] i potencjału błonowego.
Metoda ta zapewni lepszy wgląd w funkcję śródbłonka tętniczek miąższowych, który bezpośrednio łączy śródbłonek śródczaszkowy z napędzaniem aktywności neuronalnej i glejowej w całym mózgu. Wyraźną przewagą techniczną nad śródbłonkiem tętniczki jest zwiększona rozdzielczość wymiarów morfologicznych oraz sygnalizacji wapniowej i elektrycznej między poszczególnymi komórkami śródbłonka śródmózgowego i ich odpowiednimi organellami. Początkowo izolacja i badanie śródbłonka śródmózgowego będzie bardzo trudne.
Jednak możliwe jest opanowanie tej techniki przy dużej ilości praktyki, której towarzyszy cierpliwość i poświęcenie. Umyj wyizolowany mózg zimnym roztworem preparacyjnym w zlewce lub szalce Petriego, aby usunąć pozostałą krew z powierzchni mózgu. Umieść brzuszną stronę mózgu skierowaną do góry w komorze zawierającej zimny roztwór preparacyjny w celu wyizolowania tętniczek miąższowych.
Aby wyizolować tętniczki miąższowe, zabezpiecz izolowany mózg stalowymi szpilkami w zimnym roztworze preparacyjnym na szalce Petriego zawierającej ponad 50-centymetrową powłokę z polimeru krzemowego nasączoną węglem drzewnym. Wytnij prostokąt tkanki mózgowej z obu półkul ostrymi i wyrównanymi nożyczkami preparacyjnymi wokół MCA, upewniając się, że górna część segmentu tkanki znajduje się poza punktem rozgałęzienia od okręgu Willisa. Przymocuj tkankę mózgową do naczynia z MCA skierowanym do góry za pomocą stalowych kołków.
Ostrożnie wykonaj płytkie nacięcie w pobliżu szpilek i usuń pia małymi kleszkami, delikatnie złuszczając od jednego końca w kierunku drugiego. Ostrożnie zabezpiecz izolowaną pia z tętniczkami miąższowymi rozgałęzionymi od MCA w naczyniu za pomocą szpilek i ostrożnie wypreparuj tętniczki miąższowe. Odetnij wszelkie pozostałe dystalne gałęzie i upewnij się, że tętniczka jest czysta i nie ma przyczepionej tkanki.
Użyj tej czystej, nienaruszonej tętniczki do trawienia enzymatycznego. Alternatywnie, pokrój każdą tętniczkę na dwie części w celu trawienia enzymatycznego, aby w razie potrzeby przygotować rurki śródbłonka. W celu częściowego wytrawienia segmentów tętniczek należy umieścić nienaruszone segmenty tętniczek w jednym mililitrze roztworu dysocjacyjnego w 10-mililitrowej szklanej probówce zawierającej papainę, ditioerytrytol, kolagenazę i elastazę.
Inkubować segmenty tętniczek w temperaturze 34 stopni Celsjusza przez 10 do 12 minut. Aby wyizolować śródbłonek tętniczki, należy umieścić pipetę do wycierania dołączoną do iniektora mikrostrzykawki w roztworze dysocjacyjnym w komorze i umieścić ją blisko jednego końca strawionego segmentu naczynia. Ustaw szybkość w zakresie od jednego do trzech nanolitrów na sekundę na sterowniku pompy, aby uzyskać delikatne rozcieranie.
Utrzymując powiększenie od 100X do 200X, wycofaj segment tętniczki do pipety, a następnie wstrzyknij, aby dysocjować przydanki i komórki mięśni gładkich. Dziel odcinek naczynia, aż wszystkie komórki mięśni gładkich zostaną zdysocjowane i tylko komórki śródbłonka pozostaną jako nienaruszona rurka. Za pomocą mikromanipulatorów zabezpiecz każdy koniec rurki śródbłonka na szklanym szkiełku nakrywkowym w komorze za pomocą pipet przypinających ze szkła borokrzemianowego Aby zmierzyć potencjał błony śródbłonka, patrząc przez obiektyw 4X, ostrożnie umieść ostrą końcówkę elektrody tuż nad komórką śródbłonka tętniczki w przepływającym roztworze soli fizjologicznej za pomocą mikromanipulatora.
Stopniowo zwiększaj powiększenie do 400X i w razie potrzeby zmień położenie końcówki elektrody. Za pomocą mikromanipulatora delikatnie włóż końcówkę ostrej elektrody do jednej z komórek rurki śródbłonka i rozpocznij rejestrację VM za pomocą elektrometru. Gdy VM spoczynku śródbłonka ustabilizuje się z minus 30 do minus 40 miliwoltów, zastosuj pożądane środki farmakologiczne zgodnie z celem eksperymentalnym.
Załaduj rurkę śródbłonka za pomocą urządzenia do śledzenia fluorescencji błony plazmatycznej lub pożądanych organelli w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 do 30 minut. Umyj komórki świeżym roztworem soli fizjologicznej superfuzyjnej i zobrazuj żywe komórki pod mikroskopem na długości fali wzbudzenia odpowiednich barwników. Funkcję śródbłonka oceniano, mierząc wewnątrzkomórkowy potencjał wapnia i błony w odpowiedzi na środek farmakologiczny MTA, silnego agonistę receptora purynergicznego w temperaturze 37 stopni Celsjusza.
Po zastosowaniu jednego mikromolowego MTA wewnątrzkomórkowe stężenie wapnia gwałtownie wzrasta z towarzyszącą hiperpolaryzacją. Co więcej, nienaruszony śródbłonek inkubowano w temperaturze 37 stopni Celsjusza za pomocą fluorescencyjnych trackerów w celu wizualizacji w celu zbadania morfologii komórek. Obrazowanie żywych komórek śródbłonka wykazało współbarwienie błony plazmatycznej i jąder.
Błona plazmatyczna została wybarwiona razem z fluorescencyjnym barwnikiem retikulum endoplazmatycznego, przy czym obszary pozornego nakładania się ER w pobliżu błony plazmatycznej wydają się pomarańczowe. Eksperymentator powinien zachować ostrożność podczas sekcji i izolacji, aby uniknąć uszkodzenia tętniczek, ponieważ uszkodzona tętniczka na pewno nie da nienaruszonego śródbłonka. Po zabiegu komórki mogą być wykorzystane do utrwalonej immunohistochemii z przeciwciałami fluorescencyjnymi lub barwienia żywych komórek organelli i lipidów błonowych.
Technika ta pozwoli na uzyskanie nowych informacji pozwalających zrozumieć mechanizmy leżące u podstaw przepływu krwi w mózgu na podstawowym poziomie fizjologii i wybrać przejścia w kierunku patologii do terapii.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia metodę przygotowania nietkniętych "rur" śródbłonkowych komórek śródmózgowych myszy z śródmózgowych tętniczek parenchymatycznych, ułatwiającą badanie regulacji przepływu krwi w mózgu. System modelowy wykazuje zalety w obrazowaniu fluorescencyjnym i pomiarach elektrofizjologicznych, umożliwiając badania nad szlakami sygnalizacji komórkowej, takimi jak dynamika wapnia wewnątrzkomórkowego i zmiany potencjału błonowego.
Kluczowe elementy badania
Obszar badań
- Regulacja przepływu krwi w mózgu
- Sygnalizowanie komórek śródbłonkowych
- Techniki obrazowania fluorescencyjnego
Tło
- Znaczenie śródbłonka tętniczek parenchymatycznych w aktywności neuronów i komórek glejowych
- Zwiększona rozdzielczość badań sygnalizacji komórkowej w komórkach śródbłonkowych mózgu
- Wyzwania w izolowaniu i badaniu śródbłonka mózgu
Stosowane metody
- Izolacja tętniczek parenchymatycznych do badania
- System modelowy myszy
- Techniki obrazowania fluorescencyjnego i elektrofizjologii
Główne wyniki
- Udana izolacja rurek śródbłonkowych z nietkniętymi zdolnościami sygnalizacji komórkowej
- Wzrost stężenia wapnia wewnątrzkomórkowego i hiperpolaryzacja błony po farmakologicznej stymulacji
- Wizualizacja morfologii komórek za pomocą barwników fluorescencyjnych
Wnioski
- Ta metoda zapewnia nowe wglądy w mechanizmy regulujące przepływ krwi w mózgu.
- Model jest istotny dla poszerzania zrozumienia procesów fizjologicznych i potencjalnych patologii w funkcjonowaniu mózgu.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Direct isolation and functional analysis of mouse brain parenchymal arteriolar endothelium enables precise interrogation of cerebrovascular mechanisms critical for neurovascular health. This method enhances predictive confidence in target validation for vascular contributions to neurodegenerative disease and supports mechanistic de-risking at the discovery stage. Its high-resolution functional readouts position it as a pivotal tool for early-stage portfolio triage in neurovascular research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct testing of endothelial K+ channel function and regulatory mechanisms in a disease-relevant system.
- Supports mechanistic de-risking by resolving intracellular Ca2+ dynamics and membrane potential changes in intact endothelium.
- Facilitates functional target validation for pathways implicated in cerebral blood flow and neurodegeneration.
Screening & Assay Development
- Provides a validated ex vivo system for quantitative measurement of endothelial responses to pharmacological agents.
- Delivers reproducible, high-resolution imaging and electrophysiological outputs for assay standardization.
- Enables screening of compounds affecting endothelial signaling with direct physiological relevance.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with translational biomarker strategies by linking endothelial function to neurovascular health.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation in models of cognitive impairment and dementia.
- Offers predictive value for risk-adjusted advancement of neurovascular targets.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling hypothesis testing, mechanistic validation, and quantitative screening of endothelial function in brain microvasculature.
- Discovery Biology: Resolves pathway-specific effects on endothelial signaling and morphology in a native context.
- Screening: Provides quantitative, reproducible readouts for compound evaluation and assay development.
- Analytics: Supports statistical comparison of membrane potential and intracellular Ca2+ responses across experimental conditions.
- Translational Research: Bridges mechanistic findings to disease-relevant endpoints in neurovascular health.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for diverse neurovascular research and target validation efforts.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in neurovascular target validation.
- Operational Value: Standardizes high-resolution functional assays for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and capital allocation for neurovascular discovery programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets linked to cerebral blood flow and neurodegeneration.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microdissection, electrophysiology, and live-cell imaging.
- Demands specialized instrumentation for fluorescence and membrane potential measurements.
- Necessitates rigorous cross-team standardization for reproducible outputs.
- Adaptation may be needed for different brain regions or disease models.
- Technical challenges in isolating intact arteriolar endothelium may limit throughput.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:58
Dissection and Isolation of Mouse Cerebral Arterioles
2:30
Digestion of Parenchymal Arterioles and Preparation of Endothelial Tubes
3:47
Utilization of Arteriolar Endothelial Tubes for the Examination of Cellular Physiology and Cellular Imaging
4:54
Results: Assessment of Endothelial Function
5:50
Conclusion
