JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Neuronauka
0 wyświetleń • 2:38 min. • April 28th, 2025
Zabezpiecz śródbłonek tętniczki pobrany z mózgu myszy w komorze z ciągłym przepływem buforowym.
Umieść komorę w konfiguracji nagrywania.
Wprowadź wrażliwy na wapń barwnik fluorescencyjny. Inkubować, aby umożliwić komórkowy wychwyt barwnika.
Umyj, aby usunąć wszelkie niezinternalizowane barwniki.
Włóż elektrodę do komórki śródbłonka i zarejestruj spoczynkowy potencjał błony.
Podnieś temperaturę kąpieli do temperatury fizjologicznej, aby ułatwić wewnątrzkomórkowe wiązanie wapnia z barwnikiem.
Wzbudz barwnik i zmierz fluorescencję, aby określić ilościowo wyjściowy poziom wapnia w komórkach.
Wprowadź lek, który wiąże się ze specyficznymi receptorami sprzężonymi z białkiem G na komórkach śródbłonka, inicjując kaskadę sygnalizacyjną.
Ta kaskada uwalnia jony wapnia z retikulum endoplazmatycznego do cytoplazmy, zwiększając wiązanie wapnia z barwnikiem i fluorescencję.
Podwyższony poziom wapnia w cytoplazmacie aktywuje również kanały potasowe, ułatwiając odpływ jonów potasu i zmniejszając potencjał błony.
Zapisz dane.
Zwiększona fluorescencja i zmniejszony potencjał błonowy wskazują na funkcjonalną rurkę śródbłonka.
Aby zmierzyć potencjał błony śródbłonkowej, patrząc przez czterokrotny obiektyw, ostrożnie umieść ostrą końcówkę elektrody tuż nad komórką śródbłonka tętniczego w przepływającym roztworze soli fizjologicznej za pomocą mikromanipulatora. Stopniowo zwiększaj powiększenie do 400 razy i w razie potrzeby zmień położenie końcówki elektrody. Za pomocą mikromanipulatora delikatnie włóż końcówkę ostrej elektrody do jednej z komórek rurki śródbłonka i rozpocznij rejestrację VM za pomocą elektrometru.
Gdy VM spoczynku śródbłonka ustabilizuje się z minus 30 do minus 40 miliwoltów, zastosuj pożądane środki farmakologiczne zgodnie z celem eksperymentalnym. Załaduj rurkę śródbłonka za pomocą urządzenia do śledzenia fluorescencji błony plazmatycznej lub pożądanych organelli w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 do 30 minut. Umyj komórki świeżym roztworem soli fizjologicznej superfuzyjnej i zobrazuj żywe komórki pod mikroskopem przy długości fali wzbudzenia odpowiednich barwników.