Statyczna, samosterowna metoda generowania organoidów mózgowych z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych

Organoidy ludzkiego mózgu są ważnym narzędziem do badania chorób w systemie, który jest łatwy do manipulowania i obejmuje ludzkie otoczenie oraz odpowiednią interakcję wielu typów komórek. Technika ta może być stosowana do badania wielu chorób mózgu, w tym zaburzeń neurorozwojowych, toksycznych urazów oraz wzrostu i leczenia raka w mózgu. Główną zaletą tego protokołu jest zdolność do generowania wysoce powtarzalnych organoidów mózgowych z szeroką gamą typów komórek neuronalnych.

Odbywa się to za pomocą bardzo uproszczonego przepływu pracy, który może być zrealizowany przez większość laboratoriów. A te są produkowane w odpowiedni sposób tymczasowo, bez wpływu wyspecjalizowanych czynników wzrostu lub niezdefiniowanych matryc, co sprawia, że jest to bardzo prosty i opłacalny system. Na początek połącz 100 mikrolitrów matrycy z 5,9 mililitrami lodowatej pożywki Dulbecco's Modified Eagle Medium lub F12 w 15-mililitrowej stożkowej probówce.

Pokryj każdą studzienkę na płytce sześciodołkowej jednym mililitrem matrycy membranowej. Zawiń talerz w folię parafinową i przechowuj przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego dnia odessać nadmiar pożywki z każdej studzienki, przepłukać studzienki F12 i dodać H9 hESCS w łącznej objętości dwóch mililitrów pożywki mTeSR1 na studzienkę.

Hoduj komórki z tygodnia na tydzień. Dostarczaj codziennie dwa mililitry pożywki mTeSR1 i umieść płytkę w inkubatorze o niskiej temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% tlenem i 5% dwutlenkiem węgla. Użyj szklanych narzędzi, aby usunąć różnicujące się komórki z kultury między przejściami.

Codziennie odświeżaj nośniki. Komórki powinny być pasażowane od czterech do sześciu dni przed wykorzystaniem komórek H9 do produkcji organoidów. Aby przejść przez komórki, zacznij od przepłukania ich pożywką DMEM F12 i zassania nadmiaru płynu.

Po wypłukaniu dodaj roztwór proteazy i inkubuj komórki przez 40 minut, aby kolonie unosiły się w studzience. Następnie umyj komórki trzykrotnie za pomocą DMEM F12 i jeśli to konieczne, miareczkować, aby kawałki były mniejsze. Następnie rozprowadź komórki w przybliżeniu w stosunku jeden do ośmiu na czterech sześciodołkowych płytkach i umieść płytki w inkubatorze i podawaj codziennie.

Po czterech do sześciu dniach komórki osiągają około 80% zbieżności. Przenieś je do zwykłego inkubatora. Rozcieńczyć roztwór podstawowy proteazy do stężenia roboczego, dodając jeden mililitr roztworu podstawowego do pięciu mililitrów pożywki DMEM lub F12 na każdą sześciodołkową płytkę hESCS.

Odessać i usunąć pożywkę do hodowli komórkowych, a następnie przykryć hESCS roztworem proteazy. Umieść płytki w inkubatorze na 10 do 15 minut lub do momentu, gdy krawędzie kolonii zaokrąglą się do góry i zaczną oddzielać się od matrycy, ale zanim całkowicie się zaokrąglą. Przechyl płytkę, odessaj roztwór proteazy i delikatnie umyj komórki dwoma mililitrami DMEM lub F12 na każdą studzienkę trzy razy.

Upewnij się, że kolonie pozostają przyczepione do matrycy. Dlatego bardzo ważne jest, aby fragmenty komórek ES miały odpowiedni rozmiar, więc upewnij się, że są w dyspasie przez odpowiedni czas. Jeśli są tam zbyt krótko, może być bardzo trudno je spłukać i rozdzielić.

A jeśli pozostaną tam zbyt długo, mogą po prostu odpaść podczas etapów prania. Dodaj z powrotem około jednego do 1,5 mililitra świeżej pożywki mTeSR do każdej studzienki i spłucz komórki z płytki do stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów, delikatnie pipetując. Odsysać i dozować hESCS w płytce, aż osiągną około 1/30 swojego pierwotnego rozmiaru.

Teraz skupiska kolonii przypominają kawałki o rozmiarach od 250 do 350 mikrometrów. Przenieś komórki do pojedynczej kolby T75 o bardzo niskim przyłączeniu zawierającej 30 mililitrów pożywki mTeSR bez bFGF. Następnego dnia przechylić kolbę tak, aby żywe komórki zebrały się w rogu.

Jeśli istnieje duża liczba komórek, które przylgnęły do dna kolby, należy użyć pipety o pojemności 10 mililitrów, aby przenieść komórki do nowej kolby. Spodziewaj się, że przez pierwsze kilka dni będziesz mieć dużą populację martwych komórek. Gdy komórki osiądą, odessaj pożywkę i martwe komórki, pozostawiając około 10 mililitrów pożywki zawierającej żywe komórki i dodaj 20 mililitrów pożywki o niskiej zawartości bFGF uzupełnionej 30 nanogramami na mililitr bFGF.

Po dwóch dniach sprawdź komórki. Większość komórek powinna wyglądać zdrowo i jasno. Jeśli jednak więcej niż jedna trzecia komórek wydaje się ciemna, przechyl kolbę i zastąp 20 mililitrów pożywki 20 mililitrami pożywki o niskiej zawartości bFGF uzupełnionej 20 nanogramami na mililitr bFGF.

Trzeciego dnia usuń połowę pożywki i zastąp ją 15 mililitrami pożywki hESC uzupełnionej 10 nanogramami na mililitr bFGF. Piątego dnia zastąp połowę pożywki 15 mililitrami pożywki do indukcji neuronowej. Następnie co drugi dzień zastępuj połowę pożywki pożywką do indukcji neuronów.

Po trzech tygodniach w hodowli dodaj 100X penicyliny-streptomycyny do pożywki w końcowym stężeniu 1X, jeśli jest to pożądane. Odświeżaj połowę nośnika co drugi dzień. W tym protokole uformowane organoidy mózgowe wyglądały na jasne i podobnej wielkości, bez ciemnych umierających komórek w centrach tych skupisk.

Komórki były stopniowo odzwyczajane od bFGF. Piątego dnia umieszczono je w pożywce do indukcji neuronalnej i pozostały w tej pożywce przez cały okres hodowli. Chociaż organoidy z czasem stawały się większe, a tym samym ciemniejsze, struktury przypominające rozetę nerwową rozszerzyły się, co wskazuje na inicjację różnicowania neuronalnego i zawiera cechy embrionalnej cewy nerwowej.

Aby dokładniej przyjrzeć się ekspresji genów w komórkach, przeprowadzono analizę qPCR. Transporter glutaminianu VLGUT1 ulegał ekspresji po dwóch i pół tygodniu, wzrastał po pięciu tygodniach i pozostawał spójny przez pięć miesięcy hodowli. Marker przodomózgowia Foxg1 ulegał ekspresji na niskim poziomie do pięciu tygodni w hodowli.

Marker głębokiej warstwy Tbr1 osiągnął szczyt około pięciu tygodni, a następnie zmniejszył się. Natomiast ekspresja markera górnej warstwy Satb2, markera brzusznego Eng1, markera rdzenia kręgowego w tylnej części mózgu Hoxb4, a także markera oligodendrocytów Olig2 wzrosła z czasem. W przeciwieństwie do tego, marker komórek macierzystych Sox2 zmniejszał się z czasem.

Marker glejowy GFAP osiągnął szczyt po pięciu tygodniach i pozostał następnie względnie stały. Pamiętaj, aby zachować najwyższą ostrożność podczas obchodzenia się z komórkami ES we wczesnych stadiach organoidów, aby uniknąć zanieczyszczenia, ponieważ są one uprawiane bez antybiotyków, a także pamiętaj o karmieniu zgodnie z harmonogramem. Zgodnie z tą procedurą można ocenić organoidy za pomocą technik, takich jak ilościowy RT-PCR do ekspresji genów i immunofluorescencja do ekspresji i lokalizacji białek.

Korzystając z tej techniki, byliśmy w stanie zbadać zdolność małej cząsteczki do łagodzenia aspektów uszkodzenia hipoksyjnego u noworodków, modelowanego w komorze hipoksyjnej. Znamienne jest, że owe organoidy ludzkiego mózgu zachowywały się podobnie do eksperymentów in vivo na myszach.