Name: Statyczna, samosterowna metoda generowania organoidów mózgowych z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-04T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Poznaj uproszczoną metodę generowania organoidów mózgowych z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych bez czynników wzrostu. Technika ta umożliwia badanie zaburzeń neurorozwojowych i chorób mózgu w łatwo dostępnym modelu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Yale Stem Cell Core (YSCC) oraz Yale Cancer Center (YCC) za pomoc. Dziękujemy dr Jung Kimowi za jego przegląd neuropatologii. Praca ta była wspierana przez Connecticut Regenerative Medicine Research Fund, March of Dimes i NHLBI R01HL131793 (SGK), Yale Cancer Center i Yale Cancer Biology Training Program NCI CA193200 (E.B.) oraz hojny, nieograniczony dar od Josepha i Lucille Madri.

1. Utrzymanie komórek macierzystych
<ol>
	<li>Utrzymuj hESC H9 na warstwie matrycy błony podstawnej o zredukowanym czynniku wzrostu (patrz Tabela materiałów, odtąd nazywana po prostu matrycą) zgodnie z instrukcjami producenta.
	<ol>
		<li>Aby pokryć jedną płytkę 6-dołkową lub jedno 10-centymetrowe naczynie, połącz 100 μl matrycy z 5,9 ml lodowatego zmodyfikowanego podłoża Eagle (DMEM)/F12 firmy Dulbecco. Owinąć płytki folią parafinową i przechowywać przez noc w temperaturze 4 °C. Stosować je następnego dnia do pasowania komórek po odessaniu nadmiaru matrycy/podłoża.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Hoduj komórki z tygodnia na tydzień w proporcji około 1:12 co 7 dni. Utrzymuj komórki za pomocą pożywki mTESR-1 w inkubatorze o niskiej temperaturze 37 °C (5%O2, 5% CO2). Codziennie odświeżaj multimedia. Odchwaszczaj komórki różnicujące z kultury między przejściami za pomocą szklanych narzędzi.</li>
	<li>Komórki H9 powinny być pasażowane od czterech do sześciu dni przed wykorzystaniem ich do produkcji organoidów. Komórki powinny być pasażowane w stosunku około 1:8 skupisk komórek. Aby to zrobić, zacznij od przepłukania komórek pożywką DMEM F12 i dysocjacji komórek za pomocą neutralnej proteazy (np. Dyspazy, odtąd nazywanej po prostu proteazą), przepłucz DMEM / F-12 i umieść je w 30-60 skupiskach komórek na 4 płytkach (6-dołkowych lub 10 cm) przy ~20% konfluencji. Dwa dni przed zbiorem przenieś je do zwykłego inkubatora (21%O2, 5% CO2). Płytki powinny osiągnąć ~80% zbiegu po rozpoczęciu tworzenia organoidów.</li>
</ol>
2. Dysocjacja komórek macierzystych w hodowli organoidów
<ol>
	<li>Podwielokrotnić roztwór podstawowy proteazy (5 j./ml). 
	UWAGA: Zazwyczaj zamrażamy 1 ml porcji w temperaturze -20 °C do stosowania przez kilka miesięcy.</li>
	<li>Rozcieńczyć roztwór podstawowy proteazy do stężenia roboczego, dodając 1 ml roztworu podstawowego plus 5 ml DMEM/F12 na każdą 6-dołkową lub 10-centymetrową płytkę hESC.</li>
	<li>Odessać i usunąć pożywkę do hodowli komórkowych, a następnie przykryć hESC roztworem proteazy. Umieść płytki w inkubatorze na 10-15 minut lub do momentu, gdy krawędzie kolonii zaokrąglą się i zaczną oddzielać się od matrycy.</li>
	<li>Przechylić płytkę, odessać roztwór proteazy i delikatnie umyć komórki trzykrotnie DMEM/F12. Stosować 2 ml / dołek do każdego mycia w przypadku płytki 6-dołkowej i 6 ml w przypadku płytki 10 cm. Upewnij się, że kolonie pozostają przyczepione do matrycy podczas wykonywania tego kroku.</li>
	<li>Dodać z powrotem około 1,5 ml świeżej pożywki mTESR do każdego dołka (lub 5 ml w przypadku płytki 10 cm) i spłukać komórki z płytki za pomocą delikatnego pipetowania.</li>
	<li>Za pomocą pipety o pojemności 10 ml delikatnie zassać i dozować hESC w płytce, aż osiągną około 1/30 części swojego pierwotnego rozmiaru. Klastry kolonii powinny przypominać kwadraty o rozmiarach ~250-350 μm po zakończeniu tych kroków.</li>
</ol>
3. Generacja organoidów
<ol>
	<li>Przenieś komórki do pojedynczej kolby T75 o bardzo niskim przyłączeniu zawierającej 30 ml pożywki mTESR bez podstawowego czynnika wzrostu fibroblastów (bFGF).</li>
	<li>Następnego dnia przechyl kolbę (kolby) tak, aby żywe komórki zebrały się w rogu (może to zająć 5-10 minut pierwszego dnia, ale będzie szybsze w miarę powiększania się klastrów). 
	UWAGA: Jeżeli na tym etapie lub w którymkolwiek kolejnym etapie do dna kolby przylega duża liczba komórek, należy przenieść komórki do nowej kolby. To normalne, że przez pierwsze dwa dni występuje duża liczba martwych komórek. Podczas wymiany nośnika należy usunąć jak najwięcej resztek komórek.</li>
	<li>Gdy komórki osiądą, odessaj pożywkę i martwe komórki, pozostawiając około 10 ml pożywki zawierającej żywe komórki.</li>
	<li>Dodaj ~20 ml pożywki o niskiej zawartości bFGF (DMEM/F12 uzupełniony 1x N2, 1x B27, 1x L-glutamina, 1x NEAA, 0,05% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) i 0,1 mM monotioglicerolu (MTG) uzupełniony 30 ng / ml bFGF).</li>
	<li>Sprawdź komórki w dniu 2. Jeśli większość komórek wygląda zdrowo i jasno, nie ma potrzeby nic robić. Jeśli jednak więcej niż jedna trzecia komórek wydaje się ciemna, zastąp pożywkę (przy użyciu tej samej techniki przechylania, co w kroku 3.2) ~20 ml pożywki o niskiej zawartości bFGF uzupełnionej 20 ng/ml bFGF.</li>
	<li>W dniu 3 należy zastąpić połowę pożywki (stosując technikę przechylania w kroku 3.2) 20 ml pożywki o niskiej zawartości bFGF uzupełnionej 10 ng/ml bFGF.</li>
	<li>W 5 dniu zastąp połowę pożywki (stosując technikę przechylania w kroku 3.2) 20 ml pożywki do indukcji neuronalnej (NIM: DMEM/F12, 1x suplement N2, 0,1 mM MEM NEAA, 2 μg/ml heparyny). 
	UWAGA: Jeśli istnieją jakiekolwiek duże skupiska komórek lub organoidów, które są znacznie większe niż inne, należy je usunąć z hodowli. Rozmiar szacuje się na podstawie wyglądu pod mikroskopem; Na przykład za pomocą okularu z siatką celowniczą. Większość organoidów ma podobne rozmiary (około 100 ± 20 μm). Usunęliśmy organoidy, które były około 2 razy mniejsze lub większe od pozostałych.</li>
	<li>Połowę pożywki (~15 ml) (przy użyciu techniki przechylania) należy wymieniać na NIM co drugi dzień.</li>
	<li>Po 3 tygodniach w hodowli dodaj 100x penicyliny/streptomycyny do pożywki (NIM: DMEM/F12, 1x suplement N2, 0,1 mM MEM NEAA, 2 μg/ml heparyny) w końcowym stężeniu 1x, jeśli jest to pożądane. Odświeżaj nośnik co drugi dzień. 
	UWAGA: W ten sposób utrzymywaliśmy organoidy przez okres do 6 miesięcy w hodowli.</li>
</ol>
4. Ekstrakcja i przygotowanie RNA
<ol>
	<li>Delikatnie wyekstrahować około 15 organoidów (w zależności od wielkości) z kolby za pomocą pipety o pojemności 10 ml i umieścić w probówce o pojemności 1,5 ml.
	<ol>
		<li>Delikatnie otocz organoidy w wirówce (200 x g przez 1 min) i trzykrotnie spłucz 1x PBS (DPBS) firmy Dulbecco.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ekstrakcja RNA przy użyciu zwalidowanego systemu lub protokołu (np. zestawu RNeasy).</li>
	<li>Zmierzyć wartość gęstości optycznej każdej próbki przy długości fali 260 i 280 nm.</li>
	<li>Przygotuj cDNA przy użyciu zwalidowanego systemu lub protokołu (np. zestawu do syntezy cDNA iScript).</li>
	<li>Wykonaj qRT-PCR przy użyciu wstępnie zwalidowanych starterów (Tabela 1), w tym co najmniej jednego genu porządkowego.</li>
</ol>
5. Immunohistochemia
<ol>
	<li>Utrwalenie
	<ol>
		<li>Przygotować 4% roztwór paraformaldehydu (PFA) i umieścić go w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Za pomocą sterylnej maszynki do golenia odetnij końcówkę sterylnej pipety do przenoszenia.</li>
		<li>Delikatnie ekstrahuj organoidy za pomocą wyciętej pipety transferowej, ponieważ można je łatwo rozbić, zwłaszcza gdy rosną, i umieść je na 6-dołkowej płytce z dodatkowymi pożywkami lub DPBS.</li>
		<li>Przechyl płytkę, zassaj nośnik i zastąp go 1x DPBS. Wypłucz komórki 1x DPBS jeszcze dwa razy.</li>
		<li>Zastąp DPBS 4% roztworem PFA i umieść na wytrząsarce w temperaturze 4 °C. 
		UWAGA: Chociaż ustaliliśmy czas na 2 dni (dla małych organoidów) do 7 dni (dla organoidów >3 miesiące), możliwe są również krótsze czasy (np. 16-24 godziny).</li>
		<li>Przygotować 30%, 20% i 10% roztwory sacharozy w DPBS.</li>
		<li>Po utrwaleniu w PFA zastąpić 10% roztworem sacharozy i umieścić na wytrząsarce w temperaturze 4 °C na 24 godziny.</li>
		<li>Zastąp 10% sacharozę 20% sacharozą i umieść na shakerze w temperaturze 4 °C na 24 godziny.</li>
		<li>Zastąp 20% sacharozy 30% sacharozą i umieść na shakerze w temperaturze 4 °C na 24 godziny.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Sekcje zamrożone
	<ol>
		<li>Przygotuj płaską warstwę suchego lodu i umieść na niej opisaną plastikową foremkę.</li>
		<li>Wlej cienką warstwę medium o optymalnej temperaturze cięcia (OCT) do formy i pozwól jej zacząć twardnieć (w ciągu kilku sekund).</li>
		<li>Umieść kilka organoidów na wierzchu OCT w formie za pomocą pipety transferowej z odciętą końcówką i zwróć szczególną uwagę na położenie organoidów.</li>
		<li>Powoli dodawaj OCT, aż forma będzie pełna, a organoidy pokryte. Pozwól mu całkowicie stwardnieć przez dodatkowe 10 minut. 
		UWAGA: Podczas gdy zamrażanie przez ponad 10 minut pomaga zapewnić idealne względne rozmieszczenie wielu organoidów do cięcia, możliwe jest użycie mieszanki etanolu i suchego lodu lub ciekłego azotu w celu szybszego zamrożenia.</li>
		<li>Zaznacz względne położenie organoidów markerem, aby ułatwić ich znalezienie podczas cięcia.</li>
		<li>Umieść foremki w torbie lub pudełku i przechowuj w temperaturze -80 °C, aż będą gotowe do cięcia sekcji.</li>
		<li>Za pomocą kriostatu pokrój skrawki 10 μm i umieść tkankę na oznakowanych, dodatnio naładowanych szkiełkach.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Barwienia
	<ol>
		<li>Przygotować roztwór blokujący (0,3% Triton X-100, 4% normalna surowica osła w PBS).</li>
		<li>Użyj hydrofobowego pisaka papkowego, aby narysować wokół obwodu tkanki.</li>
		<li>Przepłukać szkiełka PBS 3 razy po 5 minut każde.</li>
		<li>Zastąp PBS roztworem blokującym na 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Zastąpić roztwór blokujący roztworem przeciwciała (przeciwciało o odpowiednim stężeniu, 0,1% Triton X-100, 4% normalna surowica osła w PBS) w temperaturze 4 °C przez noc.</li>
		<li>Następnego dnia umyj szkiełko 3 razy PBS przez 10 minut każde.</li>
		<li>Zastąp PBS odpowiednim przeciwciałem drugorzędowym (o odpowiednim stężeniu) rozcieńczonym w roztworze przeciwciała przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Płukać 3 razy przez 10 minut za każdym razem za pomocą 1x PBS.</li>
		<li>Nałóż barwnik 4',6-diamidino-2-fenyloindolowy (DAPI) i spłucz trzy razy przez 10 minut za pomocą 1x PBS.</li>
		<li>Szkiełka nakrywkowe przymocować do przedniej części szkiełek za pomocą roztworu montażowego, pozostawić do wyschnięcia w temperaturze pokojowej w ciemności i przechowywać w ciemności w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Northcutt, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+vertebrate+brain+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+and+Comparative+Biology%22%5BJournal%5D)">Understanding vertebrate brain evolution.</a> Integrative and Comparative Biology. 42 (4), 743-756 (2002).</li>
<li>Roth, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRoth%2C+G+%22The+Long+Evolution+of+Brains+and+Minds%22">The Long Evolution of Brains and Minds</a>. , Springer Netherlands. (2013).</li>
<li>Herculano-Houzel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+brain+in+numbers%3A+a+linearly+scaled-up+primate+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Human+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The human brain in numbers: a linearly scaled-up primate brain.</a> Frontiers in Human Neuroscience. 3, 31(2009).</li>
<li>Roth, G., Dicke, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+the+brain+and+intelligence%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cognitive+Sciences%22%5BJournal%5D)">Evolution of the brain and intelligence.</a> Trends in Cognitive Sciences. 9 (5), 250-257 (2005).</li>
<li>Eiraku, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organized+formation+of+polarized+cortical+tissues+from+ESCs+and+its+active+manipulation+by+extrinsic+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Self-organized formation of polarized cortical tissues from ESCs and its active manipulation by extrinsic signals.</a> Cell Stem Cell. 3 (5), 519-532 (2008).</li>
<li>Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+telencephalic+precursors+from+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of telencephalic precursors from embryonic stem cells.</a> Nature Neuroscience. 8 (3), 288-296 (2005).</li>
<li>Kadoshima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organization+of+axial+polarity%2C+inside-out+layer+pattern%2C+and+species-specific+progenitor+dynamics+in+human+ES+cell-derived+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Self-organization of axial polarity, inside-out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES cell-derived neocortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (50), 20284-20289 (2013).</li>
<li>Lancaster, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+organoids+model+human+brain+development+and+microcephaly%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cerebral organoids model human brain development and microcephaly.</a> Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).</li>
<li>Li, X. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specification+of+motoneurons+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Specification of motoneurons from human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 23 (2), 215-221 (2005).</li>
<li>Zhang, S. C., Wernig, M., Duncan, I. D., Brustle, O., Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+differentiation+of+transplantable+neural+precursors+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">In vitro differentiation of transplantable neural precursors from human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 19 (12), 1129-1133 (2001).</li>
<li>Pasca, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+cortical+neurons+and+astrocytes+from+human+pluripotent+stem+cells+in+3D+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells in 3D culture.</a> Nat Methods. 12 (7), 671-678 (2015).</li>
<li>Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrigel%3A+a+complex+protein+mixture+required+for+optimal+growth+of+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture.</a> Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).</li>
<li>Qian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain-Region-Specific+Organoids+Using+Mini-bioreactors+for+Modeling+ZIKV+Exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Brain-Region-Specific Organoids Using Mini-bioreactors for Modeling ZIKV Exposure.</a> Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).</li>
<li>Sloan, S. A., Andersen, J., Pasca, A. M., Birey, F., Pasca, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+assembly+of+human+brain+region-specific+three-dimensional+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generation and assembly of human brain region-specific three-dimensional cultures.</a> Nature Protocols. 13 (9), 2062-2085 (2018).</li>
<li>Kelava, I., Lancaster, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+Cell+Models+of+Human+Brain+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Stem Cell Models of Human Brain Development.</a> Cell Stem Cell. 18 (6), 736-748 (2016).</li>
<li>Boisvert, E. M., Means, R. E., Michaud, M., Madri, J. A., Katz, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minocycline+mitigates+the+effect+of+neonatal+hypoxic+insult+on+human+brain+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Disease%22%5BJournal%5D)">Minocycline mitigates the effect of neonatal hypoxic insult on human brain organoids.</a> Cell Death and Disease. 10 (4), 325(2019).</li>
<li>Bergmann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-brain-barrier+organoids+for+investigating+the+permeability+of+CNS+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Blood-brain-barrier organoids for investigating the permeability of CNS therapeutics.</a> Nature Protocols. 13 (12), 2827-2843 (2018).</li>
<li>Mansour, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vivo+model+of+functional+and+vascularized+human+brain+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">An in vivo model of functional and vascularized human brain organoids.</a> Nature Biotechnology. 36 (5), 432-441 (2018).</li>
<li>Pham, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human+vascularized+brain+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Generation of human vascularized brain organoids.</a> Neuroreport. 29 (7), 588-593 (2018).</li>
<li>Boisvert, E. M., Denton, K., Lei, L., Li, X. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+specification+of+telencephalic+glutamatergic+neurons+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">The specification of telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (74), (2013).</li>
</ol>

S.G.K. jest członkiem SAB Dansar IT i Gene-in-Cell.

Podobnie jak inne modele organoidów, jest to sztuczny system, który ma kilka zastrzeżeń. Chociaż różnice między partiami pod względem ogólnych poziomów ekspresji były niewielkie, poszczególne organoidy wykazywały różnice. Na przykład lokalizacja obszarów dodatnich Sox-2 nie była identyczna w każdym organoidzie (ryc. 3). Chociaż qPCR jest odpowiedni do poszukiwania ogólnych zmian w partiach komórek, dodatkowe techniki, takie jak sekwencja RNAseq pojedynczej komórki, zostaną wykorzystane w przyszłych badan...

Z powodu niezliczonych praktycznych i etycznych ograniczeń, badanie ludzkiego mózgu było bardzo trudne. Podczas gdy badania z wykorzystaniem gryzoni miały kluczowe znaczenie dla naszego zrozumienia ludzkiego mózgu, mózg myszy ma wiele różnic1,2. Co ciekawe, myszy mają gęstość neuronów co najmniej 7 razy mniejszą niż mózg naczelnych3,4. Chociaż z ewolucyjnego punktu widzenia naczelne są bliższe ludziom niż gryzonie, praca z nimi nie jest praktyczna dla większości badaczy. Celem tego protokołu było podsumowanie wielu ważnych cech ludzkiego mózgu przy użyciu uproszczonej i tańszej metody bez konieczności stosowania heterologicznej macierzy błony podstawnej lub egzogennych czynników wzrostu, przy jednoczesnym zachowaniu różnorodności komórek mózgowych i organizacji komórkowej.
Praca formatywna z laboratorium Sasai wykorzystała metodę hodowli ciał embrionalnych bez surowicy (SFEBq) do wygenerowania dwu- i trójwymiarowych typów komórek neuronalnych z sygnalizowanych embrionalnych komórek macierzystych (ESC)5,6. Wiele metod organoidów ludzkiego mózgu podążało stosunkowo podobną ścieżką od sygnalizowanych ESCs7,8. W przeciwieństwie do tego, protokół ten rozpoczyna się od klastrów odłączonych ludzkich ESC (hESC), podobnie jak początkowe etapy przełomowych prac laboratoriów Thomsona i Zhanga przed etapami posiewu9,10, a także początkowy etap protokołu organoidów mózgowych laboratorium Pasca przed dodaniem egzogennych czynników wzrostu11. Matryce błony podstawnej (np. Matrigel) były wykorzystywane w wielu protokołach organoidów mózgowych i wykazano, że są skutecznym rusztowaniem 8. Jednak najczęściej stosowane matryce membran podstawnych nie są pozbawione komplikacji, ponieważ współoczyszczają się z nieznanymi ilościami czynników wzrostu ze zmiennością między partiami podczas produkcji12. Ponadto matryce te mogą komplikować obrazowanie oraz zwiększać ryzyko zanieczyszczenia i kosztów.
Chociaż organoidy ludzkiego mózgu mogą być używane do odpowiadania na wiele pytań, istnieją pewne ograniczenia, o których należy pamiętać. Po pierwsze, począwszy od embrionalnych komórek macierzystych, organoidy bardziej przypominają niedojrzałe mózgi niż starzejące się mózgi i jako takie mogą nie być idealnymi modelami chorób występujących w starszym wieku, takich jak choroba Alzheimera. Po drugie, podczas gdy nasz protokół znalazł markery rozwoju przodomózgowia, śródmózgowia i tyłomózgowia, które są przydatne do badania wpływu leczenia lub choroby na komórki z wielu regionów mózgu jednocześnie, inne protokoły można stosować, aby skoncentrować się na określonych regionach mózgu13,14. Wreszcie, kolejnym ograniczeniem modeli organoidów jest rozmiar, podczas gdy średnia długość ludzkiego mózgu wynosi około 167 mm, organoidy mózgowe wykonane za pomocą pobudzenia dorastają do 4 mm8, a organoidy utworzone przez ten protokół rosną do 1-2 mm w ciągu 10 tygodni. Niemniej jednak protokół ten stanowi ważne narzędzie do badania ludzkiej tkanki mózgowej i interakcji wielu typów komórek.

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 488 koza anty-mysz</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>A11029</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 546 koza anty-królik</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>A11035</td><td></td></tr><tr><td>B27 Suplement</td><td>Gibco, Waltham, MA, USA</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>Life Technologies, Carlsbad, CA, USA</td><td>PHG0263</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Stany Zjednoczone</td><td>Mikroskop A9647</td><td></td></tr><tr><td>BX43</td><td>Olympus, Shinjuku, Tokio, Japonia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Barwienie DAPI</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>STEMCELL Technologies, Vancouver, Kanada</td><td>07913</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>11330-032</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco, Waltham, MA, USA</td><<td>a href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10010023" target="_blank">10010023</a></td><td></td></tr><tr><td>FluroSave</td><td>MilliporeSigma, Burlington, MA</td><td>345789</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało GFAP</td><td>NeuroMab, Davis, CA</td><td>N206A/8</td><td></td></tr><tr><td>Czynnik wzrostu o obniżonym współczynniku wzrostu Matrigel (Matrix)</td><td>Corning, Corning, NY, USA</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>H9 hESC</td><td>WiCell, Madison, WI, Stany Zjednoczone</td><td>WA09</td><td></td></tr><tr><td>Heparyna</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>9041-08-1</td><td></td></tr><tr><td>iQ SYBR Green Supermix</td><td>Bio-Rad, Hercules, CA, Stany Zjednoczone</td><td>1708880</td><td></td></tr><tr><td>iScript cDNA Synthesis Kit</td><td>Bio-Rad, Hercules, CA, USA</td><td>1708891</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Gibco, Waltham, MA, USA</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Monothioglycerol</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>M6145</td><td></td></tr><tr><td>mTESR media</td><td>STEMCELL Technologies, Vancouver, Kanada</td><td>85850</td><td></td></tr><tr><td>N2 NeuroPlex</td><td>Gemini Bio Products, West Sacramento, CA, USA</td><td>400-163</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>NEAA</td><td>Gibco, Waltham, MA, Stany Zjednoczone</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>Normalna surowica osła (NDS)</td><td>ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, PA, USA</td><<td>a href="https://www.jacksonimmuno.com/catalog/products/017-000-121" target="_blank">017-000-121</a></td><td></td></tr><tr><td>OCT</td><td>Sakura Finetek, Torrance, CA, USA</td><td>25608-930</td><td></td></tr><tr><td>PFA</td><td>Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA</td><td>RT15710</td><td></td></tr><tr><td>Maszyna qPCR</td><td>Bio-Rad, CFX96, Hercules, CA, Stany Zjednoczone</td><td>1855196</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw RNeasy</td><td>Qiagen, Hilden, Niemcy</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Sox2</td><td>MilliporeSigma, Burlington, MA</td><td>Mikroskop AB5603</td><td></td></tr><tr><td>TMS-F</td><td>Nikon, Melville, NY, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>T8787-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Termosy T75 o bardzo niskim nasadce</td><td>Corning, Corning, Nowy Jork, USA</td><td>3814</td><td></td></tr></tbody></table>

statyczna, samosterowna metoda generowania organoidów mózgowych z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych

A Static Self-Directed Method for Generating Brain Organoids from Human Embryonic Stem Cells

Organoidy ludzkiego mózgu różniące się od embrionalnych komórek macierzystych oferują unikalną możliwość badania skomplikowanych interakcji wielu typów komórek w systemie trójwymiarowym. Tutaj przedstawiamy stosunkowo prostą i niedrogą metodę, która daje organoidy mózgowe. W tym protokole ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste są rozbijane na małe klastry zamiast pojedynczych komórek i hodowane w podstawowych pożywkach bez heterologicznej macierzy błony podstawnej lub egzogennych czynników wzrostu, co pozwala wewnętrznym sygnałom rozwojowym kształtować wzrost organoidu. Ten prosty system wytwarza różnorodne typy komórek mózgowych, w tym komórki glejowe i mikroglejowe, komórki macierzyste i neurony przodomózgowia, śródmózgowia i tyłomózgowia. Organoidy wygenerowane za pomocą tego protokołu wykazują również cechy właściwej organizacji czasowej i przestrzennej, o czym świadczą obrazy w jasnym polu, histologia, immunofluorescencja i ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy z odwrotną transkrypcją w czasie rzeczywistym (qRT-PCR). Ponieważ te organoidy zawierają typy komórek z różnych części mózgu, mogą być wykorzystywane do badania wielu chorób. Na przykład w niedawnym artykule wykazaliśmy wykorzystanie organoidów wygenerowanych z tego protokołu do badania wpływu hipoksji na ludzki mózg. Podejście to można wykorzystać do zbadania szeregu trudnych do zbadania schorzeń, takich jak upośledzenia neurorozwojowe, zaburzenia genetyczne i choroby neurologiczne.

Rysunek 1 przedstawia reprezentatywne obrazy w jasnym polu z kilku punktów czasowych, aby zaprezentować wygląd komórek/organoidów na różnych etapach protokołu. hESC zostały usunięte z płytki do hodowli tkankowej, podzielone na małe fragmenty i umieszczone w kolbie T75 o ultra-niskim stopniu przylegania, w której utworzyły sfery. Należy zauważyć, że komórki wyglądają na jasne i mają zbliżoną wielkość, bez ciemnych, obumierających komórek w centrach tych skupisk. Komórki były stopniowo odzwycz...

Ten protokół został stworzony jako sposób na produkcję organoidów mózgowych w uproszczony, tani sposób, bez egzogennych czynników wzrostu lub macierzy błony podstawnej, przy jednoczesnym zachowaniu różnorodności typów komórek mózgowych i wielu cech organizacji komórkowej.

Statyczna, samosterowna metoda generowania organoidów mózgowych z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych

Human brain organoids differentiated from embryonic stem cells offer the unique opportunity to study complicated interactions of multiple cell types in a ...

Organoidy ludzkiego mózgu są ważnym narzędziem do badania chorób w systemie, który jest łatwy do manipulowania i obejmuje ludzkie otoczenie oraz odpowiednią interakcję wielu typów komórek. Technika ta może być stosowana do badania wielu chorób mózgu, w tym zaburzeń neurorozwojowych, toksycznych urazów oraz wzrostu i leczenia raka w mózgu. Główną zaletą tego protokołu jest zdolność do generowania wysoce powtarzalnych organoidów mózgowych z szeroką gamą typów komórek neuronalnych.Odbywa się to za pomocą bardzo uproszczonego przepływu pracy, który może być zrealizowany przez większość laboratoriów. A te są produkowane w odpowiedni sposób tymczasowo, bez wpływu wyspecjalizowanych czynników wzrostu lub niezdefiniowanych matryc, co sprawia, że jest to bardzo prosty i opłacalny system. Na początek połącz 100 mikrolitrów matrycy z 5,9 mililitrami lodowatej pożywki Dulbecco's Modified Eagle Medium lub F12 w 15-mililitrowej stożkowej probówce.Pokryj każdą studzienkę na płytce sześciodołkowej jednym mililitrem matrycy membranowej. Zawiń talerz w folię parafinową i przechowuj przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego dnia odessać nadmiar pożywki z każdej studzienki, przepłukać studzienki F12 i dodać H9 hESCS w łącznej objętości dwóch mililitrów pożywki mTeSR1 na studzienkę.Hoduj komórki z tygodnia na tydzień. Dostarczaj codziennie dwa mililitry pożywki mTeSR1 i umieść płytkę w inkubatorze o niskiej temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% tlenem i 5% dwutlenkiem węgla. Użyj szklanych narzędzi, aby usunąć różnicujące się komórki z kultury między przejściami.Codziennie odświeżaj nośniki. Komórki powinny być pasażowane od czterech do sześciu dni przed wykorzystaniem komórek H9 do produkcji organoidów. Aby przejść przez komórki, zacznij od przepłukania ich pożywką DMEM F12 i zassania nadmiaru płynu.Po wypłukaniu dodaj roztwór proteazy i inkubuj komórki przez 40 minut, aby kolonie unosiły się w studzience. Następnie umyj komórki trzykrotnie za pomocą DMEM F12 i jeśli to konieczne, miareczkować, aby kawałki były mniejsze. Następnie rozprowadź komórki w przybliżeniu w stosunku jeden do ośmiu na czterech sześciodołkowych płytkach i umieść płytki w inkubatorze i podawaj codziennie.Po czterech do sześciu dniach komórki osiągają około 80% zbieżności. Przenieś je do zwykłego inkubatora. Rozcieńczyć roztwór podstawowy proteazy do stężenia roboczego, dodając jeden mililitr roztworu podstawowego do pięciu mililitrów pożywki DMEM lub F12 na każdą sześciodołkową płytkę hESCS.Odessać i usunąć pożywkę do hodowli komórkowych, a następnie przykryć hESCS roztworem proteazy. Umieść płytki w inkubatorze na 10 do 15 minut lub do momentu, gdy krawędzie kolonii zaokrąglą się do góry i zaczną oddzielać się od matrycy, ale zanim całkowicie się zaokrąglą. Przechyl płytkę, odessaj roztwór proteazy i delikatnie umyj komórki dwoma mililitrami DMEM lub F12 na każdą studzienkę trzy razy.Upewnij się, że kolonie pozostają przyczepione do matrycy. Dlatego bardzo ważne jest, aby fragmenty komórek ES miały odpowiedni rozmiar, więc upewnij się, że są w dyspasie przez odpowiedni czas. Jeśli są tam zbyt krótko, może być bardzo trudno je spłukać i rozdzielić.A jeśli pozostaną tam zbyt długo, mogą po prostu odpaść podczas etapów prania. Dodaj z powrotem około jednego do 1,5 mililitra świeżej pożywki mTeSR do każdej studzienki i spłucz komórki z płytki do stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów, delikatnie pipetując. Odsysać i dozować hESCS w płytce, aż osiągną około 1/30 swojego pierwotnego rozmiaru.Teraz skupiska kolonii przypominają kawałki o rozmiarach od 250 do 350 mikrometrów. Przenieś komórki do pojedynczej kolby T75 o bardzo niskim przyłączeniu zawierającej 30 mililitrów pożywki mTeSR bez bFGF. Następnego dnia przechylić kolbę tak, aby żywe komórki zebrały się w rogu.Jeśli istnieje duża liczba komórek, które przylgnęły do dna kolby, należy użyć pipety o pojemności 10 mililitrów, aby przenieść komórki do nowej kolby. Spodziewaj się, że przez pierwsze kilka dni będziesz mieć dużą populację martwych komórek. Gdy komórki osiądą, odessaj pożywkę i martwe komórki, pozostawiając około 10 mililitrów pożywki zawierającej żywe komórki i dodaj 20 mililitrów pożywki o niskiej zawartości bFGF uzupełnionej 30 nanogramami na mililitr bFGF.Po dwóch dniach sprawdź komórki. Większość komórek powinna wyglądać zdrowo i jasno. Jeśli jednak więcej niż jedna trzecia komórek wydaje się ciemna, przechyl kolbę i zastąp 20 mililitrów pożywki 20 mililitrami pożywki o niskiej zawartości bFGF uzupełnionej 20 nanogramami na mililitr bFGF.Trzeciego dnia usuń połowę pożywki i zastąp ją 15 mililitrami pożywki hESC uzupełnionej 10 nanogramami na mililitr bFGF. Piątego dnia zastąp połowę pożywki 15 mililitrami pożywki do indukcji neuronowej. Następnie co drugi dzień zastępuj połowę pożywki pożywką do indukcji neuronów.Po trzech tygodniach w hodowli dodaj 100X penicyliny-streptomycyny do pożywki w końcowym stężeniu 1X, jeśli jest to pożądane. Odświeżaj połowę nośnika co drugi dzień. W tym protokole uformowane organoidy mózgowe wyglądały na jasne i podobnej wielkości, bez ciemnych umierających komórek w centrach tych skupisk.Komórki były stopniowo odzwyczajane od bFGF. Piątego dnia umieszczono je w pożywce do indukcji neuronalnej i pozostały w tej pożywce przez cały okres hodowli. Chociaż organoidy z czasem stawały się większe, a tym samym ciemniejsze, struktury przypominające rozetę nerwową rozszerzyły się, co wskazuje na inicjację różnicowania neuronalnego i zawiera cechy embrionalnej cewy nerwowej.Aby dokładniej przyjrzeć się ekspresji genów w komórkach, przeprowadzono analizę qPCR. Transporter glutaminianu VLGUT1 ulegał ekspresji po dwóch i pół tygodniu, wzrastał po pięciu tygodniach i pozostawał spójny przez pięć miesięcy hodowli. Marker przodomózgowia Foxg1 ulegał ekspresji na niskim poziomie do pięciu tygodni w hodowli.Marker głębokiej warstwy Tbr1 osiągnął szczyt około pięciu tygodni, a następnie zmniejszył się. Natomiast ekspresja markera górnej warstwy Satb2, markera brzusznego Eng1, markera rdzenia kręgowego w tylnej części mózgu Hoxb4, a także markera oligodendrocytów Olig2 wzrosła z czasem. W przeciwieństwie do tego, marker komórek macierzystych Sox2 zmniejszał się z czasem.Marker glejowy GFAP osiągnął szczyt po pięciu tygodniach i pozostał następnie względnie stały. Pamiętaj, aby zachować najwyższą ostrożność podczas obchodzenia się z komórkami ES we wczesnych stadiach organoidów, aby uniknąć zanieczyszczenia, ponieważ są one uprawiane bez antybiotyków, a także pamiętaj o karmieniu zgodnie z harmonogramem. Zgodnie z tą procedurą można ocenić organoidy za pomocą technik, takich jak ilościowy RT-PCR do ekspresji genów i immunofluorescencja do ekspresji i lokalizacji białek.Korzystając z tej techniki, byliśmy w stanie zbadać zdolność małej cząsteczki do łagodzenia aspektów uszkodzenia hipoksyjnego u noworodków, modelowanego w komorze hipoksyjnej. Znamienne jest, że owe organoidy ludzkiego mózgu zachowywały się podobnie do eksperymentów in vivo na myszach.

a-static-self-directed-method-for-generating-brain-organoids-from

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Film demonstruje metodę generowania organoidów ludzkiego mózgu z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych. Pokazuje, w jaki sposób neurosfera tworzy warstwę neuroektodermalną, która hamuje tworzenie się innych listków zarodkowych. Neurosfery są osadzone w matrycy żelowej 3D i tworzą zawiązki neuronabłonkowe. Podczas inkubacji z pożywkami organoidowymi te pąki neuroepitelialne różnicują się w określone obszary mózgu, co powoduje tworzenie dojrzałych organoidów mózgowych.

Metoda in vitro do generowania organoidów ludzkiego mózgu

Ten film demonstruje technikę generowania organoidów mózgowych z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC). Przylegająca hodowla kolonii hESC jest traktowana enzymami w celu oderwania i rozbicia ich na klastry. Klastry te tworzą trójwymiarowe kule w zawieszeniu, które są następnie indukowane do różnicowania się w organoidy, które naśladują korę mózgową z warstwami neuronów i komórek glejowych.

Technika generowania organoidów mózgowych z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych

Ten film przedstawia tworzenie organoidów typu przodomózgowia z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC), demonstrując postęp od agregatów komórek macierzystych do złożonych struktur, które naśladują korę mózgu i różnicują się w różne typy neuronów.

Generowanie organoidów mózgowych typu przodomózgowia z indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych

Modelowanie rozwoju ludzkiego mózgu zostało utrudnione z powodu bezprecedensowej złożoności tkanki nabłonka nerwowego. W tym artykule opisano metodę wytwarzania organoidów mózgowych w celu wyznaczenia wczesnych zdarzeń rozwoju ludzkiego mózgu i modelowania małogłowia in vitro.

Generowanie organoidów ludzkiego mózgu pochodzących z iPSC w celu modelowania wczesnych zaburzeń neurorozwojowych

Organoidy mózgowe reprezentują nowy system modelowy do badania wczesnego rozwoju ludzkiego mózgu in vitro. Niniejszy artykuł zawiera szczegółową metodologię wydajnego generowania jednorodnych organoidów typu grzbietowego przodomózgowia z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych, w tym krytyczne etapy charakterystyki i walidacji.

Generowanie standaryzowanych i powtarzalnych organoidów mózgowych typu przodomózgowia z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

Prezentujemy szczegółowe protokoły generowania i charakterystyki modeli rozwoju 2D i 3D ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hIPSC) opartych na korze nowej, a także uzupełniające metodologie umożliwiające jakościową i ilościową analizę biogenezy i funkcji rzęsek pierwotnych (PC).

Modele 2D i 3D oparte na pluripotencjalnych komórkach macierzystych indukowanych przez człowieka do analizy pierwotnego zaangażowania rzęsek podczas rozwoju kory nowej

Tutaj opisujemy protokół generowania organoidów mózgowych z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC). Aby uzyskać organoidy mózgowe w dużych ilościach i wysokiej jakości, używamy domowych mini bioreaktorów.

Wytwarzanie organoidów mózgowych z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych w domowych mini bioreaktorach

W tym badaniu przedstawiamy szczegółową technikę prostego, ale solidnego systemu hodowli organoidów korowych przy użyciu standardowych kultur hPSC bez karmienia. Jest to szybki, wydajny i powtarzalny protokół generowania organoidów, które modelują aspekty starzenia się mózgu in vitro.

Solidna i wysoce odtwarzalna generacja organoidów korowych mózgu do modelowania starzenia się neuronów mózgu in vitro

W tym protokole zostanie zilustrowane pochodzenie komórek progenitorowych serca zarówno z mysich, jak i ludzkich embrionalnych komórek macierzystych. Główną strategią w tym protokole jest wzbogacenie komórek progenitorowych serca za pomocą cytometrii przepływowej przy użyciu fluorescencyjnych reporterów zmodyfikowanych w embrionalnych liniach komórek macierzystych.

Wyprowadzenie komórek progenitorowych serca z embrionalnych komórek macierzystych

Badania nad rozwojem podniebienia są motywowane występowaniem rozszczepu podniebienia, wady wrodzonej, która stanowi ogromne obciążenie dla zdrowia i może pozostawić trwałe zniekształcenie. Demonstrujemy tutaj technikę hodowli półek podniebiennych, którą można wykorzystać do badania różnych szlaków sygnałowych zaangażowanych w rozwój i fuzję podniebienia.

Metoda badania fuzji podniebienia z wykorzystaniem statycznej hodowli narządów

Poznaj uproszczoną metodę generowania organoidów mózgowych z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych bez czynników wzrostu. Technika ta umożliwia badanie zaburzeń neurorozwojowych i chorób mózgu w łatwo dostępnym modelu.

Statyczna, samosterowna metoda generowania organoidów mózgowych z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych

Przeglądaj więcej filmów