Name: Generowanie standaryzowanych i powtarzalnych organoidów mózgowych typu przodomózgowia z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: Poznaj metodę generowania standaryzowanych organoidów przodomózgowia z ludzkich komórek iPSC. Technika umożliwia badanie wczesnego rozwoju kory mózgowej z wysoką powtarzalnością między partiami.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca była wspierana przez Ministerstwo Innowacji, Nauki i Badań Nadrenii Północnej-Westfalii (Junior Research Group) oraz przez ERA-NET NEURON, JTC 2015 Neurodevelopmental Disorders, STEM-MCD.

1. Generowanie agregatów iPSC
<ol>
	<li>Wytwarzanie jednokomórkowych kultur jednowarstwowych z kolonii iPSC
	<ol>
		<li>Przygotować 6-dołkową płytkę pokrytą ekstraktem z błony podstawnej (BME). Rozmrozić BME na lodzie w temperaturze 4 °C przez 2-3 godziny, rozcieńczyć zimnym zmodyfikowanym podłożem Eagle F12 firmy Dulbecco (DMEM-F12; rozcieńczenie 1:50), przykryć płytkę 1 ml/studzienkę rozcieńczonego roztworu BME i przechowywać płytkę przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Odessać pożywkę i przemyć nienaruszone kolonie iPSC z co najmniej 2 dołków 6-dołkowej płytki 0,5 mM EDTA w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) dwa razy przed inkubacją kolonii z 0,5 mM kwasem etylenodiaminotetraoctowym (EDTA) w PBS przez 4 minuty w temperaturze pokojowej (RT). Odessać roztwór EDTA i delikatnie odłączyć kolonie, zmywając je z dna naczynia 5 ml pożywki DMEM-F12. Zbierz je do probówki o pojemności 15 ml i zagnieźdź przez odwirowanie (4 min przy 1,200 x g przy RT). 
		Uwaga: Z powodzeniem zastosowano iPSC przeprogramowane z dostępnych na rynku fibroblastów10.</li>
		<li>Odessać supernatant i inkubować kolonie iPSC z 500 μl odczynnika do dysocjacji komórek przez 6 minut w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Delikatnie odpipetować zawiesinę komórek kilka razy w górę i w dół za pomocą pipety o pojemności 1 ml, aby rozbić pozostałe skupiska komórek na pojedyncze komórki.</li>
		<li>Dodać 4 ml DMEM-F12 do zawiesiny komórek, aby rozcieńczyć odczynnik do dysocjacji komórek.</li>
		<li>Wiruj komórki w dół przy 1,200 x g przez 4 minuty w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Ponownie zawiesić komórki w 2 ml pożywki iPSC uzupełnionej 5 μM Y-27632 i komórkach nasiennych do jednego dołka na 6-dołkowej płytce pokrytej BME. 
		nuta: Użyć pożywki iPSC określonej w Tabeli materiałów dla jednokomórkowych monowarstwowych kultur iPSC.</li>
		<li>Następnego dnia zastąp pożywkę nową pożywką iPSC, na której brakuje Y-27632. Od tego momentu kontynuuj hodowlę komórek, zmieniając pożywkę każdego dnia, aż iPSC będą w 100% zlewne. W zależności od linii komórkowej i zbiegu studzienek początkowych zajmie to od 2 do 4 dni.</li>
		<li>Po zlaniu się przejdź przez iPSC. Odessać pożywkę i nałożyć 500 μl odczynnika do dysocjacji komórek na komórki.</li>
		<li>Inkubować komórki przez 5-10 minut w temperaturze 37 °C. Delikatnie kołysać płytką, aby oderwać komórki.</li>
		<li>Umyj komórki ze studzienki za pomocą 2 ml DMEM-F12 i zbierz je do probówki o pojemności 15 ml. Dodaj DMEM-F12 do całkowitej objętości 5 ml.</li>
		<li>Wirować komórki przy 1,200 x g przez 4 minuty w temperaturze pokojowej i odessać supernatant.</li>
		<li>Wysiewać komórki w pożywce iPSC uzupełnionej 5 μM Y-27632 w stosunku 1:2 do 1:4 na 6-dołkowej płytce pokrytej BME (2 ml / dołek pożywki).</li>
		<li>Kontynuuj hodowlę komórek przez 2-5 dni i codziennie zmieniaj pożywkę iPSC, w której brakuje Y-27632. Po zlewaniu się przechodzą iPSC (kroki 1.1.4-1.1.8). 
		nuta: Hodowla iPSC przez co najmniej 2 pasaże jako monowarstwa w pożywce iPSC określonej w tabeli materiałów przed użyciem ich do wytworzenia agregatów iPSC, aby umożliwić komórkom przystosowanie się do warunków hodowli.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Do wytwarzania agregatów iPSC należy stosować jednowarstwowe kultury iPSC, gdy zlewają się one w 70-90%. 
	Uwaga: iPSC dostosował się do warunków hodowli, ponieważ pojedyncze komórki są mniej podatne na stres, który prowadzi do śmierci komórki podczas procedury dysocjacji i agregacji. Jednowarstwowe kultury iPSC muszą wykazywać typową morfologię pluripotencjalną bez dowodów na różnicowanie. Regularnie testuj kultury pod kątem zanieczyszczenia mykoplazmą. Pracuj tylko z kulturami iPSC wolnymi od mykoplazmy.
	<ol>
		<li>Odessać pożywkę hodowlaną z jednego dołka na płytce 6-dołkowej i nałożyć 500 μl odczynnika do dysocjacji komórek na komórki.</li>
		<li>Inkubować komórki przez 5-10 minut w temperaturze 37 °C. Delikatnie kołysać płytką, aby oderwać komórki.</li>
		<li>Umyj komórki ze studzienki za pomocą 2 ml DMEM-F12 i zbierz je do probówki o pojemności 15 ml. Dodaj DMEM-F12 do całkowitej objętości 10 ml.</li>
		<li>Do zliczania komórek należy pobrać 25 μl z zawiesiny komórek i wymieszać je z 25 μl błękitu trypanowego, aby oznaczyć martwe komórki. Policz żywe komórki za pomocą komory liczącej.</li>
		<li>Zbierz wystarczającą ilość komórek (4,500 komórek na agregat iPSC) z zawiesiny komórek w probówce o pojemności 15 ml.</li>
		<li>Wirować komórki przy 1,200 x g przez 4 minuty w temperaturze pokojowej i odessać supernatant.</li>
		<li>Ponownie zawiesić komórki w odpowiedniej objętości pożywki iPSC uzupełnionej 50 μM Y-27632, aby uzyskać 4 500 żywych komórek na 150 μL. 
		nuta: Stosowanie wysokiego stężenia Y-27632 (50 μM) ma kluczowe znaczenie dla przetrwania iPSC.</li>
		<li>Umieścić 150 μl w każdym dołku 96-dołkowej płytki dolnej w kształcie litery U o niskiej przyczepności i umieścić w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2, 
		nuta: Generując agregaty iPSC, należy wziąć pod uwagę, że do kontroli jakości w 20. dniu potrzebnych jest co najmniej 6 organoidów (zob. sekcja 5).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Indukcja neuroektodermy przedniej
<ol>
	<li>Uważnie monitoruj zmiany morfologii agregatów iPSC każdego dnia pod mikroskopem hodowli tkankowych za pomocą soczewki o dużej mocy 4X lub 10X. Obserwuj w dniu 1, agregaty komórek z wyraźnymi granicami. Kontynuować hodowlę agregatów iPSC w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2, 
	nuta: Pewna liczba martwych komórek/studzienki jest normalna i nie wpływa na wytwarzanie organoidów.</li>
	<li>Podawaj agregaty iPSC począwszy od 2 dnia i kontynuuj co drugi dzień, delikatnie zasysając około 2/3 pożywki bez naruszania agregatów komórkowych na dole. Dodać dodatkowe 100 μl pożywki iPSC bez Y-27632. 
	nuta: W ciągu 4-6 dni agregaty komórkowe będą miały średnicę 350-450 μm i gładkie krawędzie.</li>
	<li>Na tym etapie zebrać agregaty komórek za pomocą wyciętej końcówki pipety o pojemności 100 μl w naczyniu o średnicy 6 cm o niskim stopniu mocowania (maksymalnie 20 agregatów/szalkę) w pożywce do indukcji kory zawierającej DMEM-F12 z dodatkiem N2 (1:200), suplementem B27 (1:100), glukozą (0,2 mg/ml), cyklicznym monofosforanem adenozyny (cAMP; 0,15 μg/ml), 0,5% aminokwasów endogennych (NEAA), 1% L-alanylo-L-glutamina, heparyna (10 μg/ml) oraz związki LDN-193189 (180 nM), A83-01 (500 nM) i inhibitor odpowiedzi Wnt-1 (IWR-1) (10 μg/ml). Nakarm agregaty komórkowe, zmieniając pożywkę indukcyjną kory mózgowej 3 dni po przeniesieniu ich do 6-centymetrowej płytki.</li>
	<li>Ściśle monitoruj zmiany morfologiczne podczas indukcji kory mózgowej pod mikroskopem hodowli tkankowej za pomocą soczewki o mocy 4X. 
	nuta: Po 4-5 dniach w pożywce indukcyjnej korowej krawędzie agregatów komórkowych powinny zacząć rozjaśniać się na powierzchni, wskazując na różnicowanie neuroektodermalne. Na tym etapie pojawia się promienista organizacja pseudowarstwowego nabłonka. Przejdź do sekcji 3, aby osadzić agregaty komórek w matrycy BME.</li>
</ol>
3. Osadzanie agregatów neuroektodermalnych w rusztowaniu matrycowym
<ol>
	<li>Rozmrażać BME na lodzie w temperaturze 4 °C przez 2-3 godziny. Podwielokrotność nierozcieńczonego BME w wystarczających ilościach.</li>
	<li>Przygotuj arkusz folii parafinowej z tworzywa sztucznego do procedury zatapiania. Przetnij plastikową folię parafinową za pomocą sterylnych nożyczek na kawałki o wymiarach 4 cm x 4 cm, połóż kawałek plastikowej folii parafinowej na pustej tacce na końcówki o pojemności 100 μl na końcówki o pojemności 100 μl i dociśnij palcem w rękawiczce, aby powstały małe wgłębienia w plastikowym arkuszu folii parafinowej (potrzebny 1 wgłębienie/agregat komórek). Oczyść plastikową folię parafinową z 70% etanolem i naświetl ją światłem UV (moc: 15 watów, długość fali: 435 nm) pod zamkniętą sterylną ławą przez 30 minut.</li>
	<li>Przenieś każdą agregację komórek do jednego wgłębienia w arkuszu folii parafinowej z tworzywa sztucznego za pomocą końcówki o pojemności 100 μl z otworem o średnicy 1,5-2 mm. W przypadku, gdy dwa agregaty komórek są połączone, nie rozdzielaj ich, ale przenieś je razem do jednego wgłębienia.</li>
	<li>Delikatnie zassać pożywkę otaczającą agregaty komórek za pomocą nieoszlifowanej końcówki do pipety o pojemności 100 μl. 
	nuta: Uważaj, aby nie zassać agregatów komórek do końcówki, ponieważ spowoduje to uszkodzenie agregatów.</li>
	<li>Dodać 40 μl nierozcieńczonego BME do każdego agregatu komórek.</li>
	<li>Umieść każdą grupę komórek w środku kropli BME za pomocą nieobciętej końcówki pipety o pojemności 100 μl. 
	nuta: Bądź bardzo ostrożny, aby nie uszkodzić rozwijającego się nabłonka nerwowego końcówką pipety.</li>
	<li>Ostrożnie przenieś plastikowy arkusz folii parafinowej za pomocą sterylnych kleszczy na 10-centymetrową szalkę Petriego (lub inną wystarczającą ilość naczyń do hodowli komórkowych) i umieść naczynie w inkubatorze na 15-20 minut, aby umożliwić zestalenie się BME.</li>
	<li>W międzyczasie przygotuj 6-centymetrowe naczynie o niskim stopniu przystawki, zawierające 5 ml pożywki do indukcji korowej.</li>
	<li>Po polimeryzacji BME należy usunąć kropelki zawierające agregaty komórkowe z arkusza folii parafinowej z tworzywa sztucznego. Odwróć plastikową folię parafinową za pomocą sterylnych kleszczy i delikatnie ściśnij agregaty komórek do lekko pochylonego (około 30 °) nisko przylegającego naczynia o średnicy 6 cm, aż kropelki spadną z plastikowego arkusza folii parafinowej. Przenieść maksymalnie 16 agregatów komórek do jednego naczynia o średnicy 6 cm.</li>
	<li>Kontynuować inkubację agregatów komórkowych w temperaturze 37 °C.</li>
</ol>
4. Generowanie organoidów typu przodomózgowia z agregatów neuroektodermalnych
<ol>
	<li>Jednego dnia po umieszczeniu w matrycy BME umieścić szalki z kulturami organoidowymi na kołyszącym się wytrząsarce do kultur komórkowych o kącie nachylenia 5 ° i 14 obr./min, zainstalowanej w inkubatorze do hodowli komórkowych.</li>
	<li>Monitoruj organoidy każdego dnia. Jednorodne struktury przypominające pętlę neuroepitelialną rozwijają się stopniowo po osadzeniu w matrycy BME.</li>
	<li>Gdy widoczne są struktury pętli neuroepitelialnej, należy zmienić pożywkę na pożywkę różnicującą organoidy zawierającą DMEM-F12 z suplementem N2 (1:200), suplementem B27 (1:100), glukozą (0,2 mg/ml), cAMP (0,15 μg/ml), 0,5% NEAA, 1% L-alanylo-L-glutaminą, insuliną (2,5 μg/ml)</li>
	<li>Pożywkę do różnicowania organoidów należy wymieniać co 3-4 dni, aż do osiągnięcia pożądanego punktu czasowego różnicowania. Następnie zamocuj organoidy (patrz sekcja 5). 
	nuta: Czasami w tkance mogą pojawiać się zawiązki optycznie przezroczystej tkanki bez struktur pętelkowych. Chociaż nie jest to rozwiązanie idealne, nie wpływa to na rozwój struktur korowych. Organoidy można hodować w pożywce do różnicowania organoidów przez okres do 40 dni. Przez dłuższe okresy hodowli (40-100 dni) pożywkę różnicującą organoidy można uzupełnić 1:50 BME w celu zwiększenia złożoności tkanki oraz BDNF i GDNF, aby umożliwić przeżycie i dojrzewanie neuronów14,15.</li>
</ol>
5. Utrwalenie i walidacja organoidów typu przodomózgowia
<ol>
	<li>W celu walidacji zbierz 6 organoidów w 20 dniu. Użyj 3 organoidów do izolacji mRNA i analiz PCR. Przenieść dodatkowe 3 organoidy na 24-dołkową płytkę zawierającą PBS za pomocą naciętej końcówki pipety o pojemności 1 ml z otworem 3-3,5 mm w celu utrwalenia i sekwencyjnych analiz immunocytochemicznych.</li>
	<li>Umyj organoidy dwukrotnie, ostrożnie odsysając PBS i zastępując go świeżym PBS za pomocą pipety o pojemności 5 ml. Utrwal organoidy przez 15 minut w zimnym 4% paraformaldehydzie (PFA) (pH 7,4). 
	ostrożność: Należy pamiętać, że PFA jest znanym czynnikiem rakotwórczym dla ludzi. Wszystkie prace należy wykonywać w okapie oparów chemicznych w rękawicach nitrylowych. Zaleca się noszenie okularów ochronnych. Formaldehyd może powodować nieodwracalne uszkodzenie rogówki.</li>
	<li>Ostrożnie zassać PFA i umyć trzykrotnie przy użyciu PBS o temperaturze pokojowej przez 10 minut.</li>
	<li>Zastąp PBS 30% roztworem sacharozy (wag./obj., na bazie PBS) i przechowuj próbki w temperaturze 4 °C, aby umożliwić odwodnienie organoidów. Organoidy można przechowywać do 7 dni do czasu dalszego przetwarzania.</li>
	<li>Jednego dnia po utrwaleniu należy wstępnie wybarwić odwodnione organoidy, dodając błękit trypanowy w stosunku około 1:50 przez 10 minut, aby umożliwić wizualizację organoidów podczas procedury kriosekcji.</li>
	<li>Przygotować pożywkę zawierającą 10% sacharozy, 7,5% żelatyny wag./obj. w PBS i ogrzać ją do temperatury 75 °C do uzyskania płynu.</li>
	<li>Zastąp 30% roztwór sacharozy pożywką do zatapiania i przenieś płytkę 24-dołkową na płytkę grzewczą (60 °C) na 15 minut w celu zrównoważenia organoidów.</li>
	<li>Przykryj spód form do zatapiania warstwą podłoża do zatapiania i umieść je na lodzie w celu polimeryzacji.</li>
	<li>Przenieść organoidy z płytki 24-dołkowej do form do zatapiania zawierających spolimeryzowane podłoże do zatapiania, dodać dodatkowe podłoże do zatapiania na wierzchu, tak aby organoidy były przykryte, i szybko umieścić formę w kąpieli zamrażającej 100% etanolu/suchego lodu (temperatura powinna wynosić od -30 do -50 °C) na co najmniej 1 minutę w celu szokowego zamrożenia.</li>
	<li>Umieść tymczasowo formę z kleszkami na suchym lodzie i przechowuj ją w temperaturze -80 °C lub bezpośrednio przystąp do kriosekcji.</li>
	<li>Organoidy kriosekcji o grubości 20 μm i zebrać skrawki na szkiełkach mikroskopowych, śledząc kolejność skrawków na szkiełkach (sekwencyjny wychwyt). Pozostawić skrawki do wyschnięcia na szkiełkach przez kilka godzin, przed przechowywaniem ich w temperaturze -80 °C lub bezpośrednim wykonaniem barwienia immunocytochemicznego.</li>
</ol>

<ol><li>Otani, T., Marchetto, M. C., Gage, F. H., Simons, B. D., Livesey, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2D+and+3D+Stem+Cell+Models+of+Primate+Cortical+Development+Identify+Species-Specific+Differences+in+Progenitor+Behavior+Contributing+to+Brain+Size%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">2D and 3D Stem Cell Models of Primate Cortical Development Identify Species-Specific Differences in Progenitor Behavior Contributing to Brain Size.</a> Cell Stem Cell. 18 (4), 467-480 (2016).</li>
<li>Fietz, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OSVZ+progenitors+of+human+and+ferret+neocortex+are+epithelial-like+and+expand+by+integrin+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">OSVZ progenitors of human and ferret neocortex are epithelial-like and expand by integrin signaling.</a> Nat Neurosci. 13 (6), 690-699 (2010).</li>
<li>Hansen, D. V., Lui, J. H., Parker, P. R., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenic+radial+glia+in+the+outer+subventricular+zone+of+human+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neurogenic radial glia in the outer subventricular zone of human neocortex.</a> Nature. 464 (7288), 554-561 (2010).</li>
<li>Shi, Y., Kirwan, P., Smith, J., Robinson, H. P., Livesey, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+cerebral+cortex+development+from+pluripotent+stem+cells+to+functional+excitatory+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Human cerebral cortex development from pluripotent stem cells to functional excitatory synapses.</a> Nat Neurosci. 15 (3), 477-486 (2012).</li>
<li>Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organogenesis+in+a+dish%3A+modeling+development+and+disease+using+organoid+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Organogenesis in a dish: modeling development and disease using organoid technologies.</a> Science. 345 (6194), 1247125(2014).</li>
<li>Eiraku, M., Sasai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-formation+of+layered+neural+structures+in+three-dimensional+culture+of+ES+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Self-formation of layered neural structures in three-dimensional culture of ES cells.</a> Curr Opin Neurobiol. 22 (5), 768-777 (2012).</li>
<li>Camp, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+cerebral+organoids+recapitulate+gene+expression+programs+of+fetal+neocortex+development%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Human cerebral organoids recapitulate gene expression programs of fetal neocortex development.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (51), 15672-15677 (2015).</li>
<li>Quadrato, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+diversity+and+network+dynamics+in+photosensitive+human+brain+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cell diversity and network dynamics in photosensitive human brain organoids.</a> Nature. 545 (7652), 48-53 (2017).</li>
<li>Kelava, I., Lancaster, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+Cell+Models+of+Human+Brain+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Stem Cell Models of Human Brain Development.</a> Cell Stem Cell. 18 (6), 736-748 (2016).</li>
<li>Iefremova, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Organoid-Based+Model+of+Cortical+Development+Identifies+Non-Cell-Autonomous+Defects+in+Wnt+Signaling+Contributing+to+Miller-Dieker+Syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">An Organoid-Based Model of Cortical Development Identifies Non-Cell-Autonomous Defects in Wnt Signaling Contributing to Miller-Dieker Syndrome.</a> Cell Rep. 19 (1), 50-59 (2017).</li>
<li>Chambers, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+neural+conversion+of+human+ES+and+iPS+cells+by+dual+inhibition+of+SMAD+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling.</a> Nat Biotechnol. 27 (3), 275-280 (2009).</li>
<li>Kadoshima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organization+of+axial+polarity%2C+inside-out+layer+pattern%2C+and+species-specific+progenitor+dynamics+in+human+ES+cell-derived+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Self-organization of axial polarity, inside-out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES cell-derived neocortex.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (50), 20284-20289 (2013).</li>
<li>Lancaster, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+organoids+model+human+brain+development+and+microcephaly%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cerebral organoids model human brain development and microcephaly.</a> Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).</li>
<li>Qian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain-Region-Specific+Organoids+Using+Mini-bioreactors+for+Modeling+ZIKV+Exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Brain-Region-Specific Organoids Using Mini-bioreactors for Modeling ZIKV Exposure.</a> Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).</li>
<li>Lancaster, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guided+self-organization+and+cortical+plate+formation+in+human+brain+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Guided self-organization and cortical plate formation in human brain organoids.</a> Nat Biotechnol. , (2017).</li>
<li>Yamaguchi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+by+Cdk1+induces+Plk1-mediated+vimentin+phosphorylation+during+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation by Cdk1 induces Plk1-mediated vimentin phosphorylation during mitosis.</a> J Cell Biol. 171 (3), 431-436 (2005).</li>
<li>Heidebrecht, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p100%3A+a+novel+proliferation-associated+nuclear+protein+specifically+restricted+to+cell+cycle+phases+S%2C+G2%2C+and+M%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">p100: a novel proliferation-associated nuclear protein specifically restricted to cell cycle phases S, G2, and M.</a> Blood. 90 (1), 226-233 (1997).</li>
<li>Kosodo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+interkinetic+nuclear+migration+by+cell+cycle-coupled+active+and+passive+mechanisms+in+the+developing+brain%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Regulation of interkinetic nuclear migration by cell cycle-coupled active and passive mechanisms in the developing brain.</a> EMBO J. 30 (9), 1690-1704 (2011).</li>
<li>Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+cerebral+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells.</a> Nat Protoc. 9 (10), 2329-2340 (2014).</li>
<li>Chenn, A., Walsh, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+cerebral+cortical+size+by+control+of+cell+cycle+exit+in+neural+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Regulation of cerebral cortical size by control of cell cycle exit in neural precursors.</a> Science. 297 (5580), 365-369 (2002).</li>
<li>Bagley, J. A., Reumann, D., Bian, S., Levi-Strauss, J., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fused+cerebral+organoids+model+interactions+between+brain+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fused cerebral organoids model interactions between brain regions.</a> Nat Methods. , (2017).</li>
<li>Birey, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+functionally+integrated+human+forebrain+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Assembly of functionally integrated human forebrain spheroids.</a> Nature. 545 (7652), 54-59 (2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Organoidy mózgowe stanowią potężne narzędzie do badania rozwoju ludzkiego mózgu in vitro , ponieważ dostarczają odpowiedniego tła gatunkowego i złożonego układu 3D komórek w kontekście tkankowym. W ten sposób wypełnili lukę między modelami zwierzęcymi innymi niż ludzie a redukcjonistycznymi technikami dwuwymiarowej hodowli komórek jednowarstwowych u ludzi. Ich stosowanie jest jednak utrudnione ze względu na brak odtwarzalności9. Opracowaliśmy protokół organoidowy typu przodomózgowia, który przezwycięża dużą zmienność między próbkami, łącząc zdolność do samoorganizacji iPSC z ich podatnością na czynniki wzorcowe. W szczególności iPSC zostały zagregowane w celu promowania samoorganizacji, a następnie hamowania sygnalizacji TGF-ß / SMAD w celu promowania różnicowania kory grzbietowej poprzez wystawienie kultur na działanie BMP (LDN-193189) i inhibitora receptora TGF-β typu I (A83-01). Dodatkowo zastosowano związek hamujący szlak Wnt (IWR) w celu zapobiegania posterioryzacji. W przeciwieństwie do "wewnętrznych" protokołów organoidów mózgowych19, które opierają się na samoorganizacji bez zewnętrznej kontroli, co prowadzi do powstania raczej niejednorodnych organoidów mózgowych i wykazuje duże różnice w partiach (mierzone wydajnością tworzenia spolaryzowanej ektodermy neuronalnej15), opisany tutaj protokół w sposób powtarzalny generuje jednorodne organoidy specyficzne dla przodomózgowia z ludzkich iPSC.
Te organoidy typu przodomózgowia mogą być wykorzystywane do różnych zastosowań, takich jak badania neurorozwojowe, badania ewolucyjne, w tym badania funkcji genów, modelowanie chorób oraz, potencjalnie, testowanie leków i cele terapeutyczne. Protokół jest jednak najbardziej odpowiedni do badania wczesnych aspektów rozwoju kory mózgowej człowieka. Na przykład wykorzystaliśmy organoidy typu przodomózgowia do zbadania specyficznych dla człowieka aspektów zachowania vRGC. Dokładniej rzecz ujmując, zajęto się zmianami patofizjologicznymi związanymi z ciężką postacią lizencefalii, malformacją kory mózgowej człowieka charakteryzującą się prawie brakiem fałdowania kory mózgowej. Tylko niektóre aspekty tej choroby można modelować u myszy, ponieważ mózg myszy jest naturalnie lizopenfaliczny. Stosując system organoidowy do iPSC pochodzących od pacjentów z lizencefalią, mogliśmy wiarygodnie podsumować specyficzne dla człowieka aspekty choroby i zidentyfikować mechanizmy leżące u jej podstaw. Mówiąc dokładniej, mogliśmy wykazać, że organoidy pochodzące od pacjentów wykazują znaczne zmniejszenie rozmiaru spowodowane przejściem z symetrycznego do asymetrycznego podziału komórek vRGC. Przełącznik ten był związany ze zmianami w organizacji sieci mikrotubul vRGC, zakłóceniem architektury niszy VZ i zmienioną ekspresją cząsteczek adhezyjnych komórek, co prowadziło do upośledzonej aktywacji osi sygnalizacyjnej N-kadheryna / β-katenina10. Warto zauważyć, że β-katenina zależna od regulacji sposobów podziału vRGC jest specyficzna dla człowieka, ponieważ nadekspresja β-kateniny u myszy prowadzi do ekspansji kory stowej, a następnie fałdowania kory20. W związku z tym nasze dane podkreślają, że system organoidów typu przodomózgowia stanowi obiecujące narzędzie do badania w wymierny sposób specyficznych dla człowieka aspektów wczesnego rozwoju kory mózgowej in vitro.
Głównym wyzwaniem na przyszłość jest utrzymanie jednorodności organoidów w dłuższych okresach czasu w celu uzyskania bardziej dojrzałych fenotypów neuronów. Można to osiągnąć poprzez jeden lub więcej z następujących działań: hodowlę organoidów w systemie bioreaktora14, zastosowanie pływających rusztowań15, uzupełnienie pożywki różnicującej wzrostem neuronów lub czynnikami przeżycia neuronów. Wreszcie, kontrolowany wzrost złożoności mózgu można osiągnąć poprzez połączenie organoidów typu przodomózgowia z organoidami mózgowymi o różnej tożsamości regionalnej21,22.
Podsumowując, przedstawiony tutaj protokół organoidowy typu przodomózgowia oferuje łatwe do zastosowania i niezawodne narzędzie do generowania wczesnych struktur korowych in vitro. Protokół prowadzi do powstania wysoce jednorodnej wczesnej tkanki korowej w wielu liniach iPSC i może być wykorzystany do niezawodnego generowania indywidualnie specyficznej tkanki korowej. Dzięki temu system nadaje się szczególnie do zastosowań wymagających wysokiego stopnia jednorodności i odtwarzalności, takich jak modelowanie chorób.

Ludzki mózg jest zdecydowanie jednym z najbardziej złożonych organów i odpowiada za wszystkie ludzkie zdolności intelektualne. W związku z tym głębsze zrozumienie rozwoju mózgu specyficznego dla człowieka jest krytycznym warunkiem wstępnym dla zrozumienia ludzkich zdolności poznawczych. Tradycyjnie, transgeniczne zwierzęta służyły jako organizmy modelowe do badania rozwoju mózgu. Modele te dostarczyły fundamentalnych informacji na temat zasad rozwoju mózgu. Obecnie wiemy, że wspólną cechą rozwoju mózgu u wszystkich ssaków jest precyzyjna choreografia proliferacji progenitorów, neurogenezy i migracji neuronów. Istnieją jednak znaczące różnice strukturalne między mózgami organizmów modelowych, takich jak gryzonie i ludzie, zwłaszcza w korze nowej. Podstawowe mechanizmy, które zostały zaproponowane, aby przyczynić się do ewolucji kory naczelnych, to zwiększona proliferacja komórek macierzystych i progenitorowych, a także wytwarzanie zewnętrznych promienistych komórek glejowych (oRGC), które są bardzo rzadko spotykane u gryzoni1,2,3.
Metody modelowania rozwoju ludzkiej kory mózgowej obejmują generowanie komórek progenitorowych kresomózgowia pochodzących z PSC oraz neuronów projekcyjnych kory mózgowej jako kultur jednowarstwowych. Te ustandaryzowane protokoły różnicowania odtwarzają pewne aspekty rozwoju kory mózgowej człowieka, takie jak stereotypowy porządek czasowy neurogenezy korowej4. Nie są one jednak wystarczające, jeśli chodzi o rekapitulację procesów rozwojowych organogenezy, takich jak wzorce przestrzenne i morfogeneza. Nowsze osiągnięcia w biologii komórek macierzystych doprowadziły do powstania trójwymiarowych kultur organoidowych z PSC, które rewolucjonizują badania nad organogenezą człowieka in vitro. Wykorzystując zdolność PSC do samoorganizacji w struktury organotypowe, ustalono różne organoidy, które odzwierciedlają kluczowe właściwości strukturalne i funkcjonalne narządów, w tym nerek, jelit, oka i mózgu5. Takie organoidy zawierają wiele podtypów komórkowych specyficznych dla narządów, które grupują się i organizują przestrzennie bardzo podobnie do rozwijających się narządów in vivo5,6. Ponadto skład komórkowy, pokrewieństwo i badania sieci genów z wykorzystaniem sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki ujawniły, że ludzkie organoidy mózgowe wiernie odwzorowują główne aspekty rozwoju ludzkiej kory nowej płodu, takie jak programy ekspresji genów7,8. Jedną z głównych wad, która do tej pory uniemożliwiała ich szerokie zastosowanie, były jednak duże różnice między partiami i niejednorodność między organoidami9.
Tutaj udostępniamy szczegółowy protokół dla prostego i ustandaryzowanego systemu hodowli organoidów typu przodomózgowia. Kluczową cechą tego systemu jest to, że wydajnie i powtarzalnie generuje organoidy pochodzące z PSC o niemal wyłącznej tożsamości grzbietowej kresomózgowia. Protokół jest oparty na metodach użytych w naszym ostatnim artykule Cell Reports10. Łączy w sobie zdolność iPSC do samoorganizacji z selektywną indukcją nabłonka nerwowego kory mózgowej i może solidnie generować jednorodne kultury wczesnej tkanki kresomózgowia grzbietowego w ciągu 3 tygodni. Protokół opiera się na wcześniej opisanej strategii sygnalizacji SMAD i hamowania Wnt, która kieruje różnicowaniem PSC w kierunku przedniej linii neuroektodermalnej11,12 w połączeniu z osadzaniem w matrycy, co sprzyja tworzeniu dużych i ciągłych struktur neuroepitelialnych13. Z powodzeniem zastosowaliśmy opisaną metodę na różnych liniach iPSC, z kilkoma klonami na osobę. Wykazaliśmy, że system ten nadaje się do dalszych zastosowań, w których odtwarzalność i jednorodność mają kluczowe znaczenie, takich jak modelowanie chorób. Stosując protokół do iPSC pochodzących od pacjentów cierpiących na ciężką wadę rozwojową kory mózgowej, byliśmy w stanie podsumować patologiczne cechy choroby in vitro i zidentyfikować nowe mechanizmy molekularne prowadzące do zmian fenotypowych10. Sugerujemy, że opisany protokół organoidowy może być wykorzystany do wypełnienia luki między redukcjonistycznymi kulturami monowarstwowymi kory mózgowej pochodzącymi z PSC a badaniami in vivo, oraz że reprezentuje niezawodny i stabilny system modelowy oparty na komórkach do symulacji wczesnego rozwoju kory mózgowej człowieka w zdrowiu i chorobie poza ciałem ludzkim.

<table><tbody><tr><td>A83-01</td><td>StemGent</td><td>130-106-274</td><td>500 nM</td></tr><tr><td>B27 Suplement</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td>1 do 100</td></tr><tr><td>Ekstrakt z błony podstawnej (np. Geltrex)</td><td>Gibco</td><td>A14132-02</td><td></td></tr><tr><td>Cykliczny monofosforan adenozyny (cAMP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9501</td><td>0,15 &mikro; g / ml</td></tr><tr><td>Odczynnik do dysocjacji komórek (TrypLE Express)</td><td>Gibco</td><td>12605028</td><td></td></tr><tr><td>Komora licząca, np. Fuchs-Rosenthal</td><td>Karl Hecht</td><td>40449001</td><td></td></tr><tr><td>D-Glukoza</td><td>Carl Roth</td><td>HN06.3</td><td>0,2 mg / ml</td></tr><tr><td>DMEM-F12 L-glutamina</td><td>Gibco</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>Formy do zatapiania (Tissue-Tek Cryomold)</td><td>Sakura Finetek</td><td>4565</td><td></td></tr><tr><td>Kwas etylenodiaminotetraoctowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6511</td><td>0,5 mM&nbsp;</td></tr><tr><td>Gelantin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890</td><td></td></tr><tr><td>Heparyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149-25KU</td><td>10 ug/ml</td></tr><tr><td>Inhibitor odpowiedzi WNT (IWR-1)</td><td>Enzo Life Science</td><td>BML-WN103-0005</td><td>10 ug/ml</td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>91077C</td><td>2,5 i mikro; g/mL</td></tr><tr><td>Pożywka IPSC do hodowli jednowarstwowych (Pluripro)</td><td>Systemy naprowadzania komórek</td><td>MK01</td><td></td></tr><tr><td>L-alanylo-L-glutamina (GlutaMax)</td><td>Gibco</td><td>35050038</td><td>1%</td></tr><tr><td>Płytki o niskiej przyczepności 6 cm</td><td>Labomedic</td><td>2081646L</td><td></td></tr><tr><td>Płytki o niskiej przyczepności 10 cm</td><td>Labomedic</td><td>2081646O</td><td></td></tr><tr><td>LDN-193189</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-104-171</td><td>180 nM</td></tr><tr><td>N2 Suplement</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td>1 do 200</td></tr><tr><td>Aminokwasy endogenne</td><td>Gibco</td><td>11140035</td><td>0,50%</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>4,00%</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem (PBS)</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Plastikowa folia parafinowa (Parafilm)</td><td>MARKA GMBH + CO KG</td><td>701606</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitor ROCK Y-27632</td><td>Systemy naprowadzania komórek</td><td>SM02-100</td><td>5 &mikro; M lub 50 &mikro; M</td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>Probówki 15 ml</td><td>Corning Life Sciences</td><td>734-0451&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe, np. Superfrost Plus Szkiełka mikroskopowe</td><td>Thermo Scientific</td><td>4951PLUS4</td><td></td></tr><tr><td>Kultura tkankowa 6-dołkowa Falcon</td><td></td><td>734-0019</td><td></td></tr><tr><td>Płytka 24-dołkowa do hodowli tkankowych</td><td>Falcon</td><td>734-0949</td><td></td></tr><tr><td>Niebieska plama trypanowa</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-niskowiążąca 96-dołkowa płytka lipidurowa A-U96</td><td>Amsbio</td><td>AMS.51011610</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciała</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sox2</td><td>R& D Systems</td><td>MAB2018</td><td></td></tr><tr><td>Pax6</td><td>Covance</td><td>PRB-278P-100</td><td></td></tr><tr><td>Otx2</td><td>R& D Systems</td><td>ab9566</td><td></td></tr><tr><td>Emx1</td><td>Sigma HPA006421</td><td></td><td></td></tr><tr><td>N-kadheryna</td><td>BD</td><td>610921</td><td></td></tr><tr><td>ZO-1</td><td>Life Tech</td><td>61-7300</td><td></td></tr><tr><td>P-Vimentin</td><td>Biozol</td><td>D076-3</td><td></td></tr><tr><td>Tpx2</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB500-179</td><td></td></tr><tr><td>Acetylowana &alfa;-tubulina&nbsp;</td><td>NEB/CS</td><td>5335</td><td></td></tr><tr><td>Alexa488 anty ms</td><td>Invitrogen</td><td>A11001</td><td></td></tr><tr><td>Alexa488 anty rb</td><td>Invitrogen</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>Alexa555 anty ms</td><td>Invitrogen</td><td>A21424</td><td></td></tr><tr><td>Alexa555 anty rb</td><td>Invitrogen</td><td>A21429</td><td></td></tr></tbody></table>

generowanie standaryzowanych i powtarzalnych organoidów mózgowych typu przodomózgowia z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

Generation of Standardized and Reproducible Forebrain-type Cerebral Organoids from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Ludzka kora mózgowa jest bardzo rozbudowana i wykazuje złożoną strukturę z określonymi obszarami funkcjonalnymi, zapewniając wyższe funkcje mózgu, takie jak funkcje poznawcze. Wysiłki mające na celu zbadanie rozwoju ludzkiej kory mózgowej były ograniczone przez dostępność systemów modelowych. Przełożenie wyników badań na gryzoniach na organizm ludzki jest ograniczone przez różnice gatunkowe, a badania nad pierwotnymi tkankami ludzkimi są utrudnione ze względu na brak dostępności tkanek, a także obawy etyczne. Ostatnie osiągnięcia w technologii ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (PSC) obejmują generowanie trójwymiarowych (3D) samoorganizujących się systemów hodowli organotypowych, które do pewnego stopnia naśladują specyficzny dla człowieka rozwój mózgu in vitro. Obecnie dostępne są różne protokoły generowania organoidów specyficznych dla całego mózgu lub regionu mózgu. Metoda generowania jednorodnych i powtarzalnych organoidów typu przodomózgowia z indukowanego PSC (iPSC), którą wcześniej ustaliliśmy i opisaliśmy tutaj, łączy wewnętrzną zdolność PSC do samoorganizacji z kierowanym różnicowaniem w kierunku przedniej linii neuroektodermalnej i osadzaniem macierzy w celu wspierania tworzenia ciągłego nabłonka nerwowego. Dokładniej rzecz ujmując, protokół ten obejmuje: (1) generowanie agregatów iPSC, w tym konwersję kolonii iPSC do konfluencyjnej kultury jednowarstwowej; (2) indukcja neuroektodermy przedniej; (3) osadzanie agregatów neuroektodermalnych w rusztowaniu matrycy; (4) wytwarzanie organoidów typu przodomózgowia z agregatów neuroektodermalnych; oraz (5) utrwalanie i walidacja organoidów typu przodomózgowia. W związku z tym protokół ten zapewnia łatwy do zastosowania system do generowania standaryzowanych i odtwarzalnych struktur tkanki korowej pochodzących z iPSC in vitro.

Opisany tutaj znormalizowany protokół tworzenia organoidów typu przedmózgowego zazwyczaj generuje wysoce jednorodnie kultury organoidów o niemal wyłącznie grzbietowej tożsamości korowej z ludzkich iPSC w ciągu 20 dni hodowli (schemat protokołu przedstawiono na Rysunku 1A). Zaleca się przeprowadzenie kilku etapów kontroli jakości w trakcie trwania protokołu, zdefiniowanych tutaj jako: „go” (kontynuacja procesu różnicowania) oraz „no-go” (kultury suboptymalne, zaleca się przerwanie serii) (Rysunek 1). Wskazane jest również staranne dokumentowanie każdego etapu kontroli jakości poprzez wykonywanie zdjęć i sporządzanie notatek.
Pierwszym krytycznym krokiem w generowaniu organoidów typu przedmózgowego jest rozpoczęcie procesu od wysokiej jakości kultur iPSC. Ważne jest, aby iPSC nie zawierały dużych frakcji zróżnicowanych komórek. Należy używać wyłącznie kultur iPSC, które w populacji początkowej prezentują się jako jednorodna monowarstwa niezróżnicowanych komórek (Ryciny 1B, C). Ponadto kluczowe jest zastosowanie określonej liczby komórek do agregacji iPSC. Pierwszą szczegółową inspekcję agregatów iPSC należy przeprowadzić w 2. dniu. Na tym etapie agregaty powinny utworzyć zwarte pączki komórkowe o gładkich krawędziach („go”), natomiast agregaty o nieregularnym wyglądzie lub z jamami powinny zostać odrzucone („no-go”) (Ryciny 1D, E). Kolejny etap kontroli jakości należy przeprowadzić w 10. dniu protokołu. W tym punkcie czasowym agregaty komórkowe powinny wykazywać gładką i optycznie przezroczystą tkankę na powierzchni zewnętrznej, co reprezentuje indukcję neuroektodermy („go”), podczas gdy brak takiej tkanki wskazuje na suboptimalną indukcję neuralną („no-go”) (Ryciny 1F, G). Do macierzy BME należytować jedynie te agregaty, które wykazują przezroczystą powierzchnię (Rycina 1F). Po osadzeniu organoidy korowe rozwiną ciągłe, pętlowate struktury neuroepithelialne, które będą szybko powiększać się. Efektywność indukcji korowej należy przeanalizować w 15. i 20. dniu, badając, czy organoidy rozwinęły spolaryzowaną ektodermę neuralną, jak pokazano na Rycini 1H, J („go”). W przypadku, gdy organoidy nie rozwinęły takich pączków neuroepithelialnych („no-go”, jak zilustrowano na Rycini 1I, K), należy krytycznie zweryfikować przeprowadzone kroki kontroli jakości w celu rozwiązania problemu. Przy ścisłym przestrzeganiu protokołu zostaną wygenerowane wysoce zestandaryzowane serie organoidów (Ryciny 2A, B), które wykażą ≥ 90% jednorodności w formowaniu spolaryzowanej ektodermy neuralnej w obrębie i pomiędzy seriami (Rycina 2C). Powszechnym błędem prowadzącym do zmiennej efektywności formowania spolaryzowanej ektodermy neuralnej jest zwiększenie początkowej liczby komórek do agregacji iPSC lub rozpoczęcie pracy z niskiej jakości kulturami iPSC, takimi jak kultury zanieczyszczone mykoplazmami lub kultury zawierające zróżnicowane komórki.
W 20. dniu należy przeprowadzić szczegółową walidację tożsamości grzbietowej części telencefalonu w wygenerowanych organoidach. W tym celu 3 organoidy powinny zostać utrwalone i wykorzystane do analiz immunofluorescencyjnych. Warstwowe pętle neuroepitelialne (Rycina 3A) wykazują ekspresję markera komórek macierzystych neuronów Sox2 (Rycina 3B, D), markery przedmózgowia Pax6 i Otx2 (Rysunki 3C, E), oraz marker kory grzbietowej Emx1 (Rycina 3F). Pętle korowe te charakteryzują się ponadto apikalną lokalizacją N-kadheryny i ZO-1 (Rysunki 3G, H), mikrotubulę pochodzącą z komórki glejowej radialnej strefy komorowej (vRGC), która rozciąga się od strony apikalnej do bazalnej tych struktur (Rysunek 3I), oraz położone apikalnie dzielące się komórki, wykazujące pozytywne barwienie na fosforylowaną wimentynę (p-Vimentin, Rycina 3J). Wewnątrz struktur organoidów może występować śmierć komórek. Centralna apoptoza jest zjawiskiem normalnym i nie wpływa na rozwój tkanki korowej. Ponadto, do oceny homogeniczności protokołu za pomocą analiz ekspresji genów należy wykorzystać 3 organoidy. Organoidy typu przedmózgowia wykazują ekspresję markerów grzbietowej części przedmózgowia (FoxG1, Otx2, Emx1), podczas gdy ekspresja markerów śródmózgowia (FoxA2, Pax5) oraz rhombenfalonu (HoxB2, HoxA4, HoxB4, HoxB6) nie jest wykrywalna (Rysunek 3K).
Partie organoidów poddanych kontroli jakości mogą być wykorzystane w różnych zastosowaniach, takich jak analizy płaszczyzny podziału apikalnych komórek glejowych radialnych. W tym celu sugerujemy wykonanie podwójnego barwienia z użyciem przeciwciał przeciwko p-Vimentin i Tpx2 (Rycina 3J). P-Vimentin jest fosforylowany przez CDK1 podczas mitozy i znajduje się w jądrze, znakując tym samym wszystkie jądra w fazie mitotycznej16. Tpx2 to białko związane z mikrotubulami, które pozwala zwizualizować wrzeciono mitotyczne oraz wypustki apikalne podczas interkinetycznej migracji jąder17,18. Używając tych markerów, w zasadzie można przeanalizować trzy aspekty podziału vRGC: (I) czy podział komórki zachodzi po stronie apikalnej, (II) czy płaszczyzna podziału jest ustawiona pionowo (co wskazuje na symetryczny podział komórek), poziomo lub ukośnie (co wskazuje na asymetryczny podział komórek) względem powierzchni apikalnej oraz (III) czy centra organizujące mikrotubule formują się prawidłowo.
Organoidy mogą być również dalej różnicowane w bardziej złożone, zorganizowane i warstwowe struktury tkanki korowej. Struktury korowe w organoidach w 35 ± 2 dniu składają się ze strefy komorowej (VZ), wewnętrznej i zewnętrznej strefy podkomorowej (SVZ) oraz obszaru przypominającego blaszkę korową (CP). W obrębie VZ oraz wewnętrznej i zewnętrznej SVZ można zidentyfikować vRGC, progenitorów pośrednich (IPs) oraz komórki przypominające oRGC. Ponadto w obszarze przypominającym CP można zaobserwować początkowe tworzenie się warstwowej kory, z głębokimi neuronami korowymi wykazującymi ekspresję Tbr1 i Ctip2 wewnątrz oraz górnymi neuronami korowymi wykazującymi ekspresję Satb2, a także komórkami wykazującymi ekspresję Reelin w obszarach zewnętrznych10.
<img alt="różnicowanie agregatów iPSC; schemat etapów indukcji neuronalnej i rozwoju organoidów korowych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56768/56768fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1Schematyczny przegląd protokołu tworzenia organoidów oraz ilustracja kryteriów „go” i „no-go”. (A) Schematyczny przegląd protokołu. Pożywka CI: pożywka do indukcji korowej; CD: pożywka do różnicowania korowego. (B-C) Obraz optymalnej hodowli monowarstwy iPSC o 90% konfluencji (B) oraz nieodpowiednią kulturę iPSC wykazującą różnicowanie (C). (D-E) Agregat iPSC o optymalnej wielkości, gęstości komórkowej i wyglądzie powierzchni (D) oraz dwa agregaty komórkowe typu „no-go”, wykazujące albo pustki międzykomórkowe (E, górny agregat) lub nieregularne krawędzie (E, mniejsze agregaty) dwa dni po agregacji komórek. (F-G) Agregaty komórkowe wykazujące przezroczyste i gładkie krawędzie (F) oraz agregaty komórkowe bez przejrzystania optycznego (G). Żółta linia wizualizuje obszar zainteresowania. (H-K) Optymalny organoid z ciągłymi pętlami neuroepitelialnymi (H, J) oraz organoid, w którym nie rozwinął się radialnie zorganizowany neuroektoderm (I, K) obrazowano odpowiednio w 15. i 20. dniu. Paski skali, B-C 500 µm; D-K 200 µm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56768/56768fig1large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>
<img alt="Rozwój organoidów, obrazy optyczne A-B, wykres C, porównanie tworzenia neuroepithelium z iPSC." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56768/56768fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2Jednorodność i powtarzalność protokołu hodowli organoidów typu przedmózgowia. (A-B) Reprezentatywne obrazy organoidów z jednej serii w dniu 15., wykonane w jasnym polu (A) oraz 26. dnia (B). (C) Analizy ilościowe organoidów w 20. dniu. Ilościowo określono organoidy, które na zewnętrznej powierzchni wykazują neuroepitel, rozpoznawalny w jasnym polu jako optycznie przejrzysta tkanka powierzchowna z wyraźną granicą i widoczną radialną architekturą komórkową (n = 3 na linię iPSC, przy co najmniej 16 organoidach na eksperyment). Paski skali, A-B: 500 µmSłupki błędów ± SD. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56768/56768fig2large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić tę figurę w powiększeniu, należy kliknąć tutaj.</a>
<img alt="Schemat rozwoju organoidów neuronalnych; markery Sox2, Pax6; barwienie DAPI; analiza przedmózgowia i śródmózgowia." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56768/56768fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3Walidacja organoidów typu przedmózgowia w 20. dniu. (A-J) Charakterystyka immunocytochemiczna organoidów. Organoidy organizują się w wiele pętli neuroepitelialnych (A, kontrastowane DAPI). Zorganizowane warstwowo komórki w obrębie pętli neuroepitelialnych wykazują ekspresję markera komórek macierzystych neuronów Sox2 (B, D), markery przedmózgowia Pax6 (C, D) oraz Otx2 (E), a także marker grzbietowej części przedmózgowia Emx1 (F). Struktury pętli korowych wykazywały w swojej najbardziej apikalnej części cienki, przylegający pas złącz z akumulacją N-kadheryny (G) oraz białko zona occludens 1 (ZO-1; H). Sieci mikrotubul komórek RGC komór ventricularnych (barwione przeciwciałem przeciwko acetylowanej $\alpha$-tubulinie, Ac-Tub) rozciągają się od strony apikalnej do bazalnej struktur pętlowych (I). Proliferujące komórki wykazujące ekspresję p-wimentyny (p-Vim) znajdują się na powierzchni apikalnej. Wrzeciona mitotyczne są barwione za pomocą Tpx2. Po prawej stronie przedstawiono reprezentatywne obrazy przy większym powiększeniu dla pionowej i poziomej płaszczyzny podziału (J). (K) Analiza RT-PCR dla czynników transkrypcyjnych specyficznych dla regionu w 20. dniu dla dwóch niezależnych zestawów organoidów pochodzących z 2 różnych linii iPSC. FB: kontrola z mózgu płodowego; AB: kontrola z mózgu dorosłego. Paski skali, A-D 200 µm; E-I 10 µm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56768/56768fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Epitop</td>
			<td>Rozcieńczanie</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sox2</td>
			<td>1 - 300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pax6</td>
			<td>1 - 500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Otx2</td>
			<td>1 - 500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emx1</td>
			<td>1 - 50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-kaderyna</td>
			<td>1 - 500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZO-1</td>
			<td>1 - 100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-Wimentyna</td>
			<td>1 - 1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tpx2</td>
			<td>1 - 500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetylowana α-tubulina </td>
			<td>1 - 500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa48 przeciwko mysim antygenom</td>
			<td>1 - 1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>przeciwciało anty-królicze Alexa488</td>
			<td>1 - 1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>przeciwciało anty-mysie sprzężone z Alexa5</td>
			<td>1 - 1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>przeciwciało anty-Rb znakowane Alexa55</td>
			<td>1 - 1000</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Przeciwciała do kontroli jakości organoidów w 20. dniu.
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody >
		<tr >
			<td >Starter</td >
			<td >Sekwencja</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >Otx2 forward</td >
			<td >tgcaggggttcttctgtgat </td >
		</tr >
		<tr >
			<td >Otx2 reverse</td >
			<td >agggtcagcaattgacca </td >
		</tr >
		<tr >
			<td >FoxG1 forward</td >
			<td >ccctcccatttctgtacgttt </td >
		</tr >
		<tr >
			<td >FoxG1 reverse</td >
			<td >ctggcggcttagagat </td >
		</tr >
		<tr >
			<td >Emx1 forward</td >
			<td >agacgcaggtgaaggtgg </td >
		</tr >
		<tr >
			<td >Emx1 reverse</td >
			<td >caggcaggcaggctcc </td >
		</tr >
		<tr >
			<td >FoxA2 forward</td >
			<td >ccaccaccaaccccacaaaatg </td >
		</tr >
		<tr >
			<td >FoxA2 reverse</td >
			<td >tgcaacaccgtctccccaaagt </td >
		</tr >
		<tr >
			<td >Pax5 forward</td >
			<td >aggatgccgctgatggagtac </td >
		</tr >
		<tr >
			<td >Pax5 reverse</td >
			<td >tggaggagtgaatcagcttgg </td >
		</tr >
		<tr >
			<td >HoxB2 forward</td >
			<td >tttagccgttcgcttagagg </td >
		</tr >
		<tr >
			<td >HoxB2 reverse</td >
			<td >cggatagctggagacaggag </td >
		</tr >
		<tr >
			<td >HoxA4 forward</td >
			<td >ttcagcaaaatgccct </td >
		</tr >
		<tr >
			<td >HoxA4 reverse</td >
			<td >taggccagctccacagttct </td >
		</tr >
		<tr >
			<td >HoxB4 forward</td >
			<td >acccgctaacaaatgagg </td >
		</tr >
		<tr >
			<td >HoxB4 reverse</td >
			<td >gcacgaaagatgagggag </td >
		</tr >
		<tr >
			<td >HoxB6 forward</td >
			<td >gaactgaggagcggactcac </td >
		</tr >
		<tr >
			<td >HoxB6 reverse</td >
			<td >ctgggatcagggagtcttca </td >
		</tr >
		<tr >
			<td >18s forward</td >
			<td >ttccttggaccggcgcaag </td >
		</tr >
		<tr >
			<td >18s reverse</td >
			<td > gccgcatcgccggtcgg</td >
		</tr >
	</tbody >
</table >
Tabela 2: Primery i sekwencje primerów do profilu ekspresji genów.

Organoidy mózgowe reprezentują nowy system modelowy do badania wczesnego rozwoju ludzkiego mózgu in vitro. Niniejszy artykuł zawiera szczegółową metodologię wydajnego generowania jednorodnych organoidów typu grzbietowego przodomózgowia z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych, w tym krytyczne etapy charakterystyki i walidacji.

Generowanie standaryzowanych i powtarzalnych organoidów mózgowych typu przodomózgowia z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

The human cortex is highly expanded and exhibits a complex structure with specific functional areas, providing higher brain function, such as cognition. ...

Ogólnym celem tej procedury jest wygenerowanie wysoce standaryzowanych i powtarzalnych organoidów typu przodomózgowia z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych. Metoda ta jest potężnym narzędziem do modelowania mechanizmów nowych rozwojowych NTZ-ów. W szczególności może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania związane z wczesną genezą kory mózgowej człowieka.Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na ustandaryzowane i efektywne czasowo generowanie ludzkiej tkanki korowej z niewielkimi różnicami między poszczególnymi organoidami i partiami organoidów. Technologia organoidów może zapewnić wgląd w rozwój, strukturę i funkcję ludzkiego mózgu, szczególnie w przypadku tych aspektów, które nie występują w modelach mózgu niższych gatunków. Aby wygenerować pluripotencjalne agregaty komórek macierzystych, gdy kultury komórek macierzystych osiągną 70 do 90% konfluencji, dodaj 500 mikrolitrów odczynnika do dysocjacji komórek do jednego dołka z sześciodołkowej płytki hodowlanej, aby odłączyć komórki.Indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste, które są przystosowane do warunków hodowli jednowarstwowej, są dobrym typem komórek do generowania agregatów, ponieważ są mniej podatne na śmierć komórek wywołaną stresem podczas procedury dysocjacji i agregacji. Po pięciu do 10 minutach w temperaturze 37 stopni Celsjusza delikatnie postukaj w płytkę i użyj dwóch mililitrów DMEM/F-12, aby umyć komórki z dna studzienki. Przenieś powstałą zawiesinę komórek do stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów i zwiększ objętość roztworu komórkowego do 10 mililitrów za pomocą większej ilości pożywki DMEM / F-12.Po zliczeniu przenieś 4,5 razy 10 do trzeciej komórki na pluripotencjalne skupisko komórek macierzystych do nowej 15-mililitrowej probówki i zbierz komórki przez odwirowanie. Zawiesiliśmy osad w odpowiedniej objętości pluripotencjalnej pożywki z komórek macierzystych, uzupełnionej 50 mikromolowym inhibitorem skały, aby uzyskać stężenie 4,5 razy 10 do trzeciej komórek na 150 mikrolitrów pożywki. Następnie dodaj 150 mikrolitrów komórek do pojedynczych studzienek 96-dołkowej płytki dolnej w kształcie litery U o niskim nakładzie i umieść płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.Do monitorowania indukcji neuroektodermy przedniej należy używać mikroskopu hodowli tkankowej, aby codziennie dokładnie obserwować zmiany morfologiczne agregatów pluripotencjalnych komórek macierzystych w małym powiększeniu. Pierwszego dnia należy obserwować agregaty komórkowe z wyraźnymi granicami. Drugiego dnia ostrożnie odessać około dwóch trzecich pożywki, nie naruszając agregatów komórkowych na dnie każdej studzienki, i zastąpić wyrzuconą pożywkę 100 mikrolitrami świeżej pożywki z pluripotencjalnych komórek macierzystych.Między czterema a sześcioma dniami później, gdy agregaty komórek osiągną średnicę od 350 do 450 mikrometrów i będą miały gładkie krawędzie, użyj zmodyfikowanej końcówki pipety o pojemności 100 mikrolitrów, aby przenieść do 20 kruszyw do pojedynczej sześciocentymetrowej płytki hodowlanej o niskim nasadce, zawierającej pięć mililitrów korowej pożywki indukcyjnej. Raz na trzy dni należy zastąpić pożywkę indukcyjną kory mózgowej świeżą, codziennie monitorując morfologię agregatów w ramach celu 4X. Po czterech do pięciu dniach w pożywce indukcyjnej kory mózgowej krawędzie agregatów komórkowych powinny zacząć rozjaśniać się na powierzchni, co wskazuje na różnicowanie neuroektodermalne i powinna pojawić się promienista organizacja pseudowarstwowego nabłonka.Aby osadzić agregaty neuroektodermalne w rusztowaniu matrycowym, rozmrażaj ekstrakt z błony podstawnej na lodzie przez dwie do trzech godzin. Podczas rozmrażania ekstraktu użyj sterylnych nożyczek, aby pociąć plastikową folię parafinową na jeden kwadrat o wymiarach cztery na cztery centymetry kwadratowe na 16 organoidów i umieść każdy kawałek filmu na pustej tacce na końcówki do mikropipet o pojemności 100 mikrolitrów. Naciśnij folię parafinową opuszkiem palca w rękawiczce, aby pojawiły się małe wgłębienia, i wyczyść folię 70% etanolem.Po napromieniowaniu UV w zamkniętej, sterylnej komorze bezpieczeństwa biologicznego przez 30 minut, użyj zmodyfikowanej końcówki pipety o pojemności 100 mikrolitrów z otworem od półtora do dwóch milimetrów, aby przenieść każdy agregat komórek do jednego wgłębienia w folii. Po przeniesieniu wszystkich agregatów użyj nieoszlifowanej końcówki pipety o pojemności 100 mikrolitrów, aby ostrożnie zassać pożywkę z każdego wgłębienia i dodać 40 mikrolitrów nierozcieńczonego ekstraktu z błony podstawnej do każdego agregatu komórek. Należy uważać, aby nie uszkodzić organoidów poprzez brutalną manipulację lub zasysanie do końcówki pipety, ponieważ mogłoby to uszkodzić rozwijający się nabłonek nerwowy.Użyj końcówki pipety, aby umieścić kruszywo w środku każdej kropli i użyj sterylnych kleszczy, aby ostrożnie przenieść plastikowy arkusz folii parafinowej na 10-centymetrową szalkę Petriego. Umieść naczynie w inkubatorze na 15 do 20 minut. Podczas gdy ekstrakt krzepnie, dodaj pięć milimetrów świeżej pożywki do indukcji korowej do jednego sześciocentymetrowego naczynia hodowlanego o niskim nasadce.Pod koniec inkubacji odwróć arkusz folii parafinowej i za pomocą sterylnych kleszczy delikatnie wyciśnij do 16 spolimeryzowanych kropelek do każdego sześciocentymetrowego naczynia. Następnie należy zwrócić agregaty do inkubatora do hodowli komórkowych. Następnego dnia przenieś szalki z kultur organoidowych na kołyszący się wytrząsarkę do kultur komórkowych, nachyloną pod kątem pięciu stopni z prędkością 14 obr./min w inkubatorze do hodowli komórkowych, z codziennym monitorowaniem pod mikroskopem świetlnym, aż agregaty osiągną interesujący je etap różnicowania.W 20 dniu użyj zmodyfikowanej jednomililitrowej końcówki pipety z otworem o średnicy od trzech do trzech i pół mililitra, aby zebrać sześć organoidów z kultur zbiorczych. Umieścić trzy organoidy w jednym dołku 24-dołkowej płytki zawierającej 500 mikrolitrów PBS i użyć pięciomililitrowej pipety do dwukrotnego przemycia organoidów 500 mikrolitrami świeżego PBS na przemycie. Po drugim praniu utrwal organoidy w zimnym 4% paraformaldehydzie przez 15 minut, a następnie trzy 10-minutowe płukania w temperaturze pokojowej PBS i końcowe odwodnienie przez noc w 30% roztworze sacharozy w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Następnego dnia należy wstępnie wybarwić odwodnione organoidy rozcieńczeniem błękitu trypanowego od 1 do 50 przez 10 minut, aby umożliwić wizualizację organoidów podczas procedury kriosekcji, a następnie zastąpić sacharozę świeżo przygotowanym podłożem do zatapiania. Podgrzej płytkę na poduszce grzewczej o temperaturze 60 stopni Celsjusza przez 15 minut, aby zrównoważyć organoidy w pożywce do zatapiania, a następnie przykryj spód jednej formy do zatapiania na organoid świeżym podłożem do zatapiania. Umieść formę na lodzie, aby zestalić podłoże do zatapiania, przenieś organoidy do form do zatapiania i dodaj świeże podłoże do zatapiania, aż każdy organoid zostanie pokryty.Następnie zamrozić szokowo organoidy w kąpieli zamrażającej 100% etanolu z suchego lodu przez co najmniej jedną minutę i użyć kriostatu, aby uzyskać skrawki każdego organoidu o grubości 20 mikrometrów do analizy immunocytochemicznej. Aby wygenerować organoidy typu przodomózgowia, należy używać tylko kultur IPSC, które prezentują się jako jednorodna monowarstwa niezróżnicowanych komórek w populacji wyjściowej. Drugiego dnia agregaty powinny uformować zwarte pąki komórkowe o gładkich krawędziach.Agregaty dnia 10 powinny wykazywać gładką i optycznie gładką oraz optycznie przezroczystą tkankę na zewnętrznej powierzchni, reprezentującą indukcję neuroektodermy. Jeśli protokół był ściśle przestrzegany, zostaną wygenerowane wysoce standaryzowane partie organoidów, które wykazują większą lub równą 90% jednorodności w tworzeniu spolaryzowanych neuroektoderm w obrębie i między partiami. Analiza immunocytochemiczna organoidów z 20 dnia ujawnia warstwowe pętle neuronabłonkowe, które wyrażają marker nerwowych komórek macierzystych Sox2, markery przodomózgowia Pax6 i Otx2 oraz marker kory grzbietowej Emx1.Te pętle korowe są ponadto charakteryzowane przez wierzchołkową lokalizację N-kadheryny i ZO-1, mikrotubulę pochodzącą z promieniowych komórek glejowych strefy komorowej, która rozciąga się od wierzchołkowej do podstawnej strony struktur, oraz wierzchołkowe komórki dzielące, które barwią się dodatnio na fosforylowaną wimentynę. Aby przeanalizować płaszczyznę podziału wierzchołkowych promienistych komórek glejowych podwójnego barwienia wimentyny i Tpx2, można przeprowadzić białko związane z mikrotubulami, które można wykorzystać do wizualizacji wrzeciona mitotycznego i procesów wierzchołkowych podczas interkinetycznej migracji jądrowej. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak generować wysoce standaryzowane i jednorodne organoidy typu przodomózgowia z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych.Technika ta ułatwia badanie specyficznych dla człowieka aspektów zaburzeń neurorozwojowych przy użyciu złożonego modelu komórkowego 3D ułożonego w sposób specyficzny dla tkanki nerwowej. Po opanowaniu techniki te organoidy korowe mogą być wykorzystywane do różnych zastosowań, takich jak badania neurorozwojowe, ewolucyjne lub badania funkcji genów, w tym modelowanie chorób i potencjalnie testowanie leków lub terapia.

generation-standardized-reproducible-forebrain-type-cerebral

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Film demonstruje metodę generowania organoidów ludzkiego mózgu z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych. Pokazuje, w jaki sposób neurosfera tworzy warstwę neuroektodermalną, która hamuje tworzenie się innych listków zarodkowych. Neurosfery są osadzone w matrycy żelowej 3D i tworzą zawiązki neuronabłonkowe. Podczas inkubacji z pożywkami organoidowymi te pąki neuroepitelialne różnicują się w określone obszary mózgu, co powoduje tworzenie dojrzałych organoidów mózgowych.

Metoda in vitro do generowania organoidów ludzkiego mózgu

Ten film demonstruje test do generowania organoidów mózgowych z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC). Ludzkie komórki iPS są indukowane do tworzenia ciał embrionalnych (EB). EB są hodowane na rusztowaniu polimerowym przy użyciu pożywki indukcyjnej, co sprzyja różnicowaniu się w nerwowe komórki macierzyste, komórki progenitorowe i niedojrzałe neurony. Na koniec EB są osadzane w matrycy i przenoszone do pożywki podtrzymującej w celu tworzenia organoidów mózgowych.

Generowanie indukowanych pluripotencjalnych organoidów mózgowych pochodzących z komórek macierzystych

Ten film pokazuje transformację ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) w sferyczne organoidy mózgu. Stosując specyficzne inhibitory, hPSC są kierowane do różnicowania się w kierunku linii neuronalnej, tworząc kolonie neuroektodermalne. Następnie wprowadzane są specjalne czynniki wzrostu, które sprzyjają samoorganizacji i proliferacji kolonii, co ostatecznie prowadzi do powstania sferycznych organoidów mózgowych.

Generowanie sferoid z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Ten film przedstawia tworzenie organoidów typu przodomózgowia z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC), demonstrując postęp od agregatów komórek macierzystych do złożonych struktur, które naśladują korę mózgu i różnicują się w różne typy neuronów.

Generowanie organoidów mózgowych typu przodomózgowia z indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych

Modelowanie rozwoju ludzkiego mózgu zostało utrudnione z powodu bezprecedensowej złożoności tkanki nabłonka nerwowego. W tym artykule opisano metodę wytwarzania organoidów mózgowych w celu wyznaczenia wczesnych zdarzeń rozwoju ludzkiego mózgu i modelowania małogłowia in vitro.

Generowanie organoidów ludzkiego mózgu pochodzących z iPSC w celu modelowania wczesnych zaburzeń neurorozwojowych

Ten protokół został stworzony jako sposób na produkcję organoidów mózgowych w uproszczony, tani sposób, bez egzogennych czynników wzrostu lub macierzy błony podstawnej, przy jednoczesnym zachowaniu różnorodności typów komórek mózgowych i wielu cech organizacji komórkowej.

Statyczna, samosterowna metoda generowania organoidów mózgowych z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych

Prezentujemy szczegółowe protokoły generowania i charakterystyki modeli rozwoju 2D i 3D ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hIPSC) opartych na korze nowej, a także uzupełniające metodologie umożliwiające jakościową i ilościową analizę biogenezy i funkcji rzęsek pierwotnych (PC).

Modele 2D i 3D oparte na pluripotencjalnych komórkach macierzystych indukowanych przez człowieka do analizy pierwotnego zaangażowania rzęsek podczas rozwoju kory nowej

Tutaj opisujemy protokół generowania organoidów mózgowych z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC). Aby uzyskać organoidy mózgowe w dużych ilościach i wysokiej jakości, używamy domowych mini bioreaktorów.

Wytwarzanie organoidów mózgowych z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych w domowych mini bioreaktorach

W tym badaniu przedstawiamy szczegółową technikę prostego, ale solidnego systemu hodowli organoidów korowych przy użyciu standardowych kultur hPSC bez karmienia. Jest to szybki, wydajny i powtarzalny protokół generowania organoidów, które modelują aspekty starzenia się mózgu in vitro.

Solidna i wysoce odtwarzalna generacja organoidów korowych mózgu do modelowania starzenia się neuronów mózgu in vitro

Dendrytyczne kolce neuronów piramidowych są miejscami najbardziej pobudzających synaps w korze mózgowej ssaków. Metoda ta opisuje ilościową analizę 3D morfologii kręgosłupa w ludzkich korowych piramidowych neuronach glutaminergicznym pochodzących z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych.

Trójwymiarowa kwantyfikacja kolców dendrytycznych z neuronów piramidowych pochodzących z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

Poznaj metodę generowania standaryzowanych organoidów przodomózgowia z ludzkich komórek iPSC. Technika umożliwia badanie wczesnego rozwoju kory mózgowej z wysoką powtarzalnością między partiami.

Generowanie standaryzowanych i powtarzalnych organoidów mózgowych typu przodomózgowia z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (Wideo) | JoVE Journal

Generowanie standaryzowanych i powtarzalnych organoidów mózgowych typu przodomózgowia z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

Przeglądaj więcej filmów