Generowanie standaryzowanych i powtarzalnych organoidów mózgowych typu przodomózgowia z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

Organoidy mózgowe reprezentują nowy system modelowy do badania wczesnego rozwoju ludzkiego mózgu in vitro. Niniejszy artykuł zawiera szczegółową metodologię wydajnego generowania jednorodnych organoidów typu grzbietowego przodomózgowia z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych, w tym krytyczne etapy charakterystyki i walidacji.

Ogólnym celem tej procedury jest wygenerowanie wysoce standaryzowanych i powtarzalnych organoidów typu przodomózgowia z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych. Metoda ta jest potężnym narzędziem do modelowania mechanizmów nowych rozwojowych NTZ-ów. W szczególności może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania związane z wczesną genezą kory mózgowej człowieka.

Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na ustandaryzowane i efektywne czasowo generowanie ludzkiej tkanki korowej z niewielkimi różnicami między poszczególnymi organoidami i partiami organoidów. Technologia organoidów może zapewnić wgląd w rozwój, strukturę i funkcję ludzkiego mózgu, szczególnie w przypadku tych aspektów, które nie występują w modelach mózgu niższych gatunków. Aby wygenerować pluripotencjalne agregaty komórek macierzystych, gdy kultury komórek macierzystych osiągną 70 do 90% konfluencji, dodaj 500 mikrolitrów odczynnika do dysocjacji komórek do jednego dołka z sześciodołkowej płytki hodowlanej, aby odłączyć komórki.

Indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste, które są przystosowane do warunków hodowli jednowarstwowej, są dobrym typem komórek do generowania agregatów, ponieważ są mniej podatne na śmierć komórek wywołaną stresem podczas procedury dysocjacji i agregacji. Po pięciu do 10 minutach w temperaturze 37 stopni Celsjusza delikatnie postukaj w płytkę i użyj dwóch mililitrów DMEM/F-12, aby umyć komórki z dna studzienki. Przenieś powstałą zawiesinę komórek do stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów i zwiększ objętość roztworu komórkowego do 10 mililitrów za pomocą większej ilości pożywki DMEM / F-12.

Po zliczeniu przenieś 4,5 razy 10 do trzeciej komórki na pluripotencjalne skupisko komórek macierzystych do nowej 15-mililitrowej probówki i zbierz komórki przez odwirowanie. Zawiesiliśmy osad w odpowiedniej objętości pluripotencjalnej pożywki z komórek macierzystych, uzupełnionej 50 mikromolowym inhibitorem skały, aby uzyskać stężenie 4,5 razy 10 do trzeciej komórek na 150 mikrolitrów pożywki. Następnie dodaj 150 mikrolitrów komórek do pojedynczych studzienek 96-dołkowej płytki dolnej w kształcie litery U o niskim nakładzie i umieść płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.

Do monitorowania indukcji neuroektodermy przedniej należy używać mikroskopu hodowli tkankowej, aby codziennie dokładnie obserwować zmiany morfologiczne agregatów pluripotencjalnych komórek macierzystych w małym powiększeniu. Pierwszego dnia należy obserwować agregaty komórkowe z wyraźnymi granicami. Drugiego dnia ostrożnie odessać około dwóch trzecich pożywki, nie naruszając agregatów komórkowych na dnie każdej studzienki, i zastąpić wyrzuconą pożywkę 100 mikrolitrami świeżej pożywki z pluripotencjalnych komórek macierzystych.

Między czterema a sześcioma dniami później, gdy agregaty komórek osiągną średnicę od 350 do 450 mikrometrów i będą miały gładkie krawędzie, użyj zmodyfikowanej końcówki pipety o pojemności 100 mikrolitrów, aby przenieść do 20 kruszyw do pojedynczej sześciocentymetrowej płytki hodowlanej o niskim nasadce, zawierającej pięć mililitrów korowej pożywki indukcyjnej. Raz na trzy dni należy zastąpić pożywkę indukcyjną kory mózgowej świeżą, codziennie monitorując morfologię agregatów w ramach celu 4X. Po czterech do pięciu dniach w pożywce indukcyjnej kory mózgowej krawędzie agregatów komórkowych powinny zacząć rozjaśniać się na powierzchni, co wskazuje na różnicowanie neuroektodermalne i powinna pojawić się promienista organizacja pseudowarstwowego nabłonka.

Aby osadzić agregaty neuroektodermalne w rusztowaniu matrycowym, rozmrażaj ekstrakt z błony podstawnej na lodzie przez dwie do trzech godzin. Podczas rozmrażania ekstraktu użyj sterylnych nożyczek, aby pociąć plastikową folię parafinową na jeden kwadrat o wymiarach cztery na cztery centymetry kwadratowe na 16 organoidów i umieść każdy kawałek filmu na pustej tacce na końcówki do mikropipet o pojemności 100 mikrolitrów. Naciśnij folię parafinową opuszkiem palca w rękawiczce, aby pojawiły się małe wgłębienia, i wyczyść folię 70% etanolem.

Po napromieniowaniu UV w zamkniętej, sterylnej komorze bezpieczeństwa biologicznego przez 30 minut, użyj zmodyfikowanej końcówki pipety o pojemności 100 mikrolitrów z otworem od półtora do dwóch milimetrów, aby przenieść każdy agregat komórek do jednego wgłębienia w folii. Po przeniesieniu wszystkich agregatów użyj nieoszlifowanej końcówki pipety o pojemności 100 mikrolitrów, aby ostrożnie zassać pożywkę z każdego wgłębienia i dodać 40 mikrolitrów nierozcieńczonego ekstraktu z błony podstawnej do każdego agregatu komórek. Należy uważać, aby nie uszkodzić organoidów poprzez brutalną manipulację lub zasysanie do końcówki pipety, ponieważ mogłoby to uszkodzić rozwijający się nabłonek nerwowy.

Użyj końcówki pipety, aby umieścić kruszywo w środku każdej kropli i użyj sterylnych kleszczy, aby ostrożnie przenieść plastikowy arkusz folii parafinowej na 10-centymetrową szalkę Petriego. Umieść naczynie w inkubatorze na 15 do 20 minut. Podczas gdy ekstrakt krzepnie, dodaj pięć milimetrów świeżej pożywki do indukcji korowej do jednego sześciocentymetrowego naczynia hodowlanego o niskim nasadce.

Pod koniec inkubacji odwróć arkusz folii parafinowej i za pomocą sterylnych kleszczy delikatnie wyciśnij do 16 spolimeryzowanych kropelek do każdego sześciocentymetrowego naczynia. Następnie należy zwrócić agregaty do inkubatora do hodowli komórkowych. Następnego dnia przenieś szalki z kultur organoidowych na kołyszący się wytrząsarkę do kultur komórkowych, nachyloną pod kątem pięciu stopni z prędkością 14 obr./min w inkubatorze do hodowli komórkowych, z codziennym monitorowaniem pod mikroskopem świetlnym, aż agregaty osiągną interesujący je etap różnicowania.

W 20 dniu użyj zmodyfikowanej jednomililitrowej końcówki pipety z otworem o średnicy od trzech do trzech i pół mililitra, aby zebrać sześć organoidów z kultur zbiorczych. Umieścić trzy organoidy w jednym dołku 24-dołkowej płytki zawierającej 500 mikrolitrów PBS i użyć pięciomililitrowej pipety do dwukrotnego przemycia organoidów 500 mikrolitrami świeżego PBS na przemycie. Po drugim praniu utrwal organoidy w zimnym 4% paraformaldehydzie przez 15 minut, a następnie trzy 10-minutowe płukania w temperaturze pokojowej PBS i końcowe odwodnienie przez noc w 30% roztworze sacharozy w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Następnego dnia należy wstępnie wybarwić odwodnione organoidy rozcieńczeniem błękitu trypanowego od 1 do 50 przez 10 minut, aby umożliwić wizualizację organoidów podczas procedury kriosekcji, a następnie zastąpić sacharozę świeżo przygotowanym podłożem do zatapiania. Podgrzej płytkę na poduszce grzewczej o temperaturze 60 stopni Celsjusza przez 15 minut, aby zrównoważyć organoidy w pożywce do zatapiania, a następnie przykryj spód jednej formy do zatapiania na organoid świeżym podłożem do zatapiania. Umieść formę na lodzie, aby zestalić podłoże do zatapiania, przenieś organoidy do form do zatapiania i dodaj świeże podłoże do zatapiania, aż każdy organoid zostanie pokryty.

Następnie zamrozić szokowo organoidy w kąpieli zamrażającej 100% etanolu z suchego lodu przez co najmniej jedną minutę i użyć kriostatu, aby uzyskać skrawki każdego organoidu o grubości 20 mikrometrów do analizy immunocytochemicznej. Aby wygenerować organoidy typu przodomózgowia, należy używać tylko kultur IPSC, które prezentują się jako jednorodna monowarstwa niezróżnicowanych komórek w populacji wyjściowej. Drugiego dnia agregaty powinny uformować zwarte pąki komórkowe o gładkich krawędziach.

Agregaty dnia 10 powinny wykazywać gładką i optycznie gładką oraz optycznie przezroczystą tkankę na zewnętrznej powierzchni, reprezentującą indukcję neuroektodermy. Jeśli protokół był ściśle przestrzegany, zostaną wygenerowane wysoce standaryzowane partie organoidów, które wykazują większą lub równą 90% jednorodności w tworzeniu spolaryzowanych neuroektoderm w obrębie i między partiami. Analiza immunocytochemiczna organoidów z 20 dnia ujawnia warstwowe pętle neuronabłonkowe, które wyrażają marker nerwowych komórek macierzystych Sox2, markery przodomózgowia Pax6 i Otx2 oraz marker kory grzbietowej Emx1.

Te pętle korowe są ponadto charakteryzowane przez wierzchołkową lokalizację N-kadheryny i ZO-1, mikrotubulę pochodzącą z promieniowych komórek glejowych strefy komorowej, która rozciąga się od wierzchołkowej do podstawnej strony struktur, oraz wierzchołkowe komórki dzielące, które barwią się dodatnio na fosforylowaną wimentynę. Aby przeanalizować płaszczyznę podziału wierzchołkowych promienistych komórek glejowych podwójnego barwienia wimentyny i Tpx2, można przeprowadzić białko związane z mikrotubulami, które można wykorzystać do wizualizacji wrzeciona mitotycznego i procesów wierzchołkowych podczas interkinetycznej migracji jądrowej. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak generować wysoce standaryzowane i jednorodne organoidy typu przodomózgowia z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych.

Technika ta ułatwia badanie specyficznych dla człowieka aspektów zaburzeń neurorozwojowych przy użyciu złożonego modelu komórkowego 3D ułożonego w sposób specyficzny dla tkanki nerwowej. Po opanowaniu techniki te organoidy korowe mogą być wykorzystywane do różnych zastosowań, takich jak badania neurorozwojowe, ewolucyjne lub badania funkcji genów, w tym modelowanie chorób i potencjalnie testowanie leków lub terapia.