Standaryzowane testy in vitro do wizualizacji i ilościowego określenia interakcji między ludzkimi neutrofilami a biofilmami Staphylococcus aureus

Protokoły te mają na celu zrozumienie, w jaki sposób ludzkie neutrofile oddziałują z biofilmami bakteryjnymi i zabijają je. Celem jest lepsze zrozumienie tego zjawiska i ograniczenie zmienności między testami, przy zrozumieniu, że istnieją nieodłączne problemy z ludzkimi neutrofilami w zależności od dawcy. Wymienione tutaj techniki zostały zoptymalizowane, aby umożliwić użytkownikom przeprowadzanie eksperymentów przy minimalnej zmienności, zwłaszcza w przypadku luźno przylegających biofilmów.

Ponadto protokoły te można również dostosować do badania innych drobnoustrojów, które mogą tworzyć biofilmy. Zacznij od uzyskania izolowanych kolonii Staphylococcus aureus z kriokonserwowanego wywaru przy użyciu techniki płytki smugowej na bogatej w składniki odżywcze płycie agarowej, takiej jak tryptyczny agar sojowy. Pokryj poszczególne studzienki 96-dołkowej płytki 100 mikrolitrami PLL rozcieńczonymi w sterylnej wodzie i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 30 minut.

Zasysać roztwór PLL w sposób aseptyczny za pomocą pułapki aspiracyjnej wspomaganej podciśnieniem. Pozostaw studzienki do wyschnięcia na noc w temperaturze pokojowej. Przygotuj posiew na noc, zaszczepiając kolonię S.aureus w MEM-alfa uzupełnioną 2% glukozą i inkubowaną w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 16 do 18 godzin przy 200 obrotach na minutę.

Rozcieńczyć kulturę przez noc, przenosząc 50 mikrolitrów do pięciu mililitrów świeżego MEM-alfa uzupełnionego 2% glukozą. Następnie inkubuj go w temperaturze 37 stopni Celsjusza przy 200 obrotach na minutę, aż do osiągnięcia środkowej fazy logarytmicznej. Użyj MEM-alfa, aby znormalizować kulturę środkowologarytmiczną do OD 0,1.

Przenieś 150 mikrolitrów znormalizowanej kultury do każdej studzienki 96-dołkowej płytki poddanej działaniu PLL. Inkubować płytkę w wilgotnej komorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 18 do 20 godzin. Odessać supernatant w celu usunięcia komórek planktonowych.

Delikatnie umyj pozostałą biomasę 150 mikrolitrami HBSS, aby usunąć nieprzyłączone komórki. Powtórz co najmniej dwa razy, aby usunąć wszystkie komórki planktonowe. Dodaj 100 mikrolitrów 20% normalnej ludzkiej surowicy rozcieńczonej kroplami w HBSS do przemytego biofilmu i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut, aby zoptymalizować biofilm.

Odessać roztwór surowicy i przemyć biofilmy kroplami 150 mikrolitrami HBSS. Odessać HBSS, pozostawiając studzienki z opsonizowanymi biofilmami. Dodać luminol do neutrofili ponownie zawieszonych w HBSS, aby uzyskać końcowe stężenie pięcioma mikromolowymi luminolami.

Ten roztwór jest gotowy do użycia dla grup A i C. Dodaj neutrofile zmieszane z luminolem do studzienek z opsonizowanymi biofilmami. Dla grupy D przygotować 50-mikromolowy roztwór luminolu w HBSS w oddzielnej probówce bez neutrofili i dodać go do studzienki zawierającej biofilm. Podwielokrotność 350 mikrolitrów neutrofili zmieszanych z luminolem i dodać PMA w końcowym stężeniu 500 nanogramów na mililitr do mieszaniny.

W przypadku grupy B dodać neutrofile z tej mieszaniny do studzienek bez biofilmu. Służy to jako kontrola pozytywna. Odwirować płytkę w temperaturze 270 RCF przez 30 sekund w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Upewnij się, że czytnik płytek jest ustawiony na 37 stopni Celsjusza, a luminescencja i odczyt kinetyczny przez 60 minut w odstępach trzyminutowych. Umieścić płytkę w czytniku płytek, aby mierzyć produkcję ROS przez neutrofile przez 60 minut. Użyj fluorescencyjnego szczepu S.aureus, takiego jak USA300, wykazującego ekspresję GFP, aby ułatwić obrazowanie mikroskopowe.

Inkubuj neutrofile ze 100 mikromolowymi BCD przez 30 minut w bujaku w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% atmosferycznym dwutlenkiem węgla. Upewnij się, że próbki są inkubowane w ciemności i ogranicz ekspozycję na światło. Aby przepłukać nadmiar BCD, odwirować neutrofile przy 270 RCF przez pięć minut i odessać supernatant.

Ponownie zawiesić neutrofile w świeżym HBSS. Następnie dodać homodimer-1 etydyny do neutrofili barwionych BCD w końcowym stężeniu czterech mikromolowców w celu monitorowania śmierci neutrofili i bakterii. Umyj biofilm HBSS i dodaj 150 mikrolitrów neutrofili do biofilmu S.aureus, który został wyhodowany na mikroszkiełkach.

Inkubuj mikroszkiełka w wilgotnej komorze przez 30 minut. Liczba komórek bakteryjnych będzie oparta na liczbie komórek uzyskanej z 18-godzinnego posiewu biofilmu. Zobrazuj oddziaływanie biofilmu neutrofili za pomocą kanałów fluorescencyjnych odpowiadających barwnikom fluorescencyjnym lub długościom fal wzbudzenia i emisji białek.

Pożywki bakteryjne zminimalizowały żywotność neutrofili do około 60% po 30 minutach okresu inkubacji. Pożywki do hodowli komórek ssaków nie wpłynęły jednak na żywotność neutrofili i mogą również wspierać wzrost biofilmów S.aureus. Neutrofile traktowane PMA stosowane jako kontrola wykazywały zwiększoną produkcję ROS.

Przy braku biofilmów neutrofile traktowane PMA wykazywały silną produkcję ROS. W obecności biofilmu S.aureus ogólna produkcja ROS przez neutrofile traktowane PMA zmniejszyła się, podczas gdy przy braku PMA neutrofile polegały wyłącznie na swojej interakcji z biofilmem, co jeszcze bardziej zmniejszyło produkcję ROS. Szerokokątna mikroskopia fluorescencyjna ujawniła, że wiele neutrofili było zlokalizowanych na powierzchni, podczas gdy kilka znajdowało się w biofilmach S.aureus.

Większość komórek S.aureus oddziałujących z neutrofilami była martwa, podczas gdy kilka pozostało przy życiu, jak określono za pomocą barwienia ŻYWE/MARTWE. Biofilmy barwione homodimerem etydyny-1 ujawniły w biofilmie frakcję martwej populacji S.aureus. Efekt przemywania biofilmu i neutrofili po 30 minutach inkubacji w celu usunięcia nieprzylegających neutrofili ujawnił, że około 33% martwych neutrofili było nadal przyczepionych do biofilmu.

Wymienione tutaj protokoły można również wykorzystać do dalszego badania innych funkcji neutrofili, takich jak fagocytoza i tworzenie zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofili, gdy neutrofile napotykają biofilmy.