Name: Standaryzowane testy in vitro do wizualizacji i ilościowego określenia interakcji między ludzkimi neutrofilami a biofilmami Staphylococcus aureus (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 28 s
Description: Poznaj standaryzowane metody badania interakcji między ludzkimi neutrofilami a biofilmami Staphylococcus aureus. Techniki obejmują pomiar produkcji ROS i mikroskopię fluorescencyjną.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została sfinansowana przez Narodowy Instytut Alergii i Chorób Zakaźnych (R01AI077628) dla DJW oraz American Heart Association Career Development Award (19CDA34630005) dla ESG. Dziękujemy dr Paulowi Stoodleyowi za dostarczenie nam szczepu USA 300 LAC GFP. Ponadto doceniamy zasoby z Campus Microscopy and Imaging Facility (CMIF) oraz OSU Comprehensive Cancer Center (OSUCCC) Microscopy Shared Resource (MSR) The Ohio State University. Dziękujemy również Amelii Staats, Peterowi Burbackowi i Lisie Coleman z laboratorium Stoodley za pobranie krwi.

Wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez Ohio State University Institutional Review Board (IRB) (2014H0154). Uzyskano świadomą pisemną zgodę wszystkich dawców na pobranie krwi obwodowej w celu wyizolowania pierwotnych ludzkich neutrofili. Staphylococcus aureus (USA300 LAC)31 został użyty jako organizm modelowy do przeprowadzenia eksperymentów. Eksperymenty przeprowadzono przy użyciu odpowiednich środków ochrony osobistej (PPE) ze względu na potencjalne narażenie na patogen przenoszony przez krew.
1. Przygotowanie biofilmu in vitro
<ol>
	<li>Uzyskaj izolowane kolonie S. aureus z kriokonserwowanego bulionu31 przy użyciu techniki płytki smugowej32,33 na bogatej w składniki odżywcze płycie agarowej, takiej jak Tryptic Soy Agar (patrz Tabela Materiałów).</li>
	<li>Pokryj poszczególne studzienki 96-dołkowej płytki 100 μl 0,001% (v/v) poli-L-lizyny (PLL) rozcieńczonej w sterylnymH2Oi inkubuj w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Aseptycznie odessać roztwór PLL za pomocą pułapki aspiracyjnej wspomaganej próżnią. Pozostaw studzienki do wyschnięcia na noc w temperaturze pokojowej. 
	UWAGA: Wszystkie etapy aspiracji w protokole są wykonywane przy użyciu pułapki aspiracyjnej wspomaganej próżnią, chyba że zaznaczono inaczej.</li>
	<li>Przygotować posiew przez noc, zaszczepiając kolonię S. aureus w minimalnej niezbędnej pożywce alfa (MEMα) uzupełnionej 2% glukozy i inkubować w temperaturze 37 °C, wstrząsając z prędkością 200 obr./min przez 16-18 godzin.</li>
	<li>Rozcieńczyć kulturę przez noc, przenosząc 50 μl do 5 ml świeżego MEMα uzupełnionego 2% glukozą i inkubować w temperaturze 37 °C, wstrząsając przy 200 obr./min, aż do połowy fazy logarytmicznej, zwykle między gęstością optyczną 600 (OD600 nm) 0,5-0,8. Użyj MEMα, aby znormalizować kulturę średniologarytmiczną do OD600nm 0,1.</li>
	<li>Przenieś 150 μl znormalizowanej kultury do każdego dołka 96-dołkowej płytki poddanej działaniu PLL. Inkubować statycznie przez 18-20 godzin w wilgotnej komorze w temperaturze 37 °C. 
	UWAGA: Biofilmy mogą być również hodowane w innych formatach, takich jak szkiełka μ-kanałowe (patrz Tabela materiałów).</li>
	<li>Odessać supernatant w celu usunięcia komórek planktonowych. Delikatnie umyj pozostałą biomasę 150 μl zrównoważonego roztworu soli Hanksa (HBSS), aby usunąć nieprzyłączone komórki. Dodawaj HBSS kroplami, aby uniknąć przerwania biofilmu. 
	UWAGA: Podczas zasysania supernatantu i HBSS podczas mycia, należy pozostawić tylko tyle płynu (supernatantu lub HBSS) w studzienkach zawierających biofilm, tak aby biofilm był nadal zanurzony. Zapobiega to przerwaniu struktury biofilmu, gdy HBSS jest dodawany kroplami w celu wypłukania biofilmu.</li>
	<li>Powtórz krok 1.6 co najmniej dwa razy, aby usunąć wszystkie komórki planktonu. W tym momencie biofilmy są gotowe do natychmiastowych dalszych eksperymentów. 
	UWAGA: Jeśli biofilmy nie są wykorzystywane do eksperymentów z neutrofilami, HBSS można zastąpić solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS). HBSS jest preferowany w stosunku do PBS, ponieważ HBSS zawiera składniki, w tym glukozę, które zapewniają optymalne warunki do aktywacji neutrofili34.</li>
</ol>
2. Kwantyfikacja biomasy biofilmu
<ol>
	<li>Przygotować zapas 0,1% (w/v) roztworu fioletu krystalicznego (CV) (patrz tabela materiałów), rozpuszczając się w 20% (v/v) etanolu i 80% (v/v)H2O. Upewnij się, że CV jest całkowicie rozpuszczony w etanolu przed dodaniemH2O. Przefiltruj i wysterylizuj roztwór.</li>
	<li>Dodać 150 μl 0,1% roztworu CV do przemytego biofilmu i inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Użyj co najmniej trzech pustych studzienek jako kontrolek tylko dla mediów.</li>
	<li>Odessać 0,1% roztwór CV z biofilmów i przemyć poplamione biofilmy 200 μl 1x PBS. Powtórz ten proces, w sumie trzy płukania, aby usunąć nadmiar CV z dołków.</li>
	<li>Dodać 150 μl 33% (v/v) lodowatego kwasu octowego rozcieńczonegoH2O. Inkubować w temperaturze pokojowej na bujaku z prędkością 50 obr./min przez 30 minut, aby umożliwić całkowite rozpuszczenie CV związanego z biomasą. 
	UWAGA: Wykonaj ten krok w okapie z przepływem laminarnym z odpowiednimi środkami ochrony osobistej, ponieważ lodowaty kwas octowy jest substancją chemiczną.</li>
	<li>W międzyczasie należy skonfigurować czytnik mikropłytek (patrz Tabela materiałów), aby odczytać wartości barwienia CV. Po potraktowaniu lodowatym kwasem octowym odczytać tabliczkę na długości fali 595 nm. 
	UWAGA: Długość fali używana do pomiaru średnicy zewnętrznej CV może wynosić od 500 do 600 nm35.</li>
</ol>
3. Izolacja neutrofili
UWAGA: Neutrofile zostały wyizolowane zgodnie z wcześniej opublikowaną metodą z niewielkimi zmianami36. Ten protokół izolacji łączy najpierw wirowanie w gradionym gradiacji gęstości, a następnie 3% sedymentację dekstranu. W tej sekcji omówiono tylko ogólny protokół izolacji neutrofili, koncentrując się na zmianach wprowadzonych do opublikowanego protokołu. Co więcej, opisany poniżej protokół jest jedną z wielu metod, które mogą izolować neutrofile i mogą być zastępowane w razie potrzeby. Inne metody izolowania neutrofili obejmują użycie pożywki do separacji komórek lub magnetycznej separacji komórek przeciwciał37.
<ol>
	<li>Pobrać krew od dorosłego dawcy poprzez wkłucie żyły, zgodnie z protokołem przedstawionym w instytucjonalnym IRB. Przed pobraniem krwi należy upewnić się, że w strzykawce znajduje się wystarczająca ilość heparyny wolnej od konserwantów, tak aby końcowe stężenie heparyny wynosiło 20 j./ml.</li>
	<li>Rozcieńczyć krew heparynizowaną 3/4 objętości 0,9% NaCl wolnego od endotoksyn (patrz tabela materiałów) w H2O w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Na każde 20 ml rozcieńczonej próbki krwi należy dodać 14 ml dostępnego w handlu podłoża o gradiencie gęstości (patrz tabela materiałów) w świeżej stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Ostrożnie ułóż rozcieńczoną próbkę krwi na pożywce o gradiencie gęstości.</li>
	<li>Odwirować warstwową próbkę krwi o masie 400 x g przez 40 minut w temperaturze pokojowej. Upewnij się, że wirówka ma powolną przerwę, aby uniknąć naruszenia warstwy po zakończeniu wirowania. 
	UWAGA: Próbka krwi będzie miała pięć warstw zawierających mieszaninę soli fizjologicznej i osocza, warstwę komórek jednojądrzastych, pożywkę gradientu gęstości, neutrofile i erytrocyty.</li>
	<li>Za pomocą pipety serologicznej odessać wszystkie warstwy powyżej neutrofili i osadu erytrocytów, a następnie delikatnie zawiesić osad w zimnym, wolnym od endotoksyn 0,9% NaCl wH2O. Dla każdej osadki wytworzonej z 20 ml próbki krwi należy ponownie zawiesić osad z powrotem do całkowitej objętości 20 ml. Dodać 3% dekstranu w stosunku 1:1 (patrz Tabela Materiałów). Inkubować probówkę w pozycji pionowej przez 18-20 minut na lodzie. 
	UWAGA: Upewnij się, że 3% dekstran jest wykonany z wolnego od endotoksyn 0,9% NaCl w H2O.</li>
	<li>Usunąć 20 ml górnej warstwy zawierającej neutrofile i niektóre erytrocyty na nową stożkową probówkę o pojemności 50 ml i odwirować ją przy 355 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Odleć supernatant, pozostawiając czerwoną osadkę.</li>
	<li>Delikatnie zawiesić osad w 10 ml zimnego, sterylnegoH2Oprzez 30 s w celu lizy pozostałych erytrocytów. Natychmiast dodaj 10 ml zimnej 0,9% soli fizjologicznej wolnej od endotoksyn do mieszaniny, aby przywrócić toniczność. Odwirować roztwór o stężeniu 233 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Odlewać supernatant i ponownie zawiesić osad zawierający 95%-97% neutrofili w 1 ml zimnego HBSS na 20 ml próbki krwi.</li>
	<li>Przenieść 10 μl zawieszonych neutrofili w 90 μl 0,4% barwnika wykluczającego błękit trypanowy i policzyć komórki za pomocą hemocytometru (patrz tabela materiałów). 
	UWAGA: Komórki niezdolne do życia są barwione na niebiesko, ponieważ barwnik wykluczający błękit trypanowy jest nieprzepuszczalny w komórkach żywotnych. Ten protokół zapewnia >99% żywotności komórek37,38.</li>
	<li>Dodać dodatkowe HBSS tak, aby końcowe stężenie neutrofili wynosiło 4 x 106 komórek/ml. 
	UWAGA: W przypadku <99% żywotności komórek można nadal osiągnąć końcowe stężenie 4 x 106 komórek/ml; jednak całkowita objętość roztworu zawierającego 4 x 106 komórek/ml uzyskana zmniejszy się. Końcowe stężenie neutrofili można dostosować do potrzeb eksperymentalnych użytkownika. Neutrofile zostały ponownie zawieszone w końcowym stężeniu 4 x 106 komórek/ml dla wszystkich eksperymentów opisanych poniżej. Aby uwzględnić zmienność między dawcami, zdecydowanie zaleca się, aby wszystkie eksperymenty związane z neutrofilami były przeprowadzane z udziałem co najmniej trzech różnych dawców.</li>
</ol>
4. Pomiar ROS wytwarzanych przez neutrofile
<ol>
	<li>Dodać kroplami 100 μl 20% normalnej ludzkiej surowicy (rozcieńczonej w HBSS) do przemytego biofilmu (krok 1.6) i inkubować w temperaturze 37 °C w warunkach statycznych przez 30 minut w celu opsonizacji biofilmu.</li>
	<li>Odessać 20% roztwór surowicy i przemyć biofilmy kroplami 150 μl HBSS. Odessać HBSS, pozostawiając studzienki z opsonizowanymi biofilmami. 
	UWAGA: Do interpretacji eksperymentu zalecane są co najmniej cztery grupy: (A) neutrofile + biofilm, (B) neutrofile + PMA (kontrola pozytywna, patrz tabela materiałów), (C) tylko neutrofile i (D) tylko biofilm.</li>
	<li>Dodać luminol (patrz tabela materiałów) do neutrofili zawieszonych w HBSS w stężeniu 4 x 106 komórek/ml tak, aby końcowe stężenie luminolu wynosiło 50 μM. To rozwiązanie jest gotowe do użycia dla grup (A) i (C). Dodaj 4 x 105 neutrofili zmieszanych z luminolem do studzienek z opsonizowanymi biofilmami.</li>
	<li>W oddzielnej probówce przygotować 50 μM roztwór luminolu w HBSS bez neutrofili i dodać go do studzienki zawierającej biofilm (grupa D).</li>
	<li>Podwielokrotność 350 μl neutrofili zmieszanych z luminolem i dodać do mieszaniny 12-mirystynian 13-octanu forbolu (PMA) o końcowym stężeniu 500 ng/ml. Dla grupy (B) dodać 4 x 105 neutrofili z tej mieszaniny do studzienek bez biofilmu. Służy to jako kontrola pozytywna. 
	UWAGA: Stężenie PMA wskazane na tym etapie jest stosunkowo wysokie, aby zapewnić silną odpowiedź na impuls, ponieważ neutrofile stymulowane PMA są kontrolą pozytywną. PMA może być stosowany w niższym stężeniu do aktywacji neutrofili, w zależności od eksperymentu.</li>
	<li>Odwirować płytkę o sile 270 x g przez 30 s w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Upewnij się, że czytnik płytek jest ustawiony na 37 °C wraz z ustawieniem luminescencji i odczytu kinetycznego przez 60 minut w odstępach 3-minutowych. Umieść płytkę w czytniku płytek, aby zmierzyć produkcję ROS przez neutrofile przez 60 min. 
	UWAGA: W tym teście biofilmy hodowano na białych płytkach używanych do testów luminescencyjnych. PMA jest znanym agonistą odpowiedzi oksydacyjnej na wybuch39. Podczas wykonywania badań z udziałem PMA należy upewnić się, że PMA jest dodawany na ostatnim etapie, gdy roztwór zawierający neutrofile jest zimny, ponieważ PMA natychmiast inicjuje odpowiedź burst.</li>
</ol>
5. Obrazowanie interakcji biofilm-neutrofile
<ol>
	<li>Stwórz biofilm, wykonując kroki 1.2-1.6. Aby ułatwić obrazowanie biofilmu, należy zastosować fluorescencyjny szczep S. aureus, taki jak USA300 eksprymujący białko zielonej fluorescencji (GFP)40,41, aby zwiększyć łatwość obrazowania mikroskopowego. 
	UWAGA: Zamiast 96-dołkowej płytki użyto 6-μ-kanałowego szkiełka (patrz Tabela materiałów) w celu zademonstrowania modelu biofilmu in vitro (krok 1).</li>
	<li>Inkubować 4 x 106 komórek/ml neutrofili ze 100 μM niebieskiego barwnika CMAC (7-amino-4-chlorometylokoumaryny) (BCD, patrz tabela materiałów) przez 30 minut w bujaku w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Upewnij się, że próbki są inkubowane w ciemności i ogranicz ekspozycję na światło w pozostałych etapach.</li>
	<li>Aby wypłukać nadmiar BCD, odwirować neutrofile o stężeniu 270 x g przez 5 minut i odessać supernatant. Zawiesić neutrofile w świeżym HBSS. W tym momencie dodać homodimer-1 etydyny (patrz tabela materiałów) do neutrofili barwionych BCD w końcowym stężeniu 4 μM w celu monitorowania śmierci neutrofili i bakterii.</li>
	<li>Dodać 150 μl neutrofili do biofilmu S. aureus, który został wyhodowany na μ-szkiełkach, tak aby stosunek neutrofili do bakterii wynosił 1:30 (neutrofile: bakterie). Inkubować μ szkiełka w wilgotnej komorze przez 30 minut. Liczba komórek bakteryjnych opiera się na liczbie komórek uzyskanej z posiewu biofilmu trwającego 18 godzin.</li>
	<li>Zobrazuj oddziaływanie neutrofile-biofilm za pomocą kanałów fluorescencyjnych odpowiadających długościom fal wzbudzenia i emisji barwników/białek fluorescencyjnych. 
	UWAGA: W niniejszym badaniu BCD wynosi 353/466 nm, homodimer-1 etydyny-1 wynosi 528/617 nm, a GFP wynosi 395/509 nm. Ogranicz ekspozycję próbki na działanie lasera lub światła, aby zapobiec fotowybielaniu próbek.</li>
	<li>Analizuj obrazy za pomocą oprogramowania do analizy obrazów mikroskopowych lub programów, takich jak FIJI/ImageJ, COMSTAT2, BiofilmQ i BAIT, między innymi42,43,44,45. 
	UWAGA: Podczas pracy z plamami należy wziąć pod uwagę specyfikę używanych barwników. Niektóre plamy działają na komórki prokariotyczne i eukariotyczne, podczas gdy inne działają tylko na jedną. Jeśli neutrofile i biofilmy są barwione oddzielnie przy użyciu barwników, które mogą barwić oba typy komórek, upewnij się, że zmyłeś pozostały barwnik przed połączeniem neutrofili i biofilmów, aby zapobiec barwieniu krzyżowemu.</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podjęto liczne wysiłki w celu wyhodowania wytrzymałych i powtarzalnych biofilmów S. aureus do dalszych eksperymentów in vitro 48,49,50. Przedstawiono znormalizowany protokół, który wykorzystuje kationowy charakter PLL, a także uzupełnia pożywkę glukozą w celu wzrostu silnych biofilmów S. aureus in vitro. Dodatek PLL pozwala na lepsze przyłączenie ujemnie naładowanej komórki bakteryjnej do dodatnio naładowanych powierzchni pokrytych PLL. Należy zauważyć, że PLL w stężeniu 10 μg/ml ma działanie przeciwdrobnoustrojowe przeciwko Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli i S. aureus podczas inkubacji przez 24 godziny51. To samo stężenie stosuje się do powlekania powierzchni; jednak nadmiar PLL jest zasysany, co sprawia, że stężenie PLL jest niższe niż 10 μg/ml podczas siewu w celu wzrostu biofilmu.
Ważne jest, aby zauważyć, że PLL działał tylko w określonych pożywkach wzrostowych, takich jak MEMα z 2% glukozą, gdzie zaobserwowano, że S. aureus wytwarzał silne biofilmy o minimalnej zmienności (Figura 2A). Stężenie PLL, które miałoby być stosowane w połączeniu z innymi rodzajami mediów, wymagałoby dalszej optymalizacji, takiej jak zastosowanie zwiększonego stężenia PLL do pokrycia studni. Dodatkowo warunki te zostały zoptymalizowane pod kątem monogatunkowego biofilmu S. aureus . Podczas gdy biofilmy ran przewlekłych są często wielomikrobiologiczne, standaryzacja testów w celu zbadania biofilmu jednogatunkowego i jego interakcji z neutrofilami i innymi komórkami odpornościowymi jest kluczem do zrozumienia ich udziału w patogenezie52. Te ustandaryzowane protokoły można dalej optymalizować w celu utrzymania i badania biofilmów polimikrobiologicznych i ich interakcji z neutrofilami.
Zaobserwowano również, że bogate pożywki bakteryjne, takie jak TSB, doprowadziły do utraty żywotności neutrofili (ryc. 1). W związku z tym zoptymalizowano warunki wzrostu biofilmów S. aureus w MEMα, stosowanych do hodowli komórek ssaków. W przypadku badań z udziałem neutrofili pożywka ta wspomaga żywotność neutrofili i wspomaga wzrost S. aureus . Chociaż zaobserwowano, że pożywka wpływa na żywotność neutrofili, ważne jest również, aby wziąć pod uwagę, że neutrofile wyizolowane z obwodowej krwi ludzkiej ulegają apoptozie ex vivo z około 70% apoptozą neutrofili do 20 godziny53. Wymaga to odpowiedniego obchodzenia się z neutrofilami, takich jak przechowywanie neutrofili na lodzie podczas przygotowywania się do eksperymentów, stosowanie odczynników wolnych od endotoksyn oraz zapobieganie aktywacji neutrofili poprzez unikanie wirowania próbek z neutrofilami.
Ocena wybuchu oksydacyjnego w neutrofilach jest rutynowo wykonywana w celu określenia zabijającego wpływu neutrofili na patogen 14,54,55. Badania te są często wykonywane na bakteriach planktonowych, do których dodaje się neutrofile, a odpowiedź na wybuch oksydacyjny określa się ilościowo za pomocą chemiluminescencji wzmocnionej luminolem, która wykrywa aniony ponadtlenkowe wytwarzane przez neutrofile. Obecny protokół jest modyfikowany poprzez zastąpienie bakterii planktonowych statycznie rosnącym biofilmem S. aureus 18 h. W związku z tym neutrofile mogą być bezpośrednio dodawane do biofilmu w celu oceny ich aktywacji. Z drugiej strony bakterie w biofilmach wytwarzają enzymy, takie jak katalaza i dysmutaza ponadtlenkowa, w celu detoksykacji ROS23,56. Biofilmy Staphylococcus epidermidis wytwarzają pod wpływem stresu wyższą katalazę niż jego planktonowy odpowiednik57. Całkowita chemiluminescencja neutrofili stymulowanych PMA w biofilmie S. aureus jest znacznie niższa niż w neutrofilach stymulowanych PMA, w których biofilm jest nieobecny (ryc. 2). Może to wynikać z aktywności tych enzymów detoksykujących. Ponadto biofilmy S. aureus wytwarzają kilka toksyn tworzących pory zwanych leukocydynami, które zabijają neutrofile58. Zmniejszona reakcja impulsowa jest również prawdopodobnie spowodowana zmniejszoną żywotnością neutrofili w obecności biofilmu S. aureus. Podczas gdy w tym badaniu wykorzystuje się luminol, który wykrywa całkowite ROS wytwarzane zarówno wewnątrz, jak i na zewnątrz komórek, inne odczynniki, takie jak CM-H2DCFDA (dioctan 5-(i-6)-chlorometylo-2'7'-dichlorodihydrofluoresceiny) lub izoluminol, muszą być brane pod uwagę, jeśli celem pracy jest badanie wewnątrzkomórkowej lub zewnątrzkomórkowej produkcji ROS 14,53,54 konkretnie.
Możliwość wizualizacji interakcji neutrofile-biofilm za pomocą mikroskopii może dostarczyć informacji o zachowaniu neutrofili i biofilmów w swojej obecności. Widma wzbudzenia i emisji barwników i białek fluorescencyjnych stanowią migawkę interakcji między 18-godzinnym biofilmem S. aureus a neutrofilami po 30-minutowej inkubacji. Aby skutecznie przechwytywać sygnały z barwionych komórek, ważne jest, aby ograniczyć ekspozycję próbek na źródła światła podczas ustawiania próbek do mikroskopii. Podczas obrazowania uniknięto szybkiego fotowybielania próbek poprzez obniżenie intensywności źródła światła podczas regulacji wszystkich parametrów, takich jak wysokość stosu Z i czas ekspozycji dla różnych kanałów.
Te proste praktyki pozwoliły na prawidłowe obrazowanie mikroskopowe, w którym zaobserwowano, że niewiele neutrofili jest zlokalizowanych w biofilmie (ryc. 4A). Może to być spowodowane przestrzeniami obecnymi w biofilmie, ponieważ biofilm 18 h S. aureus wyhodowany w MEMα z 2% glukozą nie pokrywa równomiernie powierzchni (ryc. 4B). Jednak w innych badaniach wykorzystanie multimediów wykazało jednolity trawnik wzrostu biofilmu S. aureus i leukocytów przenikających przez biofilm30,58. Ponadto zaobserwowano również, że nastąpiła śmierć komórek neutrofili po 30 minutach inkubacji z biofilmami S. aureus z powodu leukocydyn wytwarzanych przez S. aureus biofilm, które lizują neutrofile58 (Figura 4A, D). Dodanie etapu przemywania w celu usunięcia nieprzylegających neutrofili po inkubacji ich z biofilmem przez 30 minut usunęło ~15% martwych neutrofili z systemu w porównaniu z grupą niemytą, w której mikroskopię wykonano natychmiast po 30 minutach inkubacji (Figura 4D). Zaobserwowano również neutrofile oddziałujące z S. aureus (ryc. 4C). Konieczne są dalsze eksperymenty, aby ocenić, czy S. aureus jest pochłonięty przez neutrofile, czy też przyłączony do powierzchni komórek neutrofili54. Obrazowanie neutrofili i biofilmów jest pierwszym krokiem do oceny kilku funkcji neutrofili, takich jak fagocytoza i NEToza54,59. Wpływ neutrofili na biofilmy można również ocenić, określając ilościowo biomasę biofilmu, zmiany strukturalne biofilmu i żywotność biofilmu, między innymi, za pomocą narzędzi do analizy obrazu wymienionych w kroku 5.6. Wreszcie, w neutrofilach występuje zmienność między dawcami; W związku z tym zaleca się, aby do badań z udziałem neutrofili wykorzystano co najmniej trzech różnych dawców.
Ogólnie rzecz biorąc, połączono standaryzowane testy in vitro w celu oceny interakcji między neutrofilami a biofilmami. Chociaż testy te wykorzystują S. aureus, opisane protokoły można łatwo dostosować do badania innych patogenów. Chociaż istnieją różne modele in vivo do badania interakcji gospodarz-patogen, mogą one być kosztowne i pracochłonne, zwłaszcza jeśli warunki nie są zoptymalizowane. Praca ze standaryzowanymi testami in vitro pozwala zoptymalizować warunki eksperymentalne i potwierdzić obserwacje przed przejściem do systemu in vivo. Wreszcie, do badania interakcji biofilm-neutrofile in vivo wykorzystano różne modele infekcji zwierzęcych. Jednak ważne jest, aby wziąć pod uwagę różnice immunologiczne między modelami ludzkimi i zwierzęcymi 60,61,62,63. Wymaga to wykorzystania neutrofili pochodzących od ludzi do badania tych złożonych interakcji gospodarz-patogen.

Biofilm to społeczność mikroorganizmów związanych z powierzchnią lub niezwiązanych agregatów zamkniętych w zewnątrzkomórkowej substancji polimerowej (EPS)1,2. Społeczności te chronią zamknięte mikroorganizmy przed stresorami środowiskowymi, w tym tolerancją na środki przeciwdrobnoustrojowe i układ odpornościowy3. Kilka chorobotwórczych gatunków drobnoustrojów tworzy biofilmy, które są związane z przewlekłymi infekcjami4. Rozwój biofilmów to skomplikowany proces obejmujący przyczepianie się do powierzchni, produkcję EPS, proliferację komórek, strukturyzację biofilmu i odrywanie komórek5. Gdy komórki rozproszą się, tworząc biofilm, pozostają planktoniczne lub przemieszczają się do nowego podłoża i ponownie inicjują rozwój biofilmu6.
Staphylococcus aureus, patogen oportunistyczny, podąża za ogólnym schematem rozwoju biofilmu, w tym przyczepiania, proliferacji, dojrzewania i rozprzestrzeniania się7. Proces przyłączania w biofilmach S. aureus jest podyktowany oddziaływaniami hydrofobowymi, kwasami teichojowymi i mikrobiologicznymi składnikami powierzchni rozpoznającymi cząsteczki matrycy adhezyjnej (MSCRAMMs)8,9. Gdy zaczyna się proliferacja S. aureus, wytwarzany jest EPS, który składa się głównie z polisacharydów, białek, zewnątrzkomórkowego DNA i kwasów tejchojowych5. Podczas wytwarzania składników EPS wytwarzane są również różne egzoenzymy i małe cząsteczki, które przyczyniają się do trójwymiarowej struktury biofilmu i pomagają w oderwaniu5. S. aureus wykorzystuje ten wysoce skoordynowany styl życia do tworzenia różnych przewlekłych infekcji, w tym infekcji spowodowanych zamieszkaniem urządzeń medycznych10.
Oporny na metycylinę S. aureus (MRSA) jest jedną z głównych przyczyn infekcji związanych z urządzeniami medycznymi znajdującymi się na stałe, takimi jak cewniki do żył centralnych i dróg moczowych, protezy stawów, rozruszniki serca, mechaniczne zastawki serca i urządzenia wewnątrzmaciczne11. Podczas takich infekcji neutrofile są pierwszymi komórkami odpornościowymi gospodarza rekrutowanymi do miejsca infekcji w celu zwalczania patogenów za pomocą wielu strategii12. Należą do nich fagocytoza, degranulacja, produkcja reaktywnych form tlenu i azotu (ROS/RNS) lub uwalnianie zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofili (NET) w celu wyeliminowania patogenów13.
Wytwarzanie ROS po fagocytozie drobnoustrojów jest jedną z kluczowych reakcji przeciwdrobnoustrojowych wykazywanych przez neutrofile14. Fagocytoza jest wzmocniona, jeśli drobnoustroje są pokryte opsoninami, w szczególności immunoglobulinami i składnikami dopełniacza znajdującymi się w serum15. Opsonizowane drobnoustroje są następnie rozpoznawane przez receptory powierzchniowe komórek na neutrofilach i pochłaniane, tworząc przedział zwany phagosome15. Neutrofile generują i uwalniają ROS w fagosomie za pośrednictwem związanej z błoną oksydazy NADPH16. Ten wieloskładnikowy kompleks enzymatyczny generuje aniony ponadtlenkowe, przenosząc elektrony do tlenu cząsteczkowego16. Dodatkowo, neutrofile generują również RNS poprzez ekspresję indukowalnej syntazy tlenku azotu (iNOS)17. Te wysokie rodniki ponadtlenkowe i tlenek azotu w fagosomie mają szerokie działanie przeciwdrobnoustrojowe. Mogą wchodzić w interakcje z centrami metali w enzymach i uszkadzać kwasy nukleinowe, białka i błony komórkowe patogenu18,19,20,21. Wiele mikroorganizmów przyjmuje styl życia biofilmu i stosuje różne strategie, aby uniknąć zabicia przez ROS22,23. Tak więc standaryzowane testy, które łączą biofilmy z neutrofilami w celu ilościowego określenia ROS, są korzystne dla spójnych wyników.
Podczas gdy testy, takie jak ilościowe określanie produkcji ROS neutrofili, dostarczają informacji o reakcjach neutrofili na biofilmy, możliwość wizualizacji interakcji neutrofili w biofilmie może również służyć jako potężne narzędzie. Zastosowanie barwników fluorescencyjnych do mikroskopii często wymaga optymalizacji w celu uzyskania wysokiej jakości obrazów, które można wykorzystać do analizy obrazowania mikroskopowego. Elastyczność w optymalizacji niektórych warunków jest ograniczona, ponieważ neutrofile mogą ulec śmierci komórkowej po izolacji. Ponadto biofilmy są zwykle płukane w celu usunięcia populacji planktonu z zestawu doświadczalnego przed dodaniem neutrofili. Podczas płukania może wystąpić zmienność między powtórzonymi biofilmami z powodu utraty częściowej biomasy, jeśli biofilmy są luźno przylegające do powierzchni.
Ogólnie rzecz biorąc, obecne metody analizy interakcji między neutrofilami a biofilmami obejmują głównie mikroskopię, cytometrię przepływową i wyliczanie jednostek tworzących kolonie (CFU)24,25,26,27. Mikroskopia polega na użyciu barwników, które albo bezpośrednio barwią neutrofile i biofilmy, albo celują w różne reakcje neutrofili przeciwko drobnoustrojom, takie jak tworzenie NET, degranulacja i śmierć komórki25,28. Podzbiór tych reakcji, takich jak śmierć komórek neutrofilów i degranulacja, może być również analizowany za pomocą cytometrii przepływowej, ale wymaga, aby neutrofile były preferencyjnie niezwiązane z dużymi agregatami drobnoustrojów w biofilmie28,29. Cytometria przepływowa może również określić ilościowo niektóre parametry biofilmu, takie jak żywotność komórek27. Procesy te wymagają jednak rozerwania biomasy biofilmu i nie byłyby przydatne do wizualizacji innych ważnych interakcji, takich jak przestrzenne rozmieszczenie neutrofili i ich składników w biofilmie27,29,30.
Obecny protokół skupia się na adaptacji niektórych tradycyjnie stosowanych metod do badania interakcji neutrofil-biofilm na biofilmach, które zostały zoptymalizowane tak, aby zapewnić minimalną zmienność podczas obchodzenia się z nimi. Protokół ten zapewnia zatem ustandaryzowane metody hodowli i ilościowego oznaczania biofilmów, izolowania pierwotnych ludzkich neutrofili z krwi obwodowej, ilościowego określania produkcji ROS i wizualizacji interakcji biofilm-neutrofile za pomocą mikroskopii. Protokół ten można dostosować do różnych systemów, aby zrozumieć interakcje biofilm-neutrofile, biorąc pod uwagę heterogeniczność między pulami dawców.

<table><tbody><tr><td>0,9% nawadnianie chlorkiem sodu, USP</td><td>Baxter</td><td>2F7124</td><td>Bez endotoksyn; Służy do izolacji neutrofili</td></tr><tr><td>150 mL szybkoprzepływowa jednostka filtrująca</td><td>Thermo Scientific</td><td>565-0020</td><td></td></tr><tr><td>200 proof etanol</td><td>VWR</td><td>89125-188</td><td></td></tr> 3 <tr><td>ml strzykawka</td><td>BD</td><td>309657</td><td>Służy do pobierania krwi</td></tr><tr><td>50 ml stożkowe probówki wirówkowe</td><td>Thermo Scientific</td><td>339652</td><td></td></tr><tr><td>60 ml strzykawka</td><td>BD</td><td>309653</td><td>Służy do pobierania krwi</td></tr><tr><td>Odczynniki Agar</td><td>Fisher</td><td>BP1423-2</td><td></td></tr><tr><td>Wacik nasączony alkoholem</td><td>BD</td><td></td><td>Używany do pobierania krwi</td></tr><tr><td>Plastry</td><td></td><td></td><td>Używany do pobierania krwi</td></tr><tr><td>BD Bacto Tryptyczny bulion sojowy</td><td>BD</td><td>DF0370-07-5</td><td>Połącz z 1,5% agarem, aby zrobić licznik komórek agaru sojowego Tryptic</td></tr><tr><td></td><td>Bal Saupply</td><td>202C</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker niebieski CMCH</td><td>Invitrogen</td><td>C2111</td><td>Niebieski barwnik CMAC (BCD)</td></tr><tr><td>Przezroczyste 96-dołkowe płytki polistyrenowe z płaskim dnem</td><td>Costar</td><td>3370</td><td></td></tr><tr><td>Gaza bawełniana</td><td>Fisherbrand</td><td>13-761-52</td><td>Używana do pobierania krwi</td></tr><tr><td>Kryształowy fiolet</td><td>Acros Organic</td><td>40583-0250</td><td></td></tr><tr><td>Probówki</td><td>hodowlane Fisherbrand</td><td>14-961-27</td><td>Szkło borokrzemianowe 13 x 100 mm</td></tr><tr><td>D-(+)- glukoza</td><td>Sigma</td><td>G-8270</td><td></td></tr><tr><td>Dekstran z Leuconostoc spp.</td><td>Sigma</td><td>31392-250G</td><td>Służy do izolacji neutrofili</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco (DPBS) 1x</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Ethidium homodimer-1</td><td>Invitrogen</td><td>L3224 B</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque plus</td><td>Cytiva</td><td>17144003</td><td>Służy do izolacji neutrofili (podłoże gradientu gęstości)</td></tr><tr><td>Zrównoważony roztwór soli Hanksa (HBSS) 1x</td><td>Corning cellgro</td><td>21-022-CV</td><td>bez czerwieni wapniowej, magnezowej i fenolowej</td></tr><tr><td>Hemacytometr</td><td>Bright Line</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heparyna</td><td>Novaplus</td><td>NDC 63323-540-57</td><td>1000 jednostek USP / ml, Używany do pobierania krwi</td></tr><tr><td>IMARIS 9.8</td><td>Oxford Instruments Oprogramowanie</td><td></td><td>do analizy obrazów mikroskopowych</td></tr><tr><td>Luminol</td><td>Sigma</td><td>A8511-5G</td><td></td></tr><tr><td>Minimalny podstawowe podłoże (MEM) Alpha 1x</td><td>Gibco</td><td>41061-029</td><td></td></tr><tr><td>Igła (23 G1)</td><td>BD</td><td>305145</td><td>Służy do pobierania krwi</td></tr><tr><td>Nikon Eclipse Ti2</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NIS-Elements</td><td>Nikon</td><td></td><td>Kwantyfikacja martwych neutrofili Normalna</td></tr><tr><td>ludzka surowica</td><td>Technologia dopełniacza</td><td>NHS</td><td></td></tr><tr><td>Szalka Petriego (100 x 15 mm)</td><td>VWR</td><td>25384-342</td><td></td></tr><tr><td>12-mirystynian 13-octanu</td><td></td><td></td><td></td>forbolu</tr><tr><td>Roztwór poli-L-lizyny</td><td>Sigma</td><td>P4707-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Odczynniki</td><td>Fisher BP358-10</td><td>Używany do izolacji neutrofili</td></tr><tr><td>Oprogramowanie SoftMax Pro</td><td>Urządzenia molekularne Czytnik</td><td></td><td>mikropłytek oprogramowanie używane do akwizycji danych</td></tr><tr><td>SpectraMax i3x</td><td>Urządzenia molekularne Czytnik</td><td></td><td>mikropłytek</td></tr><tr><td>Sterylna woda do nawadniania, USP</td><td>Baxter</td><td>2F7114</td><td>Bez endotoksyn; Służy do izolacji neutrofili</td></tr><tr><td>Zestaw do infuzji skrzydełkowej Surflo</td><td>Terumo</td><td>SC*19BLK</td><td>19 G x 3/4", służy do pobierania krwi</td></tr><tr><td>Barwienie niebieskim trypanem (0,4%)</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Turnicate</td><td></td><td></td><td>Używany do pobierania krwi</td></tr><tr><td>UltraPure woda destylowana</td><td>Invitrogen</td><td>10977015</td><td></td></tr><tr><td>Białe nieprzezroczyste płytki 96-dołkowe</td><td>Falcon</td><td>353296</td><td>Hodowla tkankowa poddana działaniu i płaska płyta dolna</td></tr><tr><td>&mu;-Slide VI 0.4</td><td>Ibidi</td><td>80601</td><td>&mu;-channel slide</td></tr></tbody></table>

standaryzowane testy in vitro do wizualizacji i ilościowego określenia interakcji między ludzkimi neutrofilami a biofilmami staphylococcus aureus

Standardized In vitro Assays to Visualize and Quantify Interactions between Human Neutrophils and Staphylococcus aureus Biofilms

Neutrofile są pierwszą linią obrony wykorzystywaną przez układ odpornościowy podczas infekcji mikrobiologicznej. In vivo neutrofile są rekrutowane do miejsca infekcji, gdzie wykorzystują takie procesy, jak fagocytoza, produkcja reaktywnych form tlenu i azotu (odpowiednio ROS, RNS), NEToza (pułapka zewnątrzkomórkowa neutrofili) i degranulacja w celu zabicia drobnoustrojów i ustąpienia infekcji. Interakcje między neutrofilami a drobnoustrojami planktonowymi zostały szeroko zbadane. W ostatnich latach pojawiło się zainteresowanie badaniem zakażeń wywoływanych przez biofilmy. Biofilmy wykazują właściwości, w tym tolerancję na zabijanie przez neutrofile, odmienne od ich planktonowych odpowiedników. Dzięki pomyślnemu stworzeniu modeli biofilmu zarówno in vitro, jak i in vivo, można teraz badać interakcje między tymi społecznościami drobnoustrojów a różnymi komórkami odpornościowymi. W tym przypadku techniki, które wykorzystują kombinację tradycyjnych modeli biofilmu i dobrze ugruntowanych testów aktywności neutrofili, są dostosowane specjalnie do badania interakcji neutrofili i biofilmu. Szerokokątna mikroskopia fluorescencyjna służy do monitorowania lokalizacji neutrofili w biofilmach. Te biofilmy są hodowane w warunkach statycznych, a następnie dodawane są neutrofile pochodzące z ludzkiej krwi obwodowej. Próbki są barwione odpowiednimi barwnikami przed wizualizacją pod mikroskopem. Dodatkowo produkcja ROS, która jest jedną z wielu odpowiedzi neutrofili na patogeny, jest określana ilościowo w obecności biofilmu. Dodanie komórek odpornościowych do tego uznanego systemu poszerzy wiedzę na temat interakcji gospodarz-patogen, zapewniając jednocześnie wykorzystanie ustandaryzowanych i zoptymalizowanych warunków do dokładnego pomiaru tych procesów.

Pożywki stosowane do hodowli bakteryjnych biofilmów wpływają na przeżywalność neutrofilów. Przetestowano różne pożywki, aby zminimalizować sam wpływ medium na żywotność neutrofilów w badaniach nad oddziaływaniami między neutrofilami a biofilmem (Rysunek 1). Pożywki do wzrostu bakterii, takie jak Tryptic Soy Broth, ograniczają żywotność neutrofilów, w taki sposób, że ok. 60% neutrofilów pozostaje żywych po 30-minutowej inkubacji w temperaturze 37 °C przy 5% CO2. Pożywki do hodowli komórek ssaków, takie jak MEMα, nie wpływają na żywotność neutrofilów i wspierają wzrost biofilmów S. aureus. W rzeczywistości pożywki minimalne sprzyjają intensywnemu wzrostowi biofilmów u innych bakterii46,47.
Aby ocenić wpływ pożywek na wzrost biofilmu oraz zmienność w ilościowym określaniu biomasy biofilmu po przemyciu biomasy w celu wyeliminowania komórek planktonicznych, biofilm S. aureus hodowano przez 18 h w płytce 96-dołkowej, w której dołki były traktowane lub nie traktowane poli-L-lizyną. Zastosowano pożywkę bogatą (Tryptic Soy Broth (TSB)) oraz minimalną (MEMα), w formie pierwotnej lub uzupełnione o 2% glukozy. Biomasa biofilmu barwiona CV wykazała, że biofilm S. aureus hodowany w pożywce MEMα uzupełnionej o 2% glukozy wytworzył najsilniejszy biofilm spośród wszystkich testowanych pożywek (Rysunek 2A). Co więcej, biofilmy hodowane w dołkach wstępnie traktowanych PLL, zawierających MEMα + 2% glukozy, wykazały mniejszą zmienność niż biofilmy w dołkach nietraktowanych PLL zawierających MEMα + 2% glukozy. Biofilmy te wykazały mniejszą zmienność w ilościowym określaniu via test CV35 oraz CFU/mL po wysiewaniu, przy zastosowaniu precyzyjnych procedur manipulacji biofilmem podczas kwantyfikacji biomasy. Biofilmy te zawierały średnio 1 x 108 CFU/mL, co wykazano poprzez wysiewanie biofilmów w 3 oddzielnych dniach (Rysunek 2B). Wartość ta jest przydatna przy określaniu liczby neutrofili, które należy dodać do biofilmów w celu przeprowadzenia testów funkcjonalności neutrofili.
W celu pomiaru produkcji ROS przez neutrofile w odpowiedzi na biofilmy, biofilmy S. aureus hodowano statycznie przez 18-20 h w płytce 96-dołkowej. Następnie biofilmy opsonizowano i dodano neutrofile. Następnie mierzono produkcję ROS przez 60 min (Rysunek 3A). Pole pod krzywą oblicza się z krzywej kinetycznej, aby określić całkowitą produkcję ROS przez neutrofile. Neutrofile traktowane agonistą, takim jak PMA, stosowanym jako kontrola, wykazują zwiększoną produkcję ROS. Wobec braku biofilmów neutrofile traktowane PMA wykazywały intensywną produkcję ROS. W obecności biofilmu S. aureus całkowita produkcja ROS przez neutrofile traktowane PMA uległa zmniejszeniu. W przypadku braku PMA neutrofile polegają wyłącznie na oddziaływaniu z biofilmem, co dodatkowo zmniejsza ilość produkowanego ROS (Rysunek 3B).
W celu wizualizacji interakcji między neutrofilami a biofilmem za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej wykorzystano szczep S. aureus wykazujący ekspresję GFP, barwnik Blue CMAC oraz etydium homodimer-1, który barwi odpowiednio cytoplazmę żywych komórek oraz DNA martwych komórek. Biofilm S. aureus hodowano przez 18 h na szkiełku z 6 µ-kanałami. Do przemytych biofilmów dodano neutrofile znakowane barwnikiem Blue CMAC wraz z etydium homodimer-1, a następnie inkubowano przez 30 min w temperaturze 37 °C przy 5% CO2 przed obrazowaniem. Mikroskopia fluorescencyjna w szerokim polu ujawniła, że wiele neutrofili zlokalizowanych było na powierzchni biofilmów S. aureus, podczas gdy nieliczne znajdowały się wewnątrz biofilmu (Rycina 4A). Widoczna była również interakcja między komórkami S. aureus a neutrofilami (Rycina 4C). Większość komórek S. aureus wchodzących w interakcje z neutrofilami (kolor cyjanowy) była martwa (kolor magenta), podczas gdy nieliczne pozostały żywe (kolor żółty), co określono za pomocą barwienia żywe/martwe (Rycina 4C). Dla porównania, biofilmy S. aureus wykazujące ekspresję GFP zabarwiono etydium homodimer-1, co ujawniło frakcję martwej populacji S. aureus wewnątrz biofilmu (Rycina 4B). Nieżywe neutrofile wykazujące pozytywny wynik barwienia etydium homodimer-1 ilościowo określono za pomocą oprogramowania analitycznego (patrz Tabela materiałów) po inkubacji z biofilmami S. aureus. Około 48% neutrofili obumarło w ciągu 30 min inkubacji z biofilmem S. aureus. Podczas optymalizacji protokołu mikroskopowego oceniano również wpływ przemywania biofilmu i neutrofili po 30 min inkubacji w celu usunięcia neutrofili nieprzylegających, co wykazało, że około 33% martwych neutrofili nadal pozostawało przytwierdzonych do biofilmu (Rycina 4D).
<img alt="Wykres słupkowy przeżywalności neutrofili; porównanie traktowania MEMα, TSB i SDS; istotność oznaczona gwiazdkami." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63773/63773fig1v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Analiza LIVE-DEAD porównuje przeżywalność neutrofili w bakteriologicznych i ssaczych mediach hodowlanych. Neutrofile wyizolowano i inkubowano w HBSS, MEMα, TSB lub 0,1% SDS przez 30 min. Barwienie LIVE-DEAD wykonano przy użyciu Calcein AM (żywe komórki) i etydium homodimeru-1 (martwe komórki). Wyznaczono procent żywych neutrofili, przyjmując, że neutrofile inkubowane w HBSS stanowią 100% żywych neutrofili. Wyniki reprezentują średnią z dwóch niezależnych eksperymentów przeprowadzonych w trzech powtórzeniach, z neutrofilami uzyskanymi od dwóch różnych dawców. Dane przedstawiono jako średnia ± SD (*p &lt; 0,05, ****p &lt; 0,0001; jednoczynnikowa analiza ANOVA). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63773/63773fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykres słupkowy biomasy biofilmu OD595; wykres porównawczy replikatów biologicznych CFU/ml; TSB vs MEMα." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63773/63773fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Ilościowe oznaczenie biomasy biofilmu w różnych warunkach oraz ocena żywotności bakterii w biofilmach hodowanych w warunkach zoptymalizowanych. (A) S. aureus zasiano na płytce 96-dołkowej, która była albo powlekana, albo niepowlekana poli-L-lizyną (PLL). Biofilmy hodowano w TSB, MEMα lub w którymkolwiek z tych mediów uzupełnionych o 2% glukozy w warunkach statycznych przez 18 h. W celu zabarwienia biomasy biofilmu wykonano barwienie fioletem krystalicznym (CV). Wyeluowany barwnik CV rozcieńczono w stosunku 1:10 i odczytano w czytniku mikroplatek. Wyniki stanowią średnią z trzech niezależnych eksperymentów przeprowadzonych w trzech powtórzeniach. Dane przedstawiono jako średnia ± SD. SD dla każdej grupy pokazano na dole, aby zobrazować zmienność różnych warunków wzrostu biofilmu. (B) Liczbę CFU bakterii uzyskano z biofilmów hodowanych w medium zoptymalizowanym (MEMα + 2% glukozy). Biofilmy statyczne po 18 h poddano tej samej liczbie przemyć, a następnie 10-minutowej sonikacji w celu rozluźnienia biomasy biofilmu i przepuszczono przez igłę 22G, aby rozbić agregaty przed wysiewaniem. Wyniki reprezentują trzy replikaty wykonane w trzech powtórzeniach. Dane przedstawiono jako średnia ± SD (ns = brak istotności statystycznej; jednoczynnikowa analiza ANOVA). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63773/63773fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wyniki testu luminescencyjnego; wykres luminescencji w funkcji czasu i wykres słupkowy; efekty PMN i BF." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63773/63773fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Ilościowe oznaczenie produkcji ROS przez neutrofile za pomocą testu chemiluminescencyjnego. (A) Neutrofile (PMN) inkubowano z biofilmem (BF) S. aureus przemytym buforem HBSS w obecności (zamknięty szary trójkąt) lub w nieobecności (otwarty szary trójkąt odwrócony) PMA w celu zmierzenia produkcji ROS przez neutrofile. Do detekcji ROS co 3 min przez 60 min w czytniku mikropłytek wykorzystano luminol. Podczas gdy neutrofile traktowane PMA w nieobecności biofilmu (zamknięte czarne koło) służyły jako kontrola pozytywna, grupy zawierające tylko neutrofile (otwarte czarne koło) oraz tylko biofilm (otwarty szary trójkąt) służyły jako kontrole negatywne. Dane reprezentują średnią z dwóch niezależnych eksperymentów przeprowadzonych w trzech powtórzeniach z neutrofilami uzyskanymi od dwóch różnych dawców. Dane przedstawiono jako średnia ± SD. (B) Pole pod krzywą z (A) obliczono w celu ilościowego oznaczenia całkowitej ilości ROS wytworzonych przez neutrofile. Dane przedstawiono jako średnia ± SD. (***p &lt; 0.0001. Jednoczynnikowa analiza ANOVA). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63773/63773fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Rozkład neutrofili na obrazach mikroskopowych i wykres słupkowy przedstawiający porównanie śmierci komórek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63773/63773fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Wizualizacja interakcji między biofilmem S. aureus a neutrofilami przy użyciu szerokopolowej mikroskopii fluorescencyjnej. Neutrofile znakowane niebieskim barwnikiem CMAC (cyjan) zostały uzupełnione o etydium homodimer-1 (magenta; martwe) przed inkubacją z 18-godzinnym biofilmem S. aureus (żółty). Interakcje biofilm-neutrofile obrazowano za pomocą szerokopolowej mikroskopii fluorescencyjnej, a obrazy przetworzono przy użyciu oprogramowania do analizy obrazu. Eksperymenty przeprowadzono z trzema różnymi dawcami. Reprezentatywne obrazy przedstawiają (A) widok 3D biofilmu S. aureus z żywymi (cyjan) i martwymi (magenta; kilka wskazano białymi strzałkami) neutrofilami, (B) widok 3D biofilmu S. aureus wobec braku neutrofili z żywymi S. aureus wykazującymi ekspresję GFP (żółty) lub martwymi S. aureus zabarwionymi etydium homodimer-1 (magenta), (C) widok ortogonalny interakcji S. aureus i neutrofili przedstawiony w płaszczyznach xy, yz i xz oraz (D) ilościowe oznaczenie żywotności neutrofili w obecności biofilmu S. aureus po 30 min, albo bezpośrednio (nieprzemyte), albo po trzech cyklach płukania HBSS w celu usunięcia nieprzytwierdzonych neutrofili (przemyte). Śmierć komórek neutrofili przedstawiono jako średnia ± SD (test t Studenta). Pasek skali wskazuje 50 µm w (A) i (B) oraz 10 µm w (C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63773/63773fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Obecny protokół opisuje badanie interakcji neutrofil-biofilm. Biofilmy Staphylococcus aureus tworzy się in vitro i inkubuje z neutrofilami ludzkimi pochodzącymi z krwi obwodowej. Odpowiedź oksydacyjna neutrofili jest określana ilościowo, a lokalizacja neutrofili w biofilmie jest określana za pomocą mikroskopii.

Standaryzowane testy in vitro do wizualizacji i ilościowego określenia interakcji między ludzkimi neutrofilami a biofilmami Staphylococcus aureus

Neutrophils are the first line of defense deployed by the immune system during microbial infection. In vivo, neutrophils are recruited to the site of ...

Protokoły te mają na celu zrozumienie, w jaki sposób ludzkie neutrofile oddziałują z biofilmami bakteryjnymi i zabijają je. Celem jest lepsze zrozumienie tego zjawiska i ograniczenie zmienności między testami, przy zrozumieniu, że istnieją nieodłączne problemy z ludzkimi neutrofilami w zależności od dawcy. Wymienione tutaj techniki zostały zoptymalizowane, aby umożliwić użytkownikom przeprowadzanie eksperymentów przy minimalnej zmienności, zwłaszcza w przypadku luźno przylegających biofilmów.Ponadto protokoły te można również dostosować do badania innych drobnoustrojów, które mogą tworzyć biofilmy. Zacznij od uzyskania izolowanych kolonii Staphylococcus aureus z kriokonserwowanego wywaru przy użyciu techniki płytki smugowej na bogatej w składniki odżywcze płycie agarowej, takiej jak tryptyczny agar sojowy. Pokryj poszczególne studzienki 96-dołkowej płytki 100 mikrolitrami PLL rozcieńczonymi w sterylnej wodzie i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 30 minut.Zasysać roztwór PLL w sposób aseptyczny za pomocą pułapki aspiracyjnej wspomaganej podciśnieniem. Pozostaw studzienki do wyschnięcia na noc w temperaturze pokojowej. Przygotuj posiew na noc, zaszczepiając kolonię S.aureus w MEM-alfa uzupełnioną 2% glukozą i inkubowaną w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 16 do 18 godzin przy 200 obrotach na minutę.Rozcieńczyć kulturę przez noc, przenosząc 50 mikrolitrów do pięciu mililitrów świeżego MEM-alfa uzupełnionego 2% glukozą. Następnie inkubuj go w temperaturze 37 stopni Celsjusza przy 200 obrotach na minutę, aż do osiągnięcia środkowej fazy logarytmicznej. Użyj MEM-alfa, aby znormalizować kulturę środkowologarytmiczną do OD 0,1.Przenieś 150 mikrolitrów znormalizowanej kultury do każdej studzienki 96-dołkowej płytki poddanej działaniu PLL. Inkubować płytkę w wilgotnej komorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 18 do 20 godzin. Odessać supernatant w celu usunięcia komórek planktonowych.Delikatnie umyj pozostałą biomasę 150 mikrolitrami HBSS, aby usunąć nieprzyłączone komórki. Powtórz co najmniej dwa razy, aby usunąć wszystkie komórki planktonowe. Dodaj 100 mikrolitrów 20% normalnej ludzkiej surowicy rozcieńczonej kroplami w HBSS do przemytego biofilmu i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut, aby zoptymalizować biofilm.Odessać roztwór surowicy i przemyć biofilmy kroplami 150 mikrolitrami HBSS. Odessać HBSS, pozostawiając studzienki z opsonizowanymi biofilmami. Dodać luminol do neutrofili ponownie zawieszonych w HBSS, aby uzyskać końcowe stężenie pięcioma mikromolowymi luminolami.Ten roztwór jest gotowy do użycia dla grup A i C. Dodaj neutrofile zmieszane z luminolem do studzienek z opsonizowanymi biofilmami. Dla grupy D przygotować 50-mikromolowy roztwór luminolu w HBSS w oddzielnej probówce bez neutrofili i dodać go do studzienki zawierającej biofilm. Podwielokrotność 350 mikrolitrów neutrofili zmieszanych z luminolem i dodać PMA w końcowym stężeniu 500 nanogramów na mililitr do mieszaniny.W przypadku grupy B dodać neutrofile z tej mieszaniny do studzienek bez biofilmu. Służy to jako kontrola pozytywna. Odwirować płytkę w temperaturze 270 RCF przez 30 sekund w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Upewnij się, że czytnik płytek jest ustawiony na 37 stopni Celsjusza, a luminescencja i odczyt kinetyczny przez 60 minut w odstępach trzyminutowych. Umieścić płytkę w czytniku płytek, aby mierzyć produkcję ROS przez neutrofile przez 60 minut. Użyj fluorescencyjnego szczepu S.aureus, takiego jak USA300, wykazującego ekspresję GFP, aby ułatwić obrazowanie mikroskopowe.Inkubuj neutrofile ze 100 mikromolowymi BCD przez 30 minut w bujaku w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% atmosferycznym dwutlenkiem węgla. Upewnij się, że próbki są inkubowane w ciemności i ogranicz ekspozycję na światło. Aby przepłukać nadmiar BCD, odwirować neutrofile przy 270 RCF przez pięć minut i odessać supernatant.Ponownie zawiesić neutrofile w świeżym HBSS. Następnie dodać homodimer-1 etydyny do neutrofili barwionych BCD w końcowym stężeniu czterech mikromolowców w celu monitorowania śmierci neutrofili i bakterii. Umyj biofilm HBSS i dodaj 150 mikrolitrów neutrofili do biofilmu S.aureus, który został wyhodowany na mikroszkiełkach.Inkubuj mikroszkiełka w wilgotnej komorze przez 30 minut. Liczba komórek bakteryjnych będzie oparta na liczbie komórek uzyskanej z 18-godzinnego posiewu biofilmu. Zobrazuj oddziaływanie biofilmu neutrofili za pomocą kanałów fluorescencyjnych odpowiadających barwnikom fluorescencyjnym lub długościom fal wzbudzenia i emisji białek.Pożywki bakteryjne zminimalizowały żywotność neutrofili do około 60% po 30 minutach okresu inkubacji. Pożywki do hodowli komórek ssaków nie wpłynęły jednak na żywotność neutrofili i mogą również wspierać wzrost biofilmów S.aureus. Neutrofile traktowane PMA stosowane jako kontrola wykazywały zwiększoną produkcję ROS.Przy braku biofilmów neutrofile traktowane PMA wykazywały silną produkcję ROS. W obecności biofilmu S.aureus ogólna produkcja ROS przez neutrofile traktowane PMA zmniejszyła się, podczas gdy przy braku PMA neutrofile polegały wyłącznie na swojej interakcji z biofilmem, co jeszcze bardziej zmniejszyło produkcję ROS. Szerokokątna mikroskopia fluorescencyjna ujawniła, że wiele neutrofili było zlokalizowanych na powierzchni, podczas gdy kilka znajdowało się w biofilmach S.aureus.Większość komórek S.aureus oddziałujących z neutrofilami była martwa, podczas gdy kilka pozostało przy życiu, jak określono za pomocą barwienia ŻYWE/MARTWE. Biofilmy barwione homodimerem etydyny-1 ujawniły w biofilmie frakcję martwej populacji S.aureus. Efekt przemywania biofilmu i neutrofili po 30 minutach inkubacji w celu usunięcia nieprzylegających neutrofili ujawnił, że około 33% martwych neutrofili było nadal przyczepionych do biofilmu.Wymienione tutaj protokoły można również wykorzystać do dalszego badania innych funkcji neutrofili, takich jak fagocytoza i tworzenie zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofili, gdy neutrofile napotykają biofilmy.

standardized-vitro-assays-to-visualize-quantify-interactions-between

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

W tym filmie pokazujemy przygotowanie biofilmu in vitro przez S. aureus na wielodołkowej płytce pokrytej poli-L-lizyną. Płytka uformowana w biofilm może być wykorzystana do dalszych eksperymentów.

Synteza biofilmu in vitro przez Staphylococcus aureus

W tym filmie demonstrujemy test chemiluminescencji in vitro, który wykrywa wytwarzanie reaktywnych form tlenu przez neutrofile po wystawieniu na działanie opsonizowanego biofilmu bakteryjnego.

Oznaczanie produkcji ROS przez neutrofile po interakcji z opsonizowanym biofilmem

Ten film demonstruje test in vitro do badania interakcji neutrofil-biofilm. Bakterie chorobotwórcze osadzone w biofilmie i wyizolowanych neutrofilach oznaczono za pomocą znaczników fluorescencyjnych, a odpowiedź immunologiczną neutrofili i unikanie odpowiedzi immunologicznej przez bakterie oceniono za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.

Test in vitro do badania interakcji między neutrofilami a biofilmem

Przyleganie neutrofili do aktywowanego śródbłonka w miejscach infekcji jest integralnym składnikiem odpowiedzi zapalnej gospodarza. W niniejszym raporcie opisano test wiązania neutrofili, który pozwala na ilościowe określenie in vitro pierwotnego wiązania ludzkich neutrofili z komórkami śródbłonka aktywowanymi przez mediatory stanu zapalnego w warunkach statycznych.

Ilościowy test in vitro do pomiaru adhezji neutrofili do aktywowanych pierwotnych ludzkich komórek śródbłonka mikronaczyniowego w warunkach statycznych

Prezentujemy metody badania wpływu PSM i innych toksyn wydzielanych przez Staphylococcus aureus na neutrofile za pomocą cytometrii przepływowej i mikroskopii fluorescencyjnej.

Badanie oddziaływań Staphylococcus aureus z neutrofilami za pomocą cytometrii przepływowej i mikroskopii poklatkowej

Opracowaliśmy wielodołkowy test na bazie poliakrylamidu do badania wpływu sztywności macierzy zewnątrzkomórkowej na infekcję bakteryjną przylegających komórek. Test ten jest kompatybilny z cytometrią przepływową, barwieniem immunologicznym i mikroskopią sił trakcyjnych, umożliwiając ilościowe pomiary interakcji biomechanicznych między komórkami, ich macierzą zewnątrzkomórkową i bakteriami chorobotwórczymi.

Wielodołkowy test na bazie poliakrylamidu do badania wpływu sztywności macierzy zewnątrzkomórkowej na infekcję bakteryjną przylegających komórek

Ten przepływ pracy może być wykorzystany do przeprowadzenia testów wrażliwości na antybiotyki przy użyciu ustalonego modelu ex vivo biofilmu bakteryjnego w płucach osób z mukowiscydozą. Zastosowanie tego modelu może zwiększyć ważność kliniczną testów MBEC (minimalne stężenie eradykacji biofilmu).

Badanie skuteczności antybiotyków w modelu ex vivo biofilmów Pseudomonas aeruginosa i Staphylococcus aureus w płucach mukowiscydozy

Ten protokół ma na celu opisanie sposobu badania zakresu internalizacji Staphylococcus aureus i jego zdolności do przetrwania wewnątrz ludzkiej komórki gospodarza, a także wewnątrzkomórkowej skuteczności związków przeciwdrobnoustrojowych.

Ulepszony test ochrony enzymatycznej do badania internalizacji Staphylococcus aureus i wewnątrzkomórkowej skuteczności związków przeciwdrobnoustrojowych

Wprowadzamy cztery metody oceny aktywności przeciwdrobnoustrojowej nanocząsteczek i powierzchni nanostrukturalnych za pomocą technik in vitro. Metody te można zaadaptować do badania interakcji różnych nanocząstek i powierzchni nanostrukturalnych z szeroką gamą gatunków drobnoustrojów.

Ocena aktywności przeciwdrobnoustrojowej nanocząstek i powierzchni nanostrukturalnych in vitro

Model infekcji skóry i tkanek miękkich u myszy jest wykorzystywany do oceny funkcji wirulencji gronkowca złocistego opornego na metycylinę (MRSA) oraz odpowiedzi immunologicznych gospodarza. W niniejszym materiale przedstawiamy model infekcji podskórnej w przebiegu zakażenia skóry i tkanek miękkich.

Podskórna infekcja groncem złocistym opornym na metycylinę (MRSA)

Poznaj standaryzowane metody badania interakcji między ludzkimi neutrofilami a biofilmami Staphylococcus aureus. Techniki obejmują pomiar produkcji ROS i mikroskopię fluorescencyjną.

Standaryzowane testy in vitro do wizualizacji i ilościowego określenia interakcji między ludzkimi neutrofilami a biofilmami Staphylococcus aureus (Wideo) | JoVE Journal

Standaryzowane testy in vitro do wizualizacji i ilościowego określenia interakcji między ludzkimi neutrofilami a biofilmami Staphylococcus aureus

Przeglądaj więcej filmów