Test in vitro do badania interakcji między neutrofilami a biofilmem

Biofilm to społeczność bakterii przylegających do powierzchni osadzonych w matrycy zewnątrzkomórkowych substancji polimerowych, EPS, pochodzenia mikrobiologicznego.

Aby zbadać interakcje między komórką odpornościową a biofilmem in vitro, weź szkiełko z kanałem zawierającym biofilm Staphylococcus aureus - oportunistycznego patogenu. Zmodyfikowane bakterie wykazują ekspresję białka fluorescencyjnego do wykrywania pod mikroskopem. Kanał łączy się ze zbiornikami wypełnionymi pożywką w celu dostarczania bakteriom składników odżywczych

Dodaj zawiesinę neutrofili znakowaną fluorescencyjnym barwnikiem śledzącym komórki. Pożywka zawiera również homodimer etydyny, który barwi DNA martwych komórek. Inkubować w warunkach fizjologicznych.

Receptory rozpoznawania wzorców na neutrofilach wiążą się z wzorcami molekularnymi bakterii związanymi z patogenami. Wiązanie indukuje neutrofile do fagocytozy bakterii i wytwarzania zewnątrzkomórkowych reaktywnych form tlenu lub ROS, zabijając bakterie.

Aby uniknąć odpowiedzi immunologicznej, bakterie uwalniają enzymy detoksykujące, które zmniejszają ROS i toksynę leukocydyny, która powoduje śmierć komórki. Monomeryczna leukocydyna wiąże się ze specyficznymi receptorami na neutrofilach i ulega multimeryzacji w celu utworzenia porów, zaburzając integralność błony i zabijając komórki.

Homodimer etydyny przenika przez uszkodzoną błonę komórkową, barwiąc martwe komórki.

Pod mikroskopem fluorescencyjnym o szerokim polu widzenia podzbiór komórek bakteryjnych i neutrofili wydaje się martwy, co wskazuje na interakcję neutrofili z biofilmem.

Użyj fluorescencyjnego szczepu S. aureus, takiego jak USA300 wykazującego ekspresję GFP, aby ułatwić obrazowanie mikroskopowe. Inkubuj neutrofile ze 100 mikromolowymi BCD przez 30 minut w rockerze w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% atmosferycznym dwutlenkiem węgla. Upewnij się, że próbki są inkubowane w ciemności i ogranicz ekspozycję na światło.

Aby przepłukać nadmiar BCD, odwirować neutrofile przy 270 RCF przez pięć minut i odessać supernatant. Zawiesić neutrofile w świeżym HBSS. Następnie dodać homodimer-1 etydyny do neutrofili barwionych BCD w końcowym stężeniu 4 mikromolowców w celu monitorowania śmierci neutrofili i bakterii.

Umyj biofilm HBSS i dodaj 150 mikrolitrów neutrofili do biofilmu S. aureus, który został wyhodowany na mikroszkiełkach. Inkubuj mikroszkiełka w wilgotnej komorze przez 30 minut. Liczba komórek bakteryjnych będzie oparta na liczbie komórek uzyskanej z 18-godzinnego posiewu biofilmu.

Zobrazuj oddziaływanie biofilmu neutrofili za pomocą kanałów fluorescencyjnych odpowiadających długościom fal wzbudzenia i emisji barwników fluorescencyjnych lub białek.