Szybkie, ekonomiczne, bezenzymatyczne pasażowanie ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych na komórkach zasilających przez dysadhezję za pośrednictwem kwasu etylenodiaminotetraoctowego

Protokół ten zapewnia szybką i opłacalną metodę pasażowania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych hodowanych na komórkach żywicielskich bez enzymów. Zaletą tego protokołu jest to, że nie wymaga kosztownych pożywek hodowlanych i substratów wzrostowych bez karmników, pozwala uniknąć ryzyka pełnej dysocjacji przez enzymy i zmniejsza ryzyko przejścia komórek macierzystych do stanu zapoczątkowanego. Procedurę zademonstruje Hege Brincker Fjerdingstad, codzienna kierowniczka norweskiego ośrodka zajmującego się ludzkimi pluripotencjalnymi komórkami macierzystymi.

Aby rozpocząć, wysiew 0,5 na 10 podniesiony do potęgi 6 ludzkich fibroblastów, zwanych dalej komórkami zasilającymi, w kolbie hodowlanej T 75 z 20 mililitrami IMDM zawierającymi 10% FBS, zwanych dalej pożywką dla komórek zasilających. Gdy komórki zasilające osiągną 90% konfluencji, usuń pożywkę i umyj komórki trzykrotnie 10 mililitrami DPBS, aby uniknąć hamowania trypsyny przez czynniki w pożywce. Dodaj dwa mililitry trypsyny EDTA do kolby i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez około pięć minut, obserwując gołym okiem oderwanie komórek zasilających.

Gdy rozpocznie się odłączanie, kontynuuj obserwację dysocjacji komórek pod mikroskopem, aby upewnić się, że wszystkie agregaty są dysocjowane na pojedyncze komórki. Następnie dodaj pięć mililitrów świeżej, wstępnie podgrzanej pożywki z komórek zasilających do kolby, aby dezaktywować trypsynę-EDTA i delikatnie zawiesić komórki zasilające przez pipetowanie. Przenieś zawiesinę komórek do 15-mililitrowej probówki, a następnie zakryj probówkę i odwiruj przy 200 G przez 5 minut.

Ostrożnie usuń sat, nie naruszając osadu i ponownie zawieś go w czterech mililitrach świeżego podłoża komórkowego podajnika. Po upewnieniu się, że komórki zasilające są dokładnie ponownie zawieszone, należy je policzyć za pomocą komory do liczenia komórek i obliczyć liczbę komórek wymaganych do hodowli HSC i HI PSC na 35-milimetrowych szalkach do hodowli tkankowych. Następnie, aby przeprowadzić zatrzymanie mitotyczne przez promieniowanie gamma, przenieś odpowiednią liczbę komórek zasilających do 50-mililitrowej probówki wirówkowej i dodaj pożywkę z ogniw zasilających do całkowitej objętości pięciu mililitrów.

Natychmiast przetransportować w temperaturze pokojowej do maszyny do napromieniania promieniami gamma i naświetlić w celu mitotycznego zatrzymania komórek. Gdy komórki zasilające zostaną mitotycznie zatrzymane pod kapturem do hodowli tkankowych, ponownie zawieś komórki w pożywce z komórkami zasilającymi, aby uzyskać stężenie komórek 1,5 na 10 podniesione do mocy 5 na mililitr. Dodaj 2 mililitry zawiesiny ogniw zasilających do 35-milimetrowej naczynia i przenieś naczynie do inkubatora o temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.

Aby uzyskać równomierne rozmieszczenie komórek, przesuwaj naczynie powoli, ale stanowczo na półce inkubatora do przodu i do tyłu. Następnie zatrzymaj się i wykonaj tę samą czynność od lewej do prawej przed zamknięciem drzwi inkubatora. Po 24 godzinach wymień pożywkę z ogniw zasilających na IMDM zawierającą 10% zamiennik surowicy.

Z naczynia hodowlanego zawierającego mitotycznie zatrzymane komórki karmiące, zastąp IMDM zawierającą 10% pożywkę zastępczą surowicy 1,2 mililitra wstępnie podgrzanej pożywki HESC zawierającej zasadowy czynnik wzrostu fiberblast lub BFGF, 30 minut przed przeniesieniem kolonii. Następnie wyjmij pożywkę z naczynia hodowlanego zawierającego HSC lub HI PSC i umyj kolonie jednym mililitrem DPBS, aby usunąć nieprzyłączone komórki i resztki komórek. Dodaj jeden mililitr 0,5 milimolowego EDTA i inkubuj przez jedną minutę w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Następnie za pomocą jednej mililitrowej pipety zastąp roztwór EDTA jednym mililitrem pożywki HESC zawierającej BFGF. Delikatnie rozcieraj tą samą pipetą, aby uwolnić kolonie z warstwy komórek zasilających, aż warstwa poluzuje się i złoży się w osobną grudkę. Dociśnij warstwę komórek zasilających do krawędzi dołka hodowli za pomocą końcówki pipety.

Używając nowej pipety o pojemności jednego mililitra, przenieś zawieszone kolonie do nowego naczynia hodowlanego z komórkami zasilającymi i pożywką HESC zawierającą BFGF, dzieląc w stosunku od jednego do pięciu. Przenieś naczynie do inkubatora i delikatnie przesuwaj je z boku na bok, aby ułatwić równomierne rozmieszczenie kolonii. Kolonie HESC zebrane przy użyciu EDTA były bardziej jednorodne pod względem wielkości i kształtu niż te zebrane mechanicznie.

Gęstość komórek w zebranych i ponownie platerowanych koloniach była podobna dla zbioru opartego na EDTA i zbioru mechanicznego. Kolonie zebrane mechanicznie miały większą tendencję do rozwoju nekrozy w swoich centralnych regionach, podczas gdy kolonie zebrane przy użyciu EDTA wykazywały półprzezroczysty wygląd z wyraźnymi krawędziami. Analiza QPCR wykazała stabilną ekspresję markera macierzystego w mRNA dla kolonii uzyskanych po 20 pasażach przy użyciu zbioru mechanicznego lub opartego na EDTA.

Podobne obserwacje poczyniono przy barwieniu immunochemicznym na poziomie białka dla kolonii uzyskanych po 20 pasażach przy użyciu zbioru mechanicznego lub opartego na EDTA. Ciała zarodkowe wygenerowane z HSC uzyskanych po 20 pasażach przy użyciu dowolnej metody zawierały mieszaninę komórek wyrażających powszechnie oceniane markery ektodermy, mezodermy i endodermy. Co więcej, analiza genetyczna powszechnych aberracji genomowych oparta na QPCR wykazała niewielkie odchylenie od referencyjnego diploidalnego wzorca chromosomowego.

Ważne jest, aby ograniczyć ekspozycję na EDTA do jednej minuty. Dłuższa ekspozycja może prowadzić do zbyt dużej dysocjacji. Ważne jest również, aby dobrze odciągnąć warstwę komórek zasilających, aby nie przeszkadzała podczas przenoszenia ludzkich embrionalnych komórek macierzystych lub ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych do nowej szalki hodowlanej.

Przejście do hodowli i warunków bezpaszowych, w których EDTA jest powszechnie stosowane w przypadku patogenów, jest proste i nie zmieniamy sposobu traktowania komórek.