Name: Analiza objętości terytorium astrocytów i kafelkowania w grubych, swobodnie pływających skrawkach tkanek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: Poznaj metodę analizy objętości terytorium astrocytów i kafelkowania w grubych skrawkach mózgu myszy. Protokół wykorzystuje mikroskopię konfokalną i niestandardowy kod do pomiaru morfologii komórkowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Mikroskopia została przeprowadzona w UNC Neuroscience Microscopy Core (RRID:SCR_019060), częściowo wspierana przez fundusze z NIH-NINDS Neuroscience Center Support Grant P30 NS045892 oraz NIH-NICHD Intellectual and Developmental Disabilities Research Center Grant U54 HD079124. Rysunek 1 został utworzony za pomocą BioRender.com. Obrazy i dane na rysunku 4 zostały przedrukowane z poprzedniej publikacji9 za zgodą wydawcy.

<ol><li>Stogsdill, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytic+neuroligins+control+astrocyte+morphogenesis+and+synaptogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Astrocytic neuroligins control astrocyte morphogenesis and synaptogenesis.</a> Nature. 551 (7679), 192-197 (2017).</li>
<li>Akdemir, E. S., Huang, A. Y., Deneen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytogenesis%3A+where%2C+when%2C+and+how%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Research%22%5BJournal%5D)">Astrocytogenesis: where, when, and how.</a> F1000Research. 9, F1000 Faculty Rev-233 (2020).</li>
<li>Bushong, E. A., Martone, M. E., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protoplasmic+astrocytes+in+CA1+stratum+radiatum+occupy+separate+anatomical+domains%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%3A+The+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Protoplasmic astrocytes in CA1 stratum radiatum occupy separate anatomical domains.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 22 (1), 183-192 (2002).</li>
<li>Houades, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shapes+of+astrocyte+networks+in+the+juvenile+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron+Glia+Biology%22%5BJournal%5D)">Shapes of astrocyte networks in the juvenile brain.</a> Neuron Glia Biology. 2 (1), 3-14 (2006).</li>
<li>Zuchero, J. B., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glia+in+mammalian+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Glia in mammalian development and disease.</a> Development. 142 (22), 3805-3809 (2015).</li>
<li>Srinivasan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+transgenic+mouse+lines+for+selectively+targeting+astrocytes+and+studying+calcium+signals+in+astrocyte+processes+in+situ+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">New transgenic mouse lines for selectively targeting astrocytes and studying calcium signals in astrocyte processes in situ and in vivo.</a> Neuron. 92 (6), 1181-1195 (2016).</li>
<li>Testen, A., Kim, R., Reissner, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+three-dimensional+imaging+of+individual+astrocytes+using+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">High-resolution three-dimensional imaging of individual astrocytes using confocal microscopy.</a> Current Protocols in Neuroscience. 91 (1), 92(2020).</li>
<li>Takano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemico-genetic+discovery+of+astrocytic+control+of+inhibition+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Chemico-genetic discovery of astrocytic control of inhibition in vivo.</a> Nature. 588 (7837), 296-302 (2020).</li>
<li>Baldwin, K. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HepaCAM+controls+astrocyte+self-organization+and+coupling%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">HepaCAM controls astrocyte self-organization and coupling.</a> Neuron. 109 (15), 2427-2442 (2021).</li>
<li>Amberg, N., Hippenmeyer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+mosaic+dissection+of+candidate+genes+in+mice+using+mosaic+analysis+with+double+markers%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Genetic mosaic dissection of candidate genes in mice using mosaic analysis with double markers.</a> STAR Protocols. 2 (4), 100939(2021).</li>
<li>Dumas, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+utero+electroporation+of+multiaddressable+genome-integrating+color+%28MAGIC%29+markers+to+individualize+cortical+mouse+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">In utero electroporation of multiaddressable genome-integrating color (MAGIC) markers to individualize cortical mouse astrocytes.</a> Journal of visualized experiments: JoVE. (159), e61110(2020).</li>
<li>Garcia-Marques, J., Nunez-Llaves, R., Lopez-Mascaraque, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NG2-glia+from+pallial+progenitors+produce+the+largest+clonal+clusters+of+the+brain%3A+time+frame+of+clonal+generation+in+cortex+and+olfactory+bulb%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%3A+The+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">NG2-glia from pallial progenitors produce the largest clonal clusters of the brain: time frame of clonal generation in cortex and olfactory bulb.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 34 (6), 2305-2313 (2014).</li>
<li>Clavreul, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+astrocytes+develop+in+a+plastic+manner+at+both+clonal+and+cellular+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Cortical astrocytes develop in a plastic manner at both clonal and cellular levels.</a> Nature Communication. 10 (1), 4884(2019).</li>
<li>O'Donnell, J., Ding, F., Nedergaard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+functional+states+of+astrocytes+during+sleep+and+wakefulness%3A+Is+norepinephrine+the+master+regulator%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Sleep+Medicine+Reports%22%5BJournal%5D)">Distinct functional states of astrocytes during sleep and wakefulness: Is norepinephrine the master regulator.</a> Current Sleep Medicine Reports. 1 (1), 1-8 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.

Protokół ten opisuje ustaloną metodę analizy objętości terytorium astrocytów i kafelkowania astrocytów w korze myszy, szczegółowo opisując wszystkie główne etapy, począwszy od perfuzji, a skończywszy na analizie obrazu. Protokół ten wymaga mózgów myszy, które wykazują ekspresję białek fluorescencyjnych w rzadkiej lub mozaikowej populacji astrocytów. Poza tym wymogiem, myszy w każdym wieku mogą być używane do tego protokołu, z niewielkimi zmianami ustawień perfuzji i objętości pożywki do zamrażania dodawanej do formy do z...

Astrocyty to misternie rozgałęzione komórki, które pełnią wiele ważnych funkcji w mózgu1. W korze myszy promieniste komórki macierzyste gleju dają początek astrocytom w późnych stadiach embrionalnych i wczesnych stadiach postnatalnych2. W ciągu pierwszych trzech tygodni po urodzeniu astrocyty rosną pod względem wielkości i złożoności, rozwijając tysiące drobnych gałęzi, które bezpośrednio oddziałują z synapsami1. Jednocześnie astrocyty oddziałują z sąsiednimi astrocytami, aby ustanowić dyskretne, nienakładające się terytoria w celu kafelkowania mózgu3, utrzymując komunikację za pośrednictwem kanałów połączeń szczelinowych4. Morfologia i organizacja astrocytów jest zaburzona w wielu stanach chorobowych w wyniku zniewagi lub urazu5, co wskazuje na znaczenie tych procesów dla prawidłowego funkcjonowania mózgu. Analiza właściwości morfologicznych astrocytów podczas normalnego rozwoju, starzenia się i choroby może dostarczyć cennych informacji na temat biologii i fizjologii astrocytów. Co więcej, analiza morfologii astrocytów po manipulacji genetycznej jest cennym narzędziem do rozpoznawania mechanizmów komórkowych i molekularnych, które rządzą ustalaniem i utrzymywaniem złożoności morfologicznej astrocytów.
Analiza morfologii astrocytów w mózgu myszy jest skomplikowana zarówno przez złożoność rozgałęzień astrocytów, jak i kafelkowanie astrocytów. Barwienie przeciwciał przy użyciu pośredniego włókna glejowego fibrylarnego białka kwaśnego (GFAP) jako markera specyficznego dla astrocytów wychwytuje tylko główne gałęzie i znacznie zaniża złożoność morfologiczną astrocytów1. Inne markery specyficzne dla komórek, takie jak transporter glutaminianu 1 (GLT-1; slc1a2), syntetaza glutaminy lub S100β lepiej radzą sobie z oznaczaniem gałęzi astrocytów6, ale wprowadzają nowy problem. Terytoria astrocytów w dużej mierze nie zachodzą na siebie, ale niewielki stopień nakładania się występuje na krawędziach obwodowych. Ze względu na złożoność rozgałęzień, gdy sąsiednie astrocyty są oznaczone tym samym kolorem, niemożliwe jest odróżnienie, gdzie kończy się jeden astrocyt, a zaczyna drugi. Rzadkie lub mozaikowe znakowanie astrocytów endogennymi białkami fluorescencyjnymi rozwiązuje oba problemy: marker fluorescencyjny wypełnia komórkę, aby uchwycić wszystkie gałęzie i pozwala na obrazowanie poszczególnych astrocytów, które można odróżnić od swoich sąsiadów. Zastosowano kilka różnych strategii w celu uzyskania rzadkiego znakowania fluorescencyjnego astrocytów, z manipulacją genetyczną lub bez, w tym wstrzyknięciem wirusa, elektroporacją plazmidu lub transgenicznymi liniami myszy. Szczegóły dotyczące realizacji tych strategii są opisane we wcześniej opublikowanych badaniach i protokołach1,7,8,9,10,11,12,13.
Ten artykuł opisuje metodę pomiaru objętości terytorium astrocytów z mózgów myszy za pomocą fluorescencyjnego znakowania w niewielkiej populacji astrocytów (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). Ponieważ średnia średnica astrocytu w korze myszy wynosi około 60 μm, stosuje się odcinki o grubości 100 μm, aby poprawić skuteczność wychwytywania pojedynczych astrocytów w całości. Barwienie immunologiczne nie jest wymagane, ale jest zalecane w celu wzmocnienia endogennego sygnału fluorescencyjnego do obrazowania konfokalnego i analizy. Barwienie immunologiczne może również umożliwić lepsze wykrywanie drobnych gałęzi astrocytów i zmniejszyć fotobielenie endogennych białek podczas akwizycji obrazu. Aby poprawić przenikanie przeciwciał do grubych skrawków i zachować objętość tkanki przed przecięciem przez obrazowanie, stosuje się swobodnie unoszące się skrawki tkanki. Analiza objętości terytorium astrocytów wykonywana jest za pomocą dostępnego na rynku oprogramowania do analizy obrazu. Dodatkowo protokół ten opisuje metodę analizy kafelkowania astrocytów w skrawkach tkanek z znakowaniem mozaikowym, gdzie sąsiednie astrocyty wyrażają różne znaczniki fluorescencyjne. Protokół ten został z powodzeniem wykorzystany w kilku ostatnich badaniach1,8,9 w celu scharakteryzowania wzrostu astrocytów podczas normalnego rozwoju mózgu, a także wpływu manipulacji genetycznych na rozwój astrocytów.

<table><tbody><tr><td>#5 kleszczyków</td><td>Roboz</td><td>RS-5045</td><td></td></tr><tr><td>1 mL TB Strzykawka</td><td>Becton Dickinson (BD)</td><td>309623</td><td></td></tr><tr><td>10x TBS (sól fizjologiczna buforowana tris)</td><td></td><td></td><td>30 g Tris, 80 g NaCl, 2 g KCl, HCl do pH 7,4, dH2O do 1 L; przechowywać w temperaturze pokojowej (RT)</td></tr><tr><td>Płytka 12-dołkowa</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-106MP</td><td></td></tr><tr><td>1x TBS</td><td></td><td></td><td>100 ml 10x TBS + 900 mL dH2O; przechowywać w RT</td></tr><tr><td>1x TBS + Heparyna</td><td></td><td></td><td>28,2 mg Heparyna + 250 ml 1x TBS; przechowywać w temperaturze 4 & deg; C</td></tr><tr><td>Płytka 24-dołkowa</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-107MP</td><td></td></tr><tr><td>30% sacharozy w TBS</td><td></td><td></td><td>15 g sacharozy, 1x TBS do 50 ml; przechowywać w temperaturze 4 stopni; C</td></tr><tr><td>4% PFA (paraformaldehyd) w TBS</td><td></td><td></td><td>40 g PFA, 4-6 granulek NaOH, 100 ml 10x TBS, dH2O do 1 L; przechowywać w temperaturze 4 stopni; C</td></tr><tr><td>Avertin</td><td></td><td></td><td>0,3125 g tribromoetanolu, 0,625 ml metylobutanolu, dH2O do 25 ml; przechowywać w temperaturze 4 stopni; C; wyrzucić 2 tygodnie po wykonaniu</td></tr><tr><td>Bufor blokujący i przeciwciała</td><td></td><td></td><td>10% surowicy koziej w TBST; przechowywać w temperaturze 4 & st.; C</td></tr><tr><td>Myszy CD1</td><td>Charles River</td><td>022</td><td></td></tr><tr><td>Fiolka do pobierania mózgów</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-337-20</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do akwizycji konfokalnej</td><td>Olympus</td><td>FV31S-SW</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny</td><td>Olympus</td><td>FV3000RS</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>12544E</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Thermo Scientific</td><td>CryoStar NX50</td><td></td></tr><tr><td>Ostrze kriostatu</td><td>Thermo Scientific 3052835</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Forma do zatapiania</td><td>Polysciences</td><td>18646A-1</td><td></td></tr><tr><td>Zamrażarka</td><td></td><td></td><td>2:1 30% sacharozy: OCT; przechowywać w RT</td></tr><tr><td>GFP przeciwciało</td><td>Aves Labs</td><td>GFP1010</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Thermo Scientific</td><td>158920010</td><td></td></tr><tr><td>Kozia anty-kurczak 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-11039</td><td></td></tr><tr><td>Kozia anty-królik 594</td><td>Invitrogen</td><td>A11037</td><td></td></tr><tr><td>Kozia surowica</td><td>Gibco</td><td>16210064</td><td></td></tr><tr><td>Heparyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149</td><td></td></tr><tr><td>Kwas solny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>258148</td><td></td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Bitplane</td><td>N/A</td><td>Wersja 9.8.0</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Metalowa puszka na lunch</td><td>AQUARIUS</td><td>N/A</td><td>od Amazon, "DIY Large Fun Box"</td></tr><tr><td>Metylobutanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>152463</td><td></td></tr><tr><td>Mikro nożyczki preparacyjne</td><td>Roboz</td><td>RS-5921</td><td></td></tr><tr><td>Medium</td><td></td><td></td> <td>montażowe20 mM Tris pH 8,0, 90% glicerol, 0,5% galusan N-propylu; Przechowywać w temperaturze 4 & Deg; C; dobry do 2 miesięcy</td></tr><tr><td>Lakier do paznokci</td><td>VWR</td><td>100491-940</td><td></td></tr><tr><td>galusan N-propylu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>02370-100G</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T.</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-730-571</td><td></td></tr><tr><td>Olej</td><td>Olympus</td><td>IMMOIL-F30CC</td><td>Specyficzny dla mikroskopu / obiektywu</td></tr><tr><td>Nożyczki operacyjne 6"</td> <td>Roboz</td><td>RS-6820</td><td></td></tr><tr><td>Wytrząsarka platformy orbitalnej</td><td>Fisher Scientific</td><td>88861043</td><td>Minimalna wymagana prędkość: 25 obr./min</td></tr><tr><td>Pędzel</td><td>Bogrinuo</td><td>N/A</td><td>od Amazon, "Pędzle do malowania detali - Miniaturowe szczotki"</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Pipet Pasteura (5.75")</td><td>VWR</td><td>14672-608</td><td></td></tr><tr><td>Pipet Pasteura (9")</td><td>VWR</td><td>14672-380</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541-500G</td><td></td></tr><tr><td>Żyletka</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>RFP przeciwciało</td><td>Rockland</td><td>600-401-379</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka</td><td></td><td></td> sekcyjna <td>1:1 glicerol: 1x TBS; przechowywać w RT</td></tr><tr><td>Slides</td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td></td></tr><tr><td>Chrloide sodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5881</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>TBST (TBS + Triton X-100)</td><td></td><td></td><td>0,2% Triton w 1x TBS; przechowywać w RT</td></tr><tr><td>Transfer Pipet</td><td>VWR</td><td>414004-002</td><td></td></tr><tr><td>Tri-bromoetanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T48402</td><td></td></tr><tr><td>Tris(hydroksymetylo)aminometan</td><td>Thermo Scientific</td><td>424570025</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93443</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100 ( wysokiej jakości)</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-489-120</td><td></td></tr><tr><td>XTSpotsConvexHull</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>custom XTension dostarczane jako materiał uzupełniający</td></tr></tbody></table>

analiza objętości terytorium astrocytów i kafelkowania w grubych, swobodnie pływających skrawkach tkanek

Analysis of Astrocyte Territory Volume and Tiling in Thick Free-Floating Tissue Sections

Astrocyty posiadają zdumiewający stopień złożoności morfologicznej, który umożliwia im interakcję z prawie każdym typem komórek i struktur w mózgu. Dzięki tym interakcjom astrocyty aktywnie regulują wiele krytycznych funkcji mózgu, w tym tworzenie synaps, neurotransmisję i homeostazę jonów. W mózgu gryzoni astrocyty rosną pod względem wielkości i złożoności w ciągu pierwszych trzech tygodni po urodzeniu i tworzą wyraźne, nienakładające się na siebie terytoria, aby ułożyć mózg. Protokół ten zapewnia ustaloną metodę analizy objętości terytorium astrocytów i kafelkowania astrocytów przy użyciu swobodnie unoszących się skrawków tkanek z mózgu myszy. Po pierwsze, protokół ten opisuje etapy pobierania tkanek, kriosekcji i barwienia immunologicznego swobodnie pływających skrawków tkanek. Po drugie, protokół ten opisuje akwizycję i analizę obrazu objętości terytorium astrocytów i objętości nakładania się terytoriów, przy użyciu dostępnego na rynku oprogramowania do analizy obrazu. Wreszcie, w tym manuskrypcie omówiono zalety, ważne względy, typowe pułapki i ograniczenia tych metod. Protokół ten wymaga tkanki mózgowej z rzadkim lub mozaikowym znakowaniem fluorescencyjnym astrocytów i jest przeznaczony do użytku z powszechnym sprzętem laboratoryjnym, mikroskopią konfokalną i dostępnym na rynku oprogramowaniem do analizy obrazu.

Rysunek 1 przedstawia schematyczny zarys głównych etapów i przebiegu pracy dla niniejszego protokołu. Rysunek 2 pokazuje zrzuty ekranu z kluczowych etapów wykorzystania oprogramowania do analizy obrazu w celu wygenerowania powierzchni, wygenerowania punktów blisko powierzchni oraz wygenerowania otoczki wypukłej. Rysunek 3 demonstruje zastosowanie tej techniki do określenia stopnia nakładania się lub układu mozaikowego (tilingu) tery...

Ten protokół opisuje metody cięcia, barwienia i obrazowania swobodnie unoszących się fragmentów tkanki mózgu myszy, a następnie szczegółowy opis analizy objętości terytorium astrocytów i nakładania się lub kafelkowania.

Analiza objętości terytorium astrocytów i kafelkowania w grubych, swobodnie pływających skrawkach tkanek

Astrocytes possess an astounding degree of morphological complexity that enables them to interact with nearly every type of cell and structure within the ...

Zrozumienie, w jaki sposób astrocyty rozwijają się i ustalają swoją złożoną morfologię, jest niezbędne do zrozumienia, jak rozwija się i funkcjonuje mózg. Protokół ten opisuje, jak analizować kluczowe aspekty morfologii astrocytów w tkance mózgowej. Protokół ten wykorzystuje niestandardowy kod do pomiaru objętości terytorium astrocytów w grubych odcinkach tkanki.Strategia ta może być również stosowana do pomiaru stopnia nakładania się terytoriów między sąsiednimi astrocytami. Łącząc ten protokół z manipulacją genetyczną astrocytów, naukowcy mogą bezpośrednio badać rolę określonych białek i szlaków w rozwoju astrocytów i interakcji astrocyt-astrocyty Na początek przygotuj świeży roztwór TBST, dodając 1 mililitr 10% Triton X do 50-mililitrowej probówki i wypełniając probówkę do 50 mililitrów TBS. Przygotuj 2 mililitry roztworów blokujących i przeciwciał dla każdego mózgu, łącząc kozią surowicę i TBST w Tuba o pojemności 15 mililitrów.Następnie oznacz 24-dołkową płytkę, aby umieścić różne próbki w różnych rzędach w różnych roztworach w różnych kolumnach, a następnie dodaj jeden mililitr TBST do pierwszych trzech kolumn oznaczonych jako mycie 1, płukanie 2 i płukanie 3 i dodawanie 1 mililitra roztworu blokującego do czwartej kolumny. Przygotuj szklany szpikut, topiąc koniec pipety Pasteura o średnicy 5,75 cala w małym haku za pomocą palnika Bunsena, a następnie przenieś skrawki tkanek z płytki 12-dołkowej do kolumny myjącej 1 płytki 24-dołkowej za pomocą kilofa, a następnie myj skrawki przez 10 minut każda w praniu 1, 2, i 3 dołki za pomocą szpikulca do przenoszenia skrawków z jednej studzienki do drugiej, a następnie inkubacja skrawków przez godzinę w roztworze blokującym. Przygotować q mililitrów roztworu przeciwciała pierwszorzędowego, dodając przeciwciało do roztworu przeciwciała, a następnie krótko wirować i wirować przez 5 minut w temperaturze większej lub równej 4 000 g w temperaturze 4 stopni Celsjusza.Następnie inkubuj skrawki w przeciwciałie pierwszorzędowym przez 2 do 3 nocy w temperaturze 4 stopni Celsjusza, wstrząsając. Po inkubacji przeciwciał pierwotnych odessać dzień-1 TBST ze studzienek myjących, a następnie dodać 1 mililitr nowego TBST do każdej studzienki płuczącej i przenieść sekcje do pierwszej studzienki do płukania. Następnie inkubować skrawki w przeciwciałie drugorzędowym przez 3 godziny w temperaturze pokojowej.Po wtórnej inkubacji przeciwciał odessać dzień-2 TBST z dołków myjących, a następnie dodać 1 mililitr nowego TBST do każdej studzienki płuczącej i przenieść sekcje do pierwszej studzienki do płukania. Podczas końcowego prania wyjmij podłoże montażowe z 4 stopni Celsjusza i pozwól mu ogrzać się do temperatury pokojowej, a następnie przygotuj mieszaninę TBS i wody dejonizowanej w proporcji 2 do 1 i dodaj ją do szalki Petriego. Następnie przygotuj szkiełko mikroskopowe, dodając 800 mikrolitrów mieszaniny TBS i wody dejonizowanej 2 do 1 na powierzchnię.Przenieś skrawki z dołka mycia 3 na szalkę Petriego, a następnie za pomocą cienkiego pędzla przenieś sekcje pojedynczo z płytki Petriego do płynu na szkiełku. Następnie ostrożnie ułóż sekcje tak, aby leżały płasko na szkiełku za pomocą pędzla. Ostrożnie usuń nadmiar płynu z szkiełka za pomocą pipety P-1000, a następnie odessaj próżniowo.Po usunięciu całego nadmiaru płynu ze szkiełka, użyj pipety transferowej, aby natychmiast dodać 1 kroplę podłoża montażowego do każdej sekcji i delikatnie połóż szkiełko nakrywkowe na szkiełku. Pozwól nośnikom montażowym rozprowadzić się przez kilka minut, a następnie usuń nadmiar nośników montażowych, które wydostaną się spod szkiełka nakrywkowego przez zasysanie próżniowe. Następnie uszczelnij wszystkie cztery krawędzie szkiełka nakrywkowego przezroczystym lakierem do paznokci.Pozostaw szkiełka do wyschnięcia na 30 minut w temperaturze pokojowej, a następnie przechowuj je płasko w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Korzystając z obiektywu 10x, zlokalizuj poszczególne komórki do obrazowania i zanotuj konkretny region mózgu lub podregion istotny dla eksperymentu, a następnie za pomocą pokrętła ostrości określ, czy cały astrocyt znajduje się w sekcji. Następnie przełącz się na obiektyw olejowy o większym powiększeniu i ustaw ostrość na komórce.Patrząc przez okular, użyj pokrętła ostrości, aby przesunąć się od góry do dołu komórki, a następnie sprawdź wzrokowo komórkę, aby upewnić się, że cała komórka znajduje się w sekcji. Korzystając z oprogramowania do akwizycji mikroskopów konfokalnych, dostosuj parametry akwizycji, aby uzyskać odpowiedni stosunek sygnału do szumu i poziom szczegółowości, a następnie użyj zoomu 2x dla obiektywu 40x i bez zoomu w przypadku obiektywu 60x lub 63x. Ustaw górną i dolną granicę stosu Z z krokiem o wielkości 0,5 mikrometra, upewniając się, że cały astrocyt jest przechwytywany z pierwszym i ostatnim obrazem bez żadnego fluorescencyjnego znakowania komórki.Przed rozpoczęciem analizy zainstaluj plik rozszerzenia wypukłego kadłuba, XtspotsConvexHull, wklejając plik do podfolderu rtmatlab w folderze XT. Korzystając z konwertera plików Imaris, konwertuj obrazy do formatu IMS. Następnie otwórz plik obrazu w oprogramowaniu do analizy obrazu i wybierz przycisk Widok 3D, aby wyświetlić obraz w trybie 3D, upewniając się, że komórka spełnia kryteria włączenia.Aby utworzyć powierzchnię, kliknij niebieską ikonę Dodaj nowe powierzchnie, a następnie utwórz obszar zainteresowania wokół komórki, wprowadzając wymiary w polach w obszarze rozmiar narzędzia do tworzenia powierzchni lub przeciągając krawędzie żółtego pola. Następnie dostosuj wartość bezwzględną progu, przeciągając żółty pasek lub wprowadzając wartości w polu, tak aby szara powierzchnia wypełniała jak największą część sygnału komórki, nie wychodząc poza granicę komórki. Następnie kliknij zieloną strzałkę, aby zakończyć generowanie powierzchni.Dokładnie sprawdź nowo wygenerowaną powierzchnię i usuń wszelkie elementy powierzchni, które nie są częścią komórki, zaznaczając je, a następnie klikając narzędzie Edycja ołówka, a następnie opcję Usuń. Aby ujednolicić pozostałe elementy powierzchni, kliknij ikonę Filtr lejka, aby zaznaczyć wszystko, a następnie kliknij ikonę Edycja ołówka i wybierz opcję Ujednolic. Kliknij pomarańczową ikonę Dodaj nowe punkty i wybierz właściwy kanał źródłowy z listy rozwijanej, a następnie wprowadź w polu szacowaną wartość średnicy XY wynoszącą 0,400 mikrometra.Następnie kliknij zieloną strzałkę, aby zakończyć tworzenie miejsc, a następnie ponownie wybierz miejsca. Kliknij ikonę Filtruj i wybierz z listy rozwijanej opcję Najkrótsza odległość do powierzchni Powierzchnie X, gdzie powierzchnie X to analizowana powierzchnia, upewniając się, że przyciski zasilania dolnego i górnego progu są zielone. Następnie wprowadź minimalną odległość minus 1,0 mikrometra w polu dolnego progu i maksymalną odległość 0,1 mikrometra w górnym polu progu, a następnie kliknij przycisk Duplikuj sekcję do nowych miejsc, upewniając się, że nowo utworzone punkty są wybrane w lewym górnym panelu okna oprogramowania.Następnie kliknij ikonę Gear Tools, a następnie kliknij wtyczkę Convex Hull tylko raz i poczekaj, aż pojawi się okno MATLAB, a następnie zniknie, co spowoduje powstanie solidnego kadłuba w widoku 3D. W lewym górnym panelu upewnij się, że wybrano opcję Wypukły kadłub punktów X Wybór, Najkrótsza odległość, w której Plamki X Wybór to nowo utworzone punkty, a następnie kliknij kadłub, aby go wybrać. Następnie kliknij ikonę Statystyka wykresu.Na karcie Wybór upewnij się, że z górnej listy rozwijanej wybrano opcję Określone wartości, a następnie wybierz opcję Objętość z dolnej listy rozwijanej, a następnie zarejestruj objętość kadłuba i zapisz plik, przechodząc do następnego obrazu. Objętość terytorium astrocytów mierzono w astrocytach wykazujących ekspresję białka czerwonej fluorescencji ukierunkowanego na błonę. Knockdown cząsteczki adhezyjnej komórek wzbogaconej w astrocyty, hepaCAM, znacznie zmniejsza objętość terytorium astrocytów.Analizę mozaiki z podwójnymi markerami wykorzystano do wygenerowania myszy, w których astrocyty typu dzikiego wyrażają białko czerwonej fluorescencji, a astrocyty z nokautem hepaCam wyrażają białko fluorescencyjne zielone. Obliczono procentowe nakładanie się terytorium między sąsiednimi parami astrocytów białek czerwonej i zielonej fluorescencji. Myszy z genetyczną modyfikacją hepaCAM i zielonych astrocytów wykazywały znacznie zwiększony procent objętości pokrywania się terytorium z ich czerwonymi sąsiadami typu dzikiego w porównaniu z parami astrocytów tylko typu dzikiego.Wynik ten pokazuje, że hepaCAM jest wymagany do normalnej objętości terytorium astrocytów i kafelkowania astrocytów. Bardzo ważne jest, aby upewnić się, że komórka spełnia kryteria włączenia. Niekompletna komórka będzie miała mniejszą objętość terytorium i może wpłynąć na ogólne wyniki i wnioski.

analysis-astrocyte-territory-volume-tiling-thick-free-floating-tissue

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Ten film przedstawia procedurę barwienia immunologicznego utrwalonego wycinka tkanki mózgowej myszy za pomocą fluorescencyjnie znakowanych astrocytów przy użyciu przeciwciał pierwszorzędowych i wtórnych oraz przechwytywania obrazów barwionych astrocytów za pomocą mikroskopii konfokalnej.

Barwienie immunologiczne znakowanych fluorescencyjnie astrocytów w wycinku tkanki mózgowej myszy

Źródło: Moye, S. L., et.al.  Wizualizacja morfologii astrocytów za pomocą żółtej jonoforezy Lucyfera. J. Vis. Exp. (2019).  Ten film demonstruje zastosowanie jonoforezy barwnika fluorescencyjnego do badania morfologii astrocytów w utrwalonych wycinkach mózgu. Szczegółowo opisuje przekłuwanie somy astrocytów elektrodą w celu dostarczenia anionowego, hydrofilowego barwnika do cytoplazmy pod prądem o niskim napięciu, umożliwiając barwnikowi dyfuzję i znakowanie somy i gałęzi. Mikroskopia...

Wizualizacja morfologii astrocytów za pomocą jonoforezy barwnika fluorescencyjnego w nieruchomym wycinku mózgu myszy

Źródło: Bagheri, M., et al. Protokół trójwymiarowej konfokalnej analizy morfometrycznej astrocytów. J. Vis. Exp. (2015).Ten film pokazuje obrazowanie fluorescencyjnie znakowanych astrocytów w części mózgu myszy przy użyciu mikroskopu konfokalnego. Wycinek mózgu umieszcza się pod odpowiednią soczewką obiektywu i dobiera odpowiednie fluorofory i filtry. Po automatycznej optymalizacji ekspozycji, parametry skanowania są definiowane w celu zapewnienia obrazów 2D o wysokiej rozdzielczości. Parametry...

Trójwymiarowe obrazowanie astrocytów znakowanych immunologicznie za pomocą mikroskopii konfokalnej

Astrocyty w OUN zmieniają swoje właściwości funkcjonalne i strukturalne w odpowiedzi na szkodliwe bodźce. W artykule przedstawiono protokół oceny trójwymiarowej morfologii astrocytów w stanach chorobowych lub po interwencjach terapeutycznych.

Protokół trójwymiarowej konfokalnej analizy morfometrycznej astrocytów

Tutaj prezentujemy protokół do oceny organizacji sieci astrocytowych. Opisana metoda minimalizuje odchylenie, aby zapewnić opisowe pomiary tych sieci, takie jak liczba komórek, rozmiar, obszar i położenie w jądrze. Anizotropię ocenia się za pomocą analizy wektorowej.

Analiza rozmiaru, kształtu i kierunkowości sieci sprzężonych astrocytów

Opisany potok jest przeznaczony do segmentacji zestawów danych mikroskopii elektronowej większych niż gigabajty, w celu wyodrębnienia morfologii całych komórek. Po zrekonstruowaniu komórek w 3D, dostosowane do indywidualnych potrzeb oprogramowanie może być wykorzystane do przeprowadzenia analizy jakościowej i ilościowej bezpośrednio w 3D, wykorzystując również rzeczywistość wirtualną do pokonania okluzji widoku.

Metoda rekonstrukcji 3D i analizy w wirtualnej rzeczywistości komórek glejowych i neuronalnych

Astrocyty to morfologicznie złożone komórki, czego przykładem są ich liczne procesy i krzaczaste terytoria. Aby przeanalizować ich skomplikowaną morfologię, przedstawiamy niezawodny protokół wykonywania wewnątrzkomórkowej żółtej jonoforezy Lucyfera w lekko utrwalonej tkance.

Wizualizacja morfologii astrocytów za pomocą jonoforezy Lucyfera Yellow

Tutaj opisujemy metodę obrazowania na żywo in vitro, która umożliwia wizualizację wewnątrzkomórkowego transportu organelli i transportu białek błony komórkowej w mysich astrocytach. W protokole tym przedstawiono również metodologię analizy obrazu w celu wyznaczenia tras transportu i kinetyki transportu ładunków.

Wizualizacja i analiza transportu wewnątrzkomórkowego organelli i innych ładunków w astrocytach

Astrocyty jednolicie układają korę mózgową, co utrudnia analizę ich złożonej morfologii na poziomie komórkowym. Dostarczony tutaj protokół wykorzystuje wielokolorowe znakowanie oparte na elektroporacji in utero w celu wyodrębnienia astrocytów korowych i przeanalizowania ich objętości i morfologii za pomocą przyjaznego dla użytkownika potoku analizy obrazu.

Elektroporacja in utero wieloadresowalnych markerów kolorystycznych integrujących genom (MAGIC) w celu indywidualizacji astrocytów korowych myszy

Połączenie transdukcji wektora wirusowego i oczyszczania mózgu za pomocą metody CLARITY pozwala na badanie dużej liczby neuronów i astrocytów jednocześnie.

Badanie interakcji przestrzennych między astrocytami a neuronami w oczyszczonych mózgach

Poznaj metodę analizy objętości terytorium astrocytów i kafelkowania w grubych skrawkach mózgu myszy. Protokół wykorzystuje mikroskopię konfokalną i niestandardowy kod do pomiaru morfologii komórkowej.

Analiza objętości terytorium astrocytów i kafelkowania w grubych, swobodnie pływających skrawkach tkanek

Przeglądaj więcej filmów