Analiza objętości terytorium astrocytów i kafelkowania w grubych, swobodnie pływających skrawkach tkanek

Ten protokół opisuje metody cięcia, barwienia i obrazowania swobodnie unoszących się fragmentów tkanki mózgu myszy, a następnie szczegółowy opis analizy objętości terytorium astrocytów i nakładania się lub kafelkowania.

Zrozumienie, w jaki sposób astrocyty rozwijają się i ustalają swoją złożoną morfologię, jest niezbędne do zrozumienia, jak rozwija się i funkcjonuje mózg. Protokół ten opisuje, jak analizować kluczowe aspekty morfologii astrocytów w tkance mózgowej. Protokół ten wykorzystuje niestandardowy kod do pomiaru objętości terytorium astrocytów w grubych odcinkach tkanki.

Strategia ta może być również stosowana do pomiaru stopnia nakładania się terytoriów między sąsiednimi astrocytami. Łącząc ten protokół z manipulacją genetyczną astrocytów, naukowcy mogą bezpośrednio badać rolę określonych białek i szlaków w rozwoju astrocytów i interakcji astrocyt-astrocyty Na początek przygotuj świeży roztwór TBST, dodając 1 mililitr 10% Triton X do 50-mililitrowej probówki i wypełniając probówkę do 50 mililitrów TBS. Przygotuj 2 mililitry roztworów blokujących i przeciwciał dla każdego mózgu, łącząc kozią surowicę i TBST w Tuba o pojemności 15 mililitrów.

Następnie oznacz 24-dołkową płytkę, aby umieścić różne próbki w różnych rzędach w różnych roztworach w różnych kolumnach, a następnie dodaj jeden mililitr TBST do pierwszych trzech kolumn oznaczonych jako mycie 1, płukanie 2 i płukanie 3 i dodawanie 1 mililitra roztworu blokującego do czwartej kolumny. Przygotuj szklany szpikut, topiąc koniec pipety Pasteura o średnicy 5,75 cala w małym haku za pomocą palnika Bunsena, a następnie przenieś skrawki tkanek z płytki 12-dołkowej do kolumny myjącej 1 płytki 24-dołkowej za pomocą kilofa, a następnie myj skrawki przez 10 minut każda w praniu 1, 2, i 3 dołki za pomocą szpikulca do przenoszenia skrawków z jednej studzienki do drugiej, a następnie inkubacja skrawków przez godzinę w roztworze blokującym. Przygotować q mililitrów roztworu przeciwciała pierwszorzędowego, dodając przeciwciało do roztworu przeciwciała, a następnie krótko wirować i wirować przez 5 minut w temperaturze większej lub równej 4 000 g w temperaturze 4 stopni Celsjusza.

Następnie inkubuj skrawki w przeciwciałie pierwszorzędowym przez 2 do 3 nocy w temperaturze 4 stopni Celsjusza, wstrząsając. Po inkubacji przeciwciał pierwotnych odessać dzień-1 TBST ze studzienek myjących, a następnie dodać 1 mililitr nowego TBST do każdej studzienki płuczącej i przenieść sekcje do pierwszej studzienki do płukania. Następnie inkubować skrawki w przeciwciałie drugorzędowym przez 3 godziny w temperaturze pokojowej.

Po wtórnej inkubacji przeciwciał odessać dzień-2 TBST z dołków myjących, a następnie dodać 1 mililitr nowego TBST do każdej studzienki płuczącej i przenieść sekcje do pierwszej studzienki do płukania. Podczas końcowego prania wyjmij podłoże montażowe z 4 stopni Celsjusza i pozwól mu ogrzać się do temperatury pokojowej, a następnie przygotuj mieszaninę TBS i wody dejonizowanej w proporcji 2 do 1 i dodaj ją do szalki Petriego. Następnie przygotuj szkiełko mikroskopowe, dodając 800 mikrolitrów mieszaniny TBS i wody dejonizowanej 2 do 1 na powierzchnię.

Przenieś skrawki z dołka mycia 3 na szalkę Petriego, a następnie za pomocą cienkiego pędzla przenieś sekcje pojedynczo z płytki Petriego do płynu na szkiełku. Następnie ostrożnie ułóż sekcje tak, aby leżały płasko na szkiełku za pomocą pędzla. Ostrożnie usuń nadmiar płynu z szkiełka za pomocą pipety P-1000, a następnie odessaj próżniowo.

Po usunięciu całego nadmiaru płynu ze szkiełka, użyj pipety transferowej, aby natychmiast dodać 1 kroplę podłoża montażowego do każdej sekcji i delikatnie połóż szkiełko nakrywkowe na szkiełku. Pozwól nośnikom montażowym rozprowadzić się przez kilka minut, a następnie usuń nadmiar nośników montażowych, które wydostaną się spod szkiełka nakrywkowego przez zasysanie próżniowe. Następnie uszczelnij wszystkie cztery krawędzie szkiełka nakrywkowego przezroczystym lakierem do paznokci.

Pozostaw szkiełka do wyschnięcia na 30 minut w temperaturze pokojowej, a następnie przechowuj je płasko w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Korzystając z obiektywu 10x, zlokalizuj poszczególne komórki do obrazowania i zanotuj konkretny region mózgu lub podregion istotny dla eksperymentu, a następnie za pomocą pokrętła ostrości określ, czy cały astrocyt znajduje się w sekcji. Następnie przełącz się na obiektyw olejowy o większym powiększeniu i ustaw ostrość na komórce.

Patrząc przez okular, użyj pokrętła ostrości, aby przesunąć się od góry do dołu komórki, a następnie sprawdź wzrokowo komórkę, aby upewnić się, że cała komórka znajduje się w sekcji. Korzystając z oprogramowania do akwizycji mikroskopów konfokalnych, dostosuj parametry akwizycji, aby uzyskać odpowiedni stosunek sygnału do szumu i poziom szczegółowości, a następnie użyj zoomu 2x dla obiektywu 40x i bez zoomu w przypadku obiektywu 60x lub 63x. Ustaw górną i dolną granicę stosu Z z krokiem o wielkości 0,5 mikrometra, upewniając się, że cały astrocyt jest przechwytywany z pierwszym i ostatnim obrazem bez żadnego fluorescencyjnego znakowania komórki.

Przed rozpoczęciem analizy zainstaluj plik rozszerzenia wypukłego kadłuba, XtspotsConvexHull, wklejając plik do podfolderu rtmatlab w folderze XT. Korzystając z konwertera plików Imaris, konwertuj obrazy do formatu IMS. Następnie otwórz plik obrazu w oprogramowaniu do analizy obrazu i wybierz przycisk Widok 3D, aby wyświetlić obraz w trybie 3D, upewniając się, że komórka spełnia kryteria włączenia.

Aby utworzyć powierzchnię, kliknij niebieską ikonę Dodaj nowe powierzchnie, a następnie utwórz obszar zainteresowania wokół komórki, wprowadzając wymiary w polach w obszarze rozmiar narzędzia do tworzenia powierzchni lub przeciągając krawędzie żółtego pola. Następnie dostosuj wartość bezwzględną progu, przeciągając żółty pasek lub wprowadzając wartości w polu, tak aby szara powierzchnia wypełniała jak największą część sygnału komórki, nie wychodząc poza granicę komórki. Następnie kliknij zieloną strzałkę, aby zakończyć generowanie powierzchni.

Dokładnie sprawdź nowo wygenerowaną powierzchnię i usuń wszelkie elementy powierzchni, które nie są częścią komórki, zaznaczając je, a następnie klikając narzędzie Edycja ołówka, a następnie opcję Usuń. Aby ujednolicić pozostałe elementy powierzchni, kliknij ikonę Filtr lejka, aby zaznaczyć wszystko, a następnie kliknij ikonę Edycja ołówka i wybierz opcję Ujednolic. Kliknij pomarańczową ikonę Dodaj nowe punkty i wybierz właściwy kanał źródłowy z listy rozwijanej, a następnie wprowadź w polu szacowaną wartość średnicy XY wynoszącą 0,400 mikrometra.

Następnie kliknij zieloną strzałkę, aby zakończyć tworzenie miejsc, a następnie ponownie wybierz miejsca. Kliknij ikonę Filtruj i wybierz z listy rozwijanej opcję Najkrótsza odległość do powierzchni Powierzchnie X, gdzie powierzchnie X to analizowana powierzchnia, upewniając się, że przyciski zasilania dolnego i górnego progu są zielone. Następnie wprowadź minimalną odległość minus 1,0 mikrometra w polu dolnego progu i maksymalną odległość 0,1 mikrometra w górnym polu progu, a następnie kliknij przycisk Duplikuj sekcję do nowych miejsc, upewniając się, że nowo utworzone punkty są wybrane w lewym górnym panelu okna oprogramowania.

Następnie kliknij ikonę Gear Tools, a następnie kliknij wtyczkę Convex Hull tylko raz i poczekaj, aż pojawi się okno MATLAB, a następnie zniknie, co spowoduje powstanie solidnego kadłuba w widoku 3D. W lewym górnym panelu upewnij się, że wybrano opcję Wypukły kadłub punktów X Wybór, Najkrótsza odległość, w której Plamki X Wybór to nowo utworzone punkty, a następnie kliknij kadłub, aby go wybrać. Następnie kliknij ikonę Statystyka wykresu.

Na karcie Wybór upewnij się, że z górnej listy rozwijanej wybrano opcję Określone wartości, a następnie wybierz opcję Objętość z dolnej listy rozwijanej, a następnie zarejestruj objętość kadłuba i zapisz plik, przechodząc do następnego obrazu. Objętość terytorium astrocytów mierzono w astrocytach wykazujących ekspresję białka czerwonej fluorescencji ukierunkowanego na błonę. Knockdown cząsteczki adhezyjnej komórek wzbogaconej w astrocyty, hepaCAM, znacznie zmniejsza objętość terytorium astrocytów.

Analizę mozaiki z podwójnymi markerami wykorzystano do wygenerowania myszy, w których astrocyty typu dzikiego wyrażają białko czerwonej fluorescencji, a astrocyty z nokautem hepaCam wyrażają białko fluorescencyjne zielone. Obliczono procentowe nakładanie się terytorium między sąsiednimi parami astrocytów białek czerwonej i zielonej fluorescencji. Myszy z genetyczną modyfikacją hepaCAM i zielonych astrocytów wykazywały znacznie zwiększony procent objętości pokrywania się terytorium z ich czerwonymi sąsiadami typu dzikiego w porównaniu z parami astrocytów tylko typu dzikiego.

Wynik ten pokazuje, że hepaCAM jest wymagany do normalnej objętości terytorium astrocytów i kafelkowania astrocytów. Bardzo ważne jest, aby upewnić się, że komórka spełnia kryteria włączenia. Niekompletna komórka będzie miała mniejszą objętość terytorium i może wpłynąć na ogólne wyniki i wnioski.