Analiza rozmiaru, kształtu i kierunkowości sieci sprzężonych astrocytów

Tutaj prezentujemy protokół do oceny organizacji sieci astrocytowych. Opisana metoda minimalizuje odchylenie, aby zapewnić opisowe pomiary tych sieci, takie jak liczba komórek, rozmiar, obszar i położenie w jądrze. Anizotropię ocenia się za pomocą analizy wektorowej.

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące organizacji sieci astrocytarnych w strukturach mózgu. Główną zaletą tej techniki jest to, że proponuje bezstronną metodę liczenia komórek i dokumentowania ich anatomicznej organizacji w określonej strukturze. Otwórz ImageJFIJI, wybierz żądany plik i kliknij OK w oknie opcji importu bioformatu.

Aby ponownie zdefiniować stos Z, który będzie zawierał tylko wycinki optyczne potrzebne do końcowego stosu Z, najpierw wybierz projekt STK i Z, a następnie kliknij pokrętło stosu na pasku narzędzi. Wybierz maksymalną intensywność w ustawieniu typu projekcji. Zapisz plik i nadaj mu nazwę plik stosu.

Jeśli plik obrazowania zawiera kilka kanałów, użyj koloru obrazu i podziel kanały, aby wyświetlić tylko kanał z obrazem sieci astrocytów. Sprawdź ustawienia pikseli obrazu, wybierając obraz, właściwości, piksel, z jednym dla wymiaru piksela. Następnie użyj narzędzia do odejmowania tła, otwierając proces i odejmuj tło, aby usunąć etykietowanie biocytyny w tle.

Użyj funkcji podglądu, aby ustawić promień toczącej się kuli, który zwykle wynosi 50 pikseli. Jeśli wymagana jest dalsza redukcja szumów po odjęciu tła, wybierz opcję proces, szum i usuń wartości odstające. Wybierz opcję jasny w ustawieniu które wartości odstające, a następnie użyj funkcji podglądu, aby ustawić promień i próg.

Zachowaj ostrożność podczas korzystania z narzędzia do usuwania wartości odstających, ponieważ może ono spowodować rozmycie danych, jak pokazano tutaj. Dostosuj próg za pomocą obrazu, dostosuj, progu. Wybierz tryb domyślny oraz czarno-biały.

Kliknij Zastosuj. Przekonwertuj obraz na obraz binarny za pomocą narzędzia procesu binarnego, wybierając proces, binarny i utwórz binarny. Zapisz plik jako plik tiff i nazwij go plikiem binarnym.

Aby policzyć komórki, najpierw ustaw typ pomiaru, klikając przycisk Analizuj i ustaw pomiar. Następnie wybierz opcję środka ciężkości. Upewnij się, że plik binarny jest otwarty na ekranie.

Ponownie otwórz menu analizy i tym razem wybierz opcję analizuj cząstki. Następnie wybierz pozycję pokaż i kontury. Spowoduje to wygenerowanie nowego pliku, który pokazuje wynik wykrywania.

Zoptymalizuj parametry, aby uściślić wykrywanie. Aby wykryć tylko komórki, użyj wartości rozmiaru z zakresu od 30 do 6000 i okrągłości z zakresu od zera do jednego, gdzie jeden definiuje idealny okrąg, a zero losowy kształt. Uruchom wykrywanie, klikając przycisk OK. Zostaną wyświetlone dwie tabele, tabela zatytułowana podsumowanie, która zawiera liczbę wykrytych komórek, oraz tabela zatytułowana wyniki, która zawiera współrzędne X i Y każdej komórki.

Skopiuj wartości i wklej je do aplikacji arkusza kalkulacyjnego. Zapisz tę tabelę w tabeli wykrywania nazw. Pojawi się również plik z wykresem wykrytych komórek.

Zapisz ten plik jako plik TIFF w pliku wykrywania nazw. Jeśli grupa dwóch lub więcej oznaczonych komórek zostanie wykryta jako pojedyncza komórka za pomocą narzędzia Analizuj cząstki, użyj narzędzia zlewni na obrazie binarnym, wybierając proces , binarny i zlewnia przed zastosowaniem narzędzia do analizy cząstek. Aby zmierzyć powierzchnię sieci, użyj pliku wykrywania w ImageJ.

Kliknij lewym przyciskiem myszy, aby wybrać narzędzie do zaznaczania wielokątów na pasku narzędzi. Kliknij ponownie lewym przyciskiem myszy, aby rozpocząć śledzenie obszaru zainteresowania lub ROI, który łączy wszystkie komórki znajdujące się na zewnętrznych peryferiach sieci. Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby zamknąć wielokąt.

Otwórz okno ustawiania pomiaru i wybierz opcję obszaru. Następnie otwórz menedżera ROI i dodaj śledzony wielokąt w menedżerze ROI, klikając dodaj. Uruchom pomiar, klikając przycisk miary w menedżerze zwrotu z inwestycji.

Pomiar powierzchni pojawi się w tabeli i będzie wyrażony w pikselach. Nie zapomnij przeliczyć tej wartości na współczynnik konwersji dla mikroskopu użytego do uzyskania wartości w mikrometrach kwadratowych. Otwórz plik stosu w ImageJFIJI i zidentyfikuj załataną komórkę z jej większą intensywnością etykietowania.

Następnie otwórz plik o nazwie detection table w aplikacji arkusza kalkulacyjnego i znajdź numer powiązany z załataną komórką oraz odpowiadające jej współrzędne. Jeśli nie możesz dokładnie określić załatanej komórki, użyj narzędzia wielokąta, aby otoczyć obszar, w którym złogi biocytyny są gęstsze, i odnieś się do tej pozycji jako do miejsca załatanej komórki. Użyj menedżera ROI, tak jak poprzednio, aby narysować ROI w lokalizacji poprawionej komórki i dodać go do menedżera ROI.

Następnie ustaw pomiar i wybierz opcję środka ciężkości. W menedżerze RIO kliknij środek, aby uzyskać współrzędne środka ciężkości śledzonego obszaru. Użyj tych współrzędnych jako punktu odniesienia dla tej konkretnej sieci.

Użyj tej formuły, aby obliczyć współrzędne każdej komórki w odniesieniu do astrocytu z łatką. Wyrażenie współrzędnych każdej komórki w odniesieniu do astrocytu z łatką jest ważnym krokiem do obliczenia wektora z łatanych astrocytów. Użyj tego wzoru, aby obliczyć współrzędne głównego wektora orientacji preferencyjnej.

Głównym wektorem preferencyjnej orientacji sieci jest suma wszystkich wcześniej obliczonych wektorów dla każdej komórki wchodzącej w skład sieci. Podziel długość głównego wektora przez liczbę komórek w sieci, minus jeden, aby wykluczyć załataną komórkę, aby znormalizować wartości i umożliwić porównania między sieciami. Aby określić położenie każdej sieci w jądrze zainteresowania, najpierw otwórz obraz four x za pomocą edytora obrazów wektorowych.

Pomnóż wymiary w oknie wymiarowania przez pięć, aby zwiększyć rozmiar obrazu z czterema x. W tym przypadku obraz był próbkowany z rozdzielczością 800 na 800 pikseli, a więc rozdzielczość próbkowania została zmieniona na 4000 na 4000 pikseli. Wyeksportuj plik w formacie tiff i nazwij go o zmienionym rozmiarze cztery x.

Wyrównaj lewy górny róg obrazu o zmienionym rozmiarze z czterema x do lewego dolnego rogu dokumentu programu Adobe Illustrator. Oprogramowanie udostępnia współrzędne z punktu odniesienia w lewym dolnym rogu. Otwórz obraz sieci 20 x.

Użyj pliku binarnego lub pliku wykrywania, ponieważ są one łatwiejsze do wyrównania. Następnie pobaw się narzędziem do krycia na pliku binarnym obrazu 20 x, aby wyrównać go z obrazem o zmienionym rozmiarze. Po zakończeniu wyrównywania wybierz i przytrzymaj narzędzie do pipetowania, aby pojawiło się narzędzie do mierzenia, a następnie wybierz je na lewym pasku narzędzi.

Użyj narzędzia do mierzenia, aby kliknąć lewy górny róg obrazu 20 x, aby uzyskać współrzędne punktu odniesienia 20 x na obrazie o zmienionym rozmiarze. Te 20 x współrzędnych referencyjnych jest przydatnych do wyrażania położenia każdej sieci na schematycznym rysunku jądra. Podsumowując dane, stosuje się normalizację jądra jako prostokąta.

Aby to zrobić, użyj narzędzia wielokąta, aby otoczyć jądro na obrazie o zmienionym rozmiarze four x. Następnie otwórz menedżera ROI i dodaj narysowany ROI. Użyj obrazu z przezroczystymi światłami, jeśli granice jądra nie są widoczne, w takim przypadku pamiętaj, aby najpierw zmienić jego rozmiar.

W polu Pomiar zestawu wybierz opcję prostokąta ograniczającego, aby obliczyć najmniejszy prostokąt w narysowanym jądrze. Na koniec kliknij przycisk zmierz, a następnie postępuj zgodnie z instrukcjami w pisemnym protokole, aby wyrazić współrzędne oznaczonych komórek w znormalizowanym jądrze reprezentowanym przez prostokąt ograniczający. Pojedynczy astrocyt w grzbietowej części głównego jądra czuciowego trójdzielnego, oznaczony przez SR101, został przeznaczony do rejestracji całej komórki i wypełniony 0,2% biocytyną.

Stymulacja elektryczna piątego przewodu zwiększyła znakowanie biocytyny w grzbietowej części głównego jądra czuciowego nerwu trójdzielnego, co oznacza wzrost liczby sprzężonych komórek. Sieci astrocytarne pozostają ograniczone w grzbietowej części głównego jądra czuciowego nerwu trójdzielnego i ich głównej orientacji. Technika ta została opracowana w celu pozycjonowania sieci astrocytarnych w określonej strukturze, ale może być używana do wyrażania pozycji populacji znakowanej komórki w dowolnej strukturze.