Name: Analiza rozmiaru, kształtu i kierunkowości sieci sprzężonych astrocytów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: Poznaj metodę analizy sieci astrocytów w strukturach mózgu przy użyciu ImageJFIJI. Protokół umożliwia bezstronne pomiary liczby komórek, ich rozmiaru, powierzchni i pozycji oraz wektorową analizę anizotropii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca jest finansowana przez Canadian Institutes of Health Research, numer grantu/nagrody: 14392.

<ol><li>Condamine, S., Lavoie, R., Verdier, D., Kolta, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+rhythmogenic+domains+defined+by+astrocytic+networks+in+the+trigeminal+main+sensory+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Functional rhythmogenic domains defined by astrocytic networks in the trigeminal main sensory nucleus.</a> Glia. 66 (2), 311-326 (2018).</li>
<li>Verkhratsky, A., Orkand, R. K., Kettenmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+calcium%3A+homeostasis+and+signaling+function%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Review%22%5BJournal%5D)">Glial calcium: homeostasis and signaling function.</a> Physiological Review. 78 (1), 99-141 (1998).</li>
<li>Christensen, R. K., Petersen, A. V., Perrier, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+do+glial+cells+contribute+to+motor+control%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Pharmaceutical+Design%22%5BJournal%5D)">How do glial cells contribute to motor control?</a> Current Pharmaceutical Design. 19 (24), 4385-4399 (2013).</li>
<li>Verkhratsky, A., Steinhauser, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion+channels+in+glial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research+Review%22%5BJournal%5D)">Ion channels in glial cells.</a> Brain Research Review. 32 (2-3), 380-412 (2000).</li>
<li>Harada, K., Kamiya, T., Tsuboi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gliotransmitter+Release+from+Astrocytes%3A+Functional%2C+Developmental%2C+and+Pathological+Implications+in+the+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Gliotransmitter Release from Astrocytes: Functional, Developmental, and Pathological Implications in the Brain.</a> Frontiers Neuroscience. 9, 499(2015).</li>
<li>Montero, T. D., Orellana, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemichannels%3A+new+pathways+for+gliotransmitter+release%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Hemichannels: new pathways for gliotransmitter release.</a> Neuroscience. 286, 45-59 (2015).</li>
<li>Araque, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gliotransmitters+travel+in+time+and+space%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Gliotransmitters travel in time and space.</a> Neuron. 81 (4), 728-739 (2014).</li>
<li>Augustin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+anisotropic+panglial+networks+in+the+lateral+superior+olive%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Functional anisotropic panglial networks in the lateral superior olive.</a> Glia. 64 (11), 1892-1911 (2016).</li>
<li>Houades, V., Koulakoff, A., Ezan, P., Seif, I., Giaume, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gap+junction-mediated+astrocytic+networks+in+the+mouse+barrel+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Gap junction-mediated astrocytic networks in the mouse barrel cortex.</a> Journal of Neuroscience. 28 (20), 5207-5217 (2008).</li>
<li>Roux, L., Benchenane, K., Rothstein, J. D., Bonvento, G., Giaume, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+astroglial+networks+in+olfactory+glomeruli%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+of+the+United+State+of+America%22%5BJournal%5D)">Plasticity of astroglial networks in olfactory glomeruli.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United State of America. 108 (45), 18442-18446 (2011).</li>
<li>Morquette, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+astrocyte-dependent+mechanism+for+neuronal+rhythmogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">An astrocyte-dependent mechanism for neuronal rhythmogenesis.</a> Nature Neuroscience. 18 (6), 844-854 (2015).</li>
<li>Brocard, F., Verdier, D., Arsenault, I., Lund, J. P., Kolta, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergence+of+intrinsic+bursting+in+trigeminal+sensory+neurons+parallels+the+acquisition+of+mastication+in+weanling+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Emergence of intrinsic bursting in trigeminal sensory neurons parallels the acquisition of mastication in weanling rats.</a> Journal of Neurophysiology. 96 (5), 2410-2424 (2006).</li>
<li>Anders, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+properties+of+astrocyte+gap+junction+coupling+in+the+rat+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+of+London.+Series+B%2C+Biological+Science%22%5BJournal%5D)">Spatial properties of astrocyte gap junction coupling in the rat hippocampus.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Science. 369 (1654), (2014).</li>
<li>Houades, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shapes+of+astrocyte+networks+in+the+juvenile+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron+Glia+Biology%22%5BJournal%5D)">Shapes of astrocyte networks in the juvenile brain.</a> Neuron Glia Biology. 2 (1), 3-14 (2006).</li>
<li>Rouach, N., Koulakoff, A., Abudara, V., Willecke, K., Giaume, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astroglial+metabolic+networks+sustain+hippocampal+synaptic+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Astroglial metabolic networks sustain hippocampal synaptic transmission.</a> Science. 322 (5907), 1551-1555 (2008).</li>
<li>Claus, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Barreloid+Borders+and+Neuronal+Activity+Shape+Panglial+Gap+Junction-Coupled+Networks+in+the+Mouse+Thalamus%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">Barreloid Borders and Neuronal Activity Shape Panglial Gap Junction-Coupled Networks in the Mouse Thalamus.</a> Cerebral Cortex. 28 (1), 213-222 (2018).</li>
<li>Cameron, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prolonged+Incubation+of+Acute+Neuronal+Tissue+for+Electrophysiology+and+Calcium-imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Prolonged Incubation of Acute Neuronal Tissue for Electrophysiology and Calcium-imaging.</a> Journal of Visualized Experiments. (120), (2017).</li>
<li>Kafitz, K. W., Meier, S. D., Stephan, J., Rose, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+profile+and+properties+of+sulforhodamine+101--Labeled+glial+cells+in+acute+brain+slices+of+rat+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Developmental profile and properties of sulforhodamine 101--Labeled glial cells in acute brain slices of rat hippocampus.</a> Journal of Neuroscience Methods. 169 (1), 84-92 (2008).</li>
<li>Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correction+for+liquid+junction+potentials+in+patch+clamp+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Correction for liquid junction potentials in patch clamp experiments.</a> Methods in Enzymology. , 123-131 (1992).</li>
<li>Giaume, C., Leybaert, L., Naus, C. C., Saez, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connexin+and+pannexin+hemichannels+in+brain+glial+cells%3A+properties%2C+pharmacology%2C+and+roles%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Connexin and pannexin hemichannels in brain glial cells: properties, pharmacology, and roles.</a> Frontiers in Pharmacology. 4, 88(2013).</li>
<li>Torres, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+Ca%282%29%28%2B%29+acts+as+a+mediator+of+communication+from+neurons+to+glia%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">Extracellular Ca(2)(+) acts as a mediator of communication from neurons to glia.</a> Science Signaling. 5 (208), ra8(2012).</li>
<li>Ye, Z. C., Wyeth, M. S., Baltan-Tekkok, S., Ransom, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+hemichannels+in+astrocytes%3A+a+novel+mechanism+of+glutamate+release%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Functional hemichannels in astrocytes: a novel mechanism of glutamate release.</a> Journal of Neuroscience. 23 (9), 3588-3596 (2003).</li>
<li>Ma, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gap+junction+coupling+confers+isopotentiality+on+astrocyte+syncytium%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Gap junction coupling confers isopotentiality on astrocyte syncytium.</a> Glia. 64 (2), 214-226 (2016).</li>
<li>Meme, W., Vandecasteele, M., Giaume, C., Venance, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+coupling+between+hippocampal+astrocytes+in+rat+brain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Electrical coupling between hippocampal astrocytes in rat brain slices.</a> Neuroscience Research. 63 (4), 236-243 (2009).</li>
<li>Ransom, B. R., Kettenmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+coupling%2C+without+dye+coupling%2C+between+mammalian+astrocytes+and+oligodendrocytes+in+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Electrical coupling, without dye coupling, between mammalian astrocytes and oligodendrocytes in cell culture.</a> Glia. 3 (4), 258-266 (1990).</li>
<li>Audesirk, G., Audesirk, T., Bowsher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variability+and+frequent+failure+of+lucifer+yellow+to+pass+between+two+electrically+coupled+neurons+in+Lymnaea+stagnalis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Variability and frequent failure of lucifer yellow to pass between two electrically coupled neurons in Lymnaea stagnalis.</a> Journal of Neurobiology. 13 (4), 369-375 (1982).</li>
<li>Ewadinger, N., Syed, N., Lukowiak, K., Bulloch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+Tracer+Coupling+between+Pairs+of+Identified+Neurones+of+the+Mollusc+Lymnaea+Stagnalis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Differential Tracer Coupling between Pairs of Identified Neurones of the Mollusc Lymnaea Stagnalis.</a> Journal of Experimental Biology. 192 (1), 291-297 (1994).</li>
<li>Griemsmann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Panglial+Gap+Junction+Networks+in+the+Thalamus%2C+Neocortex%2C+and+Hippocampus+Reveals+a+Unique+Population+of+Glial+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">Characterization of Panglial Gap Junction Networks in the Thalamus, Neocortex, and Hippocampus Reveals a Unique Population of Glial Cells.</a> Cerebral Cortex. 25 (10), 3420-3433 (2015).</li>
<li>Kuwajima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ClearT%3A+a+detergent-+and+solvent-free+clearing+method+for+neuronal+and+non-neuronal+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue.</a> Development. 140 (6), 1364-1368 (2013).</li>
<li>Gourine, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes+control+breathing+through+pH-dependent+release+of+ATP%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Astrocytes control breathing through pH-dependent release of ATP.</a> Science. 329 (5991), 571-575 (2010).</li>
<li>Forsberg, D., Ringstedt, T., Herlenius, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes+release+prostaglandin+E2+to+modify+respiratory+network+activity%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Astrocytes release prostaglandin E2 to modify respiratory network activity.</a> eLife. 6, (2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Istnieje wiele metod elektrofizjologicznych do oceny funkcjonalnego sprzężenia między astrocytami23,24. Metody te nie dostarczają jednak informacji o anatomicznym układzie sieci astrocytowych. Szereg badań wykazało już, że "sprzężenie barwnikowe lub znacznikowe", jak to ma miejsce tutaj, występuje tylko we frakcji sprzężonych komórek, które są wykrywane metodami elektrofizjologicznymi 25,26,27, co sugeruje, że liczba komórek wykrytych tą metodą jest niedoszacowan...

Wiele badań opisało, jak dialog neuron-astrocyt na poziomie subkomórkowym lub synaptycznym może mieć wpływ na funkcje neuronalne i transmisję synaptyczną. Powszechnie wiadomo, że astrocyty są wrażliwe na otaczającą aktywność neuronalną; w rzeczywistości mają receptory dla wielu neuroprzekaźników, w tym glutaminianu, GABA, acetylocholiny i ATP (zobacz wcześniej opublikowane recenzje2,3,4). W zamian procesy astrocytowe obejmują elementy synaptyczne i wpływają na aktywność neuronów zarówno tam, jak i w miejscach pozasynaptycznych, regulując zewnątrzkomórkową homeostazę jonową i uwalniając kilka czynników lub przekaźników, takich jak glutaminian, D-seryna i ATP5,6,7.
Pojawił się pomysł, że astrocyty mogą również modulować funkcje neuronów na poziomie sieci, z dowodami, że sprzężenie astrocytów jest regulowane przestrzennie i odpowiada segmentacji neuronów w obszarach charakteryzujących się wyraźnym anatomicznym podziałem (jak obszary z reprezentacjami sensorycznymi), co wskazuje, że astrocyty będą łączyć się z innymi astrocytami pełniącymi tę samą funkcję, a nie tylko z tymi, które są blisko. Na przykład w bocznej górnej oliwce większość sieci astrocytowych jest zorientowana prostopadle do osi tonotopowej8, podczas gdy w korze beczkowatej lub kłębuszkach olfactoty komunikacja między astrocytami jest znacznie silniejsza w beczkach lub kłębuszkach nerkowych i słabsza między sąsiednimi9,10. W obu przypadkach sieci astrocytarne są zorientowane w kierunku środka glomerrule lub barrel9,10.
Niedawno wykazaliśmy, że aktywność astrocytów moduluje odpalanie neuronów poprzez zmniejszenie stężenia zewnątrzkomórkowego Ca2+ ([Ca2+]e), przypuszczalnie poprzez uwalnianie S100β, białka wiążącego Ca2+11. Efekt ten, który wykazano w populacji neuronów rytmicznych trójdzielnych w grzbietowej części głównego jądra czuciowego nerwu trójdzielnego (NVsnpr, uważanego za odgrywający ważną rolę w generowaniu ruchów żucia), wynika z faktu, że rytmiczne odpalanie w tych neuronach zależy od stałego prądu Na+, który jest promowany przez spadki [Ca2+]e11, 12. Rytmiczne odpalanie w tych neuronach może być wywołane "fizjologicznie" przez stymulację ich danych wejściowych lub sztuczne zmniejszenie [Ca2+]e. Wykazaliśmy ponadto, że sprzężenie astrocytarne jest wymagane do rytmicznego odpalania neuronów1. To podniosło możliwość, że sieci astrocytarne mogą tworzyć ograniczone domeny funkcjonalne, w których aktywność neuronalna może być zsynchronizowana i skoordynowana. Aby ocenić tę hipotezę, musieliśmy najpierw opracować metodę rygorystycznego dokumentowania organizacji tych sieci w ramach NVsnpr.
Poprzednie badania nad sieciami astrocytarnymi opisywały głównie zakres sprzężenia pod względem liczby komórek oraz gęstości i obszaru, który obejmował. Próby oceny kształtu sieci astrocytarnych i kierunku sprzężenia barwników przeprowadzono głównie poprzez porównanie wielkości sieci wzdłuż dwóch osi (x i y) w korze beczkowatej 9, hippocampus13,14,15, barykowate pola wzgórza16, lateral superior olive8, glomeruli10, oraz cortex14. Opisane tutaj metody umożliwiają bezstronne zliczanie oznakowanych komórek w sieci i oszacowanie obszaru, który obejmują. Opracowaliśmy również narzędzia do definiowania preferowanej orientacji sprzężenia w sieci oraz do oceny, czy preferowana orientacja jest skierowana do środka jądra, czy w innym kierunku. W porównaniu z poprzednio stosowanymi metodami, protokół ten zapewnia środki do opisania organizacji i orientacji sieci astrocytarnych w strukturach takich jak grzbietowe trójdzielne główne jądro czuciowe, które nie mają znanego wyraźnego anatomicznego podziału na przedziały. W powyższych badaniach orientacja sieci jest opisana jako związek z kształtem samej struktury, który jest już udokumentowany (np. beczkowata we wzgórzu, beczki w korze, warstwy w hipokampie i korze, kłębuszki w opuszce węchowej itp.). Ponadto analiza wektorowa pozwala na porównanie orientacji sprzężeń ujawnionych w różnych warunkach. Aby przeanalizować, czy parametry te zmieniają się w zależności od położenia sieci w jądrze, opracowaliśmy również metodę wymiany każdej sieci w odniesieniu do granic jądra. Narzędzia te można łatwo zaadaptować do innych obszarów badania sieci sprzężonych komórek.

<table><tbody><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Chemicals</td><td>S671-3</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Chemicals</td><td>P217-500</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Fisher Chemicals</td><td>P285-500</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Fisher Chemicals</td><td>M65-500</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Fisher Chemicals</td><td>S233-500</td><td></td></tr><tr><td>C6H12O6 Dekstroza bezwodna</td><td>Fisher Chemicals</td><td>D16-500</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 dwuwodnisty</td><td>Sigma</td><td>C70-500</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>Sól potasowa kwasu D-glukonowego</td><td>Sigma</td><td>G45001</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 bezwodny</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>ATPTris Salt</td><td>Sigma</td><td>A9062</td><td></td></tr><tr><td>GTPTris Salt</td><td>Sigma</td><td>G9002</td><td></td></tr><tr><td>Biocytin</td><td>Sigma</td><td>B4261</td><td></td></tr><tr><td>Karbenosolon sól disodowa</td><td>Sigma</td><td>C4790</td><td></td></tr><tr><td>kompleks awidyny-biotyny: zestaw ABC</td><td>Laboratoria Vestor</td><td>PK-4000</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidine-alexa 594</td><td>Sondy molekularne</td><td>S11227</td><td></td></tr><tr><td>Triton</td><td>Fisher Chemicals</td><td>BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>Ksylen</td><td>Fisher Chemicals</td><td>X5-1</td><td></td></tr><tr><td>Wodne medium montażowe 1 : Fluoromount-G</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>Medium montażowe z żywicy syntetycznej na bazie toluenu: Permount</td><td>Fisher Chemicals</td><td>SP15-100</td><td></td></tr><tr><td>Ławka do suszenia szkiełek</td><td>Fisherbrand</td><td>11-474-470</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica</td><td>VT 1000S</td><td></td></tr><tr><td>Szkło osłonowe mikroskopu</td><td>Fisherbrand</td><td>12-544A Szkiełko</td><td></td></tr><tr><td>mikroskopowe ColorFrost</td><td>Fisherbrand</td><td>12-550-413</td><td></td></tr><tr><td>PFA</td><td>Fisherchemicals</td><td>04042-500</td><td></td></tr><tr><td>Olympus FluoView FV 1000 Mikroskop konfokalny</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>40X Soczewka zanurzeniowa</td><td>Olympus</td><td>LUMPLFLN40XW</td><td></td></tr><tr><td>20X Soczewka zanurzeniowa</td><td>Olympus</td><td>XLUMPLFL20XW</td><td></td></tr><tr><td>4X</td><td>Mikropipeta Olympus</td><td>XLFLUOR4X/340</td><td></td></tr><tr><td> ściągacz</td><td>Sutter Instrument</td><td>P97</td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td>Sutter Instrument</td><td>MP 225</td><td></td></tr><tr><td>Kamera CCD</td><td>Sony</td><td>CX-ST50</td><td></td></tr><tr><td>Czarno-biały monitor</td><td>Sony</td><td>SSM-125</td><td></td></tr><tr><td>Digidata</td><td>Urządzenia molekularne</td><td>1322A Wzmacniacz zaciskowy</td><td></td></tr><tr><td>Axon</td><td>instrument</td><td>Mulitclamp 700A</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do akwizycji elektrofizjologii</td><td>Urządzenia molekularne</td><td>pClamp 8</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do analizy elektrofizjologicznej</td><td>Urządzenia molekularne</td><td>Clampfit 8</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do analizy obrazowania</td><td>ImageJFIJI</td><td>Oprogramowanie open source. Wersja FIJI wraz z pakietem wtykowym.</td><td></td></tr><tr><td>Edytor obrazów wektorowych</td><td>Adobe</td><td>Illustrator CS4</td><td></td></tr><tr><td>Aplikacja arkusza kalkulacyjnego</td><td>Microsoft Office</td><td>Excel 2010</td><td></td></tr></tbody></table>

analiza rozmiaru, kształtu i kierunkowości sieci sprzężonych astrocytów

Analyzing the Size, Shape, and Directionality of Networks of Coupled Astrocytes

Staje się coraz bardziej jasne, że astrocyty modulują funkcje neuronów nie tylko na poziomie synaptycznym i pojedynczych komórek, ale także na poziomie sieci. Astrocyty są silnie połączone ze sobą za pomocą połączeń szczelinowych, a sprzężenie przez te połączenia jest dynamiczne i wysoce regulowane. Wyłaniającą się koncepcję jest to, że funkcje astrocytarne są wyspecjalizowane i przystosowane do funkcji obwodu neuronalnego, z którym są związane. W związku z tym potrzebne są metody pomiaru różnych parametrów sieci astrocytowych, aby lepiej opisać zasady rządzące ich komunikacją i sprzężeniem oraz lepiej zrozumieć ich funkcje.
Tutaj, korzystając z oprogramowania do analizy obrazów (np. ImageJFIJI), opisujemy metodę analizy obrazów konfokalnych sieci astrocytowych ujawnionych przez sprzężenie barwnikowe. Metody te pozwalają na: 1) zautomatyzowane i bezstronne wykrywanie znakowanych komórek, 2) obliczanie wielkości sieci, 3) obliczanie preferencyjnej orientacji rozprzestrzeniania się barwnika w sieci oraz 4) repozycjonowanie sieci w obszarze zainteresowania.
Ta analiza może być wykorzystana do scharakteryzowania sieci astrocytowych określonego obszaru, porównania sieci różnych obszarów związanych z różnymi funkcjami, lub porównania sieci uzyskanych w różnych warunkach, które mają różny wpływ na sprzężenie. Obserwacje te mogą prowadzić do ważnych rozważań funkcjonalnych. Na przykład, analizujemy sieci astrocytarne jądra trójdzielnego, gdzie wcześniej wykazaliśmy, że sprzężenie astrocytów jest niezbędne dla zdolności neuronów do przełączania swoich wzorców odpalania z tonicznego na rytmiczne bursting1. Mierząc wielkość, ograniczenie i preferencyjną orientację sieci astrocytarnych w tym jądrze, możemy budować hipotezy na temat domen funkcjonalnych, które one opisują. Kilka badań sugeruje, że kilka innych obszarów mózgu, w tym kora beczkowata, boczna górna oliwka, kłębuszki węchowe i jądra czuciowe we wzgórzu i korze wzrokowej, by wymienić tylko kilka, może skorzystać z podobnej analizy.

Połączenia między komórkami w mózgu nie są statyczne, lecz są dynamicznie regulowane przez wiele czynników. Opisane metody opracowano w celu analizy sieci astrocytarnych ujawnianych w różnych warunkach oraz zrozumienia ich organizacji w NVsnpr. Wyniki te zostały już opublikowane1. Wykonano wypełnianie biocytyną pojedynczych astrocytów w części grzbietowej NVsnpr w trzech różnych warunkach: w spoczynku (w warunkach kontrolnych, w przypadku braku jakiejkolwiek stymul...

Tutaj prezentujemy protokół do oceny organizacji sieci astrocytowych. Opisana metoda minimalizuje odchylenie, aby zapewnić opisowe pomiary tych sieci, takie jak liczba komórek, rozmiar, obszar i położenie w jądrze. Anizotropię ocenia się za pomocą analizy wektorowej.

Analiza rozmiaru, kształtu i kierunkowości sieci sprzężonych astrocytów

It has become increasingly clear that astrocytes modulate neuronal function not only at the synaptic and single-cell levels, but also at the network ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące organizacji sieci astrocytarnych w strukturach mózgu. Główną zaletą tej techniki jest to, że proponuje bezstronną metodę liczenia komórek i dokumentowania ich anatomicznej organizacji w określonej strukturze. Otwórz ImageJFIJI, wybierz żądany plik i kliknij OK w oknie opcji importu bioformatu.Aby ponownie zdefiniować stos Z, który będzie zawierał tylko wycinki optyczne potrzebne do końcowego stosu Z, najpierw wybierz projekt STK i Z, a następnie kliknij pokrętło stosu na pasku narzędzi. Wybierz maksymalną intensywność w ustawieniu typu projekcji. Zapisz plik i nadaj mu nazwę plik stosu.Jeśli plik obrazowania zawiera kilka kanałów, użyj koloru obrazu i podziel kanały, aby wyświetlić tylko kanał z obrazem sieci astrocytów. Sprawdź ustawienia pikseli obrazu, wybierając obraz, właściwości, piksel, z jednym dla wymiaru piksela. Następnie użyj narzędzia do odejmowania tła, otwierając proces i odejmuj tło, aby usunąć etykietowanie biocytyny w tle.Użyj funkcji podglądu, aby ustawić promień toczącej się kuli, który zwykle wynosi 50 pikseli. Jeśli wymagana jest dalsza redukcja szumów po odjęciu tła, wybierz opcję proces, szum i usuń wartości odstające. Wybierz opcję jasny w ustawieniu które wartości odstające, a następnie użyj funkcji podglądu, aby ustawić promień i próg.Zachowaj ostrożność podczas korzystania z narzędzia do usuwania wartości odstających, ponieważ może ono spowodować rozmycie danych, jak pokazano tutaj. Dostosuj próg za pomocą obrazu, dostosuj, progu. Wybierz tryb domyślny oraz czarno-biały.Kliknij Zastosuj. Przekonwertuj obraz na obraz binarny za pomocą narzędzia procesu binarnego, wybierając proces, binarny i utwórz binarny. Zapisz plik jako plik tiff i nazwij go plikiem binarnym.Aby policzyć komórki, najpierw ustaw typ pomiaru, klikając przycisk Analizuj i ustaw pomiar. Następnie wybierz opcję środka ciężkości. Upewnij się, że plik binarny jest otwarty na ekranie.Ponownie otwórz menu analizy i tym razem wybierz opcję analizuj cząstki. Następnie wybierz pozycję pokaż i kontury. Spowoduje to wygenerowanie nowego pliku, który pokazuje wynik wykrywania.Zoptymalizuj parametry, aby uściślić wykrywanie. Aby wykryć tylko komórki, użyj wartości rozmiaru z zakresu od 30 do 6000 i okrągłości z zakresu od zera do jednego, gdzie jeden definiuje idealny okrąg, a zero losowy kształt. Uruchom wykrywanie, klikając przycisk OK. Zostaną wyświetlone dwie tabele, tabela zatytułowana podsumowanie, która zawiera liczbę wykrytych komórek, oraz tabela zatytułowana wyniki, która zawiera współrzędne X i Y każdej komórki.Skopiuj wartości i wklej je do aplikacji arkusza kalkulacyjnego. Zapisz tę tabelę w tabeli wykrywania nazw. Pojawi się również plik z wykresem wykrytych komórek.Zapisz ten plik jako plik TIFF w pliku wykrywania nazw. Jeśli grupa dwóch lub więcej oznaczonych komórek zostanie wykryta jako pojedyncza komórka za pomocą narzędzia Analizuj cząstki, użyj narzędzia zlewni na obrazie binarnym, wybierając proces , binarny i zlewnia przed zastosowaniem narzędzia do analizy cząstek. Aby zmierzyć powierzchnię sieci, użyj pliku wykrywania w ImageJ.Kliknij lewym przyciskiem myszy, aby wybrać narzędzie do zaznaczania wielokątów na pasku narzędzi. Kliknij ponownie lewym przyciskiem myszy, aby rozpocząć śledzenie obszaru zainteresowania lub ROI, który łączy wszystkie komórki znajdujące się na zewnętrznych peryferiach sieci. Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby zamknąć wielokąt.Otwórz okno ustawiania pomiaru i wybierz opcję obszaru. Następnie otwórz menedżera ROI i dodaj śledzony wielokąt w menedżerze ROI, klikając dodaj. Uruchom pomiar, klikając przycisk miary w menedżerze zwrotu z inwestycji.Pomiar powierzchni pojawi się w tabeli i będzie wyrażony w pikselach. Nie zapomnij przeliczyć tej wartości na współczynnik konwersji dla mikroskopu użytego do uzyskania wartości w mikrometrach kwadratowych. Otwórz plik stosu w ImageJFIJI i zidentyfikuj załataną komórkę z jej większą intensywnością etykietowania.Następnie otwórz plik o nazwie detection table w aplikacji arkusza kalkulacyjnego i znajdź numer powiązany z załataną komórką oraz odpowiadające jej współrzędne. Jeśli nie możesz dokładnie określić załatanej komórki, użyj narzędzia wielokąta, aby otoczyć obszar, w którym złogi biocytyny są gęstsze, i odnieś się do tej pozycji jako do miejsca załatanej komórki. Użyj menedżera ROI, tak jak poprzednio, aby narysować ROI w lokalizacji poprawionej komórki i dodać go do menedżera ROI.Następnie ustaw pomiar i wybierz opcję środka ciężkości. W menedżerze RIO kliknij środek, aby uzyskać współrzędne środka ciężkości śledzonego obszaru. Użyj tych współrzędnych jako punktu odniesienia dla tej konkretnej sieci.Użyj tej formuły, aby obliczyć współrzędne każdej komórki w odniesieniu do astrocytu z łatką. Wyrażenie współrzędnych każdej komórki w odniesieniu do astrocytu z łatką jest ważnym krokiem do obliczenia wektora z łatanych astrocytów. Użyj tego wzoru, aby obliczyć współrzędne głównego wektora orientacji preferencyjnej.Głównym wektorem preferencyjnej orientacji sieci jest suma wszystkich wcześniej obliczonych wektorów dla każdej komórki wchodzącej w skład sieci. Podziel długość głównego wektora przez liczbę komórek w sieci, minus jeden, aby wykluczyć załataną komórkę, aby znormalizować wartości i umożliwić porównania między sieciami. Aby określić położenie każdej sieci w jądrze zainteresowania, najpierw otwórz obraz four x za pomocą edytora obrazów wektorowych.Pomnóż wymiary w oknie wymiarowania przez pięć, aby zwiększyć rozmiar obrazu z czterema x. W tym przypadku obraz był próbkowany z rozdzielczością 800 na 800 pikseli, a więc rozdzielczość próbkowania została zmieniona na 4000 na 4000 pikseli. Wyeksportuj plik w formacie tiff i nazwij go o zmienionym rozmiarze cztery x.Wyrównaj lewy górny róg obrazu o zmienionym rozmiarze z czterema x do lewego dolnego rogu dokumentu programu Adobe Illustrator. Oprogramowanie udostępnia współrzędne z punktu odniesienia w lewym dolnym rogu. Otwórz obraz sieci 20 x.Użyj pliku binarnego lub pliku wykrywania, ponieważ są one łatwiejsze do wyrównania. Następnie pobaw się narzędziem do krycia na pliku binarnym obrazu 20 x, aby wyrównać go z obrazem o zmienionym rozmiarze. Po zakończeniu wyrównywania wybierz i przytrzymaj narzędzie do pipetowania, aby pojawiło się narzędzie do mierzenia, a następnie wybierz je na lewym pasku narzędzi.Użyj narzędzia do mierzenia, aby kliknąć lewy górny róg obrazu 20 x, aby uzyskać współrzędne punktu odniesienia 20 x na obrazie o zmienionym rozmiarze. Te 20 x współrzędnych referencyjnych jest przydatnych do wyrażania położenia każdej sieci na schematycznym rysunku jądra. Podsumowując dane, stosuje się normalizację jądra jako prostokąta.Aby to zrobić, użyj narzędzia wielokąta, aby otoczyć jądro na obrazie o zmienionym rozmiarze four x. Następnie otwórz menedżera ROI i dodaj narysowany ROI. Użyj obrazu z przezroczystymi światłami, jeśli granice jądra nie są widoczne, w takim przypadku pamiętaj, aby najpierw zmienić jego rozmiar.W polu Pomiar zestawu wybierz opcję prostokąta ograniczającego, aby obliczyć najmniejszy prostokąt w narysowanym jądrze. Na koniec kliknij przycisk zmierz, a następnie postępuj zgodnie z instrukcjami w pisemnym protokole, aby wyrazić współrzędne oznaczonych komórek w znormalizowanym jądrze reprezentowanym przez prostokąt ograniczający. Pojedynczy astrocyt w grzbietowej części głównego jądra czuciowego trójdzielnego, oznaczony przez SR101, został przeznaczony do rejestracji całej komórki i wypełniony 0,2% biocytyną.Stymulacja elektryczna piątego przewodu zwiększyła znakowanie biocytyny w grzbietowej części głównego jądra czuciowego nerwu trójdzielnego, co oznacza wzrost liczby sprzężonych komórek. Sieci astrocytarne pozostają ograniczone w grzbietowej części głównego jądra czuciowego nerwu trójdzielnego i ich głównej orientacji. Technika ta została opracowana w celu pozycjonowania sieci astrocytarnych w określonej strukturze, ale może być używana do wyrażania pozycji populacji znakowanej komórki w dowolnej strukturze.

analyzing-size-shape-directionality-networks-coupled

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Opisano przygotowanie ostrych skrawków mózgu z izolowanych struktur hipokampa oraz jednoczesne rejestracje elektrofizjologiczne astrocytów i neuronów w stratum radiatum podczas stymulacji kolaterali Schaffera. Zaprezentowano farmakologiczną izolację prądów transporterów potasu i glutaminianu w astroglei.

Podwójne rejestracje elektrofizjologiczne odpowiedzi astroglialnych i neuronalnych wywołanych synaptycznie w ostrych skrawkach hipokampa

Tutaj opisujemy adaptację protokołów używanych do indukowania plastyczności homeostatycznej w neuronach do badania plastyczności receptorów sprzężonych z białkiem G astrocytów. Metoda ta, ostatnio wykorzystana do badania zmian w mGluR grupy astrocytarnej I u młodych myszy, może być stosowana do pomiaru skalowania różnych astrocytarnych GPCR w tkance dorosłych myszy in situ i in vivo oraz do lepszego zrozumienia wrażliwości receptorów astrocytarnych na zmiany aktywności neuronalnej.

Indukowanie plastyczności receptorów astrocytarnych poprzez manipulację szybkością odpalania neuronów

Astrocyty w OUN zmieniają swoje właściwości funkcjonalne i strukturalne w odpowiedzi na szkodliwe bodźce. W artykule przedstawiono protokół oceny trójwymiarowej morfologii astrocytów w stanach chorobowych lub po interwencjach terapeutycznych.

Protokół trójwymiarowej konfokalnej analizy morfometrycznej astrocytów

Ten protokół opisuje pośrednią kokulturę neuron-astrocyt do analizy interakcji neuron-glej.

Test pośredniej kokultury neuron-astrocyty: zestaw in vitro do szczegółowego badania interakcji neuron-glej

Prezentujemy rozwój samoorganizujących się, trójwymiarowych wiązek podłużnie wyrównanych somatów astrocytarnych i procesów w nowej obudowie z biomateriału. Te zaprojektowane "żywe rusztowania", wykazujące średnicę w skali mikronów, a jednocześnie wydłużające się na centymetry, mogą służyć jako stanowiska testowe do badania mechanizmów neurorozwojowych lub ułatwiać neuroregenerację poprzez kierowanie migracją neuronów i/lub odnajdywaniem ścieżek aksonalnych.

Trójwymiarowe, wyrównane sieci astrocytów oparte na inżynierii tkankowej w celu podsumowania mechanizmów rozwojowych i ułatwienia regeneracji układu nerwowego

Opisany tutaj protokół AWESAM jest optymalny do hodowli mysich astrocytów w izolacji od innych komórek mózgowych w szybki, prosty i tani sposób. Astrocyty AWESAM wykazują spontaniczną sygnalizację Ca2 +, morfologię i profile ekspresji genów podobne do astrocytów in vivo.

Hodowla mysich astrocytów podobnych do vivo przy użyciu szybkiego, prostego i niedrogiego protokołu AWESAM

W tym protokole staramy się opisać powtarzalną metodę łączenia zdysocjowanych ludzkich neuronów i astrocytów pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych w kokultury sfer 3D, utrzymywania tych sfer w warunkach swobodnego pływania, a następnie mierzenia aktywności obwodów synaptycznych kul za pomocą immunoanalizy i zapisów z matrycy wieloelektrodowej.

Modelowanie mikroukładów synaptycznych z kokulturami 3D astrocytów i neuronów z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Astrocyty to morfologicznie złożone komórki, czego przykładem są ich liczne procesy i krzaczaste terytoria. Aby przeanalizować ich skomplikowaną morfologię, przedstawiamy niezawodny protokół wykonywania wewnątrzkomórkowej żółtej jonoforezy Lucyfera w lekko utrwalonej tkance.

Wizualizacja morfologii astrocytów za pomocą jonoforezy Lucyfera Yellow

Tutaj opisujemy metodę obrazowania na żywo in vitro, która umożliwia wizualizację wewnątrzkomórkowego transportu organelli i transportu białek błony komórkowej w mysich astrocytach. W protokole tym przedstawiono również metodologię analizy obrazu w celu wyznaczenia tras transportu i kinetyki transportu ładunków.

Wizualizacja i analiza transportu wewnątrzkomórkowego organelli i innych ładunków w astrocytach

Połączenie transdukcji wektora wirusowego i oczyszczania mózgu za pomocą metody CLARITY pozwala na badanie dużej liczby neuronów i astrocytów jednocześnie.

Badanie interakcji przestrzennych między astrocytami a neuronami w oczyszczonych mózgach

Ten protokół opisuje metody cięcia, barwienia i obrazowania swobodnie unoszących się fragmentów tkanki mózgu myszy, a następnie szczegółowy opis analizy objętości terytorium astrocytów i nakładania się lub kafelkowania.

Analiza objętości terytorium astrocytów i kafelkowania w grubych, swobodnie pływających skrawkach tkanek

Poznaj metodę analizy sieci astrocytów w strukturach mózgu przy użyciu ImageJFIJI. Protokół umożliwia bezstronne pomiary liczby komórek, ich rozmiaru, powierzchni i pozycji oraz wektorową analizę anizotropii.

Analiza rozmiaru, kształtu i kierunkowości sieci sprzężonych astrocytów

Przeglądaj więcej filmów