Trójwymiarowe obrazowanie astrocytów znakowanych immunologicznie za pomocą mikroskopii konfokalnej

Weźmy wybarwiony immunologicznie wycinek mózgu myszy z fluorescencyjnie znakowanymi astrocytami. Cytoplazma astrocytu fluoryzuje na czerwono, podczas gdy jądro fluoryzuje na niebiesko.

Umieść szkiełko na stoliku mikroskopu konfokalnego pod odpowiednią soczewką obiektywu.

Korzystając z oprogramowania do akwizycji, dostosuj ostrość i wybierz fluorofory oznaczające cytoplazmę astrocytu i jądro.

Rozpocznij obrazowanie na żywo i zoptymalizuj parametry obrazowania, aby zredukować szumy w pozyskanym obrazie.

W obszarze Parametry akwizycji wybierz tryb skanowania o niskiej szybkości, aby uzyskać obraz dwuwymiarowy o wyższej jakości.

Zidentyfikuj najwyższą pozycję astrocytu jako punkt początkowy dla stosu Z, a najniższą pozycję jako punkt końcowy.

Określ liczbę plasterków pokrywających całą głębokość komórki.

Scal plasterki, aby wygenerować trójwymiarowy obraz astrocytu.

Aby rozpocząć mikroskopię konfokalną, umieść szkiełko na stoliku mikroskopu i wybierz obiektyw 63x. Po otwarciu oprogramowania Acquisition kliknij Smart Setup w zakładce Acquisition i wybierz odpowiednie fluorofory. Tutaj używane są DAPI i Alexa Fluor 555.

Następnie kliknij Najlepszy sygnał, a następnie Zastosuj. Następnie kliknij Ustaw ekspozycję, aby umożliwić komputerowi określenie optymalnych parametrów ekspozycji.

Aby zoptymalizować obraz, otwórz okno Kanały i przełącz obraz na Na żywo. W razie potrzeby dostosuj ostrość. Następnie kliknij 1 AU, aby zoptymalizować otwór. Dostosuj wzmocnienie, aby uzyskać najlepszą intensywność.

Na koniec ustaw wzmocnienie cyfrowe między 2 a 3. Po tej optymalizacji zatrzymaj obraz na żywo i otwórz okno Tryb akwizycji. Dostosuj rozmiar ramki, klikając X na Y i wybierz 1024 na 1024. Wybierz także niską prędkość.

Następnie otwórz kartę Uśrednianie i wybierz liczbę większą lub równą 4. Następnie kliknij przycisk Snap i zapisz przechwycony obraz 2D. Aby skonfigurować obrazowanie 3D, otwórz kartę Smart Setup i zaznacz element Z-Stack, co spowoduje otwarcie okna stosu.

Aby ustawić pierwszą i ostatnią pozycję dla stosu Z, ponownie kliknij przycisk Na żywo i dostosuj fokus do najwyższej pozycji astrocytu. Kliknij Ustaw najpierw. Teraz ustaw ostrość na najniższą pozycję astrocytu i kliknij Ustaw ostatnie. Następnie zatrzymaj podgląd na żywo.

Następnie wybierz interwał, klikając Optymalny, aby ustawić liczbę plasterków. Tutaj interwał wynosi 1,01 mikrometra. Na koniec kliknij Rozpocznij eksperyment i zapisz obrazy po zakończeniu skanowania.