Barwienie immunologiczne znakowanych fluorescencyjnie astrocytów w wycinku tkanki mózgowej myszy

Weźmy nieruchomy wycinek tkanki mózgowej myszy zawierający nieliczną populację astrocytów wykazujących ekspresję białka fluorescencyjnego.

Potraktuj swobodnie pływającą sekcję buforem zawierającym detergent, aby przepuszczalność komórek.

Inkubować sekcję w buforze blokującym, aby zapobiec niespecyficznemu wiązaniu przeciwciał.

Potraktuj sekcję przeciwciałami pierwszorzędowymi i inkubuj, aby przeciwciała mogły związać się z białkami fluorescencyjnymi w astrocytach.

Zmyć nadmiar przeciwciał pierwszorzędowych za pomocą buforu.

Następnie inkubuj sekcję z przeciwciałami drugorzędowymi znakowanymi fluoroforem, które wiążą się z przeciwciałami pierwszorzędowymi.

Niezwiązane przeciwciała drugorzędowe zmyć buforem.

Przenieś sekcję do mieszaniny wody dejonizowanej buforem, aby usunąć pozostałości detergentu.

Umieść sekcję na szkiełku zawierającym wodę dejonizowaną buforem. Usuń nadmiar płynu i dodaj nośnik montażowy. Następnie umieść szkiełko nakrywkowe i zabezpiecz je.

Na koniec użyj mikroskopii konfokalnej, aby uwidocznić znakowane astrocyty fluorescencyjne wyrażające białko w sekcji.

Na początek przygotuj świeży roztwór TBST, dodając 1 mililitr 10% Triton X do 50-mililitrowej probówki i wypełniając probówkę do 50 mililitrów TBS. Przygotuj 2 mililitry roztworów blokujących i przeciwciał dla każdego mózgu, łącząc kozią surowicę i TBST w 15-mililitrowej probówce.

Następnie oznacz 24-dołkową płytkę, aby umieścić różne próbki w różnych rzędach, w różnych roztworach, w różnych kolumnach. Następnie dodaj 1 mililitr TBST do pierwszych trzech kolumn oznaczonych jako "Wash 1", "Wash 2" i "Wash 3" i dodaj 1 mililitr roztworu blokującego do czwartej kolumny.

Przygotuj szklany szpikut, topiąc koniec pipety Pasteura o średnicy 5,75 cala w małym haku za pomocą palnika Bunsena. Następnie przenieś skrawki tkanki z płytki 12-dołkowej do kolumny "Umyj 1" płytki 24-dołkowej za pomocą kilofa. Następnie myj skrawki przez 10 minut każda w myciu 1, 2 i 3 studzienek, używając szklanego kilofa, aby przenieść skrawki z jednej studzienki do drugiej, a następnie inkubować skrawki przez godzinę w roztworze blokującym.

Następnie inkubuj skrawki w przeciwciałie pierwotnym przez dwie do trzech nocy w temperaturze 4 stopni Celsjusza, wstrząsając. Po inkubacji przeciwciał pierwotnych odessać jednego dnia TBST z myjek. Następnie dodaj 1 mililitr nowego TBST do każdej studzienki mycia i przenieś sekcje do pierwszej studzienki mycia.

Następnie inkubuj skrawki w przeciwciałie wtórnym przez trzy godziny w temperaturze pokojowej. Po wtórnej inkubacji przeciwciał odessać dwa TBST z myjki w dniu dziobowym. Następnie dodaj 1 mililitr nowego TBST do każdej studzienki mycia i przenieś sekcje do pierwszej studzienki mycia.

Podczas końcowego prania wyjmij materiał montażowy z 4 stopni Celsjusza i pozwól mu ogrzać się do temperatury pokojowej. Następnie przygotuj mieszaninę TBS 2 do 1 w wodzie dejonizowanej i dodaj ją do szalki Petriego. Następnie przygotuj szkiełko mikroskopowe, dodając na powierzchnię 800 mikrolitrów mieszaniny TBS 2 do 1 w wodzie dejonizowanej.

Przenieść skrawki z dołka "Wash 3" na szalkę Petriego. Następnie, za pomocą cienkiego pędzla, przenieś sekcje pojedynczo z szalki Petriego do płynu na szkiełku. Następnie ostrożnie ułóż sekcje tak, aby leżały płasko na szkiełku za pomocą pędzla. Ostrożnie usunąć nadmiar płynu z szkiełka za pomocą pipety P1000, a następnie zasysać próżniowo.

Po usunięciu całego nadmiaru płynu ze szkiełka należy użyć pipety transferowej, aby natychmiast dodać jedną kroplę podłoża montażowego do każdej sekcji i delikatnie nałożyć szkiełko nakrywkowe na szkiełko. Pozwól nośnikowi montażowemu rozprzestrzenić się przez kilka minut, a następnie usuń nadmiar materiału montażowego, który wydostaje się spod szkiełka nakrywkowego przez zasysanie próżniowe. Następnie uszczelnij wszystkie cztery krawędzie szkiełka nakrywkowego przezroczystym lakierem do paznokci.