Name: Badanie interakcji przestrzennych między astrocytami a neuronami w oczyszczonych mózgach (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-31T14:50:00.000+00:00
Duration: 5 min 17 s
Description: Poznaj metodę CLARITY do badania interakcji przestrzennych między astrocytami a neuronami w hipokampie myszy. Technika ta umożliwia wizualizację ponad 300 komórek w przezroczystych tkankach mózgu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ten projekt otrzymał dofinansowanie od Europejskiej Rady ds. Badań Naukowych (ERC) w ramach programu Unii Europejskiej Horyzont 2020 w zakresie badań i innowacji (umowa grantowa nr 803589), Izraelskiej Fundacji Naukowej (grant ISF nr 1815/18) oraz grantów kanadyjsko-izraelskich (CIHR-ISF, grant nr 2591/18). Dziękujemy Nechamie Novick za skomentowanie całego manuskryptu.

Protokoły eksperymentalne zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Hebrajskiego i spełniały wytyczne Przewodnika Narodowego Instytutu Zdrowia dotyczącego opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych.
1. Transdukcja wektora wirusowego
UWAGA: Transdukcja wektora wirusowego służy do ekspresji fluoroforów w mózgu.
<ol>
	<li>Użyj atlasu (np. atlasu mózgu Allena), aby zlokalizować odpowiednią koordynację obszaru docelowego. 
	UWAGA: Atlasy 3D można znaleźć w Internecie (np. http://connectivity.brain-map.org/3d-viewer).</li>
	<li>Za pomocą chirurgii stereotaktycznej wstrzyknij wektory wirusowe do odpowiedniej struktury mózgu. Zobacz 9, aby zapoznać się ze szczegółowym protokołem.</li>
	<li>Poczekaj 3-6 tygodni na ekspresję fluoroforu. 
	UWAGA: Wystarczy krótki okres czasu, jeśli trzeba oznaczyć tylko ciała komórek. Potrzebny będzie długi okres czasu, jeśli projekcje aksonalne są istotne dla pytania, ponieważ ekspresja fluoroforów w aksonach, które mogą mieć kilka milimetrów długości, trwa dłużej.</li>
	<li>Wcześniej zweryfikuj specyficzność i penetrację ekspresji fluoroforu (zarówno ekspresji wirusa, jak i zwierząt TG) (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1A). Przed przystąpieniem do procedury CLARITY należy wyznaczyć co najmniej jeden mózg dla cienkich plasterków i upewnić się, że ekspresja fluoroforu jest zarówno silna, jak i specyficzna dla cechy komórki docelowej.</li>
</ol>
2. PRZEJRZYSTOŚĆ
UWAGA: Ta metoda sprawia, że mózg staje się przezroczysty w ciągu 2-6 tygodni.
<ol>
	<li>Przeprowadzić perfuzję przezczaszkową u zwierząt przy użyciu zimnej soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), a następnie 4% paraformaldehydu (PFA) w PBS. Wyjąć mózg i przechowywać go przez noc w PFA w temperaturze 4 °C w probówce o pojemności 50 ml lub podobnym pojemniku. 
	UWAGA: Przed wykonaniem perfuzji przezczaszkowej zwierzę musi być głęboko znieczulone. W przykładach przedstawionych w tym protokole wszystkie zwierzęta zostały znieczulone przy użyciu ketaminy i ksylazyny (odpowiednio 90% i 10%).</li>
	<li>Zastąp PFA roztworem hydrożelu (HS; patrz Tabela 1) przez 48 godzin w temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: Na tym etapie nie pozwól, aby materiały stały się cieplejsze niż temperatura chłodzenia (4-8 °C), w przeciwnym razie hydrożel ulegnie polimeryzacji. HS używany w tym protokole zawiera 2% akrylamidu, w przeciwieństwie do poprzednich protokołów sugerujących 4%22 lub 1%17. Korzyść w wysokości 2% jest szczegółowo opisana w sekcji dyskusji. Przygotowując HS, pracuj na lodowatej powierzchni. Przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Odgazowanie 
	UWAGA: Celem tego etapu jest usunięcie całego wolnego tlenu z tkanki, ponieważO2 zakłóca proces polimeryzacji. Można stosować dowolny gaz inny niżO2 (np. N2, CO2 ); Zalecany jest N2.
	<ol>
		<li>PrzenieśN2 ze zbiornika za pomocą elastycznej rurki o średnicy 5 mm (wewnętrznej), podłączonej do igły 19 G na jej końcu (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1B).</li>
		<li>Wykonaj dwa małe otwory (o szerokości igły) w nasadce rurki: jeden do wprowadzenia gazu, a drugi, aby powietrze mogło opuścić rurkę (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1C).</li>
		<li>Przymocuj rurę od gazuN2 do rurki i wymieniaj gazy na około 30 minut w temperaturze pokojowej (RT).</li>
		<li>Zdejmij rurę i natychmiast uszczelnij otwory plasteliną na każdej rurze (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1D).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odgazowane, szczelnie zamknięte probówki przenieść do łaźni o temperaturze 37 °C na 3,5 godziny w celu polimeryzacji HS, który stanie się żelem. Uważaj, aby nie potrząsnąć rurkami (<silna klasa="xfig">Rysunek 1E).</li>
	<li>Wyjmij mózg z probówki i delikatnie usuń spolimeryzowany żel z jego otoczenia za pomocą chusteczek laboratoryjnych. Upewnij się, że żadne resztki żelu nie pozostały przyczepione do powierzchni tkanki, ponieważ mogą one reagować z roztworem w kolejnych krokach, hamując proces oczyszczania tkanek (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1F). 
	UWAGA: Ponieważ żel zawierał PFA, ekstrakcja powinna odbywać się pod wyciągiem.</li>
	<li>Pokrój mózg, jeśli pytanie, które masz pod ręką, wymaga tylko jego części. Podziel go na pół lub na bardzo grube plasterki, które zawierają wszystkie obszary zainteresowania (<silna klasa="xfig">Rysunek 1G).</li>
	<li>Umieścić plastry w pierwszym roztworze czyszczącym (CS1, patrz tabela 2) w nowym pojemniku i wstrząsać z prędkością 70 obr./min przez 24 godziny w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Postępuj zgodnie z krokami opisanymi poniżej, aby przenieść mózg z CS1 do drugiego roztworu oczyszczającego (CS2, patrz Tabela 2).
	<ol>
		<li>Przygotuj wcześniej perforowaną rurkę do mózgu (<silna klasa="xfig">Rysunek 1H).</li>
		<li>Podgrzej CS2 do temperatury 40-45 °C w zlewce wystarczająco dużej, aby pomieścić probówkę. Zrób to na płycie grzejnej za pomocą mieszadła. Upewnij się, że temperatura nie osiąga 55 °C, aby zapobiec bieleniu wyrażonych białek.</li>
		<li>Umieść zlewkę wypełnioną CS2 i perforowaną rurkę na mieszadle (zlewka o pojemności 2 l w <klasa mocna = "xfig" >Rysunek 1I). Ustaw umiarkowaną szybkość mieszania, która spowoduje przepływ płynu bez zniekształcania tkanki. 
		UWAGA: W ciągu 2-6 tygodni tkanka stanie się przezroczysta (proces rozpoczyna się na obrzeżach i przesuwa się do wewnątrz w kierunku centralnych struktur mózgu). Decyzja o tym, kiedy tkanka jest "wystarczająco czysta", zależy od osobistego osądu. Mózg powinien być wystarczająco przezroczysty, aby można go było obrazować pod mikroskopem bez zakłóceń (<silna klasa="xfig">Rysunek 1J nie jest wystarczająco wyraźny; <silna klasa="xfig">Rysunek 1K wystarczająco wyraźny). Przekroczenie punktu, w którym tkanka jest wystarczająco czysta, może spowodować utratę sztywności tkanki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przenieść z CS2 do PBST (0,5% Triton X-100 w PBS, patrz tabela 2) w nowym pojemniku w temperaturze 37 °C z łagodnym wstrząsaniem (70 obr./min) przez 24 h. 
	UWAGA: W PBST tkanka stanie się biaława (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1L). Przejrzystość powróci (i poprawi się) po osadzeniu w roztworze dopasowywania indeksu refrakcji (RIMS, patrz krok 2.14).</li>
	<li>Wymień PBST na nowy PBST. Przechowywać w tych samych warunkach (37 °C z łagodnym wstrząsem) przez kolejne 24 godziny.</li>
	<li>Wymień PBST ponownie na nowy PBST i utrzymuj w RT przez 24 godziny.</li>
	<li>Przejazd do PBS w RT na 24 godziny.</li>
	<li>Wymień PBS i pozostaw w RT na dodatkowe 24 godziny.</li>
	<li>Wyjąć mózg z PBS i przenieść go do RIMS w temperaturze 37 °C przez noc. 
	UWAGA: Początkowo zmarszczki w RIMS mogą otaczać mózg. Protokół ten został zaprojektowany i zweryfikowany przy użyciu dwóch specyficznych komercyjnych RIMS (patrz Tabela 3). Protokół nie powinien się jednak różnić w przypadku korzystania z innych RIM-ów (komercyjnych lub własnej produkcji).</li>
	<li>Utrzymuj tkankę w temperaturze pokojowej przez kolejne 24 godziny lub do momentu, gdy roztwór osiągnie pełną równowagę, tj. gdy tkanka stanie się przezroczysta, a roztwór nie będzie już zawierał żadnych widocznych zmarszczek (<silna klasa="xfig">Rysunek 1M).</li>
	<li>Jeśli tkanka jest przezroczysta, przystąp do przygotowania komory. Jeśli w tym momencie tkanka stanie się biała, a nie przezroczysta (z powodu agregatów resztkowych cząsteczek SDS), należy ponownie oczyścić próbkę, powtarzając kroki 2.9 i 2.10, a następnie przenieść tkankę do CS2 (krok 2.8) na kilka dni, a następnie wszystkie kroki aż do kroku 2.15.</li>
</ol>
3. Przygotowanie komory
UWAGA: Każda próbka wymaga szkiełka z komorą obrazowania, w której próbka zostanie umieszczona.
<ol>
	<li>Umieść próbkę na środku szkiełka.</li>
	<li>Za pomocą pistoletu do klejenia na gorąco utwórz ścianki na krawędziach szkiełka, prawie tak wysokie jak tkanka. Upewnij się, że zostawiłeś niewielką szczelinę (około 5 mm) w jednym z rogów (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A,B).</li>
	<li>Nałóż 1-2 krople RIMS na próbkę, aby utrzymać wilgotność górnej powierzchni i zapobiec tworzeniu się pęcherzyków między szkiełkiem nakrywkowym a tkanką.</li>
	<li>Natychmiast po nałożeniu kropli RIMS dodaj ostatnią warstwę gorącego kleju do ścianek (tak, aby osiągnęły wysokość mózgu/plasterka) i natychmiast przejdź (gdy gorący klej jest jeszcze płynny) do kroku 3.5.</li>
	<li>Uszczelnij wierzch szkiełkiem nakrywkowym, kładąc go tak równomiernie, jak to możliwe, na wierzchu jeszcze ciepłej warstwy gorącego kleju (<silna klasa="xfig">Rysunek 2C).</li>
	<li>Napełnij komorę RIMS przez szczelinę pozostawioną w ściankach gorącego kleju (<silna klasa="xfig">Rysunek 2D,E).</li>
	<li>Zamknij szczelinę gorącym klejem. Nie zostawiaj powietrza w środku (<silna klasa="xfig">Rysunek 2F).</li>
	<li>Jeśli ścianki gorącego kleju wystają poza granice prowadnicy, przytnij krawędzie przedłużające (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 2G).</li>
	<li>Jeśli obiektyw używany do obrazowania jest zanurzony, dodaj kolejne 2-3 mm kleju do ścianek nad szkiełkiem nakrywkowym, aby roztwór zanurzeniowy działał przez dłuższy czas (<silna klasa="xfig">Rysunek 2H).</li>
</ol>
4. Obrazowanie (konfokalne lub dwufotonowe)
<ol>
	<li>Sprawdź, czy stolik może utrzymać komorę, ponieważ grubość komory może sięgać kilku milimetrów. 
	UWAGA: Na przykład mikroskop konfokalny (patrz Tabela materiałów) używany w tym protokole jest wyposażony w kilka stopni (np. okrągły, prostokątny). Niezależnie od tego, który etap zostanie wybrany do utrzymania komory, nie ma znaczenia, o ile jego parametry pasują do rozmiarów komory.</li>
	<li>Pracuj z obiektywem o wystarczającej odległości roboczej, tj. minimalnej odległości roboczej ≥3 mm, ponieważ obszar mózgu będący przedmiotem zainteresowania może mieć głębokość kilku milimetrów, a szkiełko nakrywkowe może nie być całkowicie proste, ponieważ zostało umieszczone ręcznie. 
	UWAGA: W ramach demonstracji, wyniki przedstawione w <silna klasa="xfig">Rysunek 1, Wideo 1 i Wideo 2 uzyskano pod mikroskopem dwufotonowym przy użyciu 16-krotnego obiektywu zanurzonego w wodzie z odległością roboczą 3 mm i powiększeniem 2,4, aby uzyskać pole widzenia 652 x 483 μm i stos z odstępami 0,937 μm między płaszczyznami.</li>
	<li>Wykonaj obrazowanie wieloobszarowe, które może zająć kilka godzin, a nawet dni. Upewnij się, że w komputerze jest wystarczająco dużo wolnego miejsca, ponieważ rozmiar każdego obrazu może sięgać nawet kilkudziesięciu gigabitów. 
	UWAGA: Obrazowanie CLARITY może skutkować znacznie większą ilością głębokich sekcji obrazu. W związku z tym intensywności używane do uchwycenia wyrażenia powinny być stosunkowo niskie, aby zapobiec nadekspresji podczas sumowania obrazu.</li>
	<li>W przypadku obiektywów zanurzeniowych należy rutynowo sprawdzać płyn podczas obrazowania i w razie potrzeby uzupełnić go dodatkowym płynem. 
	UWAGA: Podczas obrazowania danych przedstawionych na Filmie 3, woda była dodawana do powierzchni komory co 6-8 godzin, aby zwalczyć parowanie.</li>
	<li>Po uzyskaniu obrazu przeglądaj go i analizuj za pomocą kilku różnych pakietów oprogramowania. 
	UWAGA: Zalecane oprogramowanie obejmuje Imaris i SyGlass zarówno do wizualizacji, jak i analizy. Precyzyjny proces optymalnej rekonstrukcji astrocytów za pomocą oprogramowania Imaris został opisany wcześniej9. Krótko mówiąc, cechy Imaris użyte w tym badaniu to Filamenty do pełnej rekonstrukcji struktur komórkowych i Spoty do wyodrębnienia pozycji w przestrzeni wszystkich somatów.</li>
</ol>

<ol><li>Perea, G., Navarrete, M., Araque, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tripartite+synapses%3A+astrocytes+process+and+control+synaptic+information%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Tripartite synapses: astrocytes process and control synaptic information.</a> Trends in Neurosciences. 32 (8), 421-431 (2009).</li>
<li>Ciappelloni, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aquaporin-4+surface+trafficking+regulates+astrocytic+process+motility+and+synaptic+activity+in+health+and+autoimmune+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Aquaporin-4 surface trafficking regulates astrocytic process motility and synaptic activity in health and autoimmune disease.</a> Cell Reports. 27 (13), 3860-3872 (2019).</li>
<li>Sylvain, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+trifluoperazine+on+brain+edema%2C+aquaporin-4+expression+and+metabolic+markers+during+the+acute+phase+of+stroke+using+photothrombotic+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta.+Biomembranes%22%5BJournal%5D)">The effects of trifluoperazine on brain edema, aquaporin-4 expression and metabolic markers during the acute phase of stroke using photothrombotic mouse model.</a> Biochimica et Biophysica Acta. Biomembranes. 1863 (5), 183573(2021).</li>
<li>Kitchen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+aquaporin-4+subcellular+localization+to+treat+central+nervous+system+edema%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Targeting aquaporin-4 subcellular localization to treat central nervous system edema.</a> Cell. 181 (4), 784-799 (2020).</li>
<li>Adamsky, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytic+activation+generates+de+novo+neuronal+potentiation+and+memory+enhancement%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Astrocytic activation generates de novo neuronal potentiation and memory enhancement.</a> Cell. 174 (1), 59-71 (2018).</li>
<li>Adamsky, A., Goshen, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes+in+memory+function%3A+pioneering+findings+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Astrocytes in memory function: pioneering findings and future directions.</a> Neuroscience. 370, 14-26 (2018).</li>
<li>Nagai, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behaviorally+consequential+astrocytic+regulation+of+neural+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Behaviorally consequential astrocytic regulation of neural circuits.</a> Neuron. 109 (4), 576-596 (2021).</li>
<li>Clavreul, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+astrocytes+develop+in+a+plastic+manner+at+both+clonal+and+cellular+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Cortical astrocytes develop in a plastic manner at both clonal and cellular levels.</a> Nature Communications. 10 (1), 4884(2019).</li>
<li>Refaeli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Features+of+hippocampal+astrocytic+domains+and+their+spatial+relation+to+excitatory+and+inhibitory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Features of hippocampal astrocytic domains and their spatial relation to excitatory and inhibitory neurons.</a> Glia. 69 (10), 2378-2390 (2021).</li>
<li>Eilam, R., Aharoni, R., Arnon, R., Malach, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocyte+morphology+is+confined+by+cortical+functional+boundaries+in+mammals+ranging+from+mice+to+human%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Astrocyte morphology is confined by cortical functional boundaries in mammals ranging from mice to human.</a> eLife. 5, 15915(2016).</li>
<li>Bushong, E. A., Marton, M. E., Ellisman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maturation+of+astrocyte+morphology+and+the+establishment+of+astrocyte+domains+during+postnatal+hippocampal+development%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Developmental+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Maturation of astrocyte morphology and the establishment of astrocyte domains during postnatal hippocampal development.</a> International Journal of Developmental Neuroscience. 22 (2), 73-86 (2004).</li>
<li>Bushong, E. A., Martone, M. E., Ellisman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Examination+of+the+relationship+between+astrocyte+morphology+and+laminar+boundaries+in+the+molecular+layer+of+adult+dentate+gyrus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Examination of the relationship between astrocyte morphology and laminar boundaries in the molecular layer of adult dentate gyrus.</a> Journal of Comparative Neurology. 462 (2), 241-251 (2003).</li>
<li>Bushong, E. A., Martone, M. E., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protoplasmic+astrocytes+in+CA1+stratum+radiatum+occupy+separate+anatomical+domains%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Protoplasmic astrocytes in CA1 stratum radiatum occupy separate anatomical domains.</a> The Journal of Neuroscience. 22 (1), 183-192 (2002).</li>
<li>Chai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+circuit-specialized+astrocytes%3A+transcriptomic%2C+proteomic%2C+morphological%2C+and+functional+evidence%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Neural circuit-specialized astrocytes: transcriptomic, proteomic, morphological, and functional evidence.</a> Neuron. 95 (3), 531-549 (2017).</li>
<li>Taniguchi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+resource+of+Cre+driver+lines+for+genetic+targeting+of+GABAergic+neurons+in+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A resource of Cre driver lines for genetic targeting of GABAergic neurons in cerebral cortex.</a> Neuron. 71 (6), 995-1013 (2011).</li>
<li>Hippenmeyer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+developmental+switch+in+the+response+of+DRG+neurons+to+ETS+transcription+factor+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">A developmental switch in the response of DRG neurons to ETS transcription factor signaling.</a> PLoS Biology. 3 (5), 159(2005).</li>
<li>Ye, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wiring+and+molecular+features+of+prefrontal+ensembles+representing+distinct+experiences%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Wiring and molecular features of prefrontal ensembles representing distinct experiences.</a> Cell. 165 (7), 1776-1788 (2016).</li>
<li>DeNardo, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+evolution+of+cortical+ensembles+promoting+remote+memory+retrieval%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Temporal evolution of cortical ensembles promoting remote memory retrieval.</a> Nature Neuroscience. 22 (3), 460-469 (2019).</li>
<li>Srinivasan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+transgenic+mouse+lines+for+selectively+targeting+astrocytes+and+studying+calcium+signals+in+astrocyte+processes+in+situ+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">New transgenic mouse lines for selectively targeting astrocytes and studying calcium signals in astrocyte processes in situ and in vivo.</a> Neuron. 92 (6), 1181-1195 (2016).</li>
<li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).</li>
<li>Ye, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wiring+and+molecular+features+of+prefrontal+ensembles+representing+distinct+experiences%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Wiring and molecular features of prefrontal ensembles representing distinct experiences.</a> Cell. 165 (7), 1776-1788 (2016).</li>
<li>Chung, K., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CLARITY+for+mapping+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">CLARITY for mapping the nervous system.</a> Nature Methods. 10 (6), 508-513 (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Metody oczyszczania tkanek stanowią rewolucyjne narzędzie w badaniach nad mózgiem, zachęcając do zadawania pytań, które wcześniej nie mogły zostać zadane. Skupiając się na właściwościach niewielkiej grupy komórek, pojedynczej komórki, a nawet pojedynczej synapsy, projekt CLARITY umożliwia teraz skupienie się na całkowitej populacji komórek lub cechach łączności dalekiego zasięgu przy użyciu odpowiednich fluoroforów.
Wynik połączenia ekspresji fluoroforu i procedury CLARITY nie jest binarny; Wi...

W ostatnich latach wiedza na temat funkcji astrocytów i ich interakcji z obwodami neuronalnymi znacznie wzrosła. Astrocyty mogą wpływać na plastyczność1,2, wspomagać regenerację neuronów po urazie3,4, a nawet indukować de novo wzmocnienie neuronów, przy czym ostatnie badania wykazały znaczenie astrocytów w nabywaniu pamięci i nagrodzie, wcześniej uważanych za funkcje czysto neuronalne5,6,7. Cechą szczególnie interesującą w badaniach nad astrocytami jest przestrzenne rozmieszczenie komórek, które utrzymują unikalną organizację przestrzenną w hipokampie i innych strukturach mózgu8,9,10. W przeciwieństwie do dendrytów neuronalnych, które przeplatają się między somatami komórkowymi, astrocyty hipokampa zamieszkują wizualnie rozróżnialne terytoria z niewielkim nakładaniem się ich procesów, tworząc odrębne domeny8,11,12,13. Dowody potwierdzające udział astrocytów w obwodach neuronalnych nie potwierdzają braku szczegółowego opisu anatomicznego takich populacji i neuronów w ich domenach14.
Procedury transdukcji wektorów wirusowych, wraz ze zwierzętami transgenicznymi (TG), zostały spopularyzowane jako zestaw narzędzi do badania struktur, funkcji i interakcji między komórkami mózgu15,16. Wykorzystanie różnych promotorów pozwala na celowanie w określone komórki zgodnie z ich właściwościami genetycznymi, poziomami aktywacji17,18 lub celami projekcji. Różne wirusy mogą wyrażać różnokolorowe fluorofory w różnych populacjach. Wirus może być łączony z endogenną ekspresją fluoroforów w TG lub zwierzęta TG mogą być używane bez potrzeby stosowania wirusów. Techniki te są szeroko stosowane do znakowania neuronów, a niektóre laboratoria zaczęły ich używać z modyfikacjami wyspecjalizowanymi w celowaniu w inne typy komórek, takie jak astrocyty5,9,19.
Technika CLARITY, po raz pierwszy opisana w 2013 roku20,21, umożliwia badanie grubych warstw mózgu, czyniąc cały mózg przezroczystym, pozostawiając nienaruszone mikroskopijne struktury. Dzięki połączeniu tych dwóch metod – transdukcji wektora wirusowego i oczyszczania tkanek – dostępna jest obecnie możliwość badania interakcji przestrzennych między różnymi populacjami typów komórek. Większość badań interakcji astrocytów-neuronów przeprowadzono na cienkich wycinkach mózgu, co dało obrazy niekompletnych astrocytów ze względu na ich duże domeny, co radykalnie ograniczyło liczbę analizowanych komórek. Zastosowanie techniki CLARITY pozwala na jednoczesną charakterystykę populacji komórek w dużych objętościach w rozdzielczości pojedynczej komórki. Obrazowanie fluorescencyjnie znakowanych populacji komórek w czystych mózgach nie zapewnia rozdzielczości synaptycznej, ale pozwala na dokładne scharakteryzowanie interakcji przestrzennych między astrocytami a różnymi typami komórek neuronalnych.
Z tego powodu wykorzystaliśmy te najnowocześniejsze techniki do zbadania właściwości astrocytów w całym grzbietowym CA1, obrazując wszystkie blaszki (Stratum Radiatum, warstwa piramidalna i Stratum Oriens). Zmierzyliśmy dziesiątki tysięcy astrocytów (z penetracją wirusa >96%5), analizując w ten sposób informacje o całej populacji astrocytów wokół CA1. Dzięki efektywnej penetracji markerów neuronalnych mogliśmy zarejestrować interakcje między całą populacją astrocytów CA1 a czterema typami komórek neuronalnych - parwalbuminą (PV), somatostatyną (SST), neuronami hamującymi VIP i pobudzającymi komórkami piramidowymi9.
Kilka eksperymentów zostało przeprowadzonych przy użyciu kombinacji fluorescencji zwierząt TG i różnokolorowych wektorów wirusowych (wszystkie komórki hamujące), podczas gdy inne (pobudzające) wykorzystywały dwa wektory wirusowe wyrażające różne fluorofory pod różnymi promotorami9. W artykule przedstawiono szczegółowy protokół, w tym znakowanie pożądanych komórek w mózgu, uczynienie mózgu przezroczystym za pomocą zmodyfikowanej procedury CLARITY, a także obrazowanie i analizowanie całych struktur mózgu przy użyciu różnych procedur i oprogramowania.

<table><tbody><tr><td>AAV1-GFAP::TdTomato</td><td>ELSC Vector Core Facility (EVCF)</td><td></td><td>wektor wirusowy używany do wykrywania astrocytów</td></tr><tr><td>AAV5-CaMKII::eGFP</td><td>ELSC Vector Core Facility (EVCF)</td><td></td><td>wektor wirusowy używany do wykrywania neuronów</td></tr><tr><td>AAV5-CaMKII::H2B-eGFP</td><td>ELSC Vector Core Facility (EVCF)</td><td></td><td>wektor wirusowy używany do wykrywania jąder neuronalnych</td></tr><tr><td>AAV5-CaMKII::TdTomato</td><td>ELSC Vector Core Facility (EVCF)</td><td></td> wektor <td>wirusowy używany do wykrywania neuronów</td></tr><tr><td>Akrylamid (40%)</td><td>Bio-rad</td><td>#161-0140</td><td></td></tr><tr><td>Bisakryloamid (2%)</td><td>Bio-rad</td><td>#161-0142</td><td></td></tr><tr><td>Kwas borowy</td><td>Sigma</td><td>#B7901</td><td>Masa cząsteczkowa - 61,83 g/mol</td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny, skanowanie, Obiektyw FV1000</td><td>Olympus</td><td></td><td>4x (UPlanSApo, 0,16 NA)</td></tr><tr><td>Oprogramowanie</td> <td>ImarisBitplane, Wielka Brytania</td><td></td><td>Oprogramowanie umożliwiające analizę 3D obrazów</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma</td><td>#S5881</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PFA 4%</td><td>EMS#</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>RapiClear</td><td>SunJin lab</td><td>#RC147002</td><td></td></tr><tr><td>RapiClear CS</td><td>SunJin lab</td><td>#RCCS002</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma</td><td>#L3771</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie</td><td></td><td></td> SyGlass <td>Oprogramowanie umożliwiające analizę 3D obrazów z wykorzystaniem wirtualnej rzeczywistości</td></tr><tr><td>Tris base 1 M</td><td>Bio-rad</td><td>#002009239100</td><td>Masa cząsteczkowa - 121,14 g/mol</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>ChemCruz</td><td>#sc-29112A</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop dwufotonowy</td><td>Neurolabware</td><td></td><td>Laser Ti:szafirowy (Chameleon Discovery TPC, Coherent), lampy fotopowielacza GaAsP (Hamamatsu, H10770-40), filtr pasmowo-przepustowy (Semrock), obiektyw zanurzeniowy 16x (Nikon, 0,8 NA)&nbsp;</td></tr><tr><td>VA-044 Inicjator</td><td>Wako</td><td>#011-19365</td><td></td></tr></tbody></table>

badanie interakcji przestrzennych między astrocytami a neuronami w oczyszczonych mózgach

Investigation of Spatial Interaction Between Astrocytes and Neurons in Cleared Brains

Połączenie transdukcji wektora wirusowego i oczyszczania tkanek za pomocą metody CLARITY umożliwia jednoczesne badanie kilku typów komórek mózgowych i ich interakcji. Transdukcja wektorów wirusowych umożliwia znakowanie różnych typów komórek w różnych kolorach fluorescencji w tej samej tkance. Komórki można zidentyfikować genetycznie na podstawie aktywności lub projekcji. Korzystając ze zmodyfikowanego protokołu CLARITY, potencjalna wielkość próbki astrocytów i neuronów wzrosła o 2-3 rzędy wielkości. Zastosowanie CLARITY pozwala na obrazowanie całych astrocytów, które są zbyt duże, aby zmieścić się w całości w plasterkach, oraz na badanie somatów wraz ze wszystkimi ich procesami. Ponadto daje możliwość zbadania interakcji przestrzennej między astrocytami a różnymi typami komórek neuronalnych, a mianowicie liczby neuronów piramidowych w każdej domenie astrocytarnej lub bliskości między astrocytami a określonymi populacjami neuronów hamujących. W niniejszym artykule szczegółowo opisano, w jaki sposób metody te mają być stosowane.

Skuteczne oczyszczanie grubych skrawków tkanki mózgowej otwiera możliwość zadania nowego zakresu pytań dotyczących właściwości dużych populacji komórek, w przeciwieństwie do właściwości pojedynczych komórek lub sąsiadujących grup komórek. Aby osiągnąć pomyślne rezultaty, należy ściśle przestrzegać protokołu CLARITY, ponieważ istnieje szeroki zakres parametrów, które muszą zostać uwzględnione w celu zmniejszenia zmienności między próbkami (np. procent oczyszczenia, informacje o fluorescencji, parametry obrzęku).
<p cl...

Połączenie transdukcji wektora wirusowego i oczyszczania mózgu za pomocą metody CLARITY pozwala na badanie dużej liczby neuronów i astrocytów jednocześnie.

Badanie interakcji przestrzennych między astrocytami a neuronami w oczyszczonych mózgach

Combining viral vector transduction and tissue clearing using the CLARITY method makes it possible to simultaneously investigate several types of brain ...

Technika klarowności opisana po raz pierwszy w 2013 roku to technika oczyszczania tkanek, która umożliwia pobieranie próbek większych ilości komórek, naczyń krwionośnych, a więc nawet białek, takich jak rozdzielczość pojedynczej komórki w grubych wycinkach mózgu. Technika ta umożliwia badanie nienaruszonych mikroskopijnych struktur poprzez uczynienie całego mózgu przezroczystym. Ten protokół jest prostym chipem i prostym rurociągiem do czyszczenia tkanki.Technika ta może być stosowana do oczyszczania tkanek w innych układach oprócz tkanek mózgowych. Aby rozpocząć, uszczelnij rurkę i nakrętkę za pomocą parafilmu i przebij dwa otwory w nasadce. Następnie przenieś gazowy azot ze zbiornika za pomocą elastycznej rurki o średnicy wewnętrznej pięciu milimetrów i igły o średnicy 19 podłączonej na jej końcu.Odgazowanie należy rozpocząć od przymocowania rurki do rurki i pozostawienia wymiany gazowej przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Odłącz rurę i natychmiast uszczelnij otwory modeliną. Następnie przenieś zamknięte probówki odgazowujące do kąpieli o temperaturze 37 stopni Celsjusza na 3 1/2 godziny w celu polimeryzacji roztworu hydrożelu.Wyjmij mózg z rurki. Za pomocą chusteczek laboratoryjnych usuń spolimeryzowany hydrożel wokół mózgu, upewniając się, że żadne resztki żelu nie pozostały przyczepione do powierzchni mózgu. Podziel mózg na grube plasterki, które zawierają wszystkie obszary zainteresowania.Umieść plastry w pierwszym roztworze klarującym i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza z rotacją przy 70 obr./min przez 24 godziny. W międzyczasie przygotuj perforowaną rurkę, w której umieścisz mózg. Umieścić perforowaną rurkę w zlewce wypełnionej drugim roztworem czyszczącym na mieszadle.Następnie umieść mózg w zlewce i uszczelnij go folią aluminiową, aby zapobiec bieleniu. Po tym, jak tkanka stanie się przezroczysta, przenieś mózg do PBST w inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza z rotacją z prędkością 70 obr./min przez 24 godziny. Zastąp roztwór świeżym PBST i kontynuuj inkubację przez kolejne 24 godziny.Następnie przenieś mózg do PBS w temperaturze pokojowej na 24 godziny. Po 24 godzinach wyjmij mózg z PBS i przenieś go do roztworu dopasowującego współczynnik załamania światła. Inkubuj mózg w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc.Najpierw umieść próbkę na środku szkiełka. Za pomocą gorącego kleju utwórz ścianki na krawędziach zjeżdżalni, prawie tak wysokie jak tkanka. Upewnij się, że zostawiłeś niewielką szczelinę w jednym z rogów.Gdy gorąca warstwa kleju zbliża się do wysokości wycinka mózgu, nałóż jedną lub dwie krople roztworu dopasowującego współczynnik załamania światła na próbkę, aby zwilżyć górną powierzchnię i zapobiec tworzeniu się pęcherzyków. Gdy gorący klej jest jeszcze płynny, uszczelnij górę szkiełkiem nakrywkowym, układając ją tak równomiernie, jak to możliwe, a następnie napełnij komorę roztworem dopasowującym współczynnik załamania światła. Zamknij szczelinę gorącym klejem.Jeśli ścianki gorącego kleju wystają poza granice prowadnicy, przytnij krawędzie przedłużające. Jeśli do obrazowania używany jest obiektyw zanurzeniowy w oleju, dodaj kolejne dwa do trzech milimetrów kleju do ścianek nad szkiełkiem nakrywkowym, aby zachować roztwór zanurzeniowy. Po tym protokole tkanka mózgowa zostanie oczyszczona.Przezroczyste wycinki mózgu przygotowano przy użyciu tego protokołu do wizualizacji populacji astrocytów i neuronów w regionie CA1 hipokampa myszy. Wszystkie astrocyty wykazywały ekspresję tdPomidor i neurony pobudzające wyrażały H2B-GFP w swoich jądrach. Komora przygotowana na oczyszczoną tkankę była optymalna do obrazowania pod mikroskopem dwufotonowym lub konfokalnym.Za pomocą mikroskopu dwufotonowego zaobserwowano ponad 300 astrocytów w oczyszczonym odcinku regionu CA1 hipokampa myszy. Astrocyty hipokampa w komórkach czerwonych i piramidalnych, somaty w kolorze zielonym były widoczne i stanowiły grubą, przezroczystą tkankę reprezentującą przestrzenną bliskość między tymi dwoma typami komórek. Za pomocą skaningowego laserowego mikroskopu konfokalnego prześledzono wiązki aksonalne z neuronów pobudzających na całej półkuli.Zielone wiązki były śledzone od grzbietowego hipokampa w kierunku ciał super sutkowych. Czerwone wiązki zostały prześledzone od ciał sutkowych w kierunku ich początku w hipokampie wentylacyjnym. Czynniki takie jak temperatura, stężenia i czas inkubacji wpłynęły na wynik procedury klarowności.Dlatego precyzja na każdym etapie protokołu ma kluczowe znaczenie dla powodzenia w uzyskaniu czystej tkanki. Za pomocą tej techniki mierzymy odległości między neuronami i astrocytami w kilku strukturach mózgu. Protokół ten pozwolił na analizę od dwóch do trzech rzędów wielkości więcej komórek niż w poprzednich badaniach.

investigation-spatial-interaction-between-astrocytes-neurons-cleared

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Niniejsze badanie opisuje procedury tworzenia nowatorskiej platformy do kokultury aksonów neuronalnych i (astro)gleju. W tym systemie kokultury możliwa staje się manipulacja bezpośrednią interakcją między pojedynczym aksonem (i pojedynczą komórką glejową), co pozwala na analizę mechanistyczną wzajemnego sygnalizowania między neuronem a glejem.

Analiza obrazowa oddziaływań neuronów z glejem w systemie kokultury aksonów neuronowych i gleju opartym na mikrofluidycznej platformie hodowlanej (MCP)

Ten film ilustruje metodę ustanawiania pośredniej kokultury neuronów i astrocytów przy użyciu podejścia opartego na podziałach. W tej konfiguracji neurony i astrocyty są przestrzennie oddzielone, ale mają wspólne uwarunkowane podłoże. Czynniki neurotroficzne uwalniane przez astrocyty sprzyjają różnicowaniu neuronów i tworzeniu połączeń synaptycznych, co sugeruje interakcje neuron-glej.

Technika pośredniej kohodowli neuronów i astrocytów do badania interakcji neuron-glej

Źródło: Refaeli, R., i wsp., Badanie interakcji przestrzennej między astrocytami a neuronami w oczyszczonych mózgach. J. Vis. Exp. (2022) Film przedstawia przygotowanie komora i neuroobrazowanie oczyszczonej tkanki hipokampa myszy przy użyciu mikroskopii dwufotonowej w celu wizualizacji interakcji przestrzennych między fluorescencyjnie znakowanymi astrocytami a neuronami pobudzającymi.

Mikroskopia dwufotonowa astrocytów i neuronów pobudzających w oczyszczonej tkance hipokampa myszy

Astrocyty w OUN zmieniają swoje właściwości funkcjonalne i strukturalne w odpowiedzi na szkodliwe bodźce. W artykule przedstawiono protokół oceny trójwymiarowej morfologii astrocytów w stanach chorobowych lub po interwencjach terapeutycznych.

Protokół trójwymiarowej konfokalnej analizy morfometrycznej astrocytów

Ten protokół opisuje pośrednią kokulturę neuron-astrocyt do analizy interakcji neuron-glej.

Test pośredniej kokultury neuron-astrocyty: zestaw in vitro do szczegółowego badania interakcji neuron-glej

Prezentujemy rozwój samoorganizujących się, trójwymiarowych wiązek podłużnie wyrównanych somatów astrocytarnych i procesów w nowej obudowie z biomateriału. Te zaprojektowane "żywe rusztowania", wykazujące średnicę w skali mikronów, a jednocześnie wydłużające się na centymetry, mogą służyć jako stanowiska testowe do badania mechanizmów neurorozwojowych lub ułatwiać neuroregenerację poprzez kierowanie migracją neuronów i/lub odnajdywaniem ścieżek aksonalnych.

Trójwymiarowe, wyrównane sieci astrocytów oparte na inżynierii tkankowej w celu podsumowania mechanizmów rozwojowych i ułatwienia regeneracji układu nerwowego

Tutaj prezentujemy protokół do oceny organizacji sieci astrocytowych. Opisana metoda minimalizuje odchylenie, aby zapewnić opisowe pomiary tych sieci, takie jak liczba komórek, rozmiar, obszar i położenie w jądrze. Anizotropię ocenia się za pomocą analizy wektorowej.

Analiza rozmiaru, kształtu i kierunkowości sieci sprzężonych astrocytów

Opisany potok jest przeznaczony do segmentacji zestawów danych mikroskopii elektronowej większych niż gigabajty, w celu wyodrębnienia morfologii całych komórek. Po zrekonstruowaniu komórek w 3D, dostosowane do indywidualnych potrzeb oprogramowanie może być wykorzystane do przeprowadzenia analizy jakościowej i ilościowej bezpośrednio w 3D, wykorzystując również rzeczywistość wirtualną do pokonania okluzji widoku.

Metoda rekonstrukcji 3D i analizy w wirtualnej rzeczywistości komórek glejowych i neuronalnych

Tutaj opisujemy metodę obrazowania na żywo in vitro, która umożliwia wizualizację wewnątrzkomórkowego transportu organelli i transportu białek błony komórkowej w mysich astrocytach. W protokole tym przedstawiono również metodologię analizy obrazu w celu wyznaczenia tras transportu i kinetyki transportu ładunków.

Wizualizacja i analiza transportu wewnątrzkomórkowego organelli i innych ładunków w astrocytach

Ten protokół opisuje metody cięcia, barwienia i obrazowania swobodnie unoszących się fragmentów tkanki mózgu myszy, a następnie szczegółowy opis analizy objętości terytorium astrocytów i nakładania się lub kafelkowania.

Analiza objętości terytorium astrocytów i kafelkowania w grubych, swobodnie pływających skrawkach tkanek

Poznaj metodę CLARITY do badania interakcji przestrzennych między astrocytami a neuronami w hipokampie myszy. Technika ta umożliwia wizualizację ponad 300 komórek w przezroczystych tkankach mózgu.

Badanie interakcji przestrzennych między astrocytami a neuronami w oczyszczonych mózgach

Przeglądaj więcej filmów