Badanie interakcji przestrzennych między astrocytami a neuronami w oczyszczonych mózgach
31 marca 2022
Połączenie transdukcji wektora wirusowego i oczyszczania mózgu za pomocą metody CLARITY pozwala na badanie dużej liczby neuronów i astrocytów jednocześnie.
Technika klarowności opisana po raz pierwszy w 2013 roku to technika oczyszczania tkanek, która umożliwia pobieranie próbek większych ilości komórek, naczyń krwionośnych, a więc nawet białek, takich jak rozdzielczość pojedynczej komórki w grubych wycinkach mózgu. Technika ta umożliwia badanie nienaruszonych mikroskopijnych struktur poprzez uczynienie całego mózgu przezroczystym. Ten protokół jest prostym chipem i prostym rurociągiem do czyszczenia tkanki.
Technika ta może być stosowana do oczyszczania tkanek w innych układach oprócz tkanek mózgowych. Aby rozpocząć, uszczelnij rurkę i nakrętkę za pomocą parafilmu i przebij dwa otwory w nasadce. Następnie przenieś gazowy azot ze zbiornika za pomocą elastycznej rurki o średnicy wewnętrznej pięciu milimetrów i igły o średnicy 19 podłączonej na jej końcu.
Odgazowanie należy rozpocząć od przymocowania rurki do rurki i pozostawienia wymiany gazowej przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Odłącz rurę i natychmiast uszczelnij otwory modeliną. Następnie przenieś zamknięte probówki odgazowujące do kąpieli o temperaturze 37 stopni Celsjusza na 3 1/2 godziny w celu polimeryzacji roztworu hydrożelu.
Wyjmij mózg z rurki. Za pomocą chusteczek laboratoryjnych usuń spolimeryzowany hydrożel wokół mózgu, upewniając się, że żadne resztki żelu nie pozostały przyczepione do powierzchni mózgu. Podziel mózg na grube plasterki, które zawierają wszystkie obszary zainteresowania.
Umieść plastry w pierwszym roztworze klarującym i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza z rotacją przy 70 obr./min przez 24 godziny. W międzyczasie przygotuj perforowaną rurkę, w której umieścisz mózg. Umieścić perforowaną rurkę w zlewce wypełnionej drugim roztworem czyszczącym na mieszadle.
Następnie umieść mózg w zlewce i uszczelnij go folią aluminiową, aby zapobiec bieleniu. Po tym, jak tkanka stanie się przezroczysta, przenieś mózg do PBST w inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza z rotacją z prędkością 70 obr./min przez 24 godziny. Zastąp roztwór świeżym PBST i kontynuuj inkubację przez kolejne 24 godziny.
Następnie przenieś mózg do PBS w temperaturze pokojowej na 24 godziny. Po 24 godzinach wyjmij mózg z PBS i przenieś go do roztworu dopasowującego współczynnik załamania światła. Inkubuj mózg w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc.
Najpierw umieść próbkę na środku szkiełka. Za pomocą gorącego kleju utwórz ścianki na krawędziach zjeżdżalni, prawie tak wysokie jak tkanka. Upewnij się, że zostawiłeś niewielką szczelinę w jednym z rogów.
Gdy gorąca warstwa kleju zbliża się do wysokości wycinka mózgu, nałóż jedną lub dwie krople roztworu dopasowującego współczynnik załamania światła na próbkę, aby zwilżyć górną powierzchnię i zapobiec tworzeniu się pęcherzyków. Gdy gorący klej jest jeszcze płynny, uszczelnij górę szkiełkiem nakrywkowym, układając ją tak równomiernie, jak to możliwe, a następnie napełnij komorę roztworem dopasowującym współczynnik załamania światła. Zamknij szczelinę gorącym klejem.
Jeśli ścianki gorącego kleju wystają poza granice prowadnicy, przytnij krawędzie przedłużające. Jeśli do obrazowania używany jest obiektyw zanurzeniowy w oleju, dodaj kolejne dwa do trzech milimetrów kleju do ścianek nad szkiełkiem nakrywkowym, aby zachować roztwór zanurzeniowy. Po tym protokole tkanka mózgowa zostanie oczyszczona.
Przezroczyste wycinki mózgu przygotowano przy użyciu tego protokołu do wizualizacji populacji astrocytów i neuronów w regionie CA1 hipokampa myszy. Wszystkie astrocyty wykazywały ekspresję tdPomidor i neurony pobudzające wyrażały H2B-GFP w swoich jądrach. Komora przygotowana na oczyszczoną tkankę była optymalna do obrazowania pod mikroskopem dwufotonowym lub konfokalnym.
Za pomocą mikroskopu dwufotonowego zaobserwowano ponad 300 astrocytów w oczyszczonym odcinku regionu CA1 hipokampa myszy. Astrocyty hipokampa w komórkach czerwonych i piramidalnych, somaty w kolorze zielonym były widoczne i stanowiły grubą, przezroczystą tkankę reprezentującą przestrzenną bliskość między tymi dwoma typami komórek. Za pomocą skaningowego laserowego mikroskopu konfokalnego prześledzono wiązki aksonalne z neuronów pobudzających na całej półkuli.
Zielone wiązki były śledzone od grzbietowego hipokampa w kierunku ciał super sutkowych. Czerwone wiązki zostały prześledzone od ciał sutkowych w kierunku ich początku w hipokampie wentylacyjnym. Czynniki takie jak temperatura, stężenia i czas inkubacji wpłynęły na wynik procedury klarowności.
Dlatego precyzja na każdym etapie protokołu ma kluczowe znaczenie dla powodzenia w uzyskaniu czystej tkanki. Za pomocą tej techniki mierzymy odległości między neuronami i astrocytami w kilku strukturach mózgu. Protokół ten pozwolił na analizę od dwóch do trzech rzędów wielkości więcej komórek niż w poprzednich badaniach.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie wykorzystuje metodę CLARITY w połączeniu z transdukcją wektorów wirusowych w celu zbadania przestrzennych relacji między neuronami a astrocytami w hipokampie myszy. Dzięki uczynieniu tkanki przezroczystej, ta technika umożliwia badaczom zbadanie większej liczby komórek, ujawniając wgląd w organizację komórkową i interakcje.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Neuronauki
- Techniki klarowania tkanek
- Obrazowanie komórkowe
Tło
- Technika CLARITY umożliwia wizualizację tkanki mózgowej na poziomie komórkowym.
- Pozwola na analizę dużych populacji neuronów i astrocytów w nietkniętych tkankach.
- Ta metoda poprawia jasność grubych przekrojów mózgu w porównaniu z tradycyjnymi metodami obrazowania.
- Badanie podkreśla rolę przezroczystości tkanki w zrozumieniu architektury neuronów.
Cel badania
- Zbadanie strukturalnych relacji między astrocytami a neuronami w hipokampie myszy.
- Pomiar odległości między różnymi typami komórek w różnych strukturach mózgu.
- Demonstracja skuteczności metody CLARITY w obrazowaniu komórkowym.
Stosowane metody
- Badanie wykorzystało technikę CLARITY do klarowania tkanki w przekrojach mózgu.
- Tkanka hipokampu myszy została wykorzystana do wizualizowania astrocytów i neuronów pobudzających.
- Nie wymieniono żadnych przepływów multiomics.
- Kluczowe kroki obejmowały odgazowywanie, polimeryzację hydrożelu i inkubację w roztworach klarujących.
- Tkanka była obrazowana za pomocą mikroskopii dwufotonowej i konfokalnej.
Główne wyniki
- W przeczyszczonych sekcjach hipokampu zwizualizowano ponad 300 astrocytów.
- Ustalono kontekst przestrzenny astrocytów i neuronów pobudzających, pokazując ich bliskość.
- Zostały zaobserwowane znaczące wiązki aksonowe między populacjami neuronów w klarowanych tkankach.
- Różne czynniki wpływały na jasność tkanek, podkreślając potrzebę precyzyjnej metodologii.
Wnioski
- To badanie pokazuje, że metoda CLARITY może znacząco poprawić wizualizację relacji komórkowych w mózgu.
- Wyniki umożliwiają lepsze zrozumienie przestrzennej organizacji neuronów i komórek glejowych.
- Wgląd uzyskanym z tej metody może mieć zastosowanie w badaniach nad mechanizmami neuronów i potencjalnymi modelach chorobowych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
High-resolution mapping of astrocyte-neuron spatial interactions in intact brain tissue addresses a critical gap in early CNS target validation and mechanistic de-risking. The integration of viral vector labeling with CLARITY tissue clearing enables quantitative, large-scale analysis of cellular domains, supporting predictive confidence in neurobiological discovery. This capability enhances portfolio triage by providing robust, scalable data on cell-type interactions relevant to disease modeling and target prioritization.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables quantitative interrogation of astrocyte-neuron spatial relationships in disease-relevant brain regions.
- Supports mechanistic de-risking by clarifying cellular domain boundaries and proximity metrics.
- Facilitates functional target validation through genetically defined cell-type labeling and imaging.
- Provides high-content data for predictive confidence in CNS target selection.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, intact brain tissue systems for downstream imaging-based assays.
- Standardizes sample preparation for reproducible, quantitative spatial measurements.
- Enables scalable imaging of hundreds to thousands of cells per sample for robust screening.
- Supports assay development for compound evaluation targeting neuron-glia interactions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns spatial mapping outputs with disease-relevant CNS models for translational continuity.
- Enables risk-adjusted advancement by providing quantitative benchmarks for cell-type interactions.
- Supports biomarker discovery through high-resolution mapping of cellular domains.
- Facilitates continuity from discovery through preclinical validation in neurobiology portfolios.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling high-content spatial analysis of genetically defined brain cell populations.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on astrocyte-neuron interactions and clarifies mechanistic pathways in CNS tissue.
- Screening: Provides reproducible, quantitative spatial readouts for assay readiness and compound screening.
- Analytics: Delivers cell proximity and domain occupancy metrics for comparative analysis across experimental conditions.
- Translational Research: Connects spatial mapping data to disease models and biomarker strategies when supported by the system.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, reusable workflow for CNS tissue clearing and imaging across multiple programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in CNS target validation.
- Operational Value: Standardizes tissue clearing and imaging for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling robust, quantitative data generation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of neurobiological assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in viral vector transduction, tissue clearing, and advanced microscopy.
- Demands access to two-photon or confocal imaging platforms and analytical infrastructure.
- Necessitates strict protocol standardization for cross-team reproducibility.
- Adaptation may be needed for different brain regions or model systems.
- Protocol precision is critical; temperature, reagent concentrations, and timing directly affect data quality.
