Izogeniczny chip kłębuszków nerkowych zaprojektowany z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

Izogeniczny chip kłębuszków nerkowych umożliwi modelowanie chorób specyficznych dla pacjenta i badanie nefrotoksyczności oraz zaawansowane zastosowania w medycynie precyzyjnej. Nabłonek i śródbłonek kłębuszków nerkowych pochodzą z pojedynczej populacji pluripotencjalnych komórek macierzystych indukowanych przez człowieka lub IPSC. IPSC mają nieograniczoną zdolność do samoodnawiania się i mogą różnicować się w prawie każdy typ komórek.

Technika ta może być stosowana do oceny patologicznych fenotypów komórkowych i chorób. Specyficzny dla pacjenta chip narządowy może również służyć jako platforma do badań przesiewowych leków i badań mechanistycznych. Model ten można zastosować do opracowania ciała na chipie systemu spersonalizowanego dla konkretnego pacjenta.

System ten może być w stanie przewidywać specyficzne reakcje pacjenta przed rozpoczęciem badań klinicznych. Zacznij od delikatnego dodania 25 mikrolitrów roztworu macierzy błony podstawnej 2 do kanału moczowego i 20 mikrolitrów do kanału kapilarnego chipa. Weź dwie sterylne 15-mililitrowe stożkowe nakrętki probówek i napełnij je 500 mikrolitrami sterylnej wody destylowanej.

Umieść nakrętkę na szalce Petriego, aby zapobiec wysuszeniu i umieść pokrywkę na naczyniu. Inkubuj go w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc. Kontynuując, odessać pożywkę z kolb T75 zawierających 15-dniową hodowlę komórek śródbłonka naczyń krwionośnych przy 90% zbieganiu.

Dodać pięć mililitrów buforu do odłączania komórek i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć do siedmiu minut. Następnie przenieś komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów i dodaj pięć mililitrów DMEM/F-12. Wirować 200 razy G przez pięć minut.

Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w 300 mikrolitrach pożywki do konserwacji śródbłonka. Policz komórki za pomocą hemocytometru, aby uzyskać około 2 milionów komórek. Za pomocą końcówki barierowej P200 przepłucz zarówno górny, jak i dolny kanał chipa mikroprzepływowego 200 mikrolitrami DMEM/F-12, jednocześnie zasysając z obrzeża wylotu.

Trzymaj chip mocno z końcówką bariery P200 przymocowaną do aspiratora z dala od wylotu dolnego kanału. Mocno wstrzyknąć 20 mikrolitrów zawiesiny komórek śródbłonka naczyń krwionośnych do kanału kapilarnego chipa i ostrożnie zassać pożywkę z obrzeża wylotu. Sprawdź pod mikroskopem, czy nie ma pęcherzyków lub nierównomiernej gęstości wysiewu.

Delikatnie odwróć chip, aby komórki mogły przylegać do podstawowej strony elastycznej błony PDMS. Umieść chip we wkładzie uchwytu i dodaj trzy mililitry PBS do wkładu, aby zapobiec wyschnięciu membrany. Inkubuj chip w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy godziny.

Sprawdź dolny kanał pod mikroskopem pod kątem zlewającej się warstwy komórek przyczepionych do elastycznej membrany PDMS. Umyj nieprzyłączone komórki, dodając 200 mikrolitrów pożywki do konserwacji śródbłonka na wlocie dolnego kanału, zasysając od obwodu wylotu kanału kapilarnego. Umieść chip z powrotem we wkładzie utrwalacza i inkubuj przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Następnego dnia delikatnie przepłucz kanał kapilarny 200 mikrolitrami pożywki do konserwacji śródbłonka. Przepłucz kanał moczowy 200 mikrolitrami DMEM/F-12 i upuść 50 mikrolitrów DMEM/F-12 na porty wlotowe i wylotowe. Postępując z pośrednimi komórkami mezodermy, zastąp pośrednią pożywkę indukcyjną mezodermy z każdej studzienki 12-dołkowej płytki jednym mililitrem trypsyny EDTA i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut.

Delikatnie zeskrobać komórki za pomocą podnośnika do komórek i rozdzielić komórki za pomocą pipetowania. Dodaj dwa mililitry roztworu neutralizującego trypsynę do każdej studzienki i przenieś komórki do stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów. Uzupełnić objętość zawiesiny komórek do 50 mililitrów za pomocą DMEM/F-12 i odwirować w temperaturze 200 razy G przez pięć minut.

Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w 500 mikrolitrach pożywki do indukcji mezodermy, aby uzyskać około 3 miliony komórek. Policz komórki za pomocą hemocytometru. Przytrzymaj chip i mocno wstrzyknij 25 mikrolitrów zawiesiny komórkowej do kanału moczowego chipa, jednocześnie ostrożnie zasysając pożywkę z obrzeży wylotu.

Sprawdź, czy nie ma pęcherzyków lub nierównomiernej gęstości wysiewu komórek. Dodaj trzy mililitry PBS do wkładu z uchwytem na wióry i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy godziny. Po inkubacji przepłukać oba kanały 200 mikrolitrami odpowiedniej pożywki do hodowli komórkowych.

Przymocuj puste końcówki bariery P200 do obu wylotów kanału moczowego i kapilarnego. Odpipetować 200 mikrolitrów pożywki do konserwacji śródbłonka i wstrzyknąć połowę do wlotu kanału kapilarnego. Zwolnij końcówkę pipety wewnątrz wlotu w taki sposób, aby zarówno wlot, jak i wylot kanału były przymocowane do końcówek pipet wypełnionych medium.

Powtórz tę procedurę dla wlotu kanału moczowego z 200 mikrolitrami pożywki podtrzymującej mezodermę. Inkubuj chipsy z końcówkami osadzonymi w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc. Aby podłączyć chipy do bioreaktora z chipami narządowymi, najpierw wyjmij końcówki P200 z kanałów.

Dodaj kropelki odpowiednich pożywek do wlotu i wylotu kanałów moczowych i kapilarnych, aby zapobiec wysuszeniu. Dodaj trzy mililitry ciepłej pożywki do indukcji podocytów do zbiornika wlotowego moczu i trzy mililitry ciepłej pożywki do konserwacji śródbłonka do zbiornika wlotowego kapilary. Dodaj 300 mikrolitrów odpowiednich mediów do zbiorników wylotowych bezpośrednio nad portem wylotowym.

Wsuń saszetki na tackę i do bioreaktora z chipami narządowymi. Użyj pokrętła, aby wybrać i rozpocząć cykl zacierania na dwie minuty. Sprawdź wzrokowo spód kapsuły pod kątem małych kropelek we wszystkich czterech portach fluidycznych.

Aby uzyskać kontakt płyn-płyn między spodem saszetki a mikroprzepływowymi portami chipów, delikatnie wsuń nośnik wiórów do saszetki. Delikatnie wciśnij zaczep uchwytu na wióry do środka i do góry. Odessać nadmiar pożywki z powierzchni chipa.

Ustaw natężenie przepływu w bioreaktorze z chipami narządów na 60 mikrolitrów na godzinę. Ustaw napięcie cykliczne na 10% przy 0,4 herca. Użyj pokrętła na bioreaktorze z chipami narządowymi, aby wybrać cykl regulacji i działać przez dwie godziny.

Sprawdź wzrokowo zbiorniki wylotowe pod kątem wzrostu poziomu medium. Użyj pokrętła na bioreaktorze z chipami narządowymi, aby wybrać cykl regulacji. Po 17 dniu hodowli należy codziennie zasysać pożywkę ze zbiorników wylotowych kanału moczowego po przekątnej od portu, ale należy zachować trochę pożywki w zbiorniku.

Uzupełniaj zbiornik wlotowy kanału moczowego do trzech mililitrów pożywki indukcyjnej podocytów co dwa dni przez pięć dni. Po pięciu dniach odessać pożywkę z kanału moczowego, ale zachować trochę pożywki w zbiorniku. Codziennie uzupełniaj zbiornik wlotowy kanału moczowego trzema mililitrami pożywki podtrzymującej podocyty.

Podobnie należy zassać pożywkę z wylotu kanału kapilarnego i codziennie uzupełniać zbiorniki wlotowe środkiem do konserwacji śródbłonka. Korzystając z tego protokołu, ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste wykorzystano do opracowania funkcjonalnego modelu kłębuszków nerkowych in vitro poprzez namnażanie komórek śródbłonka naczyń krwionośnych i podocytów. W 21 dniu po indukcji podocytów i propagacji śródbłonka naczyniowego, komórki w chipach wyrażały markery identyfikacyjne linii, takie jak Podocin i Nephrine dla podocytów, VE Kadheryna i PECAM-1 dla komórek śródbłonka naczyniowego.

Zarówno warstwy komórek podocytów, jak i śródbłonka naczyń krwionośnych wyrażają kolagen IV, który jest najobficiej występującym białkiem GBM w kłębuszku nerkowym. Chipy kłębuszkowe selektywnie filtrowały małe cząsteczki, takie jak inulina, z naczynia włosowatego do kanału moczowego, jednocześnie zapobiegając wydostawaniu się dużych białek, takich jak albumina, do kanału kapilarycznego, wykazując selektywną funkcję filtracji molekularnej. Podczas indukcji śródbłonka w dniach od czwartego do siódmego wzrost liczby komórek może spowodować powstanie wtórnej warstwy komórek, ale nadmierne wysiew może spowodować agregację, która może utrudnić różnicowanie.

Nieoczekiwany przepływ krzyżowy płynu między kanałami moczowymi i kapilarnymi można zaobserwować w przypadku nieodpowiedniego połączenia elementów układu PDMS, zablokowania ścieżki przepływu płynu lub naruszenia bariery filtracyjnej. Podczas wysiewu śródbłonka i nabłonka oraz konserwacji wiórów od 15 dnia ważne jest, aby na każdym etapie sprawdzać, czy w kanałach nie ma pęcherzyków powietrza. W izogenicznym chipie kłębuszka nerkowego można podawać klinicznie istotnych kandydatów na leki w celu zbadania ich potencjału terapeutycznego lub poziomów toksyczności.

Technika ta otwiera teraz możliwości zrozumienia genetycznych podstaw choroby nerek u ludzi i opracowania spersonalizowanych metod leczenia.