Name: Izogeniczny chip kłębuszków nerkowych zaprojektowany z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-11-04T13:15:00.000+00:00
Duration: 10 min 23 s
Description: Odkryj izogeniczny chip kłębuszków nerkowych z komórek macierzystych iPSC do modelowania chorób i testowania nefrotoksyczności. Ta technika wspiera rozwój spersonalizowanej medycyny precyzyjnej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Pratt School of Engineering na Duke University, Division of Nephrology na Duke Department of Medicine, stypendium Whitehead w badaniach biomedycznych oraz Genentech Research Award dla S. Musah. Y. Roye jest laureatem stypendium Duke University-Alfred P. Sloan Foundation oraz William M. "Monty" Reichert Graduate Fellowship z Duke University's Department of Biomedical Engineering. Linia komórkowa iPS DU11 (klon Duke University #11) została wygenerowana w Duke iPSC Core Facility i dostarczona nam przez Bursac Lab na Uniwersytecie Duke'a. Autorzy dziękują N. Abutalebowi, J. Holmesowi, R. Bhattacharyi i Y. Zhou za pomoc techniczną i pomocne dyskusje. Autorzy pragną również podziękować członkom Musah Lab za pomocne komentarze do manuskryptu. Autorzy dziękują Segura Lab za dar cytometru przepływowego Acuri C6.

<ol><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+disease+model+of+diabetic+nephropathy+in+a+glomerulus-on-a-chip+microdevice%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">A disease model of diabetic nephropathy in a glomerulus-on-a-chip microdevice.</a> Lab on a Chip. 17 (10), 1749-1760 (2017).</li>
<li>Musah, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mature+induced-pluripotent-stem-cell-derived+human+podocytes+reconstitute+kidney+glomerular-capillary-wall+function+on+a+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Mature induced-pluripotent-stem-cell-derived human podocytes reconstitute kidney glomerular-capillary-wall function on a chip.</a> Nature Biomedical Engineering. 1 (5), 1-12 (2017).</li>
<li>Petrosyan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+glomerulus-on-a-chip+to+recapitulate+the+human+glomerular+filtration+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A glomerulus-on-a-chip to recapitulate the human glomerular filtration barrier.</a> Nature Communications. 10 (1), 3656(2019).</li>
<li>Hass, R., Kasper, C., Böhm, S., Jacobs, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+populations+and+sources+of+human+mesenchymal+stem+cells+%28MSC%29%3A+A+comparison+of+adult+and+neonatal+tissue-derived+MSC%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Communication+and+Signaling%22%5BJournal%5D)">Different populations and sources of human mesenchymal stem cells (MSC): A comparison of adult and neonatal tissue-derived MSC.</a> Cell Communication and Signaling. 9, 12(2011).</li>
<li>Altschuler, S. J., Wu, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+heterogeneity%3A+when+do+differences+make+a+difference%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cellular heterogeneity: when do differences make a difference.</a> Cell. 141 (4), 559-563 (2010).</li>
<li>Da Sacco, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+source+of+cultured+podocytes%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">A novel source of cultured podocytes.</a> PloS One. 8 (12), 81812(2013).</li>
<li>Singh, V. K., Kalsan, M., Kumar, N., Saini, A., Chandra, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells%3A+applications+in+regenerative+medicine%2C+disease+modeling%2C+and+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells: applications in regenerative medicine, disease modeling, and drug discovery.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 3, 2(2015).</li>
<li>Ebert, A. D., Liang, P., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells+as+a+disease+modeling+and+drug+screening+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+cardiovascular+pharmacology%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells as a disease modeling and drug screening platform.</a> Journal of cardiovascular pharmacology. 60 (4), 408-416 (2012).</li>
<li>Patsch, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+vascular+endothelial+and+smooth+muscle+cells+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Generation of vascular endothelial and smooth muscle cells from human pluripotent stem cells.</a> Nature Cell Biology. 17 (8), 994-1003 (2015).</li>
<li>Musah, S., Dimitrakakis, N., Camacho, D. M., Church, G. M., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+into+mature+kidney+podocytes+and+establishment+of+a+Glomerulus+Chip%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of human induced pluripotent stem cells into mature kidney podocytes and establishment of a Glomerulus Chip.</a> Nature Protocols. 13 (7), 1662-1685 (2018).</li>
<li>Burt, M., Bhattachaya, R., Okafor, A. E., Musah, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guided+differentiation+of+mature+kidney+podocytes+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+under+chemically+defined+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Guided differentiation of mature kidney podocytes from human induced pluripotent stem cells under chemically defined conditions.</a> Journal of Visualized Experiments. (161), e61299(2020).</li>
<li>Roye, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+personalized+glomerulus+chip+engineered+from+stem+cell-derived+epithelium+and+vascular+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Micromachines%22%5BJournal%5D)">A personalized glomerulus chip engineered from stem cell-derived epithelium and vascular endothelium.</a> Micromachines. 12 (8), 967(2021).</li>
<li>Roselli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Podocin+localizes+in+the+kidney+to+the+slit+diaphragm+area%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Podocin localizes in the kidney to the slit diaphragm area.</a> The American Journal of Pathology. 160 (1), 131-139 (2002).</li>
<li>Ruotsalainen, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nephrin+is+specifically+located+at+the+slit+diaphragm+of+glomerular+podocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Nephrin is specifically located at the slit diaphragm of glomerular podocytes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (14), 7962-7967 (1999).</li>
<li>Privratsky, J. R., Newman, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PECAM-1%3A+regulator+of+endothelial+junctional+integrity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">PECAM-1: regulator of endothelial junctional integrity.</a> Cell and Tissue Research. 355 (3), 607-619 (2014).</li>
<li>Menon, M. C., Chuang, P. Y., He, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+glomerular+filtration+barrier%3A+components+and+crosstalk%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">The glomerular filtration barrier: components and crosstalk.</a> International Journal of Nephrology. 2012, 749010(2012).</li>
<li>Abutaleb, N. O., Truskey, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+and+characterization+of+human+iPSC-derived+vascular+endothelial+cells+under+physiological+shear+stress%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Differentiation and characterization of human iPSC-derived vascular endothelial cells under physiological shear stress.</a> STAR Protocols. 2 (2), 100394(2021).</li>
<li>Pammolli, F., Magazzini, L., Riccaboni, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+productivity+crisis+in+pharmaceutical+R%26D%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">The productivity crisis in pharmaceutical R&D.</a> Nature Reviews. Drug Discovery. 10 (6), 428-438 (2011).</li>
<li>Atchison, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iPSC-derived+endothelial+cells+affect+vascular+function+in+a+tissue-engineered+blood+vessel+model+of+Hutchinson-Gilford+progeria+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">iPSC-derived endothelial cells affect vascular function in a tissue-engineered blood vessel model of Hutchinson-Gilford progeria syndrome.</a> Stem Cell Reports. 14 (2), 325-337 (2020).</li>
</ol>

S.M. jest wynalazcą patentu związanego z różnicowaniem podocytów od ludzkich komórek iPS. Drugi autor nie ma nic do ujawnienia.

W tym raporcie przedstawiamy protokół uzyskiwania śródbłonka naczyniowego i nabłonka kłębuszków nerkowych (podocytów) z izogenicznej ludzkiej linii komórkowej iPS oraz wykorzystania tych komórek do inżynierii systemu 3D narządów na chipie, który naśladuje strukturę, interfejs tkanka-tkanka i funkcję filtracji molekularnej kłębuszków nerkowych. Ten chip kłębuszków nerkowych jest wyposażony w śródbłonek i nabłonek kłębuszków nerkowych, które razem stanowią barierę dla selektywnego filtrowania cząsteczek. 
<p class="jov...

Urządzenia typu organ-on-a-chip to dynamiczne modele 3D in vitro, które wykorzystują molekularną i mechaniczną stymulację, a także unaczynienie, do tworzenia interfejsów tkanka-tkanka, które modelują strukturę i funkcję określonych narządów. Wcześniej opracowane urządzenia typu organ-on-a-chip, które miały na celu rekapitulację kłębuszków nerkowych (chipy kłębuszków nerkowych), składały się z linii komórek zwierzęcych1 lub ludzkich pierwotnych i nieśmiertelnych linii komórkowych o heterogenicznych źródłach2,3. Wykorzystanie genetycznie heterogenicznych źródeł komórek przedstawia różnice, które znacznie ograniczają badania specyficznych dla pacjenta odpowiedzi oraz genetyki lub mechanizmów choroby4,5. Sprostanie temu wyzwaniu zależy od dostępności izogenicznych linii komórkowych pochodzących od konkretnych osobników z zachowanymi profilami molekularnymi i genetycznymi, aby zapewnić dokładniejsze mikrośrodowisko dla inżynierii modeli in vitro2,3,6. Izogeniczne linie komórkowe pochodzenia ludzkiego można teraz łatwo generować dzięki postępom w hodowli ludzkich komórek iPS. Ponieważ ludzkie komórki iPS są zazwyczaj pozyskiwane nieinwazyjnie, mogą samoodnawiać się w nieskończoność i różnicować w prawie każdy typ komórek, służą jako atrakcyjne źródło komórek do tworzenia modeli in vitro, takich jak chip kłębuszków nerkowych7,8. Bariera filtracji kłębuszkowej jest głównym miejscem filtracji krwi. Krew jest najpierw filtrowana przez śródbłonek naczyniowy, błonę podstawną kłębuszków nerkowych, a na końcu przez wyspecjalizowany nabłonek zwany podocytami. Wszystkie trzy składniki bariery filtracyjnej przyczyniają się do selektywnej filtracji cząsteczek. Przedstawiono tutaj protokół mający na celu stworzenie urządzenia typu narząd na chipie połączonego ze śródbłonkiem naczyniowym i nabłonkiem kłębuszków nerkowych z jednego źródła ludzkich komórek iPS. Chociaż protokół ten jest szczególnie przydatny do inżynierii izogenicznego i unaczynionego chipa w celu podsumowania bariery filtracji kłębuszkowej, zapewnia również plan rozwoju innych rodzajów spersonalizowanych narządów na chipach i platform wielonarządowych, takich jak izogeniczny system "ciało na chipie".
Protokół opisany tutaj zaczyna się od rozbieżnego różnicowania ludzkich komórek iPS na dwie oddzielne linie - boczne komórki mezodermy i komórki mezodermy, które następnie różnicują się odpowiednio w śródbłonek naczyniowy i nabłonek kłębuszków nerkowych. Aby wytworzyć boczne komórki mezodermy, ludzkie komórki iPS wysiewano na płytkach pokrytych macierzą błony podstawnej 1 i hodowano przez 3 dni (bez wymiany pożywki) w pożywce N2B27 uzupełnionej aktywatorem Wnt, CHIR 99021 i silnym induktorem mezodermy, morfogenetycznym 4 (BMP4). Powstałe w ten sposób boczne komórki mezodermy były wcześniej charakteryzowane przez ekspresję brachyury (T), homeoboxu typu mix paired-like (MIXL) i eomesoderminy (EOMES)9. Następnie boczne komórki mezodermy hodowano przez 4 dni w pożywce uzupełnionej VEGF165 i forskoliną w celu indukcji komórek śródbłonka naczyniowego, które zostały posortowane na podstawie ekspresji VE-kadheryny i / lub PECAM-1 przy użyciu sortowania komórek aktywowanych magnetycznie (MACS). Powstałe w ten sposób komórki śródbłonka naczyń krwionośnych (viEC) rozwinięto poprzez hodowlę ich w kolbach z powłoką 3 z macierzyą błony podstawnej, aż będą gotowe do wysiewu w urządzeniu mikroprzepływowym.
Aby wygenerować komórki mezodermy, ludzkie komórki iPS zostały wysiane na płytkach z matrycą błony podstawnej pokrytej 2 i hodowane przez 2 dni w pożywce zawierającej Aktywinę A i CHIR99021. Powstałe komórki mezodermy charakteryzowały się ekspresją HAND1, goosecoid i brachury (T), jak opisano wcześniej2,10,11. Aby indukować pośrednie różnicowanie komórek mezodermy (IM), komórki mezodermy hodowano przez 14 dni w pożywce uzupełnionej BMP-7 i CHIR99021. Powstałe komórki IM wyrażają guz Wilma 1 (WT1), sparowany gen pudełkowy 2 (PAX2) i nieparzyście pominięte białko pokrewne 1 (OSR-1)2,10,11.
Dwukanałowy mikroprzepływowy chip oparty na polidimetylosiloksanie (PDMS) został zaprojektowany w celu podsumowania struktury bariery filtracji kłębuszkowej in vitro. Kanał moczowy wynosi 1 000 μm x 1 000 μm (szer. x wys.), a wymiar kanału kapilarnego 1 000 μm x 200 μm (szer. x wys.). Cykliczne cykle rozciągania i relaksacji były ułatwione dzięki pustym komorom znajdującym się po obu stronach kanałów płynowych. Komórki wysiano na elastycznej błonie PDMS (o grubości 50 μm), która oddziela kanały moczowe i kapilarne. Membrana jest wyposażona w sześciokątne pory (średnica 7 μm, 40 μm odstęp od siebie), które pomagają promować sygnalizację międzykomórkową (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 1A) 2,12. Dwa dni przed zakończeniem indukcji IM chipy mikroprzepływowe zostały pokryte matrycą membrany podstawnej 2. viEC wysiewano do kanału kapilarnego chipa mikroprzepływowego za pomocą pożywki do konserwacji śródbłonka na 1 dzień przed zakończeniem indukcji IM, a chip odwrócono do góry nogami, aby umożliwić adhezję komórek po stronie podstawy membrany PDMS pokrytej ECM. W dniu, w którym zakończono indukcję IM, komórki zostały wysiane do kanału moczowego chipa mikroprzepływowego za pomocą pożywki uzupełnionej BMP7, Activiną A, CHIR99021, VEGF165 i całym kwasem trans retinowym w celu indukowania różnicowania podocytów w chipie. Następnego dnia zbiorniki pożywki napełniono pożywką do indukcji podocytów i pożywką do konserwacji śródbłonka, a następnie do chipów przyłożono 10% naprężenia mechanicznego przy 0,4 Hz i przepływie płynu (60 μl/h).
Komórkowe chipy mikroprzepływowe były hodowane przez dodatkowe 5 dni przy użyciu pożywki do indukcji podocytów (w kanale moczowym) i pożywki do konserwacji śródbłonka (w kanale naczyniowym). Powstałe w ten sposób chipy kłębuszków nerkowych hodowano przez okres do 7 dodatkowych dni w pożywkach podtrzymujących zarówno dla komórek podocytów, jak i śródbłonka. Zróżnicowane podocyty wykazywały dodatnią ekspresję białek specyficznych dla linii, w tym podocyny i nefryny13,14, podczas gdy viECs pozytywnie wyrażały białka identyfikujące linię PECAM-1 i VE-Cadherin, z których wszystkie są niezbędnymi cząsteczkami do utrzymania integralności kłębuszkowej bariery filtracyjnej15,16. Stwierdzono, że zarówno podocyty, jak i viEC wydzielają najliczniej występujące białko błony podstawnej kłębuszków nerkowych, kolagen IV, który jest również ważny dla dojrzewania i funkcjonowania tkanek.
>jove_content<Stwierdzono, że trójskładnikowy system bariery filtracyjnej - śródbłonek, błona podstawna i nabłonek - w chipach kłębuszków nerkowych selektywnie filtruje cząsteczki i reaguje na chemioterapeutyczne, nefrotoksyczne leczenie. Wyniki leczenia farmakologicznego wskazują, że chip kłębuszka nerkowego może być wykorzystywany do badań nefrotoksyczności i modelowania choroby. Protokół ten zawiera ogólne wytyczne dotyczące inżynierii funkcjonalnego mikroprzepływowego chipa kłębuszków nerkowych z izogenicznych pochodnych komórek iPS. Dalsze analizy zmodyfikowanego chipa mogą być przeprowadzane zgodnie z życzeniem badacza. Więcej informacji na temat wykorzystania chipa kłębuszków nerkowych do modelowania uszkodzenia kłębuszków nerkowych wywołanego przez lek można znaleźć w poprzednich publikacjach2,12.

<table><tbody><tr><td>Przeciwciała</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488- i Alexa Fluor 594 sprzężone z przeciwciałami drugorzędowymi</td><td>Thermo/Life Technologies</td><td>A32744; A32754; A-11076; A32790; A21203; A11015</td><td></td></tr><tr><td>Kolagen IV</td><td>Thermo/Life Technologies</td><td>14-9871-82</td><td></td></tr><tr><td>Progen nefryny</td><td></td><td>GP-N2</td><td></td></tr><tr><td>PECAM-1</td><td>R& D Systems</td><td>AF806</td><td></td></tr><tr><td>Podocin</td><td>Abcam</td><td>ab50339</td><td></td></tr><tr><td>VE-Cadherin</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-9989</td><td></td></tr><tr><td>Matryce membran podstawnych</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Corning Fibronectin, Human</td><td>Corning</td><td>356008</td><td>Membrana podstawna (3)</td></tr><tr><td>iMatrix-511 Laminin-E8 (LM-E8) fragment</td><td>Iwai Ameryka Północna</td><td>N8922012</td><td>Macierz błony podstawnej (2)</td></tr><tr><td>Matrigel Matryca kwalifikowana do hESC, fiolka 5 ml</td><td>BD Biosciences</td><td>354277</td><td>Macierz błony podstawnej (1); może wykazywać zmienność między partiami</td></tr><tr><td><silne>komórki</silne></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DU11 ludzkie komórki</td><td></td><td></td> <td>iPSLinia komórkowa iPS DU11 (klon Duke University #11) została wygenerowana w Duke iPSC Core Facility i dostarczona nam przez Bursac Lab na Uniwersytecie Duke'a. Linia została przetestowana i stwierdzono, że jest wolna od mykoplazmy (ostatnie badanie w listopadzie 2021 r.) i nieprawidłowości kariotypu (lipiec 2019 r.)</td></tr> <tr><td> pożywki i suplementy pożywki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,5M EDTA, pH 8,0</td><td>Invitrogen</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>Thermo/Life Technologies</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>Albumina z surowicy bydlęcej, Texas Red koniugat</td><td>Thermo/Life Technologies</td><td>A23017</td><td></td></tr><tr><td>Kwas all-trans retinowy (500 mg)</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>72262</td><td></td></tr><tr><td>B27 suplement bez surowicy</td><td>Thermo/Life Technologies</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>suplement B-27 (50x) bez witaminy A</td><td>Thermo/Life Technologies</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Stemgent</td><td>04-0004</td><td>Może wykazywać różnice między partiami</td></tr><tr><td>Kompletny zestaw pożywek z systemami komórkowymi CultureBoost-R</td><td></td><td>4Z0-500-R</td><td>Pożywki do konserwacji podocytów</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Thermo/Life Technologies</td><td>12634028</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 z suplementem GlutaMAX</td><td>Thermo/Life Technologies</td><td>10565042</td><td>DMEM/F12 z glutaminą</td></tr><tr><td>Forskolina (aktywator cyklazy adenylowej)</td><td>Abcam</td><td>ab120058</td><td></td></tr><tr><td>Suplement GlutaMAX</td><td>Thermo/Life Technologies</td><td>35050061</td><td>suplement glutaminy</td></tr><tr><td>Inaktywowany termicznie FBS</td><td>Thermo/Life Technologies</td><td>10082147</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór heparyny</td><td>Technologie macierzyste</td><td>7980</td><td></td></tr><tr><td>Human Activin A</td><td>Thermo/Life Technologies</td><td>PHC9544</td><td></td></tr><tr><td>Ludzki BMP4</td><td>Preprotech</td><td>120-05ET</td><td></td></tr><tr><td>Ludzki BMP7</td><td>Technologie Thermo/Life</td><td>PHC9544</td><td></td></tr><tr><td>Ludzkie technologie VEGF</td><td>Thermo/Life PHC9394</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inulina-FITC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3272</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR1 średnie</td><td>technologie komórek macierzystych</td><td>05850</td><td>Pożywki do hodowli ludzkich komórek iPS (CCM). Dodaj 5x suplement według producenta. Ludzki iPS CCM może być przechowywany przez okres do 6 miesięcy w temperaturze -20 stopni Celsjusza.</td></tr><tr><td>Suplement N-2 (100x)</td><td>Technologie Thermo/Life</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>Media neurobazalne</td><td>Technologie Thermo/Life 21103049</td><td></td><td>Boczne podłoże bazowe mezodermy</td></tr><tr><td>PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami)</td><td>Thermo/Life Technologies</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-streptomycyna, płyn (100x)</td><td>Thermo/Life Technologies</td><td>15140-163</td><td></td></tr><tr><td>ROCK inhibitor (Y27632)</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td></td></tr><tr><td>StemPro-34 SFM</td><td>Thermo/Life Technologies</td><td>10639011</td><td>Pożywka do hodowli komórek śródbłonka (CCM). Dodaj suplement według producenta. Śródbłonek CCM może być przechowywany do dwóch tygodni w temperaturze 4 & stopni; C lub -20 &deg; C przez okres do 6 miesięcy.</td></tr><tr><td>Inhibitor TGF-Beta (SB431542)</td><td>Technologie komórek macierzystych</td><td>72234</td><td></td></tr><tr><td>Enzymy i inne odczynniki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Thermo/Life Technologies</td><td>A1110501</td><td>Bufor do odłączania komórek</td></tr><tr><td>Sultlenek dimetylu (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2438</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór etanolu, 70% (obj./obj.), klasa biotechnologiczna</td><td>VWR</td><td>97065-058</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd (PFA)</td><td>Thermo/Life Technologies</td><td>28906</td><td></td></tr><tr><td>Sterylna woda destylowana</td><td>Thermo/Life Technologies</td><td>15230162</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>VWR</td><td>97062-208</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypsin EDTA, 0.05%</td><td>Thermo/Life Technologies</td><td>25300-120</td><td></td></tr><tr><td>(Orb) Moduł koncentratora</td><td>Emulacja</td><td>ORB-HM1</td><td></td></tr><tr><td>Okrągła szalka Petriego 100 mm x 15 mm</td><td>Fisherbrand</td><td>FB087579B</td><td></td></tr><tr><td>kwadratowa miska do hodowli komórkowych 120 x 120 mm</td><td>VWR</td><td>688161</td><td></td></tr><tr><td>Accuri C6</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipety zasysające, pakowane pojedynczo</td><td>Corning</td><td>29442-462</td><td></td></tr><tr><td>Jednostka zasysająca</td><td>SP Bel-Art</td><td>F19917-0150</td><td></td></tr><tr><td>Avanti J-15R Wirówka</td><td>Beckman Coulter</td><td>B99516</td><td></td></tr><tr><td>Stożkowa probówka wirówkowa, 15 ml</td><td>Corning</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>Stożkowa probówka wirówkowa, 50 ml</td><td>Corning</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>EVOS M7000</td><td>Thermo/Life Technologies</td><td>AMF7000</td><td>Mikroskop fluorescencyjny do wykonywania zdjęć utrwalonych i barwionych Komórek.</td></tr><tr><td>Hemocytometr</td><td>VWR</td><td>100503-092</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator CO2 Heracell VIOS 160i</td><td>Thermo/Life Technologies</td><td>51030403</td><td></td></tr><tr><td>Odwrócony Zeiss Axio Observer wyposażony w kamerę AxioCam 503</td><td>Carl Zeiss Micrscopy</td><td>491916-0001-000 (mikroskop) ; 426558-0000-000(kamera)</td><td></td></tr><tr><td>Rękawice nitrylowe Kimberly-Clark</td><td>VWR</td><td>40101-346</td><td></td></tr><tr><td>Chusteczki Kimbre, duże</td><td>VWR</td><td>21905-049</td><td></td></tr><tr><td>Leoca SP8 Pionowy mikroskop</td><td></td><td></td><td></td>konfokalny</tr><tr><td>Zbiornik mediów (moduł przenośny POD)</td><td>Emuluj</td><td>POD-1</td><td></td></tr><tr><td>Wytrząsarka do mikropłytek</td><td>VWR</td><td>12620-926</td><td></td></tr><tr><td>Chip do organów</td><td>Emulacja</td> chipa <td>S-1 Uchwyt</td><td></td></tr><tr><td>na chip do organów</td><td>Emuluj</td><td>AK-CCR</td><td></td></tr><tr><td>P10 precyzyjne końcówki do pipet barierowych</td> Końcówki do pipet barierowych <td>Denville Scientific</td><td>P1096-FR</td><td></td></tr><tr><td>P100</td> Końcówki do pipet barierowych <td>Denville</td><td>Scientific P1125</td><td></td></tr><tr><td>P1000</td><td>Końcówki</td> do pipet barierowych Denville Scientific <td>P1121</td><td></td></tr><tr><td>P20</td> Końcówki do pipet barierowych <td>Denville Scientific</td><td>P1122</td><td></td></tr><tr><td>P200</td><td>Denville Scientific</td><td>P1122</td><td></td></tr><tr><td>Plasma Asher</td><td>Quorum tech</td><td>K1050X RF</td><td>Ten wytrawiacz plazmowy / spopielnik / środek czyszczący był używany jako część Shared Materials Instrumentation Facility (SMiF) Uniwersytetu Duke'a.</td></tr><tr><td>Probówka z polistyrenu z okrągłym dnem z zatrzaskiem sitka Corning</td><td></td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta serologiczna, 10 ml, indywidualnie pakowana</td><td>Corning</td><td>356551</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta serologiczna, 25 mL, indywidualnie pakowana</td><td>Corning</td><td>356525</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta serologiczna, 5 mL, indywidualnie pakowana</td><td>Corning</td><td>356543</td><td></td></tr><tr><td>Steriflip, 0,22 i mikro; m, PES</td><td>EMD Millipore</td><td>SCGP00525</td><td></td></tr><tr><td>sterylne probówki do mikrowirówek</td><td>Thomas Scientific</td><td>1138W14</td><td></td></tr><tr><td>T75cm2 kolba do hodowli komórkowych z nasadką odpowietrzającą</td><td>Corning</td><td>430641U</td><td></td></tr><tr><td>Płytki 12-dołkowe poddane hodowli tkankowej</td><td>Corning</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>Płytki 6-dołkowe poddane kulturze tkankowej</td><td>Corning</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Modulator próżni i pompa perstaltyczna (moduł hodowli Zoe)</td><td>Emuluj</td><td>bioreaktor ZOE-CM1</td><td>Organ Chip</td></tr><tr><td>VE-Cadherin CD144 przeciwciało antyludzkie - APC sprzężone</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-126-010</td><td></td></tr><tr><td>Podnośnik komórkowy z szerokim skosem</td><td>Corning</td><td>3008</td><td></td></tr><tr><td>MACS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD144 MicroBeads, ludzkie</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-097-857</td><td></td></tr><tr><td>CD31 Zestaw mikrokulek, człowiek</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-935</td><td></td></tr><tr><td>Kolumny LS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr></tbody></table>

izogeniczny chip kłębuszków nerkowych zaprojektowany z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

Isogenic Kidney Glomerulus Chip Engineered from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Przewlekła choroba nerek (PChN) dotyka 15% dorosłej populacji USA, ale wprowadzenie terapii celowanych zostało ograniczone przez brak funkcjonalnych modeli, które mogłyby dokładnie przewidzieć ludzkie reakcje biologiczne i nefrotoksyczność. Postępy w medycynie precyzyjnej nerek mogą pomóc w przezwyciężeniu tych ograniczeń. Jednak wcześniej ustalone modele in vitro kłębuszka nerkowego ludzkiego – głównego miejsca filtracji krwi i kluczowego celu wielu chorób i toksyczności leków – zazwyczaj wykorzystują heterogeniczne populacje komórek o ograniczonych cechach funkcjonalnych i niezrównanym tle genetycznym. Cechy te znacznie ograniczają ich zastosowanie w modelowaniu chorób specyficznych dla pacjenta i odkrywaniu terapii. 
Ten artykuł przedstawia protokół, który integruje indukowany przez człowieka pluripotencjalny (iPS) nabłonek kłębuszków nerkowych (podocyty) i śródbłonek naczyniowy od jednego pacjenta w celu stworzenia izogenicznego i unaczynionego mikroprzepływowego chipa kłębuszków nerkowych. Powstały chip kłębuszków nerkowych składa się z warstw komórek śródbłonka i nabłonka pochodzących z komórek macierzystych, które wyrażają markery specyficzne dla linii, wytwarzają białka błony podstawnej i tworzą interfejs tkanka-tkanka przypominający barierę filtracji kłębuszkowej nerki. Zmodyfikowany chip kłębuszków nerkowych selektywnie filtruje cząsteczki i podsumowuje uszkodzenie nerek wywołane przez leki. Zdolność do odtworzenia struktury i funkcji kłębuszka nerkowego przy użyciu izogenicznych typów komórek stwarza możliwość modelowania choroby nerek ze specyficznością dla pacjenta i zwiększenia użyteczności narządów na chipach w medycynie precyzyjnej nerek i powiązanych zastosowaniach.

W niniejszej pracy pokazujemy, że funkcjonalny model 3D in vitro kłębuszka może zostać unaczyniony i upitelializowany z izogenicznego źródła ludzkich komórek iPS. W szczególności niniejszy protokół zawiera instrukcje dotyczące zastosowania technologii ludzkich komórek iPS, a zwłaszcza ich zdolności do różnicowania się w wyspecjalizowane typy komórek, w celu wygenerowania nabłonka kłębuszkowego nerki (podocytów) oraz śródbłonka naczyniowego (viECs), które mogą zostać zintegrowane z urządzeniami mikroprzepływowymi...

Prezentowany tutaj jest protokół do opracowania spersonalizowanego systemu organ-on-a-chip, który podsumowuje strukturę i funkcję bariery filtracyjnej kłębuszków nerkowych poprzez integrację genetycznie dopasowanych komórek nabłonka i śródbłonka naczyniowego, zróżnicowanych z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych. Ten bioinżynieryjny system może przyczynić się do rozwoju medycyny precyzyjnej nerek i powiązanych zastosowań.

Izogeniczny chip kłębuszków nerkowych zaprojektowany z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

Chronic kidney disease (CKD) affects 15% of the U.S. adult population, but the establishment of targeted therapies has been limited by the lack of ...

Izogeniczny chip kłębuszków nerkowych umożliwi modelowanie chorób specyficznych dla pacjenta i badanie nefrotoksyczności oraz zaawansowane zastosowania w medycynie precyzyjnej. Nabłonek i śródbłonek kłębuszków nerkowych pochodzą z pojedynczej populacji pluripotencjalnych komórek macierzystych indukowanych przez człowieka lub IPSC. IPSC mają nieograniczoną zdolność do samoodnawiania się i mogą różnicować się w prawie każdy typ komórek.Technika ta może być stosowana do oceny patologicznych fenotypów komórkowych i chorób. Specyficzny dla pacjenta chip narządowy może również służyć jako platforma do badań przesiewowych leków i badań mechanistycznych. Model ten można zastosować do opracowania ciała na chipie systemu spersonalizowanego dla konkretnego pacjenta.System ten może być w stanie przewidywać specyficzne reakcje pacjenta przed rozpoczęciem badań klinicznych. Zacznij od delikatnego dodania 25 mikrolitrów roztworu macierzy błony podstawnej 2 do kanału moczowego i 20 mikrolitrów do kanału kapilarnego chipa. Weź dwie sterylne 15-mililitrowe stożkowe nakrętki probówek i napełnij je 500 mikrolitrami sterylnej wody destylowanej.Umieść nakrętkę na szalce Petriego, aby zapobiec wysuszeniu i umieść pokrywkę na naczyniu. Inkubuj go w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc. Kontynuując, odessać pożywkę z kolb T75 zawierających 15-dniową hodowlę komórek śródbłonka naczyń krwionośnych przy 90% zbieganiu.Dodać pięć mililitrów buforu do odłączania komórek i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć do siedmiu minut. Następnie przenieś komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów i dodaj pięć mililitrów DMEM/F-12. Wirować 200 razy G przez pięć minut.Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w 300 mikrolitrach pożywki do konserwacji śródbłonka. Policz komórki za pomocą hemocytometru, aby uzyskać około 2 milionów komórek. Za pomocą końcówki barierowej P200 przepłucz zarówno górny, jak i dolny kanał chipa mikroprzepływowego 200 mikrolitrami DMEM/F-12, jednocześnie zasysając z obrzeża wylotu.Trzymaj chip mocno z końcówką bariery P200 przymocowaną do aspiratora z dala od wylotu dolnego kanału. Mocno wstrzyknąć 20 mikrolitrów zawiesiny komórek śródbłonka naczyń krwionośnych do kanału kapilarnego chipa i ostrożnie zassać pożywkę z obrzeża wylotu. Sprawdź pod mikroskopem, czy nie ma pęcherzyków lub nierównomiernej gęstości wysiewu.Delikatnie odwróć chip, aby komórki mogły przylegać do podstawowej strony elastycznej błony PDMS. Umieść chip we wkładzie uchwytu i dodaj trzy mililitry PBS do wkładu, aby zapobiec wyschnięciu membrany. Inkubuj chip w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy godziny.Sprawdź dolny kanał pod mikroskopem pod kątem zlewającej się warstwy komórek przyczepionych do elastycznej membrany PDMS. Umyj nieprzyłączone komórki, dodając 200 mikrolitrów pożywki do konserwacji śródbłonka na wlocie dolnego kanału, zasysając od obwodu wylotu kanału kapilarnego. Umieść chip z powrotem we wkładzie utrwalacza i inkubuj przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Następnego dnia delikatnie przepłucz kanał kapilarny 200 mikrolitrami pożywki do konserwacji śródbłonka. Przepłucz kanał moczowy 200 mikrolitrami DMEM/F-12 i upuść 50 mikrolitrów DMEM/F-12 na porty wlotowe i wylotowe. Postępując z pośrednimi komórkami mezodermy, zastąp pośrednią pożywkę indukcyjną mezodermy z każdej studzienki 12-dołkowej płytki jednym mililitrem trypsyny EDTA i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut.Delikatnie zeskrobać komórki za pomocą podnośnika do komórek i rozdzielić komórki za pomocą pipetowania. Dodaj dwa mililitry roztworu neutralizującego trypsynę do każdej studzienki i przenieś komórki do stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów. Uzupełnić objętość zawiesiny komórek do 50 mililitrów za pomocą DMEM/F-12 i odwirować w temperaturze 200 razy G przez pięć minut.Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w 500 mikrolitrach pożywki do indukcji mezodermy, aby uzyskać około 3 miliony komórek. Policz komórki za pomocą hemocytometru. Przytrzymaj chip i mocno wstrzyknij 25 mikrolitrów zawiesiny komórkowej do kanału moczowego chipa, jednocześnie ostrożnie zasysając pożywkę z obrzeży wylotu.Sprawdź, czy nie ma pęcherzyków lub nierównomiernej gęstości wysiewu komórek. Dodaj trzy mililitry PBS do wkładu z uchwytem na wióry i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy godziny. Po inkubacji przepłukać oba kanały 200 mikrolitrami odpowiedniej pożywki do hodowli komórkowych.Przymocuj puste końcówki bariery P200 do obu wylotów kanału moczowego i kapilarnego. Odpipetować 200 mikrolitrów pożywki do konserwacji śródbłonka i wstrzyknąć połowę do wlotu kanału kapilarnego. Zwolnij końcówkę pipety wewnątrz wlotu w taki sposób, aby zarówno wlot, jak i wylot kanału były przymocowane do końcówek pipet wypełnionych medium.Powtórz tę procedurę dla wlotu kanału moczowego z 200 mikrolitrami pożywki podtrzymującej mezodermę. Inkubuj chipsy z końcówkami osadzonymi w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc. Aby podłączyć chipy do bioreaktora z chipami narządowymi, najpierw wyjmij końcówki P200 z kanałów.Dodaj kropelki odpowiednich pożywek do wlotu i wylotu kanałów moczowych i kapilarnych, aby zapobiec wysuszeniu. Dodaj trzy mililitry ciepłej pożywki do indukcji podocytów do zbiornika wlotowego moczu i trzy mililitry ciepłej pożywki do konserwacji śródbłonka do zbiornika wlotowego kapilary. Dodaj 300 mikrolitrów odpowiednich mediów do zbiorników wylotowych bezpośrednio nad portem wylotowym.Wsuń saszetki na tackę i do bioreaktora z chipami narządowymi. Użyj pokrętła, aby wybrać i rozpocząć cykl zacierania na dwie minuty. Sprawdź wzrokowo spód kapsuły pod kątem małych kropelek we wszystkich czterech portach fluidycznych.Aby uzyskać kontakt płyn-płyn między spodem saszetki a mikroprzepływowymi portami chipów, delikatnie wsuń nośnik wiórów do saszetki. Delikatnie wciśnij zaczep uchwytu na wióry do środka i do góry. Odessać nadmiar pożywki z powierzchni chipa.Ustaw natężenie przepływu w bioreaktorze z chipami narządów na 60 mikrolitrów na godzinę. Ustaw napięcie cykliczne na 10% przy 0,4 herca. Użyj pokrętła na bioreaktorze z chipami narządowymi, aby wybrać cykl regulacji i działać przez dwie godziny.Sprawdź wzrokowo zbiorniki wylotowe pod kątem wzrostu poziomu medium. Użyj pokrętła na bioreaktorze z chipami narządowymi, aby wybrać cykl regulacji. Po 17 dniu hodowli należy codziennie zasysać pożywkę ze zbiorników wylotowych kanału moczowego po przekątnej od portu, ale należy zachować trochę pożywki w zbiorniku.Uzupełniaj zbiornik wlotowy kanału moczowego do trzech mililitrów pożywki indukcyjnej podocytów co dwa dni przez pięć dni. Po pięciu dniach odessać pożywkę z kanału moczowego, ale zachować trochę pożywki w zbiorniku. Codziennie uzupełniaj zbiornik wlotowy kanału moczowego trzema mililitrami pożywki podtrzymującej podocyty.Podobnie należy zassać pożywkę z wylotu kanału kapilarnego i codziennie uzupełniać zbiorniki wlotowe środkiem do konserwacji śródbłonka. Korzystając z tego protokołu, ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste wykorzystano do opracowania funkcjonalnego modelu kłębuszków nerkowych in vitro poprzez namnażanie komórek śródbłonka naczyń krwionośnych i podocytów. W 21 dniu po indukcji podocytów i propagacji śródbłonka naczyniowego, komórki w chipach wyrażały markery identyfikacyjne linii, takie jak Podocin i Nephrine dla podocytów, VE Kadheryna i PECAM-1 dla komórek śródbłonka naczyniowego.Zarówno warstwy komórek podocytów, jak i śródbłonka naczyń krwionośnych wyrażają kolagen IV, który jest najobficiej występującym białkiem GBM w kłębuszku nerkowym. Chipy kłębuszkowe selektywnie filtrowały małe cząsteczki, takie jak inulina, z naczynia włosowatego do kanału moczowego, jednocześnie zapobiegając wydostawaniu się dużych białek, takich jak albumina, do kanału kapilarycznego, wykazując selektywną funkcję filtracji molekularnej. Podczas indukcji śródbłonka w dniach od czwartego do siódmego wzrost liczby komórek może spowodować powstanie wtórnej warstwy komórek, ale nadmierne wysiew może spowodować agregację, która może utrudnić różnicowanie.Nieoczekiwany przepływ krzyżowy płynu między kanałami moczowymi i kapilarnymi można zaobserwować w przypadku nieodpowiedniego połączenia elementów układu PDMS, zablokowania ścieżki przepływu płynu lub naruszenia bariery filtracyjnej. Podczas wysiewu śródbłonka i nabłonka oraz konserwacji wiórów od 15 dnia ważne jest, aby na każdym etapie sprawdzać, czy w kanałach nie ma pęcherzyków powietrza. W izogenicznym chipie kłębuszka nerkowego można podawać klinicznie istotnych kandydatów na leki w celu zbadania ich potencjału terapeutycznego lub poziomów toksyczności.Technika ta otwiera teraz możliwości zrozumienia genetycznych podstaw choroby nerek u ludzi i opracowania spersonalizowanych metod leczenia.

isogenic-kidney-glomerulus-chip-engineered-from-human-induced

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

W tym filmie opisujemy protokół pozyskiwania ludzkich podocytów nerkowych z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych poprzez różnicowanie komórek w określonych warunkach chemicznych. Wygenerowane podocyty mogą być wykorzystane do badań nefrotoksyczności i modelowania chorób.

Pozyskiwanie ludzkich podocytów nerkowych z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych: procedura ukierunkowanego różnicowania dojrzałych podocytów nerkowych z komórek macierzystych

Prezentowany tutaj jest chemicznie zdefiniowany protokół pozyskiwania ludzkich podocytów nerkowych z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych o wysokiej skuteczności (&gt;90%) i niezależny od manipulacji genetycznych czy selekcji subpopulacji. Protokół ten pozwala na uzyskanie pożądanego typu komórek w ciągu 26 dni i może być przydatny do testowania nefrotoksyczności i modelowania choroby.

Sterowane różnicowanie dojrzałych podocytów nerkowych od ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych w warunkach zdefiniowanych chemicznie

Tutaj opisujemy protokół generowania organoidów nerkowych z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC). Protokół ten generuje organoidy nerkowe w ciągu dwóch tygodni. Powstałe w ten sposób organoidy nerkowe można hodować w dużych kolbach obrotowych lub wielodołkowych magnetycznych płytkach mieszających w celu równoległego testowania leków.

Uproszczona metoda generowania organoidów nerkowych z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół przeszczepu organoidów nerkowych w jamie celomicznej zarodków kurczaków. Metoda ta indukuje unaczynienie i przyspieszone dojrzewanie organoidów w ciągu 8 dni i może być wykorzystana do skutecznego badania tych procesów.

Skuteczne unaczynienie organoidów nerkowych poprzez docelomiczne przeszczepienie zarodków kurczaków

Ten manuskrypt opisuje dwuetapowy protokół generowania specyficznych dla pacjenta podocytów z fibroblastów skóry poprzez episomalne przeprogramowanie w indukowane przez człowieka pluripotencjalne komórki macierzyste (hiPSC) i późniejsze różnicowanie w podocyty.

Generowanie podocytów pochodzących od pacjenta z biopsji skóry

Ten protokół przedstawia kompleksową i efektywną metodę wytwarzania organoidów nerkowych z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) przy użyciu warunków hodowli zawiesinowych. Główny nacisk tego badania kładzie się na określenie początkowej gęstości komórek i stężenia agonisty WNT, co przynosi korzyści badaczom zainteresowanym badaniami nad organoidami nerkowymi.

Generowanie organoidów nerkowych w zawiesinie z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

Ten protokół opisuje rozwój, ekspansję i obrazowanie in vivo komórek NK pochodzących z hESC i iPSC.

Rozwój, ekspansja i monitorowanie in vivo ludzkich komórek NK z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC) i indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC)

Indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) pochodzące z miogennych komórek macierzystych są obiecującymi kandydatami na strategie terapii komórkowej w leczeniu dystrofii mięśniowych. Protokół ten opisuje przeszczep i pomiary funkcjonalne wymagane do oceny wszczepienia i różnicowania mezoangioblastów pochodzących z iPSC (rodzaj komórek progenitorowych mięśni) w mysich modelach ostrej i przewlekłej regeneracji mięśni.

Przeszczep indukowanych pluripotencjalnych progenitorów miogennych podobnych do mezoangioblastów pochodzących z mezoangioblastów w mysich modelach regeneracji mięśni

Przedstawiamy protokół do zbadania biomarkerów ekspresji mRNA komórek pochodzących z okostnej (PDC) indukowanych przez witaminę C (witaminę C) i 1,25-dihydroksywitaminę D [1,25-(OH)2D3]. Ponadto oceniamy zdolność PDC do różnicowania się w osteocyty, chondrocyty i adipocyty.

Izolacja mezenchymalnych komórek macierzystych z ludzkiej okostnej pęcherzyków płucnych i wpływ witaminy D na aktywność osteogenną komórek pochodzących z okostnej

Przeprogramowanie komórek wymaga wprowadzenia kluczowych genów, które regulują i utrzymują pluripotencjalny stan komórki. Opisany protokół umożliwia tworzenie kolonii indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) z ludzkich fibroblastów skóry bez metod wirusowych/integrujących, ale przy użyciu niemodyfikowanych RNA (NM-RNA) w połączeniu z czynnikami unikania odporności zmniejszającymi mechanizmy obrony komórkowej.

Izolacja dorosłych ludzkich fibroblastów skórnych ze skóry brzucha i wytwarzanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu metody nieintegrującej

Odkryj izogeniczny chip kłębuszków nerkowych z komórek macierzystych iPSC do modelowania chorób i testowania nefrotoksyczności. Ta technika wspiera rozwój spersonalizowanej medycyny precyzyjnej.

Izogeniczny chip kłębuszków nerkowych zaprojektowany z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

Przeglądaj więcej filmów