Name: Generowanie organoidów nerkowych w zawiesinie z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-01T13:20:00.000+00:00
Duration: 7 min 22 s
Description: Poznaj metodę generowania organoidów nerkowych z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych w zawiesinie. Protokół optymalizuje gęstość komórek i stężenie agonisty WNT dla badaczy biologii komórek macierzystych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy niezmiernie wdzięczni wszystkim członkom Mao i Hu Lab, byłym i obecnym, za interesujące dyskusje i wielki wkład w projekt. Dziękujemy Narodowemu Centrum Badań Klinicznych nad Zdrowiem Dziecka za ogromne wsparcie. Badania te były wspierane finansowo przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (U20A20351 Jianhua Mao, 82200784 Lidana Hu), Fundację Nauk Przyrodniczych prowincji Zhejiang w Chinach (nr 1). LQ22C070004 do Lidan Hu) oraz Fundacji Nauk Przyrodniczych Prowincji Jiangsu (dotacje nr. BK20210150 do Gang Wang).

Materiały iPS użyte w niniejszym badaniu zostały uzyskane z komercyjnego źródła. Komórki utrzymywano za pomocą pożywki mTeSR na dostępnych na rynku płytkach pokrytych matrycą błony podstawnej (patrz Tabela materiałów). Tabela 1 zawiera wszystkie kompozycje pożywek wykorzystanych w badaniu.
1. Poszycie iPSC dla różnicowania i indukowania tylnych prążków pierwotnych (PS)
<ol>
	<li>Przemyć iPSC na 6-dołkowej płytce pokrytej matrycą membranową za pomocą 2 ml DPBS. Zassać DPBS za pomocą pipety.</li>
	<li>Dodać 1 ml dostępnego w handlu roztworu do oddzielania komórek (patrz tabela materiałów) w celu odłączenia iPSC i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut.</li>
	<li>Dodaj 1 ml mTeSR do iPSC i upewnij się, że komórki oderwały się od plastikowej powierzchni.</li>
	<li>Odwirować komórki przy 400 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej (RT). Ponownie zawiesić osad komórkowy i policzyć liczbę komórek za pomocą hemocytometru.</li>
	<li>Zasiać komórki o różnych gęstościach na 24-dołkowej lub 6-dołkowej płytce pokrytej matrycą błonową i kulturze z mTeSR uzupełnionym inhibitorem 10 μM kinazy Rho (Y-27632) (patrz tabela materiałów). Hodować je przez noc w inkubatorze CO2 o temperaturze 37 °C. 
	UWAGA: Aby indukować PS, optymalne stężenie CHIR99021 i odpowiednia gęstość komórek różnią się w zależności od różnych linii iPSC. Wysiewać w różnych gęstościach (np. 0,6, 0,9, 1,2, 1,5, 1,8, 2,4 * 103 pojedyncze komórki na centymetr kwadratowy) i zakres stężeń CHIR99021 od 7 μM-12 μM. Rozpocznij różnicowanie każdej gęstości i każdego CHIR tego samego dnia. Znajdź optymalne stężenie CHIR99021 i odpowiednią gęstość komórek na płytce 24-dołkowej, a następnie rozszczep kulturę na płytkach 6-dołkowych. Tutaj udostępniamy protokół oparty na płytce 6-dołkowej.</li>
	<li>Następnego dnia odessać mTeSR i przemyć komórki 2 ml DPBS.</li>
	<li>Dodać 2 ml pożywki w stadium I (pożywki różnicującej komórki macierzyste zawierającej 8-12 μM CHIR99021) (Tabela 1), określana jako Dzień 0.</li>
	<li>Hodować je w inkubatorze w temperaturze 37 °C przez 4 dni, co dwa dni odświeżać pożywkę w fazie I.</li>
</ol>
2. Indukowanie nefrogennej mezodermy pośredniej (IM)
<ol>
	<li>W dniu 4 usuń pożywkę stopnia I i przemyj ją 2 ml DPBS.</li>
	<li>Dodać 2 ml pożywki II stopnia do komórek (pożywka różnicująca komórki macierzyste zawierająca 200 ng/ml FGF9, 1 μg/ml heparyny i 1 μM CHIR99021) (Tabela 1).</li>
	<li>Hodować je w inkubatorze w temperaturze 37 °C i odświeżać pożywkę co 2 dni aż do dnia 7.</li>
</ol>
3. Generowanie organoidów nerkowych w hodowli zawiesinowej
UWAGA: Podczas okresu obserwacji od dnia 0 do dnia 7, stan komórek jest krytyczny. Jeśli komórki wykazują udaną ekspansję i gromadzą się bez znaczących szczątków komórkowych, świadczy to o pomyślnym wyprowadzeniu mezodermy pośredniej (IM), wskazując na gotowość do przejścia do następnego etapu. Jeśli jednak komórki wykazują oznaki początkowej apoptozy, po której następuje martwica lub pęknięcie, może to wskazywać na niewłaściwe stężenia CHIR99021 lub gęstości komórek.
<ol>
	<li>W dniu 7 usuń pożywkę II stopnia i przemyj komórki 2 ml DPBS.</li>
	<li>Dodać 1 ml roztworu do oddzielania komórek do każdego dołka i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut, aż komórki uzyskają załamanie światła w kontraście fazowym.</li>
	<li>Odpipetować 1 ml pożywki etapu II do komórek, wymieszać i upewnić się, że komórki oderwały się od powierzchni.</li>
	<li>Zebrać zawiesinę komórek do probówki o pojemności 15 ml i odwirować przy 400 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 2 ml pożywki stopnia III (pożywka różnicująca komórki macierzyste zawierające 200 ng/ml FGF9, 1 μg/ml heparyny i 1 μM CHIR99021 w 0,1% metylocelulozie (MC), 0,1% polialkoholu winylowego (PVA)) uzupełnionej inhibitorem 10 μM kinazy Rho (Y-27632) (patrz tabela materiałów). Delikatnie wymieszaj.</li>
	<li>Wymieszaj zawiesinę komórkową i nasiona z 6-dołkową płytką o niskiej przyczepności w stosunku 1:3. Umieścić płytkę na wytrząsarce orbitalnej (odpornej na CO2 , obracającej się z prędkością 60 obr./min) w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
	<li>24 godziny później usuń inhibitor kinazy Rho (Y-27632) i dodaj pożywkę III stopnia (suplement pożywki różnicowania komórek macierzystych z 200 ng / ml FGF9, 1 μg / ml heparyny, 1 μM CHIR99021, 0,1% MC, 0,1% PVA). Kultura przez 2 dni. Zmień pożywkę w kulturze zawiesiny, wykonując poniższe czynności:
	<ol>
		<li>Odciąć końcówkę pipety o pojemności 1 ml za pomocą aseptycznych nożyczek.</li>
		<li>Delikatnie potrząśnij płytką 6-dołkową, aby ułożyć organoidy na środku płytki.</li>
		<li>Odessać organoidy za pomocą przygotowanych pipet do probówki o pojemności 15 ml i odstawić na 5 minut.</li>
		<li>Odessać supernatant i pozostawić organoidy na dnie probówki.</li>
		<li>Dodać świeżą pożywkę, aby ponownie zawiesić organoidy i ponownie potalerzować z powrotem na 6-dołkową płytkę o niskiej przyczepności.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kontynuować wytrząsanie płytki o niskiej przyczepności z prędkością 60 obr./min w inkubatorze. Zmieniaj pożywkę stopnia III co dwa dni aż do dnia 12.</li>
	<li>W dniu 12 należy zmienić pożywkę na pożywkę w stadium IV (pożywka różnicująca komórki macierzyste zawierająca 0,1% MC i 0,1% PVA).</li>
	<li>Zmieniaj podłoże co dwa dni aż do 25 dnia. Organoidy mogą stopniowo przekształcać się w dojrzałe struktury nefronowe od 12 do 25 dnia.</li>
</ol>
4. Barwienie immunofluorescencyjne organoidów nerkowych
<ol>
	<li>Zebrać organoidy nerkowe do probówki o pojemności 15 ml i przemyć 2 ml PBS.</li>
	<li>Po pozostawieniu na 5-10 minut, utrwalić organoidy nerkowe w świeżo przygotowanym 2% PFA na 20 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Usunąć PFA i umyć organoidy 1 ml PBS zawierającym 0,3% Triton X-100 (0,3% PBST), wytrząsnąć równomiernie na wytrząsarce (z prędkością obrotową nieprzekraczającą 60 obr./min) przez 8 minut, odstawić na 5 minut, a następnie usunąć supernatant. Powtórz trzy razy. 
	UWAGA: Organoidy można przechowywać w 0,3% PBST w temperaturze 4°C przez 2-4 tygodnie.</li>
	<li>Inkubować utrwalone organoidy z 10% surowicą osła w PBST (bufor blokujący) (patrz tabela materiałów) przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Rozcieńczyć przeciwciała pierwszorzędowe (wymienione w Tabeli materiałów) w buforze blokującym w stosunku 1:300.</li>
	<li>Inkubować organoidy z przeciwciałami pierwszorzędowymi przez noc w temperaturze 4 °C z mieszaniem. 
	UWAGA: Upewnij się, że kłębuszki nerkowe i kanaliki mogą być barwione jednocześnie na jednym organoidzie.</li>
	<li>Umyć organoidy 1 ml 0,3% PBST, wstrząsnąć równomiernie na wytrząsarce (z prędkością obrotową nieprzekraczającą 60 obr./min) przez 8 minut, odstawić na 5 minut, a następnie usunąć supernatant. Powtórz trzy razy.</li>
	<li>Inkubować organoidy z przeciwciałami drugorzędowymi (wymienionymi w tabeli materiałów) i DAPI przez noc w temperaturze 4 °C z mieszaniem. Następnie powtórz krok 4.7. 
	UWAGA: Zarówno przeciwciało drugorzędowe, jak i DAPI rozcieńcza się w roztworze blokującym, przeciwciałie drugorzędowym (1:400) i DAPI (1:1000).</li>
	<li>Po barwieniu odwodnić organoidy metanolem (25%, 50%, 75% i 100% przez 5 minut), a następnie przesiąknąć alkoholem benzylowym i benzoesanem benzylu (BABB, stosunek 1:2) (patrz tabela materiałów) przez 5 minut.</li>
	<li>Oczyszczone organoidy rozdrobnić na naczyniu ze szklanym dnem (patrz Tabela Materiałów) i zbadać je za pomocą mikroskopii konfokalnej. 
	UWAGA: Podczas obrazowania wybierz szalkę Petriego na dnie szklanego naczynia, a podczas przenikania umieść BABB bezpośrednio na szalce Petriego, aby dno naczynia było wilgotne.</li>
</ol>
5. Test wychwytu dekstranu in vitro
<ol>
	<li>W dniu 25 inkubować organoidy ze 100 μg/ml znakowanego fluorescencyjnie dekstranu (patrz tabela materiałów) przez 4 godziny w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
	<li>4 godziny później przełącz się na nową pożywkę i uchwyć obrazy żywych kultur komórkowych za pomocą szerokokątnego mikroskopu fluorescencyjnego.</li>
</ol>

Using Induced Pluripotent Stem Cell Suspension for Kidney Organoid Production

<ol><li>Tekguc, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kidney+organoids%3A+a+pioneering+model+for+kidney+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+Research%22%5BJournal%5D)">Kidney organoids: a pioneering model for kidney diseases.</a> Translational Research. 250, 1-17 (2022).</li>
<li>Hill, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+prevalence+of+chronic+kidney+disease+-+a+systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Global prevalence of chronic kidney disease - a systematic review and meta-analysis.</a> PLOS ONE. 11 (7), 0158765(2016).</li>
<li>Rossi, G., Manfrin, A., Lutolf, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+and+potential+in+organoid+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Progress and potential in organoid research.</a> Nature Reviews Genetics. 19 (11), 671-687 (2018).</li>
<li>Takasato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directing+human+embryonic+stem+cell+differentiation+towards+a+renal+lineage+generates+a+self-organizing+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Directing human embryonic stem cell differentiation towards a renal lineage generates a self-organizing kidney.</a> Nature Cell Biology. 16 (1), 118-126 (2014).</li>
<li>Morizane, R., Lam, A. Q., Freedman, B. S., Kishi, S., Valerius, M. T., Bonventre, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nephron+organoids+derived+from+human+pluripotent+stem+cells+model+kidney+development+and+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Nephron organoids derived from human pluripotent stem cells model kidney development and injury.</a> Nature Biotechnology. 33 (11), 1193-1200 (2015).</li>
<li>Freedman, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+kidney+disease+with+CRISPR-mutant+kidney+organoids+derived+from+human+pluripotent+epiblast+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Modelling kidney disease with CRISPR-mutant kidney organoids derived from human pluripotent epiblast spheroids.</a> Nature Communications. 6 (1), 8715(2015).</li>
<li>Takasato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kidney+organoids+from+human+iPS+cells+contain+multiple+lineages+and+model+human+nephrogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis.</a> Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).</li>
<li>Mugford, J. W., Sipilä, P., McMahon, J. A., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osr1+expression+demarcates+a+multi-potent+population+of+intermediate+mesoderm+that+undergoes+progressive+restriction+to+an+Osr1-dependent+nephron+progenitor+compartment+within+the+mammalian+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Osr1 expression demarcates a multi-potent population of intermediate mesoderm that undergoes progressive restriction to an Osr1-dependent nephron progenitor compartment within the mammalian kidney.</a> Developmental biology. 324 (1), 88-98 (2008).</li>
<li>SaxOn, L., Sariola, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+organogenesis+of+the+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Early organogenesis of the kidney.</a> Pediatric Nephrology. 1, 385-392 (1987).</li>
<li>Kobayashi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Six2+defines+and+regulates+a+multipotent+self-renewing+nephron+progenitor+population+throughout+mammalian+kidney+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Six2 defines and regulates a multipotent self-renewing nephron progenitor population throughout mammalian kidney development.</a> Cell Stem Cell. 3 (2), 169-181 (2008).</li>
<li>Boyle, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fate+mapping+using+Cited1-CreERT2+mice+demonstrates+that+the+cap+mesenchyme+contains+self-renewing+progenitor+cells+and+gives+rise+exclusively+to+nephronic+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Fate mapping using Cited1-CreERT2 mice demonstrates that the cap mesenchyme contains self-renewing progenitor cells and gives rise exclusively to nephronic epithelia.</a> Developmental Biology. 313 (1), 234-245 (2008).</li>
<li>Nishinakamura, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+kidney+organoids%3A+progress+and+remaining+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Human kidney organoids: progress and remaining challenges.</a> Nature Reviews Nephrology. 15 (10), 613-624 (2019).</li>
<li>Kumar, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kidney+micro-organoids+in+suspension+culture+as+a+scalable+source+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+kidney+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Kidney micro-organoids in suspension culture as a scalable source of human pluripotent stem cell-derived kidney cells.</a> Development. 146 (5), 172361(2019).</li>
<li>Takasato, M., Er, P. X., Chiu, H. S., Little, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+kidney+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generation of kidney organoids from human pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 11 (9), 1681-1692 (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie zgłosili potencjalnego konfliktu interesów.

Opisano szczegółowy protokół generowania organoidów nerkowych z iPSC, obejmujący niewielkie modyfikacje podłoża podstawowego, początkowej gęstości komórek i stężenia CHIR99021. W różnych eksperymentach stwierdzono, że krytycznymi czynnikami dla pomyślnego wytworzenia organoidów nerkowych są początkowe różnicowanie mezodermy pośredniej (IM) i stan komórki w dniu 7. Co więcej, różne linie iPSC wykazywały różnice w potencjale proliferacji i różnicowania komórek, co skutkowało różnymi optymalnymi gęstościami komórek i stężen...

Nerka odgrywa kluczową rolę w utrzymaniu fizjologicznej homeostazy, w zależności od jej jednostki funkcjonalnej. Nefrony, które wydalają produkty przemiany materii, mogą regulować skład płynów ustrojowych. Przewlekła choroba nerek (PChN), spowodowana dziedzicznymi mutacjami lub innymi czynnikami wysokiego ryzyka, ostatecznie przekształci się w schyłkową niewydolność nerek (ESKD)1,2. ESKD jest najwyraźniej spowodowane ograniczoną zdolnością regeneracji nefronów. W związku z tym konieczna jest terapia nerkozastępcza. Ukierunkowane różnicowanie ludzkich iPSC umożliwia generowanie in vitro specyficznych dla pacjenta organoidów nerkowych 3D, które można wykorzystać do badania rozwoju nerek, modelowania chorób specyficznych dla pacjenta i przeprowadzania badań przesiewowych leków nefrotoksycznych3,4.
Podczas rozwoju embrionalnego, nerki pochodzą z mezodermy pośredniej (IM), która odróżnia się od prążka pierwotnego (PS). Klasyczny szlak sygnałowy WNT może indukować dodatkowe różnicowanie IM przy skoordynowanym udziale FGF (FGF9, FGF20) i BMP (sygnalizacja Bmp7 przez JNK)5,6,7. Wytwarzają one dwie ważne populacje komórek progenitorowych nefryki (NPC): pączek moczowodu (UB) i mezenchymę śródnerczyczą (MM), tworzące odpowiednio kanały zbiorcze i nefron8,9. Każdy nefron składa się z segmentów kłębuszkowych i rurkowych, takich jak kanaliki proksymalne i dystalne oraz pętla Henle10,11. Zgodnie z teorią wspomnianą powyżej, obecnie opublikowane protokoły naśladują kaskady sygnałowe i stymulację czynnika wzrostu w celu indukcji organoidów nerkowych5,12.
W ciągu ostatnich kilku lat opracowano wiele protokołów różnicujących ludzkie iPSC na organoidy nerkowe5,6,7,12. Takasato i wsp.7 zoptymalizowali czas trwania leczenia CHIR (agonistą WNT) przed zastąpieniem przez FGF9. Zgodnie z ich protokołem, ekspozycja na CHIR przez 4 dni, a następnie FGF9 przez 3 dni, jest najskuteczniejszym sposobem wywołania IM z iPSC. Filtry Transwell zostały wykorzystane jako format hodowli w ich procedurze; Jednak ta metoda jest trudna dla początkujących. Dlatego Kumar i in.13 próbowali zmienić format kultury i zdecydowali się zawiesić kulturę. Dysocjowali przylegające komórki w dniu 7 w celu wysiewu na płytkach o niskiej przyczepności, aby pomóc im złożyć się w ciała embrionoidalne (EB), które zawierają struktury podobne do nefronów. Efekt wsadowy tych metod był jednak widoczny, zwłaszcza w przypadku różnych iPSC. Ponadto w różnej literaturze stwierdzono, że stężenie CHIR wahało się od 7 μM do 12 μM5,13,14.
Spekulowaliśmy, że stężenie gęstości komórek i CHIR może wpływać na wytwarzanie organoidów w różnych iPSC, co zostało wielokrotnie zweryfikowane w naszych eksperymentach. Obecny protokół nieznacznie zmodyfikował metodę badania Kumar et al.13 i zapewnił użytkownikom procedurę krok po kroku. Schemat i schemat podejścia są pokazane w Rysunek 1.

<table><tbody><tr><td>96 Płytka do hodowli komórkowych dołków, płaskodenna</td><td>NEST</td><td>Cat #701003</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>Cat #07920</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciała</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alkohol benzylowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat #100-51-6</td><td></td></tr><tr><td>Benzoesan benzylu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat #120-51-4</td><td></td></tr><tr><td>Szafa bezpieczeństwa biologicznego</td><td>Kot Haier</td><td>#HR40  <img alt="Równanie 1" src="/files/ftp_upload/65698/65698eq01.jpg" style="margines: auto; ">  A2</td><td></td></tr><tr><td>Biotyna anty-ludzka LTL (1:300)</td><td>Vector Laboratories</td><td>Cat #B-1325</td><td></td></tr><tr><td>Komórki jednojądrzaste krwi hiPS-B1 (iPSc, samica)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Wytrząsarka poziomu dwutlenku węgla</td><td>HAMANY</td><td>Cat #C0-06UC6</td><td></td></tr><tr><td>Chemikalia, peptydy i białka</td><td></td><td></td><td></td>rekombinowane</tr><tr><td>CHIR99021 (aktywator szlaku Wnt)</td><td>STEMCELL Technologie</td><td>Cat #72054</td><td></td></tr><tr><td>Costar Wielokrotna 6-dołkowa płytka do hodowli komórkowej</td><td>Corning</td><td>Cat #3516</td><td></td></tr><tr><td>Costar Ultra-Low Attachment 6-dołkowa płytka</td><td>Corning</td><td>Cat #3471</td><td></td></tr><tr><td>CryoStor CS10</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>Cat #07930</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór do barwienia DAPI</td><td>Coolaber</td><td>Cat #SL7102</td><td></td></tr><tr><td>Dextran, Alexa Fluor 647</td><td>Thermo SCIENTIFIC</td><td>Cat #D22914</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12 HEPES-free</td><td>Servicebio</td><td>Cat #G4610</td><td></td></tr><tr><td>Donkey Anti-Sheep IgG H&amp; L (Alexa Fluor 647)</td><td>Abcam</td><td>Cat #ab150179</td><td></td></tr><tr><td>Surowica osła stoste</td><td>Meilunbio</td><td>Cat #MB4516-1</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS (bez wapnia, magnezu, czerwieni fenolowej)</td><td>Solarbio Life Science</td><td>Cat #D1040</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator do suchej kąpieli</td><td>Shanghai Jingxin</td><td>Cat #JX-10</td><td></td></tr><tr><td>Dylight 488-Goat Anti-Mouse IgG (1:400)</td><td>Earthox</td><td>Cat #E032210</td><td></td></tr><tr><td>Dylight 488-Koza IgG Anty-Królika (1:400)</td><td>Earthox</td><td>Cat #E032220</td><td></td></tr><tr><td>Dylight 549-Goat Anti-Mouse IgG (1:400)</td><td>Earthox</td><td>Cat #E032310</td><td></td></tr><tr><td>Dylight 549-Koza IgG Anty-Królika (1:400)</td><td>Earthox</td><td>Cat #E032320</td><td></td></tr><tr><td>Dylight 649-Koza IgG Anty-Królika (1:400)</td><td>Kot Earthox</td><td>#E032620</td><td></td></tr><tr><td>Modele eksperymentalne: Linie komórkowe</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Forma Steri-Cycle CO2 Inkubator</td><td>Thermo SCIENTIFIC</td><td>Cat #370</td><td></td></tr><tr><td>Geltre LDEV-Free</td><td>Gibco</td><td>Cat #A1413202</td><td></td></tr><tr><td>Naczynia hodowlane ze szklanym dnem</td><td>NEST</td><td>Kot #801002</td><td></td></tr><tr><td>Koza anty-ludzka CUBN (1:300)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>Cat #sc-20607</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór heparyny (suplement do hodowli komórkowych)</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>Cat #07980</td><td></td></tr><tr><td>Ludzki rekombinowany FGF-9</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>Cat #78161</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony</td><td>OLYMPUS</td><td>Cat #CKX53</td><td></td></tr><tr><td>Laserowy skaningowy mikroskop konfokalny</td><td>OLYMPUS</td><td>Cat #FV3000</td><td></td></tr><tr><td>Mikrowirówka</td><td></td><td></td> Sigma-Aldrich Cat #M7027 <td></td></tr><tr><td></td><td>HENGNUO</td><td>Kot #2-4B</td><td></td></tr><tr><td>Mysz anty-ludzka CD31 (1:300)</td><td>BD Biosciences</td><td>Kot #555444</td><td></td></tr><tr><td>Mysz anty-ludzka ECAD (1:300)</td><td>BD Biosciences</td><td>Kot #610182</td><td></td></tr><tr><td>Mysz anty-ludzka Integryna beta 1 (1:300)</td><td>Abcam</td><td>Kot #ab30394</td><td></td></tr><tr><td>Mysz anty-ludzka MEIS 1/2/3 (1:300)</td><td>Thermo SCIENTIFIC</td><td>Kot #39795</td><td></td></tr><tr><td>Mowiol 4-88 ( Alkohol poliwinylowy 4-88)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat #81381</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR1 5X Suplement</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>Cat #85852</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR1 Basal Medium</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>Cat #85851</td><td></td></tr><tr><td>Nunc Fiolki CryoTube</td><td>Thermo SCIENTIFIC</td><td>Cat #377267</td><td></td></tr><tr><td>Inne</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Królik anty-ludzki GATA3 (1:300)</td><td>Technologia sygnalizacji komórkowej</td><td>Kot #5852S</td><td></td></tr><tr><td>Królik anty-ludzki LRP2 (1:300)</td><td>Sapphire Bioscience</td><td>Cat #NBP2-39033</td><td></td></tr><tr><td>Królik anty-ludzki Synaptopodin (1:300)</td><td>Abcam</td><td>Kot #ab224491</td><td></td></tr><tr><td>Królik anty-ludzki WT1 (1:300)</td><td>Abcam</td><td>Kot #ab89901</td><td></td></tr><tr><td>Królik anty-mysz PDGFR (1:300)</td><td>Kot Abcam</td><td>#ab32570</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowana albumina surowicy ludzkiej (rHSA)</td><td>YEASEN</td><td>Kot #20901ES03</td><td></td></tr><tr><td>Owca anty-ludzki NPHS1 (1:300)</td><td>R&amp; D Systems</td><td>Cat #AF4269</td><td></td></tr><tr><td>STEMdiff APEL 2 Medium</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>Cat #05275</td><td></td></tr><tr><td>Streptawidyna Cy3 (1:400)</td><td>Gene Tex</td><td>Cat #GTX85902</td><td></td></tr><tr><td>Versene (1X)</td><td>Gibco</td><td>Cat #15040066</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 (dichlorowodorek)</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>Cat #72304</td><td></td></tr></tbody></table>

generowanie organoidów nerkowych w zawiesinie z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

Generating Kidney Organoids in Suspension from Induced Pluripotent Stem Cells

Organoidy nerkowe mogą być generowane z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) za pomocą różnych metod. Te organoidy są bardzo obiecujące w modelowaniu chorób, badaniach przesiewowych leków i potencjalnych zastosowaniach terapeutycznych. W artykule przedstawiono krok po kroku procedurę tworzenia organoidów nerkowych z iPSC, począwszy od tylnej prążka pierwotnej (PS) do mezodermy pośredniej (IM). Podejście to opiera się na pożywce APEL 2, która jest zdefiniowaną, wolną od składników pochodzenia zwierzęcego. Jest uzupełniany wysokim stężeniem agonisty WNT (CHIR99021) przez okres 4 dni, a następnie czynnikiem wzrostu fibroblastów 9 (FGF9)/heparyną i niskim stężeniem CHIR99021 przez dodatkowe 3 dni. Podczas tego procesu kładzie się nacisk na wybór optymalnej gęstości komórek i stężenia CHIR99021 na początku iPSC, ponieważ czynniki te mają kluczowe znaczenie dla pomyślnego wytwarzania organoidów nerkowych. Ważnym aspektem tego protokołu jest hodowla zawiesiny w płytce o niskiej przyczepności, co pozwala IM stopniowo przekształcać się w struktury nefronowe, obejmujące kłębuszkowe, proksymalne rurkowe i dystalne struktury rurkowe, wszystkie przedstawione w wizualnie zrozumiałym formacie. Ogólnie rzecz biorąc, ten szczegółowy protokół oferuje wydajną i specyficzną technikę wytwarzania organoidów nerkowych z różnych iPSC, zapewniając pomyślne i spójne wyniki.

Produkcję IM uzyskuje się poprzez aktywację kanonicznego szlaku sygnałowego WNT przy użyciu inhibitora GSK3 CHIR99021, a następnie FGF9/heparyną. Od dnia 0 do dnia 4 iPSCs szybko namnażają się i przyjmują kształty romboidalne lub trójkątne. Konfluencja osiąga 90%-100% i narasta równomiernie aż do dnia 7. W hodowli zawiesinowej, po dysocjacji w dniu 7, agregaty spontanicznie tworzą struktury nefronowe. Organoidy nerek wytworzone w hodowli zawiesinowej wykazują struktury rurkowe, które są łatwo widoczne w obrazach w świetl...

Ten protokół przedstawia kompleksową i efektywną metodę wytwarzania organoidów nerkowych z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) przy użyciu warunków hodowli zawiesinowych. Główny nacisk tego badania kładzie się na określenie początkowej gęstości komórek i stężenia agonisty WNT, co przynosi korzyści badaczom zainteresowanym badaniami nad organoidami nerkowymi.

Generowanie organoidów nerkowych w zawiesinie z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

Kidney organoids can be generated from induced pluripotent stem cells (iPSCs) through various approaches. These organoids hold great promise for disease ...

W naszych badaniach przedstawiono kompleksową i efektywną metodę wytwarzania organoidów nerkowych z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z wykorzystaniem warunków hodowli zawiesinowych. Podkreślamy znaczenie początkowej gęstości komórek i stężenia agonisty WNT podczas fazy indukcji, co pozwoli kształcić nowych badaczy organoidów. Obecnie trudno jest uzyskać pojedynczą linię komórkową o dużej gęstości dla iPSC.Wpływ partii był zauważalny, szczególnie w różnych liniach iPSC. Organoidy nerkowe każdej partii mogą mieć różną formę i wielkość. Konieczne jest podjęcie kilku prób, aby uzyskać najlepszą początkową gęstość komórek i stężenie CHIR dla jednej linii iPSC.Ustaliliśmy, że początkowe różnicowanie metody pośredniej jest ważne dla pomyślnego tworzenia organoidów nerkowych. Nasz protokół szczegółowo opisuje, jak wybrać optymalną gęstość komórek i stężenia CHIR podczas procesu, ponieważ różne linie iPSC wykazały różnice w zdolności do proliferacji i różnicowania komórek. Naukowcy mogą szybko wygenerować specyficzne organoidy nerkowe z ich iPSC.Zgodnie z naszym protokołem, dostosowując gęstość komórek i stężenie CHIR, niewątpliwie korzystne dla wszystkich naszych badaczy jest skupienie się na chorobie nerek. Nasze przyszłe badania laboratoryjne mają na celu optymalizację metody protokołu w modelach chorób, regenerację nowych leków i badania przesiewowe leków. W ciągu ostatnich pięciu lat nasze laboratorium skupi się na epigenetyce i opracowywaniu leków na temat komórek w różnych dziedzicznych chorobach nerek, w oparciu o rozwój pacjenta, iPSC i modele chorób zorganizowanych przez nerki.Rozpocznij od przemycia indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych lub iPSC na 6-dołkowej płytce pokrytej matrycą membranową za pomocą dwóch mililitrów DPBS. Zassać DPBS za pomocą pipety. Następnie dodaj jeden mililitr dostępnego w handlu roztworu do odrywania komórek, aby odłączyć iPSC.Następnie umieść komórkę w inkubatorze pod kątem 37 stopni na pięć minut. Teraz odpipetuj jeden mililitr mTeSR na iPSC, upewniając się, że komórki oddzieliły się od plastikowej powierzchni. Odwirować te komórki w temperaturze 400 g przez trzy minuty w temperaturze pokojowej.Ponownie zawiesić osad komórkowy. Następnie policz numery komórek za pomocą hemocytometru. Następnie wysiewaj komórki o różnych gęstościach na 6-dołkowej płytce, która została pokryta matrycą membranową.Hoduj je za pomocą mTeSR uzupełnionego 10-mikromolowym inhibitorem kinazy Rho. Hoduj płytki przez noc w inkubatorze dwutlenku węgla ustawionym na 37 stopni Celsjusza. Następnego dnia odessać mTeSR i umyć komórki dwoma mililitrami DPBS.Następnie dodaj do komórek dwa mililitry pożywki etapu I. Następnie umieść komórki w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza na cztery dni. Czwartego dnia usuń pożywkę etapu I i umyj komórki dwoma mililitrami DPBS.Następnie dodaj dwa mililitry pożywki etapu II do komórek przed inkubacją komórek jak poprzednio. Od dnia zerowego do dnia czwartego iPSC szybko się rozrastały i przybrały romboidalne lub trójkątne kształty. Zbieg osiągnął od 90 do 100% i kumulował się równomiernie do siódmego dnia.Po posadzie zawiesinowej agregaty spontanicznie tworzą struktury nefronowe po dysocjacji w siódmym dniu. Rozpocząć od usunięcia pożywki II stopnia z zawiesiny komórek iPSC w siódmym dniu hodowli. Teraz umyj komórki dwoma mililitrami DPBS.Odpipetować jeden mililitr roztworu do odrywania komórek do każdej studzienki. Następnie umieść płytkę w inkubatorze pod kątem 37 stopni na pięć minut. Po inkubacji dodać jeden mililitr pożywki etapu II do komórek i dokładnie wymieszać, aż komórki oderwą się od powierzchni.Zbierz zawiesinę komórek do 15-mililitrowej probówki. Następnie odwiruj go w 400 g przez trzy minuty w temperaturze pokojowej. Po odwirowaniu odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w dwóch mililitrach pożywki stopnia III.Delikatnie wymieszaj roztwór. Teraz umieść zawiesinę w 6-dołkowej płytce o niskiej przyczepności w stosunku 1:3. Umieść płytkę na wytrząsarce orbitalnej w inkubatorze ustawionym na 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla.Aby usunąć pożywkę z kultury zawiesiny, najpierw odetnij końcówkę pipety o pojemności jednego mililitra za pomocą aseptycznych nożyczek. Następnie delikatnie wymieszaj 6-dołkową płytkę, aby scentralizować organoidy. Następnie odessać organoidy przygotowanymi pipetami i umieścić je w 15-mililitrowej probówce, odstawiając na pięć minut.Odessać supernatant, upewniając się, że organoidy pozostają u podstawy probówki. Następnie odpipetować pożywkę stopnia III do płytki. Odpipetować mieszaninę, aby ponownie zawiesić organoidy.Ponownie umieść organoidy z powrotem na 6-dołkowej płytce o niskiej przyczepności. Kontynuuj wytrząsanie płytki o niskiej przyczepności z prędkością 60 obrotów na minutę w inkubatorze. W 12 dniu zastąp pożywkę pożywką w stadium IV.Organoidy nerkowe mają struktury przypominające rurki i można je łatwo zaobserwować na obrazach jasnego pola po 18 dniach agregacji. Indukowano komórki śródbłonka CD31. Dekstran był wprowadzany do kanalików proksymalnych organoidów nerkowych.

generating-kidney-organoids-suspension-from-induced-pluripotent-stem

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

W tym filmie opisujemy protokół pozyskiwania ludzkich podocytów nerkowych z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych poprzez różnicowanie komórek w określonych warunkach chemicznych. Wygenerowane podocyty mogą być wykorzystane do badań nefrotoksyczności i modelowania chorób.

Pozyskiwanie ludzkich podocytów nerkowych z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych: procedura ukierunkowanego różnicowania dojrzałych podocytów nerkowych z komórek macierzystych

Ten film demonstruje test do generowania organoidów mózgowych z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC). Ludzkie komórki iPS są indukowane do tworzenia ciał embrionalnych (EB). EB są hodowane na rusztowaniu polimerowym przy użyciu pożywki indukcyjnej, co sprzyja różnicowaniu się w nerwowe komórki macierzyste, komórki progenitorowe i niedojrzałe neurony. Na koniec EB są osadzane w matrycy i przenoszone do pożywki podtrzymującej w celu tworzenia organoidów mózgowych.

Generowanie indukowanych pluripotencjalnych organoidów mózgowych pochodzących z komórek macierzystych

Ta praca opisuje dwie metody badania rozwoju narządów, ulepszone ustawienie ksenotransplantacji na błonie kosmówkowo-omoczniowej (CAM) z ptasich embrionów, które pozwala na unaczynienie hodowanych narządów embrionalnych i organoidów oraz nowatorską metodę hodowli narządów w stałym kierunku z zmodyfikowanymi warunkami eksperymentalnymi, która pozwala na obrazowanie konfokalne w wysokiej rozdzielczości w trybie poklatkowym.

Optymalizacja organoidów nerkowych i hodowli organotypowych pod kątem unaczynienia, przedłużony rozwój i ulepszone obrazowanie mikroskopowe

Hodowle kanalików nerkowych stanowią cenny model in vitro do badania fizjologii i chorób nerek. Kanaliki można ustalić z tkanki nerkowej (zdrowej i chorej), a także z moczu, który stanowi łatwo dostępne i mniej inwazyjne źródło materiału badawczego.

Wytwarzanie ludzkich kanalików nerkowych z tkanek i moczu

Tutaj opisujemy protokół generowania organoidów nerkowych z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC). Protokół ten generuje organoidy nerkowe w ciągu dwóch tygodni. Powstałe w ten sposób organoidy nerkowe można hodować w dużych kolbach obrotowych lub wielodołkowych magnetycznych płytkach mieszających w celu równoległego testowania leków.

Uproszczona metoda generowania organoidów nerkowych z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Prezentowany tutaj jest protokół do opracowania spersonalizowanego systemu organ-on-a-chip, który podsumowuje strukturę i funkcję bariery filtracyjnej kłębuszków nerkowych poprzez integrację genetycznie dopasowanych komórek nabłonka i śródbłonka naczyniowego, zróżnicowanych z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych. Ten bioinżynieryjny system może przyczynić się do rozwoju medycyny precyzyjnej nerek i powiązanych zastosowań.

Izogeniczny chip kłębuszków nerkowych zaprojektowany z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół przeszczepu organoidów nerkowych w jamie celomicznej zarodków kurczaków. Metoda ta indukuje unaczynienie i przyspieszone dojrzewanie organoidów w ciągu 8 dni i może być wykorzystana do skutecznego badania tych procesów.

Skuteczne unaczynienie organoidów nerkowych poprzez docelomiczne przeszczepienie zarodków kurczaków

Tutaj prezentujemy protokoły hodowli ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC), używane do różnicowania hPSC na hematopoetyczne komórki progenitorowe CD34+. Metoda ta wykorzystuje specyficzną dla etapu manipulację kanoniczną sygnalizacją WNT w celu określenia komórek wyłącznie do ostatecznego lub pierwotnego programu krwiotwórczego.

Ukierunkowane różnicowanie pierwotnych i ostatecznych progenitorów hematopoetycznych z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Przedstawiamy protokół generowania linii chondrogennej z ludzkiej krwi obwodowej (PB) za pomocą indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) przy użyciu metody bez integracji, która obejmuje tworzenie ciała zarodkowego (EB), ekspansję komórek fibroblastycznych i indukcję chondrogeneczną.

Różnicowanie chondrocytów od pluripotencjalnych komórek macierzystych pochodzących z krwi obwodowej pochodzących od człowieka

Tutaj proponujemy protokół chondrogenicznego różnicowania od ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych pochodzących z krwi pępowinowej.

Tworzenie chondrogennych osadów z pluripotencjalnych komórek macierzystych pochodzących z krwi pępowinowej

Poznaj metodę generowania organoidów nerkowych z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych w zawiesinie. Protokół optymalizuje gęstość komórek i stężenie agonisty WNT dla badaczy biologii komórek macierzystych.

Generowanie organoidów nerkowych w zawiesinie z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

Przeglądaj więcej filmów