Generowanie organoidów nerkowych w zawiesinie z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

W naszych badaniach przedstawiono kompleksową i efektywną metodę wytwarzania organoidów nerkowych z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z wykorzystaniem warunków hodowli zawiesinowych. Podkreślamy znaczenie początkowej gęstości komórek i stężenia agonisty WNT podczas fazy indukcji, co pozwoli kształcić nowych badaczy organoidów. Obecnie trudno jest uzyskać pojedynczą linię komórkową o dużej gęstości dla iPSC.

Wpływ partii był zauważalny, szczególnie w różnych liniach iPSC. Organoidy nerkowe każdej partii mogą mieć różną formę i wielkość. Konieczne jest podjęcie kilku prób, aby uzyskać najlepszą początkową gęstość komórek i stężenie CHIR dla jednej linii iPSC.

Ustaliliśmy, że początkowe różnicowanie metody pośredniej jest ważne dla pomyślnego tworzenia organoidów nerkowych. Nasz protokół szczegółowo opisuje, jak wybrać optymalną gęstość komórek i stężenia CHIR podczas procesu, ponieważ różne linie iPSC wykazały różnice w zdolności do proliferacji i różnicowania komórek. Naukowcy mogą szybko wygenerować specyficzne organoidy nerkowe z ich iPSC.

Zgodnie z naszym protokołem, dostosowując gęstość komórek i stężenie CHIR, niewątpliwie korzystne dla wszystkich naszych badaczy jest skupienie się na chorobie nerek. Nasze przyszłe badania laboratoryjne mają na celu optymalizację metody protokołu w modelach chorób, regenerację nowych leków i badania przesiewowe leków. W ciągu ostatnich pięciu lat nasze laboratorium skupi się na epigenetyce i opracowywaniu leków na temat komórek w różnych dziedzicznych chorobach nerek, w oparciu o rozwój pacjenta, iPSC i modele chorób zorganizowanych przez nerki.

Rozpocznij od przemycia indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych lub iPSC na 6-dołkowej płytce pokrytej matrycą membranową za pomocą dwóch mililitrów DPBS. Zassać DPBS za pomocą pipety. Następnie dodaj jeden mililitr dostępnego w handlu roztworu do odrywania komórek, aby odłączyć iPSC.

Następnie umieść komórkę w inkubatorze pod kątem 37 stopni na pięć minut. Teraz odpipetuj jeden mililitr mTeSR na iPSC, upewniając się, że komórki oddzieliły się od plastikowej powierzchni. Odwirować te komórki w temperaturze 400 g przez trzy minuty w temperaturze pokojowej.

Ponownie zawiesić osad komórkowy. Następnie policz numery komórek za pomocą hemocytometru. Następnie wysiewaj komórki o różnych gęstościach na 6-dołkowej płytce, która została pokryta matrycą membranową.

Hoduj je za pomocą mTeSR uzupełnionego 10-mikromolowym inhibitorem kinazy Rho. Hoduj płytki przez noc w inkubatorze dwutlenku węgla ustawionym na 37 stopni Celsjusza. Następnego dnia odessać mTeSR i umyć komórki dwoma mililitrami DPBS.

Następnie dodaj do komórek dwa mililitry pożywki etapu I. Następnie umieść komórki w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza na cztery dni. Czwartego dnia usuń pożywkę etapu I i umyj komórki dwoma mililitrami DPBS.

Następnie dodaj dwa mililitry pożywki etapu II do komórek przed inkubacją komórek jak poprzednio. Od dnia zerowego do dnia czwartego iPSC szybko się rozrastały i przybrały romboidalne lub trójkątne kształty. Zbieg osiągnął od 90 do 100% i kumulował się równomiernie do siódmego dnia.

Po posadzie zawiesinowej agregaty spontanicznie tworzą struktury nefronowe po dysocjacji w siódmym dniu. Rozpocząć od usunięcia pożywki II stopnia z zawiesiny komórek iPSC w siódmym dniu hodowli. Teraz umyj komórki dwoma mililitrami DPBS.

Odpipetować jeden mililitr roztworu do odrywania komórek do każdej studzienki. Następnie umieść płytkę w inkubatorze pod kątem 37 stopni na pięć minut. Po inkubacji dodać jeden mililitr pożywki etapu II do komórek i dokładnie wymieszać, aż komórki oderwą się od powierzchni.

Zbierz zawiesinę komórek do 15-mililitrowej probówki. Następnie odwiruj go w 400 g przez trzy minuty w temperaturze pokojowej. Po odwirowaniu odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w dwóch mililitrach pożywki stopnia III.

Delikatnie wymieszaj roztwór. Teraz umieść zawiesinę w 6-dołkowej płytce o niskiej przyczepności w stosunku 1:3. Umieść płytkę na wytrząsarce orbitalnej w inkubatorze ustawionym na 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla.

Aby usunąć pożywkę z kultury zawiesiny, najpierw odetnij końcówkę pipety o pojemności jednego mililitra za pomocą aseptycznych nożyczek. Następnie delikatnie wymieszaj 6-dołkową płytkę, aby scentralizować organoidy. Następnie odessać organoidy przygotowanymi pipetami i umieścić je w 15-mililitrowej probówce, odstawiając na pięć minut.

Odessać supernatant, upewniając się, że organoidy pozostają u podstawy probówki. Następnie odpipetować pożywkę stopnia III do płytki. Odpipetować mieszaninę, aby ponownie zawiesić organoidy.

Ponownie umieść organoidy z powrotem na 6-dołkowej płytce o niskiej przyczepności. Kontynuuj wytrząsanie płytki o niskiej przyczepności z prędkością 60 obrotów na minutę w inkubatorze. W 12 dniu zastąp pożywkę pożywką w stadium IV.

Organoidy nerkowe mają struktury przypominające rurki i można je łatwo zaobserwować na obrazach jasnego pola po 18 dniach agregacji. Indukowano komórki śródbłonka CD31. Dekstran był wprowadzany do kanalików proksymalnych organoidów nerkowych.