Generowanie organoidów nerkowych w zawiesinie z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych
1 września 2023
Ten protokół przedstawia kompleksową i efektywną metodę wytwarzania organoidów nerkowych z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) przy użyciu warunków hodowli zawiesinowych. Główny nacisk tego badania kładzie się na określenie początkowej gęstości komórek i stężenia agonisty WNT, co przynosi korzyści badaczom zainteresowanym badaniami nad organoidami nerkowymi.
W naszych badaniach przedstawiono kompleksową i efektywną metodę wytwarzania organoidów nerkowych z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z wykorzystaniem warunków hodowli zawiesinowych. Podkreślamy znaczenie początkowej gęstości komórek i stężenia agonisty WNT podczas fazy indukcji, co pozwoli kształcić nowych badaczy organoidów. Obecnie trudno jest uzyskać pojedynczą linię komórkową o dużej gęstości dla iPSC.
Wpływ partii był zauważalny, szczególnie w różnych liniach iPSC. Organoidy nerkowe każdej partii mogą mieć różną formę i wielkość. Konieczne jest podjęcie kilku prób, aby uzyskać najlepszą początkową gęstość komórek i stężenie CHIR dla jednej linii iPSC.
Ustaliliśmy, że początkowe różnicowanie metody pośredniej jest ważne dla pomyślnego tworzenia organoidów nerkowych. Nasz protokół szczegółowo opisuje, jak wybrać optymalną gęstość komórek i stężenia CHIR podczas procesu, ponieważ różne linie iPSC wykazały różnice w zdolności do proliferacji i różnicowania komórek. Naukowcy mogą szybko wygenerować specyficzne organoidy nerkowe z ich iPSC.
Zgodnie z naszym protokołem, dostosowując gęstość komórek i stężenie CHIR, niewątpliwie korzystne dla wszystkich naszych badaczy jest skupienie się na chorobie nerek. Nasze przyszłe badania laboratoryjne mają na celu optymalizację metody protokołu w modelach chorób, regenerację nowych leków i badania przesiewowe leków. W ciągu ostatnich pięciu lat nasze laboratorium skupi się na epigenetyce i opracowywaniu leków na temat komórek w różnych dziedzicznych chorobach nerek, w oparciu o rozwój pacjenta, iPSC i modele chorób zorganizowanych przez nerki.
Rozpocznij od przemycia indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych lub iPSC na 6-dołkowej płytce pokrytej matrycą membranową za pomocą dwóch mililitrów DPBS. Zassać DPBS za pomocą pipety. Następnie dodaj jeden mililitr dostępnego w handlu roztworu do odrywania komórek, aby odłączyć iPSC.
Następnie umieść komórkę w inkubatorze pod kątem 37 stopni na pięć minut. Teraz odpipetuj jeden mililitr mTeSR na iPSC, upewniając się, że komórki oddzieliły się od plastikowej powierzchni. Odwirować te komórki w temperaturze 400 g przez trzy minuty w temperaturze pokojowej.
Ponownie zawiesić osad komórkowy. Następnie policz numery komórek za pomocą hemocytometru. Następnie wysiewaj komórki o różnych gęstościach na 6-dołkowej płytce, która została pokryta matrycą membranową.
Hoduj je za pomocą mTeSR uzupełnionego 10-mikromolowym inhibitorem kinazy Rho. Hoduj płytki przez noc w inkubatorze dwutlenku węgla ustawionym na 37 stopni Celsjusza. Następnego dnia odessać mTeSR i umyć komórki dwoma mililitrami DPBS.
Następnie dodaj do komórek dwa mililitry pożywki etapu I. Następnie umieść komórki w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza na cztery dni. Czwartego dnia usuń pożywkę etapu I i umyj komórki dwoma mililitrami DPBS.
Następnie dodaj dwa mililitry pożywki etapu II do komórek przed inkubacją komórek jak poprzednio. Od dnia zerowego do dnia czwartego iPSC szybko się rozrastały i przybrały romboidalne lub trójkątne kształty. Zbieg osiągnął od 90 do 100% i kumulował się równomiernie do siódmego dnia.
Po posadzie zawiesinowej agregaty spontanicznie tworzą struktury nefronowe po dysocjacji w siódmym dniu. Rozpocząć od usunięcia pożywki II stopnia z zawiesiny komórek iPSC w siódmym dniu hodowli. Teraz umyj komórki dwoma mililitrami DPBS.
Odpipetować jeden mililitr roztworu do odrywania komórek do każdej studzienki. Następnie umieść płytkę w inkubatorze pod kątem 37 stopni na pięć minut. Po inkubacji dodać jeden mililitr pożywki etapu II do komórek i dokładnie wymieszać, aż komórki oderwą się od powierzchni.
Zbierz zawiesinę komórek do 15-mililitrowej probówki. Następnie odwiruj go w 400 g przez trzy minuty w temperaturze pokojowej. Po odwirowaniu odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w dwóch mililitrach pożywki stopnia III.
Delikatnie wymieszaj roztwór. Teraz umieść zawiesinę w 6-dołkowej płytce o niskiej przyczepności w stosunku 1:3. Umieść płytkę na wytrząsarce orbitalnej w inkubatorze ustawionym na 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla.
Aby usunąć pożywkę z kultury zawiesiny, najpierw odetnij końcówkę pipety o pojemności jednego mililitra za pomocą aseptycznych nożyczek. Następnie delikatnie wymieszaj 6-dołkową płytkę, aby scentralizować organoidy. Następnie odessać organoidy przygotowanymi pipetami i umieścić je w 15-mililitrowej probówce, odstawiając na pięć minut.
Odessać supernatant, upewniając się, że organoidy pozostają u podstawy probówki. Następnie odpipetować pożywkę stopnia III do płytki. Odpipetować mieszaninę, aby ponownie zawiesić organoidy.
Ponownie umieść organoidy z powrotem na 6-dołkowej płytce o niskiej przyczepności. Kontynuuj wytrząsanie płytki o niskiej przyczepności z prędkością 60 obrotów na minutę w inkubatorze. W 12 dniu zastąp pożywkę pożywką w stadium IV.
Organoidy nerkowe mają struktury przypominające rurki i można je łatwo zaobserwować na obrazach jasnego pola po 18 dniach agregacji. Indukowano komórki śródbłonka CD31. Dekstran był wprowadzany do kanalików proksymalnych organoidów nerkowych.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten protokół przedstawia kompleksową i efektywną metodę wytwarzania organoidalnych nerek z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) przy użyciu warunków hodowli w zawiesinie. Badanie podkreśla znaczenie początkowej gęstości komórek i stężenia agonistów WNT, dostarczając cennych informacji dla badaczy zajmujących się badaniami nad organoidami nerek.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Biologia komórek macierzystych
- Badania nad organoidalnymi strukturami
Tło
- Organoidy nerek są niezbędne do badań nad rozwojem i chorobami nerek.
- Indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) oferują obiecujące źródło do tworzenia organoidów.
- Istnieją wyzwania związane z osiągnięciem spójnych linii komórek o wysokiej gęstości dla iPSC.
- Może wystąpić zmienność w kształcie i rozmiarze organoidalnych struktur w różnych partiach iPSC.
Cel badania
- Ustanowienie niezawodnej metody wytwarzania organoidalnych nerek z iPSC.
- Określenie optymalnej początkowej gęstości komórek i stężenia agonistów WNT.
- Pomoc nowym badaczom w dziedzinie technologii organoidalnych.
Stosowane metody
- Warunki hodowli w zawiesinie do formowania organoidalnych struktur.
- Ocenienie początkowej gęstości komórek i stężenia agonistów WNT.
- Porównanie cech organoidalnych struktur w różnych liniach iPSC.
- Iteracyjna optymalizacja warunków hodowli dla najlepszych wyników.
Główne wyniki
- Początkowa gęstość komórek znacząco wpływa na rozwój organoidalnych struktur.
- Stężenie agonistów WNT jest kluczowe dla udanego formowania organoidalnych struktur.
- Zmienność w morfologii organoidalnych struktur obserwowano w różnych liniach iPSC.
- Może być koniecznych wiele prób, aby osiągnąć optymalne warunki.
Wnioski
- Badanie dostarcza cennego protokołu wytwarzania organoidalnych nerek.
- Rozumienie roli gęstości komórek i stężenia WNT jest istotne.
- To badanie pomoże w rozwijaniu badań nad organoidalnymi strukturami nerek.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Suspension-based generation of kidney organoids from iPSCs enables scalable, reproducible disease models for early-stage drug discovery and nephrotoxicity screening. Optimizing initial cell density and WNT agonist concentration directly impacts the predictive confidence and standardization of organoid-based assays. This protocol supports translational research continuity and portfolio-wide risk reduction in renal target validation and compound evaluation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of renal developmental pathways and disease mechanisms in a controlled 3D system.
- Supports functional target validation by recapitulating nephron structures from diverse iPSC lines.
- Facilitates mechanistic de-risking through reproducible differentiation and organoid formation.
Screening & Assay Development
- Provides standardized, animal component-free organoids for compound screening and nephrotoxicity assessment.
- Delivers quantitative, reproducible outputs by controlling cell density and WNT agonist exposure.
- Enables scalability and platform reuse across multiple iPSC lines and disease models.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant modeling for hereditary kidney disorders using patient-derived iPSCs.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by enabling drug response studies in organoids.
- Reduces translational risk by providing human-relevant nephron structures for biomarker and efficacy studies.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum, supporting early target validation, lead identification, and translational research in renal biology.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing and pathway clarification in kidney development and disease.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible organoids for compound evaluation and toxicity profiling.
- Analytics: Provides quantitative readouts of nephron structure formation and functional uptake (e.g., dextran in proximal tubules).
- Translational Research: Enables disease modeling and drug response studies in patient-specific organoids.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized, adaptable protocol for diverse iPSC lines and renal disease models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in renal target validation.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability through defined, animal-free culture conditions.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling robust, human-relevant assays.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of renal drug candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in iPSC culture, differentiation, and organoid handling.
- Needs access to low-adhesion plates, orbital shakers, and quantitative imaging or functional assays.
- Demands cross-team standardization of cell density and WNT agonist concentration for reproducibility.
- Must be adapted for variability across iPSC lines and disease-specific models.
- Batch-to-batch variability in organoid morphology and size requires iterative optimization.
