Wysokoprzepustowe badania przesiewowe izolatów drobnoustrojów mające wpływ na zdrowie Caenorhabditis elegans

Protokół ten opisuje, w jaki sposób przeprowadzać badania przesiewowe pod kątem bakterii mających wpływ na odporność na oksydacyjny stres termiczny C.elegans w dwóch szczepach C.elegans na 48 izolatach bakteryjnych równolegle. Takie podejście jest wszechstronne i skalowalne. Umożliwia szybkie badania przesiewowe wielu schorzeń mających wpływ na C. elegans w stosunku do zdrowia, co ma zastosowanie w badaniu mechanizmów zdrowia i chorób.

Wykorzystując odporność na stres jako wskaźnik zastępczy dla zdrowia, ten potok można łatwo zastosować do przedklinicznych badań przesiewowych leków, leków przeciwwymiotnych i probiotyków na modelach mutantów nicieni, knockdown, transgenicznych i chorobowych. Możliwość równoległego testowania wielu warunków umożliwia badanie złożonych interakcji zachodzących w ich obsłudze i służy procesom fizjologicznym. Należą do nich interakcje mikroorganizmów gospodarza, zaburzenia metaboliczne, radzenie sobie ze stresem i starzenie się.

Bardzo ważne jest, aby unikać zanieczyszczenia w całym budynku. Nie pozwól, aby robakom zabrakło pożywienia i wykonaj kluczowe kroki, gdy tylko robaki osiągną wymagany etap. Zacznij od przygotowania skoncentrowanej kultury bakterii E. coli OP50, zaszczepiając cztery jednolitrowe butelki bulionu lizogenicznego po dwa mililitry kultury starterowej OP50 każda.

Następnie umieść butelki w inkubatorze z wytrząsaniem na sześć godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 160 G, a następnie granuluj bakterie w temperaturze 3057 g i 20 stopni Celsjusza przez 15 minut. Następnie wyrzuć supernatant i ponownie zawiesić granulki z sześcioma mililitrami pożywki OP50. Zbierz skoncentrowaną kulturę w sterylnej stożkowej probówce o pojemności 50 mililitrów.

Zaszczep osiem sześciocentymetrowych płytek NGM na szczep 100 mikrolitrami nasyconej kultury OP50 wyhodowanej przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza na płytkę. Następnie trzymaj talerze w temperaturze 20 stopni Celsjusza przez dwa dni przed użyciem. Następnie za pomocą skalpela wytnij kwadratowy kawałek agaru o grubości 0,5 centymetra z robakami z niedawno zagłodzonej płytki NGM i przenieś na każdą z ośmiu zaszczepionych sześciocentymetrowych płytek NGM.

Inkubuj te płytki w temperaturze 20 stopni Celsjusza przez trzy dni. Następnie ponownie zawiesić robaki, dodając do trzech mililitrów sterylnego buforu M nine do sześciocentymetrowych płytek NGM za pomocą pipety P1000 i zebrać roztwór robaka ze wszystkich ośmiu płytek na szczep w jednej 15-mililitrowej stożkowej probówce. Następnie odwirować w temperaturze 142 razy G przez dwie minuty w temperaturze czterech stopni Celsjusza i ostrożnie usunąć supernatant za pomocą pipety P5000 lub pompy wodnej wyposażonej w sterylną pipetę lub końcówkę Pasteura.

Następnie dodaj 10 mililitrów sterylnego buforu M nine, aby umyć osad robaka. Następnie usunąć supernatant i przenieść robaki na 15-centymetrową płytkę NGM zaszczepioną OP50 uzupełnioną skoncentrowanym OP50 za pomocą pipety. Hoduj każdy szczep robaka na płytce NGM o średnicy 15 centymetrów przez trzy do czterech dni w temperaturze 15 stopni Celsjusza, ponownie karmiąc robaki 0,5 mililitra skoncentrowanego OP50 dziennie.

Po zebraniu i umyciu bufora M 9 przenieś każdą kulturę szczepu robaka na więcej płytek NGM i rozmnażaj robaki w temperaturze 20 stopni Celsjusza, aż 95% populacji będzie graitować jako dorosłe. Następnie wybiel dorosłe robaki, postępując zgodnie ze standardową metodą przygotowania jaj, i przenieś jaja na dwie nieobsiane 15-centymetrowe płytki NGM na 24 godziny w temperaturze 15 stopni Celsjusza, aby umożliwić wszystkim larwom L one wyklucie się i synchroniczny wzrost w kolejnych krokach. Najpierw zbierz całą masę bakteryjną wyhodowaną wcześniej na sześciocentymetrowej płytce agarowej LB i przenieś ją do oznakowanej 1,5-mililitrowej probówki mikrowirówkowej zawierającej jeden mililitr buforu M nine.

Następnie wiruj probówkę mikrowirówki, aż granulki bakteryjne zostaną całkowicie ponownie zawieszone. Następnie wirować w dół przy 9 300 razy G przez pięć minut w temperaturze pokojowej i usunąć 700 mikrolitrów supernatantu. Ponownie zawiesić osad bakteryjny przez wirowanie.

Następnie przenieś 200 mikrolitrów każdej zawiesiny bakteryjnej do jednego dołka pustej sterylnej płytki 96-dołkowej. Z tej płytki zaszczepić osiem 96-dołkowych płytek agarozowych NGM 10 mikrolitrami roztworu bakteryjnego za pomocą pipety wielokanałowej i inkubować z założoną pokrywką w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez 24 godziny. Następnie uszczelnij 96-dołkową płytę zawieszenia czystą samoprzylepną folią sufitową i przechowuj ją w temperaturze 15 stopni Celsjusza do pięciu dni.

Na początek oceń etap rozwojowy zsynchronizowanej populacji robaków, patrząc na płytki. Gdy ponad 90% robaków osiągnie etap L cztery, zbierz robaki w maksymalnie 10 mililitrach sterylnego roztworu M nine w 15-mililitrowych stożkowych probówkach. Następnie dokładnie umyj robaki cztery razy, wirując w dół z prędkością 142 razy G przez dwie minuty w czterech stopniach Celsjusza, dodając 10 mililitrów świeżego sterylnego M nine między każdym praniem, aby pozbyć się bakterii OP50.

Następnie usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad robaka w 10 mililitrach M nine. Przenieś 50 mikrolitrów roztworu robaka do 1,5 lub dwumililitrowej rurki wiążącej o niskiej powierzchni zawierającej 950 mikrolitrów M 9. Po delikatnym wymieszaniu zawartości probówki, aby uniknąć sedymentacji robaków, szybko użyj zwilżonej końcówki pipety o niskim poziomie wiązania, aby przenieść trzy do czterech oddzielnych kropli o pojemności 10 mikrolitrów na szkiełko podstawowe lub płytkę NGM.

Pod mikroskopem stereoskopowym przy 16-krotnym powiększeniu policz liczbę robaków i uśrednij liczby od trzech do czterech kropli, aby określić liczbę robaków na mikrolitr w roztworze robaka. Dostosuj stężenie robaków do 15 robaków na mikrolitr w stożkowej rurce o pojemności 15 mililitrów. Następnie przenieś osiem mikrolitrów roztworu robaka do każdego z dołków ośmiu 96-dołkowych płytek agarozowych NGM za pomocą pipety wielokanałowej lub pipety powtórzonej za pomocą pipety wielokanałowej.

Po 36 godzinach dozować 30 mikrolitrów M nine do każdego dołka płytki 96-dołkowej. Następnie przenieś robaki na płytkę 384-dołkową zgodnie z ustalonym układem za pomocą końcówek o niskiej retencji, upewniając się, że czytniki płytek są prawidłowo ustawione. Następnie uzupełnij 384 płytki dołkowe większą ilością M dziewięć, dążąc do uzyskania końcowej objętości 60 mikrolitrów na studzienkę, dodając 40 mikrolitrów M dziewięć do testu stresu termicznego i 34 mikrolitry M dziewięć do sześciu mikrolitrów TBHP do stresu oksydacyjnego wywołanego przez TBHP.

Następnie rozpocznij test w ciągu dwóch minut od dodania TBHP. Następnie zamknij płytki przezroczystą pokrywką i uszczelnij krawędzie płytek 384-dołkowych taśmą maskującą, upewniając się, że taśma nie przechodzi przez pokrywkę ani pod płytką. Następnie włóż płytkę do czytnika płytek.

Określ wartość fluorescencji, poniżej której pik nie różniłby się znacząco od szumu, i zanotuj najwcześniejszy punkt czasowy, w którym wahania fluorescencji tłumią się przed wzrostem. Następnie zanotuj punkty czasowe, między którymi spodziewane jest przypadanie minimalnych i maksymalnych wartości fluorescencji, ponieważ będą one używane do dopasowania krzywej. Następnie sprawdź, czy amplitudy pików fluorescencji różnią się znacznie między studzienkami.

Znormalizuj dane przed dalszą analizą, korzystając z formuły opisanej w manuskrypcie. Najpierw pobierz LFASS z GitHub, uruchom program MATLAB i przejdź do folderu LFASS. Następnie wpisz i uruchom dopasuj folder w oknie poleceń, postępując zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi na ekranie.

Po wpisaniu folderu dopasowania wpisz nazwę folderu danych, w którym znajduje się plik Excel, jako Moje dane. Następnie wprowadź dwa dla odstępu czasu między kolejnymi pomiarami w bieżącym protokole i wpisz wartość progową szumu. Następnie przypisz górny próg tolerancji, wpisując 0,94, a dolny próg tolerancji, wpisując 0,06, aby ograniczyć pasowanie esicy.

Ustaw przedziały czasu, aby znaleźć wartości maksymalne i minimalne. Aby wizualnie sprawdzić pasowania zbieżne, wpisz Y dla tak lub N dla nie, aby nie wyświetlać dopasowanych i gładkich krzywych po wyświetleniu monitu. Następnie podaj nowe, dolne i górne granice czasowe na próbę ponownego dopasowania.

Jeśli chcesz podjąć próbę remontu, wpisz dwa. Ale jeśli chcesz zaakceptować remont i przejść do następnego łuku, wpisz zero. Aby wybrać, czy przeanalizować krzywe zidentyfikowane jako hałas, czy ponownie dopasować źle dopasowane krzywe, należy wpisać typ Y do zatwierdzenia i N do odrzucenia.

Po próbie ponownego dopasowania lub odrzuceniu wszystkich pozostałych krzywych, program zostanie zakończony. Pobierz pliki wyników z folderu wyników i zapisz je jako kropkę XLSX do dalszej analizy. Testy odporności na ciepło i stres oksydacyjny przeprowadzono na dwóch robakach typu dzikiego Bristol N, które karmiono izolatami bakterii MYB11 lub MYB115 lub bakteriami kontrolnymi E coli OP50.

Po 36 godzinach dorosłe populacje robaków typu dzikiego były wystawione na stres termiczny o temperaturze 42 stopni Celsjusza i stres oksydacyjny wywołany przez 7% TBHP. Mediana czasu zgonu wahała się od 40 do 130 minut w przypadku testu stresu termicznego i od 90 do 240 minut w przypadku testu stresu oksydacyjnego. Aby upewnić się, że robaki są hodowane w kroku 2.5, a krok 2.1 może potrwać do dwóch godzin, narysuj układ płytek, aby przygotować robaki z 96 dołków do 284 dołków w kroku 4.6.

Kroki można dodawać lub zastępować. Na przykład badania przesiewowe RNA całego genomu gospodarza lub genetyczne badania przesiewowe bakterii bakteryjnych można przeprowadzić, zastępując izolaty bakterii jelitowych odpowiednio klonami RNI lub mutantami bakteryjnymi. Obecnie używamy tego podejścia do identyfikacji nowych probiotyków i odkrywania sieci regulacyjnych genów zaangażowanych w mikrointerakcje gospodarza w kontekście infekcji i starzenia się.