Cyfrowa mikroprzepływność w zautomatyzowanym przetwarzaniu proteomicznym

Proteomika kliniczna jest ważną, nową dyscypliną, która daje nadzieję na odkrycie biomarkerów przydatnych do wczesnej diagnostyki i prognozowania przebiegu chorób. W niniejszym opracowaniu przedstawiamy nową metodę cyfrowej mikrofluidyki (DMF), która integruje kilka etapów procesowych stosowanych w proteomice klinicznej, w tym ekstrakcję białek, ponowne rozpuszczanie, redukcję, alkilację oraz trawienie enzymatyczne. DMF wykorzystuje dyskretne mikrokrople białek z próbek na matrycy elektrod i może być prowadzona w temperaturze pokojowej, co umożliwia zautomatyzowaną analizę próbek w sposób równoległy.

Niniejsza metodologia stanowi znaczący postęp w stosunku do metod konwencjonalnych i ma potencjał stać się użytecznym nowym narzędziem w proteomice klinicznej. Cześć, jestem Steve Sche z laboratorium profesor Erin Wheeler na Wydziale Chemii oraz w Instytucie Biomateriałów i Inżynierii Biomedycznej na Uniwersytecie w Toronto. Cześć, jestem Gabriel z laboratorium Wheeler na Uniwersytecie w Toronto.

A ja jestem Vivian Luke, również z laboratorium Wearera na University of Toronto. Ja jestem Erin Wheeler. Mam szczęście pracować ze Steve'em Mace'em i Vivian.

Dzisiaj zaprezentujemy procedurę przetwarzania proteomicznego z wykorzystaniem cyfrowej mikrofluidyki. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania białek i próbek biologicznych. Zapraszamy do oglądania.

Rozpocznij procedurę w dygestorium, oczyszczając podłoża szklane w roztworze Piranha. Przy stosowaniu odpowiednich środków ochrony osobistej należy pamiętać, że roztwór Piranha składa się z zagęszczonego kwasu siarkowego i 30% nadtlenku wodoru w stosunku trzy do jednego. W związku z tym podczas pracy z tym odczynnikiem należy zachować szczególną ostrożność.

Inkubuj podłoża szklane w roztworze piranha przez 10 minut, a następnie po oczyszczeniu opłucz je wodą dejonizowaną i wysusz podłoża gazem azotowym. Umieść podłoża w komorze naparowania wiązką elektronów w celu naniesienia warstwy chromu o grubości 250 nanometrów. Wyjmij podłoża z komory po osiągnięciu tej grubości i opłucz izopropanolem, a następnie wysusz na płycie grzejnej przez pięć minut w temperaturze 115 °C.

Przygotuj wysuszone podłoża, nakładając heksametylodisilazan lub HMDS metodą spin-coatingu przez 30 sekund. Następnie w tej samej prędkości 3000 RPM nałóż fotorezyst Shipley S 1811, stosując identyczne parametry.

Wstępnie wyprać podłoże bezpośrednio na płycie grzejnej w temperaturze 100 °C przez kilka minut. Następnie nałożyć wzór na fotorezyst poprzez naświetlanie promieniowaniem ultrafioletowym (UV) przez pięć sekund przy użyciu fotomaski. Następnie wywołać naświetlone podłoża w wywoływaczu Shipley MF 3 21, używając ilości wystarczającej do całkowitego zanurzenia podłoża, przez trzy minuty.

Opłucz podłoże w wodzie dejonizowanej. Wypal bezpośrednio na płycie grzejnej w temperaturze 100 °C przez jedną minutę. Traw chrom w odsłoniętych miejscach, zanurzając podłoża na 30 sekund w takiej ilości trawia do chromu, która całkowicie je pokryje.

Opłucz podłoża wodą DI i zanurz w strippingu Z 300 T w ilości wystarczającej do całkowitego zakrycia podłoża na 10 minut, aby usunąć pozostałości fotorezystu. Opłucz wodą DI i wysusz strumieniem azotu.

Po tym osadzeniu, naniesiono od dwóch do pięciu mikrometrów izolującego polimeru Paraline C na podłoże metodą chemicznego osadzania z fazy gazowej, a następnie osadzono 50 nanometrów Teflon AF w celu nadania powierzchni właściwości hydrofobowych poprzez spin coating roztworu 1% wagowo w fluorinert FC 40 przy 2000 RPM przez 60 sekund na podłoże.

Powtórz czynność, używając niepowlekanego podłoża szklanego z tlenkiem indu i cyny (ITO), aby stworzyć górną płytkę. Wypiecz oba podłoża na płycie grzejnej w temperaturze 160 °C przez 10 minut, aby przygotować cyfrowe urządzenie mikrofluidyczne.

Usuń powłoki polimerowe z padów kontaktowych dolnego podłoża, zeskrobując je skalpelem. Połącz odsłonięte pady dolnego podłoża z 40-pinowymi złączami, a następnie uruchom komputer z zainstalowanym programem LabVIEW. Używamy własnoręcznie zbudowanej skrzynki sterującej zawierającej przekaźniki z sygnałami sterowanymi za pomocą dpadu.

Sterownik komputerowy umożliwia użytkownikowi kontrolę nad przyłożeniem sygnałów o wartości 100 V RMS i częstotliwości 18 kHz do urządzenia poprzez 40-pinowe złącza. Następnie włącz generator funkcji oraz wzmacniacz. Zmontuj urządzenie, nakładając dwa kawałki dwustronnej taśmy o całkowitej grubości 140 µm na krawędzie dolnej podłoża.

Pipetuj 4 µL wody DI do jednego z zbiorników i zamknij urządzenie, umieszczając nieustrukturyzowany szkiełko z tlenkiem indu i cyny na górze urządzenia stroną powleczoną teflonem do dołu. Podłącz złącze uziemienia do górnej płyty. Uruchom stworzony w laboratorium program inicjalizacyjny w LabVIEW, aby skalibrować sterowanie sprzężeniem zwrotnym; urządzenie jest teraz gotowe do eksperymentów.

W niniejszym protokole wykorzystamy albuminę surowicy bydlęcej (BSA) jako próbkę białka, aby zademonstrować konstrukcję i zastosowanie naszego systemu cyfrowej mikroprzepływowości. BSA rozcieńczono w buforze roboczym (WB) składającym się ze 100 mM Tris-HCl o pH 7,8 z dodatkiem 0,08% (m/v) Tween 20. Należy przygotować jeden mililitr każdego roztworu próbki i odczynnika oraz oznaczyć zbiornik, do którego zostaną one wprowadzone.

Po przygotowaniu odczynników należy zdjąć górną płytkę z urządzenia i nalać cztery µL roztworu do przypisanego otworu. Po napełnieniu otworów należy ponownie założyć górną płytkę na urządzenie. W celu wykonania następujących kroków należy użyć wewnętrznego programu LabVIEW.

Pamiętajmy, że interfejs komputerowy pozwala użytkownikowi na dozowanie kropli o objętości około 600 nanolitrów z rezerwuarów oraz manipulowanie kroplami na macierzy elektrod. Najpierw dozuj kroplę próbki zawierającej białko z R1 oraz kroplę osadnika z R2. Połącz obie krople i pozostaw połączoną kroplę na pięć minut, aby białka mogły wytrącić się na powierzchni.

Przenieś nadsącz z osadzonego białka do zbiornika na odpady. W celu przemycia osadzonego białka, z R cztery dozuj trzy krople buforu piorącego i przesuń je przez osadzone białko do zbiornika na odpady. Pozostaw osad do wyschnięcia, a następnie nanieś na białko kroplę buforu resolubilizującego z R pięć.

Inkubować bufor przez 20 minut, aż osad się rozpuści. Następnie nanieść kroplę reduktora z sekcji R6 i połączyć ją z kroplą próbki. Wymieszać połączone krople, przemieszczając je okrężnie przez sześć elektrod.

Inkubuj kropelkę przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Pobierz kropelkę czynnika alkilującego z R seven i połącz ją z kropelką próbki, a następnie wymieszaj. Inkubuj kropelkę przez 15 minut w temperaturze pokojowej, chroniąc ją przed światłem.

Na koniec nanieś kroplę trypsyny z pola R8 i połącz ją z kroplą próbki, a następnie wymieszaj. Pozostaw kroplę do inkubacji przez trzy godziny w temperaturze 37 °C w szalce Petri na płycie grzejnej. Aby zakończyć reakcję, zdejmij górną płytkę i przerwij trawienie za pomocą pipetowania.

Nanieś 0,6 ml 2,5% kwasu trójchlorooctowego w wodzie na kroplę reakcyjną. Oczyść zatrzymany produkt reakcji, odsysając kroplę próbki bezpośrednio z płyty dolnej. Używając końcówki C 18 zip tip, zgodnie z instrukcją producenta, próbki można teraz rozcieńczyć w razie potrzeby i poddać analizie metodą spektrometrii mas w celu zidentyfikowania białek w próbce przy użyciu tego systemu.

Następnie, za pomocą spektrometrii mas, zidentyfikowano białka z wynikiem prawdopodobieństwa mniejszym niż 1 × 10⁻³, co odpowiada przedziałowi ufności 99,9% oraz pokryciu sekwencji na poziomie co najmniej 30%. Zatem DMF jest bardzo użyteczną metodologią w zautomatyzowanym przetwarzaniu próbek proteomicznych. Zaprezentrowaliśmy dzisiaj, w jaki sposób wykorzystujemy cyfrową mikroprzepływowość do ekstrakcji i przetwarzania białek w sposób zautomatyzowany. Metodologia ta stanowi potencjalne rozwiązanie problemu utraty i kontaminacji próbek podczas izolacji i identyfikacji białek.

Mamy nadzieję, że w przyszłości zastosujemy tę metodę w innych zastosowaniach biologicznych, w tym w testach immunoenzymatycznych i testach opartych na komórkach. Wykonując tego rodzaju eksperyment, najważniejsze jest, aby pamiętać o czerpaniu z niego przyjemności. To wszystko.

Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu doświadczeń.