Name: Cyfrowa mikrofluidyka do zautomatyzowanego przetwarzania proteomicznego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-11-06T16:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 55 s
Description: Poznaj cyfrową mikrofluidykę do zautomatyzowanego przetwarzania proteomicznego w temperaturze pokojowej. Ta metoda integruje ekstrakcję białek, redukcję, alkilowanie i trawienie enzymatyczne, umożliwiając równoległą analizę próbek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC) oraz Canadian Cancer Society za wsparcie finansowe. SCCS dziękuje NSERC, a VNL dziękuje programowi Ontario Graduate Scholarship (OGS) za stypendia doktoranckie. ARW dziękuje CRC za ustanowienie stanowiska Canada Research Chair.

Część 1: Wytwarzanie urządzenia
<ol>
<li>Oczyścić szklane podłoża w roztworze Piranha (3:1 stężony kwas siarkowy:30% nadtlenek wodoru). Pozostawić podłoża w roztworze Piranha na 10 min, często wstrząsając.</li>
<li>Po opłukaniu w wodzie dejonizowanej (DI) i osuszeniu podłoży gazem N2, umieścić podłoża w komorze wiązki elektronowej w celu osadzenia chromu (grubość 250 nm).</li>
<li>Aby odwodnić podłoże pokryte chromem, opłukać je izopropanolem, a następnie wypiec na płycie grzejnej przez 5 min w temperaturze 115°C.</li>
<li>Osuszyć podłoża i zagruntować heksametylodisylazanem (HMDS) metodą spin-coatingu (30 s, 3000 rpm). Ponownie nanieść metodą spin-coatingu (stosując te same parametry) fotorezyst Shipley S1811.</li>
<li>Wstępnie wypiec podłoże na płycie grzejnej (100°C, 2 min), a następnie nałożyć wzór na fotoreziście poprzez naświetlanie promieniowaniem ultrafioletowym (UV) przez 5 s przez fotomaskę.</li>
<li>Wywołać naświetlone promieniami UV podłoża w wywoływaczu Shipley MF 321 przez 3 min i przemyć wodą DI. Wypiec po wywoływaniu na płycie grzejnej w temperaturze 100°C przez 1 min.</li>
<li>Ztrawić odsłonięty chrom poprzez zanurzenie w trawieniu do chromu na 30 s. Opłukać w wodzie DI, a następnie zanurzyć w stripperze AZ300T na 10 min w celu usunięcia pozostałego fotorezistu. Opłukać w wodzie DI i osuszyć gazem N2.</li>
<li>Osadzić 2-5 μm Parylenu-C (polimeru izolacyjnego) metodą chemicznego osadzania z fazy gazowej na podłożu z naniesionym wzorem z chromu. Osadzić 50 nm Teflon-AF (aby powierzchnia stała się hydrofobowa) poprzez spin-coating roztworu (1% wt/wt w Fluorinert FC-40) przy 2000 rpm przez 60 s. Wypiec po procesie na płycie grzejnej (160 °C, 10 min).</li>
<li>Aby utworzyć górną płytkę, pokryć niepodzielone podłoża szklane z tlenkiem indu i cyny (ITO) warstwą 50 nm Teflon-AF, analogicznie jak powyżej.</li>
<li>Wypiec oba podłoża po procesie na płycie grzejnej (160 °C, 10 min).</li>
</ol>
Część 2: Konfiguracja urządzenia i automatyzacja
<ol>
<li>W cyfrowych urządzeniach mikroprzepływowych pracujących w konfiguracji „dwupłytkowej”,1 krople są umieszczone pomiędzy podłożem dolnym (z naniesionymi elektrodami) a podłożem górnym (z jedną ciągłą, przezroczystą elektrodą, zazwyczaj wykonaną z ITO).</li>
<li>Aby przygotować urządzenie, należy usunąć powłoki polimerowe z pól kontaktowych podłoża dolnego, delikatnie zdrapując je skalpelem. Połącz odsłonięte pola podłoża dolnego z 40-pinowymi złączami (Rysunek 1a).</li>
<li>Włącz komputer z zainstalowanym programem LabView (National Instruments, Austin, TX), własnoręcznie zbudowaną skrzynkę sterującą (zawierającą macierz przekaźników wysokiego napięcia sterowanych sygnałami z modułu National Instruments DaqPad), generator funkcji oraz wzmacniacz. Komputer i skrzynka sterująca umożliwiają użytkownikowi sterowanie przyłożeniem sygnałów 100 VRMS/18 kHz do urządzenia za pośrednictwem 40-pinowych złączy.</li>
<li>Zmontuj urządzenie, umieszczając dwa kawałki dwustronnej taśmy klejącej (całkowita grubość 140 μm) na krawędziach podłoża dolnego, a następnie dołącz niestrukturyzowane płytki ITO (płyta górna).</li>
<li>Aby zainicjować system sterowania, uruchom program kalibracyjny LabView (opracowany wewnętrznie) w celu skalibrowania sterowania sprzężeniem zwrotnym.</li>
<li>Wprowadź próbkę i odczynniki do odpowiednich zbiorników (patrz sekcja 3 poniżej) i zamknij je pod podłożem górnym (stroną pokrytą Teflonem do dołu). Podłącz złącze uziemiające do podłoża górnego.</li>
<li>Wgraj kod sterujący w programie LabView (opracowany wewnętrznie) i uruchom program, aby zainicjować manipulację kroplami.</li>
</ol>
Część 3: Przygotowanie próbek i odczynników
<ol>
<li>Przygotować bufor roboczy (WB): 100 mM TrisHCl (pH 7.8) oraz 0,08% Pluronic F127 w/v.</li>
<li>Rozpuścić analizowane białka w buforze WB i pipetować próbkę do zbiornika 1 (R-1) na urządzeniu, zgodnie z rysunkiem 1b.</li>
<li>Przygotować czynnik wytrącający: 20% kwas trójchlorooctowy (TCA) w wodzie dejonizowanej (DI) i pipetować do R-2.</li>
<li>Przygotować bufor płuczący: chloroform/acetonitryl (ACN) w stosunku 70/30 i pipetować do R-4.</li>
<li>Przygotować bufor do resolubilizacji: 100 mM wodorowęglan amonu (pH 8.0) oraz 0,08% Pluronic F127 w/v i pipetować do R-5.</li>
<li>Rozpuścić reduktor, tris(2-karboksyetylo)fosfinę (TCEP), w stężeniu 10 mM w buforze WB i pipetować do R-6.</li>
<li>Rozpuścić czynnik alkilujący, jod acetamid (IAM), w stężeniu 12 mM w buforze WB i pipetować do R-7.</li>
<li>Rozpuścić trypsynę w buforze WB w stężeniu równym 1/5 stężenia całkowitej próbki białka (patrz pkt 3.1 powyżej) i pipetować do R-8.</li>
</ol>
Część 4: Cyfrowe mikrofluidyczne przetwarzanie próbek
<ol>
<li>Poniższa procedura jest realizowana automatycznie za pomocą wewnętrznego kodu LabView. Objętość kropel dozowanych z rezerwuarów jest określona przez wymiary elektrod (w tym przypadku dozowane krople mają objętość ~600nL).</li>
<li>Dozować kroplę próbki zawierającej białko z R-1 oraz kroplę czynnika wytrącającego z R-2 (Rysunek 2, Klatka 1). Połączyć obie krople i inkubować połączoną kroplę przez 5 min, co doprowadzi do wytrącenia białek na powierzchni (Rysunek 2, Klatki 2-3). Przesunąć nadfiltr z wytrąconego białka do rezerwuaru na odpady R-3 (Rysunek 2, Klatka 4).</li>
<li>Dozować trzy krople buforu piorącego z R-4 i przemieszczać je przez miejsce wytrąconego białka do rezerwuaru na odpady R-3 (Rysunek 2, Klatka 5).</li>
<li>Pozostawić osad do wyschnięcia, a następnie dozować kroplę buforu rozpuszczającego z R-5 na białko. Inkubować bufor przez 20 min, aż osad się rozpuści (Rysunek 2, Klatka 6).</li>
<li>Dozować kroplę reduktora z R-6 i połączyć ją z kroplą próbki. Wymieszać połączoną kroplę, przemieszczając ją po 6 elektrodach po okręgu. Inkubować kroplę przez 1 h w temperaturze pokojowej w komorze nawilżanej (Rysunek 3, Klatki 1-2).</li>
<li>Dozować kroplę czynnika alkilującego z R-7 i połączyć ją z kroplą próbki, a następnie wymieszać (podobnie jak w punkcie 4.5). Inkubować kroplę przez 15 min w temperaturze pokojowej w komorze nawilżanej, chroniąc ją przed światłem (Rysunek 3, Klatki 2-3).</li>
<li>Dozować kroplę trypsyny z R-8 i połączyć ją z kroplą próbki, a następnie wymieszać (podobnie jak w punkcie 4.5). Inkubować kroplę przez 3 h w temperaturze 37°C w komorze nawilżanej na płycie grzejnej (Rysunek 3, Klatki 3-4).</li>
</ol>
Część 5: Przygotowanie próbek do obróbki końcowej
<ol>
<li>Usunąć górny substrat i przerwać reakcję trawienia, dodając 0,6 mL 2,5% kwasu trifluorooctowego w wodzie.</li>
<li>Oczyścić produkt przerwanej reakcji, wykorzystując ZipTips C18 (Millipore, Billerica, MA) zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
<li>Rozcieńczyć oczyszczoną próbkę w wodzie DI do końcowej objętości 100 mL.</li>
</ol>
Część 6: Spektrometria mas
<ol>
<li>Przeanalizuj przetworzoną próbkę za pomocą nano-HPLC połączonego z tandemowym spektrometrem mas. Zastosowany tutaj system HPLC pochodzi od firmy Eksigent Technologies i jest wyposażony w kolumnę pułapkującą (kule C18 o średnicy 3 mm, 150 μm ID x 2,5 cm) oraz kolumnę separacyjną do chromatografii przeciwprądowej (kule C18 o średnicy 3 μm, 75 μm ID x 15 cm). Wykorzystany spektrometr mas to model LTQ firmy Thermo-Fisher Scientific.</li>
<li>Nanieś 2 μL próbki na kolumnę pułapkującą z przepływem 5μL/min w fazie ruchomej składającej się z 5% acetonitrylu w wodzie. Rozdziel próbkę na kolumnie przeciwprądowej z przepływem 0,5μL/min, stosując gradient liniowy od 20% acetonitrylu do 80% acetonitrylu w czasie 25 min. Kontynuuj pomiar przy 80% acetonitrylu przez kolejne 10 min.</li>
<li>Przeanalizuj pasma eluowane z kolumny za pomocą tandemowej spektrometrii mas. W opisanym tutaj badaniu eluent jest wprowadzany do spektrometru mas za pomocą emitera nanoelektrospray (20 μm ID zwężającego się do 10 μm ID) firmy NewObjective.</li>
<li>Zidentyfikuj białka w próbce, korzystając z programu do przeszukiwania baz danych, takiego jak SEQUEST. W niniejszej pracy zastosowano wersję programu SEQUEST zintegrowaną z Bioworks v3.01 (Thermo-Fisher Scientific); zidentyfikowane białka posiadały wartości prawdopodobieństwa mniejsze niż 1.0E-03 (odpowiadające przedziałowi ufności 99,9%) oraz pokrycie sekwencji na poziomie co najmniej 30% (Rysunek 4).</li>
</ol>
<img src="/files/ftp_upload/1603/1603fig1a.jpg" align="Figure 1a" alt="Platforma cyfrowej mikroprzepływowości z konektorami pinowymi; schemat obwodu elektronicznego do badań nad systemami lab-on-chip." data-altupdatedat="1787630408000"> <img src="/files/ftp_upload/1603/1603fig1b.jpg" align="Figure 1b" alt="Schemat mikroprzepływowy przetwarzania próbki surowicy z odczynnikami do analizy trawienia proteazą" data-altupdatedat="1787630408000"> Rycina 1. (a) Zdjęcie urządzenia DMF połączonego z konektorami 40-pinowymi do zautomatyzowanego sterowania kroplami. (b) Schemat urządzenia przedstawiający rozmieszczenie próbki i odczynników wymaganych do analizy proteomicznej.
<img src="/files/ftp_upload/1603/1603fig2.jpg" align="Figure 2" alt="Schemat procesu wytrącania białka; konfiguracja mikrowzorca; etapy: wytrącanie, łączenie, płukanie, ponowne rozpuszczanie." data-altupdatedat="1787630408000"> Rysunek 2. Kadry z filmu przedstawiające zautomatyzowaną ekstrakcję i oczyszczanie BSA w 20% TCA (czynnik wytrącający) oraz w 70/30% chloroformie/acetonitrylu (roztwór płuczący). Na kadrze 6 wytrącone białko zostaje ponownie rozpuszczone w kropli 100 mM wodorowęglanu amonu.
<img src="/files/ftp_upload/1603/1603fig3.jpg" align="Figure 3" alt="Przebieg przetwarzania białek w chipie mikrofluidycznym: schemat sekwencji redukcji, alkilowania i trawienia." data-altupdatedat="1787630408000"> Rysunek 3. Kadry z filmu ilustrujące sekwencyjną redukcję, alkilowanie i trawienie kropli resolubilizowanego białka. Na tym rysunku odczynniki są zabarwione barwnikami dla przejrzystości; w praktyce odczynniki nie są barwione.
<img src="/files/ftp_upload/1603/1603fig4.jpg" align="Figure 4" alt="Wynik spektrometrii mas z chromatografią; wykres przedstawiający analizę względnej obfitości w funkcji czasu." data-altupdatedat="1787630408000"> Rysunek 4. Chromatogram MS próbki albuminy surowicy bydlęcej przetworzonej za pomocą cyfrowej mikrofluidyki. Zidentyfikowano 25 odrębnych peptydów (przedział ufności 99,9%), co odpowiada 44% pokrycia sekwencji.

<ol><li>Abdelgawad, M., Wheeler, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Digital+Revolution%3A+A+New+Paradigm+for+Microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Mat%22%5BJournal%5D)">The Digital Revolution: A New Paradigm for Microfluidics.</a> Adv. Mat. 21, 920-925 (2009).</li>
<li>Jebrail, M., Wheeler, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Digital+Microfluidic+Method+for+Protein+Extraction+by+Precipitation%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">A Digital Microfluidic Method for Protein Extraction by Precipitation.</a> Anal. Chem. 81, 330-335 (2009).</li>
<li>Luk, V. N., Wheeler, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Digital+Microfluidic+Approach+to+Proteomic+Sample+Processing%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">A Digital Microfluidic Approach to Proteomic Sample Processing.</a> Anal. Chem. 81, 4524-4530 (2009).</li>
</ol>

Brak standaryzacji w zakresie przygotowania i przetwarzania próbek w proteomice stanowi istotne ograniczenie dla tej dziedziny. Ponadto tradycyjne przetwarzanie próbek w skali makro wiąże się z użyciem wielu naczyń i wielokrotnym przenoszeniem roztworów, co może prowadzić do utraty próbki oraz kontaminacji. Potencjalnym rozwiązaniem tych problemów jest tworzenie zintegrowanych systemów do przetwarzania próbek opartych na cyfrowej mikrofluidyce1 (DMF). W poprzednich pracach wykazano, że DMF jest użytecznym narz...

cyfrowa mikroprzepływowość w zautomatyzowanym przetwarzaniu proteomicznym

Digital Microfluidics for Automated Proteomic Processing

Proteomika kliniczna wyłoniła się jako ważna nowa dyscyplina, obiecująca odkrycie biomarkerów, które będą przydatne w wczesnej diagnostyce i prognozowaniu chorób. Choć metody proteomiczne stosowane w klinice są bardzo zróżnicowane, wspólną cechą jest potrzeba (i) ekstrakcji białek z niezwykle heterogenicznych płynów (np. surowicy, krwi pełnej itp.) oraz (ii) rozległego przetwarzania biochemicznego przed analizą. W niniejszej pracy przedstawiamy nową metodę opartą na cyfrowej mikrofluidyce (DMF), integrującą kilka etapów przetwarzania stosowanych w proteomice klinicznej. Obejmuje ona ekstrakcję białek, resolubilizację, redukcję, alkilację oraz trawienie enzymatyczne. Cyfrowa mikrofluidyka to technika manipulacji płynami w skali mikro, w której kropelki o rozmiarach nanolitrowych i mikrolitrowych są manipulowane na otwartej powierzchni. Kropelki są rozmieszczone nad macierzą elektrod pokrytych warstwą dielektryczną – po przyłożeniu potencjału elektrycznego do kropelki, ładunki gromadzą się po obu stronach dielektryka. Ładunki te służą jako uchwyty elektrostatyczne, które mogą być wykorzystane do kontrolowania pozycji kropelki, a poprzez polaryzację sekwencji elektrod szeregowo, kropelki mogą być dozowane, przemieszczane, łączone, mieszane i dzielone na powierzchni. W związku z tym DMF jest naturalnym rozwiązaniem do przeprowadzania szybkich, sekwencyjnych, wieloetapowych, zminiaturyzowanych zautomatyzowanych analiz biochemicznych. Stanowi to znaczący postęp w stosunku do konwencjonalnych metod (opierających się na manualnym pipetowaniu lub robotach) i ma potencjał, by stać się przydatnym nowym narzędziem w proteomice klinicznej.
Mais J. Jebrail, Vivienne N. Luk i Steve C. C. Shih wnieśli równy wkład w tę pracę.
Obecny adres Sergio L. S. Freire to University of the Sciences w Filadelfii, mieszczący się pod adresem 600 South 43rd Street, Philadelphia, PA 19104.

Cyfrowa mikroprzepływność to technika polegająca na manipulowaniu pojedynczymi kroplami (~nL - mL) na macierzy elektrod poprzez przykładanie pól elektrycznych. Jest ona odpowiednia do przeprowadzania szybkich, sekwencyjnych, zminiaturyzowanych zautomatyzowanych analiz biochemicznych. W niniejszej pracy przedstawiamy platformę zdolną do automatyzacji kilku etapów przetwarzania proteomicznego.

Cyfrowa mikroprzepływowość w zautomatyzowanym przetwarzaniu proteomicznym

Proteomika kliniczna wyłoniła się jako ważna nowa dyscyplina, obiecująca odkrycie biomarkerów, które będą użyteczne w wczesnej diagnostyce i ...

Proteomika kliniczna to ważna, nowa dyscyplina, która daje nadzieję na odkrycie biomarkerów przydatnych w wczesnej diagnostyce i prognozowaniu chorób. Przedstawiamy tutaj nową metodę cyfrowej mikroprzepływowości (DMF), integrującą kilka etapów przetwarzania stosowanych w proteomice klinicznej, w tym ekstrakcję białek, resolubilizację, redukcję, alkilację oraz trawienie enzymatyczne. DMF wykorzystuje dyskretne mikrokrople białek z próbki na macierzy elektrod i może być prowadzona w temperaturze pokojowej, co umożliwia zautomatyzowaną analizę równoległą wielu próbek.Niniejsza metodologia stanowi znaczący postęp w stosunku do metod konwencjonalnych i ma potencjał, aby stać się użytecznym nowym narzędziem w proteomice klinicznej. Cześć, jestem Steve Sche z laboratorium profesor Erin Wheeler w Departamencie Chemii oraz Instytucie Biomateriałów i Inżynierii Biomedycznej na Uniwersytecie w Toronto. Cześć, nazywam się Gabriel i jestem z laboratorium Wheeler na Uniwersytecie w Toronto.Jestem Vivian Luke, również z laboratorium Wearer na Uniwersytecie w Toronto. Jestem Erin Wheeler. Mam przyjemność współpracować ze Steve'em Mace'em i Vivian.Dzisiaj przedstawimy procedurę przetwarzania proteomicznego z wykorzystaniem cyfrowej mikrofluidyki. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania białek i próbek biologicznych. Zapraszamy do rozpoczęcia.Rozpocznij procedurę w wyciągu, czyszcząc podłoża szklane w roztworze Piranha. Przy zachowaniu odpowiednich środków ochrony osobistej, należy pamiętać, że roztwór Piranha składa się z trzech części stężonego kwasu siarkowego i jednej części 30% nadtlenku wodoru, dlatego podczas pracy z nim należy zachować szczególną ostrożność.Inkubuj szklane podłoża w roztworze piranha przez 10 minut, a po oczyszczeniu przepłucz je wodą dejonizowaną lub destylowaną i wysusz podłoża strumieniem azotu. Umieść podłoża w komorze do naparowania wiązką elektronów w celu nałożenia warstwy chromu o grubości 250 nanometrów. Wyjmij podłoża z komory po osiągnięciu tej grubości i przepłucz izopropanolem, a następnie wysusz na płycie grzejnej przez pięć minut w temperaturze 115 stopni Celsjusza.Przygotuj wysuszone podłoża, nakładając heksametylodysilazan (HMDS) metodą spin coatingu przez 30 sekund. Ponownie wykonaj spin coating przy 3000 RPM, stosując fotorezyst Shipley S 1811 przy użyciu tych samych parametrów.Wykonać wstępne wypalanie podłoża bezpośrednio na płycie grzewczej w temperaturze 100 °C przez kilka minut. Następnie nałożyć wzór na fotorezyst poprzez naświetlanie promieniowaniem ultrafioletowym lub UV przez pięć sekund przez fotomaskę. Następnie wywołać naświetlone promieniami UV podłoża w wywoływaczu Shipley MF 3 21, używając ilości wystarczającej do całkowitego zanurzenia podłoża, i pozostawić na trzy minuty.Opłucz podłoże w wodzie DI. Wypal bezpośrednio na płycie grzejnej w temperaturze 100 °C przez jedną minutę. Traw chrom wystawiony na działanie odczynnika, zanurzając podłoża na 30 sekund w ilości trawia do chromu wystarczającej do ich całkowitego przykrycia.Opłukać podłoża wodą dejonizowaną (DI), a następnie zanurzyć w preparacie do usuwania fotorezystu Z 300 T w ilości wystarczającej do całkowitego przykrycia podłoża na 10 minut, aby usunąć pozostałości fotorezystu. Opłukać wodą DI i osuszyć strumieniem azotu.Po tej aplikacji, na podłoże naniesiono warstwę izolacyjnego polimeru Paraline C o grubości od dwóch do pięciu mikrometrów metodą chemicznego osadzania z fazy gazowej, a następnie naniesiono 50 nanometrów Teflon AF w celu nadania powierzchni właściwości hydrofobowych, poprzez spin coating roztworu 1% w/w we fluorinert FC 40 przy 2000 RPM przez 60 sekund na podłoże.Powtórz procedurę, używając niepowlekanej płytki szklanej z tlenkiem indu i cyny (ITO), aby stworzyć górną płytę urządzenia. Wypiecz oba podłoża na płycie grzejnej w temperaturze 160 °C przez 10 minut, aby przygotować cyfrowe urządzenie mikrofluidyczne.Usuń powłoki polimerowe z padów kontaktowych dolnej podłoża, zeskrobując je skalpelem. Połącz odsłonięte pady dolnej podłoża z 40-pinowymi złączami, a następnie uruchom komputer z zainstalowanym programem LabVIEW. Używamy własnoręcznie zbudowanej skrzynki sterującej, która zawiera przekaźniki z sygnałami sterowanymi przez dpad.Skrzynka sterowania komputerowego umożliwia użytkownikowi kontrolę nad przyłożeniem sygnałów o wartości 100 V RMS przy częstotliwości 18 kHz do urządzenia za pomocą 40-pinowych złączy. Należy również włączyć generator funkcji i wzmacniacz. Złożyć urządzenie, umieszczając dwa kawałki taśmy dwustronnej o całkowitej grubości 140 µm na krawędziach dolnego podłoża.Pipetuj 4 µL wodyy dejonizowanej do jednego z zbiorników i zamknij urządzenie, umieszczając niewzorcowaną płytkę z tlenku indu i cyny na górze urządzenia, stroną pokrytą teflonem do dołu. Podłącz złącze uziemiające do górnej płyty. Uruchom stworzony w laboratorium program inicjalizacyjny w LabVIEW, aby skalibrować sterowanie sprzężeniem zwrotnym; urządzenie jest teraz gotowe do przeprowadzenia eksperymentów.W niniejszym protokole wykorzystamy albuminę surowicy bydlęcej lub BSA jako próbkę białka, aby zademonstrować konstrukcję i zastosowanie naszego układu cyfrowej mikrofluidyki. BSA jest rozcieńczona w buforze roboczym lub WB, składającym się z 100 mM Tris-HCl pH 7.8 z dodatkiem 0,08% w/v nioninu F-127. Należy przygotować jeden mililitr każdej próbki oraz roztworu odczynnika i oznaczyć zbiornik, do którego zostaną one wprowadzone.Po przygotowaniu odczynników należy zdjąć górną płytkę z urządzenia i nanieść pipetą 4 µL roztworu do przypisanego zbiorniczka. Po napełnieniu zbiorniczków należy ponownie nałożyć górną płytkę na urządzenie. Do wykonania następnych kroków należy użyć wewnętrznego programu LabVIEW.Należy pamiętać, że interfejs komputerowy umożliwia użytkownikowi dozowanie kropli o objętości około 600 nanolitrów z rezerwuarów oraz manipulowanie nimi na macierzy elektrod. W pierwszej kolejności dozuj kroplę próbki zawierającej białko z R1 oraz kroplę osadznika z R2. Połącz obie krople i inkubuj połączoną kroplę przez pięć minut, aby białka wytrąciły się na powierzchni.Przesuń supernatant z miejsca wytrąconego białka do zbiornika na odpady. R trzy, aby wypłukać wytrącone białko, dozuj trzy krople buforu płuczącego z R cztery i przesuń je przez wytrącone białko do zbiornika na odpady. Pozostaw osad do wyschnięcia, a następnie dozuj kroplę buforu resuspensującego z R pięć na białko.Pozostaw bufor do inkubacji przez 20 minut, aż osad się rozpuści. Następnie nanieś kroplę reduktora z kanału R6 i połącz ją z kroplą próbki. Wymieszaj połączone krople, przemieszczając je po okręgu przez sześć elektrod.Inkubować kroplę przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Nanieść kroplę czynnika alkilującego z R7 i połączyć ją z kroplą próbki, a następnie wymieszać. Inkubować kroplę przez 15 minut w temperaturze pokojowej, chroniąc ją przed światłem.Na koniec nanieś kropelkę trypsyny z otworu R8 i połącz ją z kropelką próbki, a następnie wymieszaj. Inkubuj kropelkę przez trzy godziny w temperaturze 37 °C w szalce Petri na płytce grzejnej. Aby zakończyć reakcję, zdejmij górną płytkę i przerwij trawienie poprzez pipetowanie.Nanieś 0,6 ml 2,5% kwasu trichlorooctowego w wodzie na kropelkę reakcyjną. Oczyść produkt reakcji po zatrzymaniu procesu, odsysając kropelkę próbki bezpośrednio z płyty dolnej. Używając końcówki C 18 zip tip zgodnie z instrukcjami producenta, próbki można teraz rozcieńczyć w razie potrzeby i poddać analizie spektrometrią mas w celu zidentyfikowania białek w próbce przy użyciu tego systemu.Następnie, przy użyciu spektrometrii mas, zidentyfikowano białka z wartościami prawdopodobieństwa mniejszymi niż 1 × 10⁻³, co odpowiada 99,9% przedziałowi ufności, oraz przy pokryciu sekwencji wynoszącym co najmniej 30%. Zatem DMF jest bardzo użyteczną metodologią do zautomatyzowanego przetwarzania próbek proteomicznych. Przedstawiliśmy dzisiaj, w jaki sposób wykorzystujemy cyfrową mikroprzepływność do ekstrakcji i przetwarzania białek w sposób zautomatyzowany. Metodologia ta stanowi potencjalne rozwiązanie problemu utraty i kontaminacji próbek podczas izolacji i identyfikacji białek.Mamy nadzieję, że w przyszłości zastosujemy tę metodę w innych aplikacjach biologicznych, w tym w testach immunoologicznych i testach komórkowych. Wykonując tego typu eksperyment, najważniejsze jest, aby pamiętać o czerpaniu z tego przyjemności. To wszystko.Dziękujemy za obejrzenie i życzymy powodzenia w eksperymentach.

digital-microfluidics-for-automated-proteomic-processing

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Mikrofluidyka cyfrowa do automatycznego przetwarzania proteomiki

Przedstawiamy podejście mikrofluidyczne do ekspresji macierzy białkowych. Urządzenie składa się z tysięcy komór reakcyjnych sterowanych za pomocą mikromechanicznych zaworów. Urządzenie mikrofluidyczne jest połączone z biblioteką genów naniesioną w formie mikromacierzy. Geny te są następnie transkrybowane i translacyjne bezpośrednio na chipie, co pozwala na otrzymanie macierzy białkowej gotowej do zastosowań eksperymentalnych.

Generator wysokoprzepustowej ekspresji białek z wykorzystaniem platformy mikroprzepływowej

Opracowaliśmy zautomatyzowaną platformę do hodowli komórek i przesłuchań do eksperymentów stymulacji komórek na mikroskalę.  Platforma oferuje prostą, wszechstronną i precyzyjną kontrolę w hodowli i stymulacji małych populacji komórek oraz odzyskiwaniu lizatów do analiz molekularnych.  Platforma doskonale nadaje się do badań, w których wykorzystuje się cenne komórki i/lub odczynniki.

Wszechstronna, zautomatyzowana platforma do eksperymentów ze stymulacją komórek w mikroskali

W tym artykule prezentujemy mikroprzepływowy chip do analizy pojedynczych komórek. Umożliwia ilościowe oznaczanie wewnątrzkomórkowych białek, enzymów, kofaktorów i drugich przekaźników za pomocą testów fluorescencyjnych lub testów immunologicznych.

Mikroprzepływowy chip do wszechstronnej analizy chemicznej pojedynczych komórek

Opisujemy cyfrowy test końcowy do ilościowego oznaczania kwasów nukleinowych za pomocą uproszczonego (analogowego) odczytu. Mierzymy fluorescencję masową kropelkowych testów cyfrowych za pomocą standardowej maszyny qPCR, a nie specjalistycznego oprzyrządowania, i potwierdzamy nasze wyniki za pomocą mikroskopii.

Prosty masowy odczyt cyfrowych testów ilościowych kwasów nukleinowych

Ten protokół opisuje architekturę systemu do wykonywania automatycznych separacji cząstek o małej objętości (0,15–1,5 ml) za pomocą urządzenia mikroprzepływowego i omawia metody optymalizacji wydajności i działania urządzenia akustycznego.

Platforma mikroprzepływowa do precyzyjnego przetwarzania próbek o małej objętości i jej wykorzystanie do wymiarowania oddzielnych cząstek biologicznych za pomocą mikrourządzenia akustycznego

Przedstawiono szybki protokół trawienia proteolitycznego za pomocą własnego mikroreaktora tryptycznego sprzężonego ze spektrometrem masowym z jonizacją elektrorozpylania (ESI). Opisano sposób wytwarzania mikroreaktora, układ doświadczalny i proces pozyskiwania danych.

Szybkie przetwarzanie enzymatyczne białek w celu wykrywania stwardnienia rozsianego za pomocą mikroreaktora przepływowego

Ten protokół pokazuje, jak osiągnąć czułość wykrywania femtomolowych białek w 10 μL pełnej krwi w ciągu 30 minut. Można to osiągnąć dzięki zastosowaniu elektroprzędzonych mat nanowłóknistych zintegrowanych w lab-on-a-disc, który oferuje dużą powierzchnię, a także skuteczne mieszanie i mycie w celu zwiększenia stosunku sygnału do szumu.

W pełni zautomatyzowane odśrodkowe urządzenie mikroprzepływowe do ultraczułego wykrywania białek z krwi pełnej

Prezentujemy platformę mikroprzepływową ze zintegrowaną siecią elektrod powierzchniowych, która łączy rezystancyjne wykrywanie impulsów (RPS) z wielokrotnym dostępem z podziałem kodu (CDMA), do wielokrotnego wykrywania i wymiarowania cząstek w wielu kanałach mikroprzepływowych.

Platforma mikroprzepływowa z multipleksowaną detekcją elektroniczną do przestrzennego śledzenia cząstek

Tutaj prezentujemy zautomatyzowaną metodę trawienia białek osocza do ilościowej analizy proteomicznej opartej na spektrometrii mas. W tym protokole etapy przenoszenia cieczy i inkubacji w celu denaturacji, redukcji, alkilowania i trawienia trypsyny są usprawnione i zautomatyzowane. Przygotowanie płytki 96-dołkowej z pożądaną precyzją zajmuje około pięciu godzin.

Przygotowanie próbki osocza do spektrometrii mas przy użyciu zautomatyzowanej stacji roboczej

Cyfrowy mikrofluidyk oparty na elektrozwilżaniu to technika, która wykorzystuje sterowaną napięciem zmianę pozornego kąta zwilżania kropli o objętości mikrolitra, aby ułatwić jej manipulację. Połączenie tego z funkcjonalizowanymi kulkami magnetycznymi umożliwia integrację wielu operacji laboratoryjnych w celu przygotowania próbki i identyfikacji patogenów za pomocą testu immunoenzymatycznego (ELISA).

Cyfrowa platforma mikroprzepływowa oparta na elektrozwilżaniu do zautomatyzowanego testu immunoenzymatycznego

Szczegółowy protokół i trzy skrypty Pythona są dostępne do obsługi zrobotyzowanego systemu obsługi płynów o otwartym kodzie źródłowym do wykonywania półautomatycznego przygotowania próbek białek do eksperymentów spektrometrii mas, obejmujących etapy usuwania detergentów, trawienia białek i odsalania peptydów.

Zautomatyzowane przetwarzanie próbek proteomicznych typu shotgun przez robota laboratoryjnego typu open source

Poznaj cyfrową mikrofluidykę do zautomatyzowanego przetwarzania proteomicznego w temperaturze pokojowej. Ta metoda integruje ekstrakcję białek, redukcję, alkilowanie i trawienie enzymatyczne, umożliwiając równoległą analizę próbek.

Cyfrowa mikroprzepływowość w zautomatyzowanym przetwarzaniu proteomicznym

Przeglądaj więcej filmów