Cyfrowa mikrofluidyka do zautomatyzowanego przetwarzania proteomicznego

Proteomika kliniczna to ważna nowa dyscyplina, która obiecuje odkrycie biomarkerów, które będą przydatne we wczesnej diagnostyce i prognozowaniu choroby. W tym miejscu przedstawiamy nową cyfrową metodę mikrofluidyki lub DMF, łączącą kilka etapów przetwarzania stosowanych w proteomice klinicznej, w tym ekstrakcję białek, redukcję resolubilizacji, alkilowanie i trawienie enzymatyczne. DMF wykorzystuje dyskretne mikrokropelki białek próbki na szeregu elektrod i może być uruchamiany w temperaturze pokojowej, co umożliwia równoległą automatyczną analizę próbek.

Metodologia ta stanowi znaczący postęp w stosunku do metod konwencjonalnych i ma potencjał, aby stać się użytecznym nowym narzędziem w proteomice klinicznej. Cześć, nazywam się Steve Sche i pracuję w laboratorium, profesor Erin Wheeler na Wydziale Chemii oraz w Instytucie Biomateriałów i Inżynierii Biomedycznej na Uniwersytecie w Toronto. Cześć, jestem Gabriel i pracuję w Wheeler Lab na Uniwersytecie w Toronto.

Nazywam się Vivian Luke i również pracuję w laboratorium Wearer na Uniwersytecie w Toronto. Nazywam się Erin Wheeler. Mam szczęście pracować ze Steve'em Mace'em i Vivian.

Dzisiaj pokażemy Ci procedurę przetwarzania proteomicznego przy użyciu cyfrowej mikrofluidyki. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania białek i próbek biologicznych. Więc zacznijmy.

Rozpocznij procedurę w dygestoria od oczyszczenia szklanych podłoży w roztworze Piranha. Przy odpowiedniej ochronie roztwór piranii składa się z trzech do jednego stężonego kwasu siarkowego do 30% nadtlenku wodoru. Dlatego należy zachować ostrożność podczas pracy z nim.

Inkubuj szklane podłoża w piranii przez 10 minut, a po oczyszczeniu spłucz je i zdejonizuj lub odlej i wysusz podłoża gazowym azotem. Umieść podłoża w komorze parowania wiązki elektronów w celu osadzania chromu do grubości 250 nanometrów. Po osiągnięciu tej grubości usuń podłoża z komory i spłucz izopropanolem, a następnie wysusz na gorącej płycie przez pięć minut w temperaturze 115 stopni Celsjusza.

Zagruntować wysuszone podłoża heksametyloksazyną lub HMDS przez powlekanie wirowe po 30 sekundach. Kod wirowania 3000 obr./min ponownie ze zdjęciem Shipley S 1811. Oprzyj się przy użyciu identycznych parametrów.

Wstępnie upiecz podłoże bezpośrednio na gorącej płycie w temperaturze 100 stopni Celsjusza przez minuty. Następnie ułóż wzór fotoodporności poprzez ekspozycję na promieniowanie ultrafioletowe lub UV przez pięć sekund przez maskę fotograficzną. Następnie rozwiń podłoża naświetlone promieniami UV w wywoływaczu Shipley MF 3 21 Wystarczy zanurzyć podłoże na trzy minuty po.

Opłucz podłoże w końcówce wodnej DI. Piecz bezpośrednio na gorącej płycie w temperaturze 100 stopni Celsjusza przez minutę. Wytraw odsłonięty chrom, zanurzając podłoża na 30 sekund w tyle wytrawiania chromem, aby całkowicie je pokryć.

Spłucz podłoża wodą demineralizowaną i zanurz w urządzeniu do usuwania izolacji Z 300 T na tyle, aby zanurzyć podłoże na 10 minut. Aby usunąć pozostały fotorezyst. Spłucz w wodzie DI i wysusz w gazowym azocie.

Po tym osadzaniu, od dwóch do pięciu mikrometrów Paraline C.Polimer izolacyjny na podłożu przez chemiczne osadzanie z fazy gazowej osadza 50 nanometrów teflonu AF, aby powierzchnia była hydrofobowa przez powlekanie wirowe roztworem. 1% masy na masę w nerwie flory FC 40 przy 2000 obr./min przez 60 sekund. Na podłoże.

Powtórz z nieprzepuszczonym tlenkiem indu i cyny lub podłożem szklanym ITO, aby utworzyć górny słupek płyty. Upiecz oba podłoża na gorącej płycie w temperaturze 160 stopni Celsjusza. 10 minut na ustawienie cyfrowego urządzenia mikroprzepływowego.

Usunąć powłoki polimerowe z podkładek stykowych dolnego podłoża poprzez zeskrobanie skalpelem. Połącz odsłonięte pady dolnego podłoża z 40-pinowymi złączami zasilania na komputerze z uruchomionym widokiem laboratoryjnym. Korzystamy z domowej roboty skrzynki sterowniczej, która zawiera przekaźniki z sygnałami sterowanymi przez dpad.

Komputerowa skrzynka sterownicza ułatwia użytkownikowi kontrolę nad dostarczaniem sygnałów o napięciu 100 V RMS na 18 kiloherców do urządzenia za pośrednictwem 40-pinowych złączy. Włącz także generator funkcyjny i wzmacniacz. Zmontuj urządzenie, umieszczając dwa kawałki taśmy dwustronnej o całkowitej grubości 140 mikrometrów na krawędziach dolnego podłoża.

Odpipetuj cztery mikrolitry wody demineralizowanej do jednego ze zbiorników i zamknij urządzenie, umieszczając szkiełko z tlenku indu i cyny bez wzoru na górze urządzenia, stroną pokrytą teflonem skierowaną w dół. Podłącz łącznik uziemiający do biegu płyty górnej. Laboratorium stworzyło program inicjujący w widoku laboratorium do kalibracji kontroli sprzężenia zwrotnego, urządzenie jest teraz gotowe do eksperymentów.

W tym protokole użyjemy albuminy surowicy bydlęcej lub BSA jako próbki białka, aby zademonstrować nasz projekt i zastosowanie cyfrowej mikrofluidyki. BSA rozcieńcza się w buforze roboczym lub WB wykonanym ze 100 milimolowych tris HCL pH 7,8 o masie 0,08% onowej F1 27 na objętość. Przygotuj jeden mililitr każdej próbki i roztworu odczynnika i oznacz zbiornik, do którego zostanie on dodany.

Po przygotowaniu odczynnika wyjmij górną płytkę z urządzenia i odpipetuj cztery mikrolitry roztworu do przypisanego mu zbiornika. Po napełnieniu zbiorników załóż górną płytę na urządzenie. Użyj wewnętrznego programu widoku laboratorium, aby wykonać następujące kroki.

Pamiętaj, że interfejs komputerowy pozwala użytkownikowi dozować około 600 nanolitrowych kropel ze zbiorników i manipulować kropelkami na układzie elektrod. Najpierw należy dozować kroplę białka zawierającą próbkę z R 1 i kroplę osadu z R 2. Połącz dwie kropelki i pozwól połączonej kropli inkubować przez pięć minut, aby białka wytrąciły się na powierzchni.

Uruchomić supernatant z dala od wytrąconego białka do zbiornika odpadów. R trzy, aby przepłukać wytrącone białko, należy dozować trzy kropelki buforu do przemywania z R cztery i przekierować je przez wytrącone białko do zbiornika na odpady. Pozostawić osad do wyschnięcia i dozować kroplę buforu rozpuszczającego z R 5 na białko.

Pozostawić bufor do inkubacji przez 20 minut, aż osad się rozpuści. Następnie dozować kroplę środka redukującego z R six i połączyć ją z kroplą próbki. Wymieszaj połączoną kroplę, uruchamiając ją przez sześć elektrod w okrągły wzór.

Pozostawić kroplę do inkubacji przez godzinę w temperaturze pokojowej. Dozować kroplę środka alkilującego z R seven i połączyć ją z kroplą próbki, a następnie wymieszać. Pozostawić kroplę do inkubacji przez 15 minut w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem.

Na koniec dozować kroplę trypsyny z R eight i połączyć ją z kroplą próbki, a następnie wymieszać. Pozostaw kroplę do inkubacji przez trzy godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza na szalce Petriego na gorącym talerzu. Aby zakończyć reakcję, należy zdjąć górną płytkę i wygasić wytrawianie przez pipetowanie.

Umieść sześć mililitrów 2,5% kwasu trichlorooctowego w wodzie na kropli reakcyjnej. Oczyścić stłumiony produkt reakcji, odsysając kroplę próbki bezpośrednio z dolnej płytki. Za pomocą końcówki zamka błyskawicznego C 18, zgodnie z instrukcjami producenta, próbki można teraz rozcieńczać w razie potrzeby i oceniać za pomocą spektrometrii mas w celu identyfikacji białek w próbce Za pomocą tego systemu.

Następnie zidentyfikowano białka o specyfikacji masowej z wynikami prawdopodobieństwa mniejszym niż jeden razy E do ujemnej trójki, co odpowiada 99,9% przedziałowi ufności i pokryciu sekwencji co najmniej 30%Stąd DMF jest bardzo przydatną metodologią do zautomatyzowanego przetwarzania próbek proteomicznych. Pokazaliśmy dzisiaj, w jaki sposób wykorzystujemy cyfrowe mikroprzepływy do ekstrakcji i przetwarzania białek w sposób zautomatyzowany. Metodologia ta zapewnia potencjalne rozwiązanie problemu utraty i zanieczyszczenia próbki podczas izolacji i identyfikacji białek.

Mamy nadzieję, że w przyszłości uda nam się zastosować tę metodę do innych zastosowań biologicznych, w tym testów immunologicznych i testów komórkowych. Wykonując tego typu eksperyment, najważniejsze jest, aby pamiętać o tym, aby czerpać z niego przyjemność. Więc to wszystko.

Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.