Izolacja i analiza identyfikowalnych i funkcjonalizowanych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z osocza i tkanek stałych

Protokół ten zapewnia realny sposób izolowania i zbierania odpowiednich pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z większości krwi i tkanek stałych, a zwłaszcza analizy ich źródła i zawartości białka, co pomaga w dalszych eksperymentach funkcjonalnych. Oprócz wysokiej wydajności i niskiego zanieczyszczenia, główną zaletą tego protokołu jest analiza antygenów powierzchniowych i ładunków białkowych EV, co jest przydatne w badaniach fizjologicznych i patologicznych. Ułatwia diagnostykę nowotworów lub chorób, takich jak choroby zapalne i osteoporoza poprzez wykrywanie markerów powierzchniowych komórek rodzicielskich pęcherzyków zewnątrzkomórkowych za pomocą cytometru przepływowego.

Ilość tkankowego pęcherzyka zewnątrzkomórkowego ma kluczowe znaczenie dla następujących eksperymentów. Upewnij się, że stężenie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych nie jest wysokie. Uzbrój się w cierpliwość, aby wykonać rozcieńczenie.

Na początek przygotuj próbki kości szczęki, izolując kość szczęki za pomocą pęsety okulistycznej i nożyczek, a następnie umyj je PBS, aby pozbyć się tkanek miękkich za pomocą pęsety. Następnie włóż kość szczęki do 1,5 mililitrowych probówek wirówkowych i pokrój kość na małe kawałki o średnicy jednego milimetra nożyczkami. Dodaj pewną ilość liberazy, aby przykryć tkankę i inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Następnie odwirować próbkę o sile 800 G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i ostrożnie przenieść supernatant za pomocą pipety do nowych i czystych probówek wirówkowych o pojemności 1,5 mililitra. Po odwirowaniu przygotowanych próbek osocza i kości przez 15 minut w temperaturze 2 500 G i czterech stopniach Celsjusza w celu usunięcia dużych resztek komórek i pozostałych płytek krwi, ostrożnie przenieść supernatanty do nowych i czystych probówek wirówkowych o pojemności 1,5 mililitra i odwirować w temperaturze 16 800 G przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie wyrzuć supernatant i ponownie zawieś granulki w każdej probówce z jednym mililitrem PBS.

Po odwirowaniu i odrzuceniu supernatantu, jak wykazano wcześniej, ponownie zawiesić granulki w każdej probówce z 50 mikrolitrami PBS i przechowywać te próbki w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez mniej niż 24 godziny lub najlepiej natychmiast użyć ich do analiz. Ponownie zawiesić próbki z 500 mikrolitrami PBS i przenieść 50 mikrolitrów do nowej i czystej 1,5-mililitrowej probówki wirówkowej jako ślepej próby kontrolnej oznaczonej jako probówka A i kolejne 50 mikrolitrów do innej czystej 1,5-mililitrowej probówki wirówkowej jako prostej probówki do barwienia FITC, oznaczonej jako probówka B. Dodaj 0,5 mikrolitra barwnika membranowego do pierwotnej probówki w celu barwienia membrany podczas inkubacji przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Po odwirowaniu probówki pierwotnej przez 30 minut przy 16 800 G i odrzuceniu supernatantu, ponownie zawiesić granulki z 200 mikrolitrami PBS.

Podziel każdą próbkę o pojemności 50 mikrolitrów na cztery 1,5-mililitrowe probówki wirówkowe do prostych probówek do barwienia PE oznaczonych jako probówka C, barwienie markerem powierzchniowym oznaczonym jako probówka D i wtórne kontrole zawierające tylko przeciwciała oznaczone jako probówka E. Dodaj pierwotne przeciwciało z receptora związanego z osteoklastami i próbek pęcherzyków zewnątrzkomórkowych kości, a także przeciwciała CD-18 i próbek pęcherzyków zewnątrzkomórkowych osocza do probówki B i probówki D oddzielnie, inkubacja przez godzinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Odwirować probówki i wyrzucić supernatant, jak wykazano wcześniej, a następnie ponownie zawiesić granulki z 500 mikrolitrami PBS. Ponownie wirować przez 30 minut w temperaturze 16, 800 G i czterech stopniach Celsjusza, aby usunąć dodatkowe przeciwciała pierwszorzędowe.

Po odrzuceniu supernatantu ponownie zawiesić granulki z 50 mikrolitrami PBS, a następnie dodać sprzężone z FITC przeciwciała drugorzędowe odpowiednio w probówce E. Inkubować wszystkie probówki przez godzinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza w ciemności. Rozcieńczyć jedną kroplę odpowiednio 0,2, 0,5 i jednej zawiesiny kulek o wielkości jednego mikrometra w jednym mililitrze PBS. Następnie uruchom każdy rozmiar kulek, aby upewnić się, że bramka została wybrana dla pęcherzyków zewnątrzkomórkowych i ustaw próg cytometru przepływowego, aby wyszukać koraliki i populację pęcherzyków zewnątrzkomórkowych za pomocą odpowiedniego rozproszenia do przodu wewnątrz.

Ustaw warunek końcowy jako obliczanie 100 000 cząstek barwionych membranowo i przeanalizuj próbkę za pomocą cytometru przepływowego, jak opisano w manuskrypcie. Zawiesić granulki w 50 mikrolitrach buforu do lizy RIPA i inkubować przez 30 minut na lodzie. Aby określić ilościowo stężenia białka we wszystkich próbkach w 96-dołkowej mikropłytce za pomocą testu białka BCA, rozcieńczyć dwa miligramy na mililitr BSA 0,9% normalnej soli fizjologicznej do 0,5 miligrama na mililitr.

W ilości 0,5 miligrama na mililitr BSA i 0,9% zwykłej soli fizjologicznej do trzech zduplikowanych studzienek o określonych objętościach. Następnie upuść dwa mikrolitry próbek i dodaj osobno 18 mikrolitrów normalnej soli fizjologicznej do trzech zduplikowanych studzienek. Po przygotowaniu roztworu roboczego przez zmieszanie odczynnika BCA A z odczynnikiem B, dodaj 200 mikrolitrów roztworu roboczego do każdej studzienki i delikatnie wstrząsaj przez 30 sekund.

Następnie inkubować 96-dołkową mikropłytkę przez 20 do 25 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza i zmierzyć gęstość optyczną przy 596 nanometrach za pomocą spektrofotometru. Następnie wyeksportuj dane, narysuj krzywą wzorcową i oblicz stężenie białka w próbkach. Zgodnie z wynikami, rozcieńczyć próbki do jednego mikrograma na mikrolitr z 0,9% normalnej soli fizjologicznej i pięciokrotnym stężeniem buforu ładującego SDS-PAGE, a następnie szczelnie zamknąć probówki folią i podgrzewać przez pięć minut w temperaturze 100 stopni Celsjusza.

Załaduj próbki do drabinki białkowej do gradientowego stężenia od czterech do 20% żelu tris HEPy. Uruchom żel w buforze do pracy pod napięciem 80 woltów, aż białka utworzą linię. Następnie przełącz się na 120 V na jedną godzinę, aż barwnik ładujący znajdzie się na dnie żelu.

Przenieść żel na membranę z polifluorku winylidenu wstępnie inkubowaną w alkoholu metylowym przez 20 sekund przy użyciu mokrego systemu przenoszenia, aby przenieść przez jedną godzinę przy natężeniu 200 miliamperów. Przygotuj 5% bufor blokujący BSA, dodając 2,5 grama BSA i 50 mililitrów TBST do 50-mililitrowej probówki wirówkowej. Zablokuj membrany w tym buforze na dwie godziny w temperaturze pokojowej z mieszaniem.

Inkubować błony ze specyficznymi przeciwciałami pierwszorzędowymi rozcieńczonymi TBST do odpowiedniego stężenia przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przemyć błony w buforze płuczącym cztery razy i inkubować błony z odpowiednimi przeciwciałami drugorzędowymi przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej z mieszaniem. Po czterokrotnym umyciu membran w buforze myjącym, należy zobrazować membrany za pomocą zestawu chemiluminescencji w żelowym systemie obrazowania.

Transmisyjna mikroskopia elektronowa i analiza śledzenia nanocząstek wykazały, że typowe cechy morfologiczne pęcherzyków zewnątrzkomórkowych były okrągłe i miały kształt miseczki o średnicy od 500 do 300 nanometrów. Analiza cytometrii przepływowej pokazuje procentową zawartość specyficznych markerów błonowych wyrażonych na pęcherzykach zewnątrzkomórkowych, co sugeruje ich pochodzenie z komórek rodzicielskich. Analiza Western blot wykazuje ekspresję PGD i PKM2 odpowiednio jako reprezentatywnych dla zawartości białka i pęcherzyków zewnątrzkomórkowych osocza oraz pęcherzyków zewnątrzkomórkowych kości, co wskazuje na stan metaboliczny.

Ujemną ekspresję Golgin-84 w pęcherzykach zewnątrzkomórkowych wykryto przy obecności mitofiliny, alfa-aktyniny-4, flotyliny-1, kaweoliny-1 i beta-aktyny, wraz z markerem pęcherzyków CD9, podczas gdy ekspresja CD81 jest niska lub nieobecna przy braku obecności APO-A-1 w pęcherzykach zewnątrzkomórkowych osocza. Naukowcy, mając więc na uwadze krok 2.2, przygotowanie i trawienie próbek tkanek powinno być wykonane w wystarczającym stopniu. W przeciwnym razie liczba pęcherzyków zewnątrzkomórkowych wyekstrahowanych z tkanek jest ograniczona.

Marker oznaczony fluorescencyjnym barwnikiem pęcherzyków zewnątrzkomórkowych może być wstrzykiwany do jamy ustnej w celu leczenia fazy związanej z potencjalną funkcją.