Name: Izolacja i analiza identyfikowalnych i funkcjonalizowanych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z osocza i tkanek stałych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Poznaj metodę izolacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z osocza i tkanek stałych z wysoką wydajnością i niskim zanieczyszczeniem. Protokół umożliwia analizę powierzchniowych antygenów i diagnostykę chorób nowotworowych oraz zapalnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty z Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (32000974, 81870796, 82170988 i 81930025) oraz Chińskiej Fundacji Nauk Podoktoranckich (2019M663986 i BX20190380). Jesteśmy wdzięczni za pomoc ze strony Narodowego Centrum Demonstracyjnego Nauczania Eksperymentalnego dla Medycyny Podstawowej (AMFU).

Eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Czwartego Wojskowego Uniwersytetu Medycznego oraz wytycznymi ARRIVE. W niniejszym badaniu wykorzystano 8-tygodniowe myszy C57Bl/6 (bez preferencji ani dla samic, ani samców). Etapy związane z izolacją EV osocza i tkanek są zilustrowane na Rysunek 1. Osocze jest traktowane jako przedstawiciel opisujący procedurę izolacji EV z płynów ustrojowych. Kość szczęki jest traktowana jako reprezentatywna w celu wyjaśnienia procedury izolacji EV z tkanek litych.
1. Przygotowanie próbek osocza i kości szczęki
<ol>
	<li>Przygotuj próbki osocza, postępując zgodnie z poniższymi krokami.
	<ol>
		<li>Określ masę ciała myszy za pomocą standardowej wagi laboratoryjnej.</li>
		<li>Dodać 20 μl, 2 mg/ml heparyny do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml i użyć mieszalnika (patrz tabela materiałów), aby heparyna przyczepiła się do ścianki probówki. 
		UWAGA: Probówki przeciwzakrzepowe mogą być również używane bezpośrednio do pobierania krwi.</li>
		<li>Znieczulić mysz przez dootrzewnowe wstrzyknięcie 50 mg/kg pentobarbitalu sodu (patrz tabela materiałów). Chwyć szyję myszy kciukiem i palcem wskazującym, a następnie przymocuj ogon i lewą tylną nogę małym palcem i wstrzyknij sód pentobarbitalu za pomocą strzykawki do wstrzykiwań o pojemności 1 ml po odsłonięciu brzucha.</li>
		<li>Upewnij się, że mysz jest odpowiednio znieczulona w oparciu o brak odruchu rogówkowego i reakcji kończyny, gdy podnóżek jest ściśnięty.</li>
		<li>Ogol włosy na twarzy i rzęsach oczu zakrzywionymi nożyczkami.</li>
		<li>Chwyć skórę szyi myszy i dociśnij skórę wokół oczu do tyłu szyi, tak aby gałka oczna wystawała. Użyj pęsety okulistycznej, aby szybko zacisnąć gałkę oczną i zebrać odpływ krwi za pomocą probówek wirówkowych o pojemności 1,5 ml przygotowanych w kroku 1.1.2. Poświęć mysz, zwichając kręg szyjny. 
		UWAGA: Uważaj na włoski i rzęsy, ponieważ mogą one powodować hemolizę.</li>
		<li>Delikatnie obróć rurkę kilka razy do góry nogami, aby zapobiec krzepnięciu krwi. 
		UWAGA: Jak najszybciej odwróć rurkę do góry nogami.</li>
		<li>Odwirować próbkę krwi przez 15 minut w temperaturze 1 200 x g w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Ostrożnie przenieść supernatant do nowych i czystych probówek wirówkowych o pojemności 1,5 ml i natychmiast użyć próbki osocza lub przechowywać ją w temperaturze 4 °C przez kilka godzin.</li>
		<li>Rozcieńczyć supernatant równą objętością 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) i dobrze wymieszać. 
		UWAGA: Podany powyżej protokół pobierania osocza jest śmiertelny. Krew może być również pobrana przez nakłucie żyły podobojczykowej11 bez poświęcania myszy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj próbki kości szczęki, wykonując poniższe czynności.
	<ol>
		<li>Odizoluj kość szczęki za pomocą pęsety okulistycznej i nożyczek i umyj je PBS, aby pozbyć się tkanek miękkich za pomocą pęsety.</li>
		<li>Włóż kość szczęki do probówek wirówkowych o pojemności 1,5 ml i pokrój kość na małe kawałki (rozmiar musi być mniejszy niż 1 mm średnicy) nożyczkami. Dodać pewną ilość liberazy (5 μg/ml, patrz tabela materiałów) w celu pokrycia tkanki (zwykle 1 ml w przypadku próbek kości od 8-tygodniowej myszy), a następnie inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Odwirować próbkę o masie 800 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Ostrożnie przenieść supernatant za pomocą pipety do nowych i czystych probówek wirówkowych o pojemności 1,5 ml.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Ekstrakcja EV
<ol>
	<li>Odwirować próbki (przygotowane w krokach 1.1.10 i 1.2.4) przez 15 minut w temperaturze 2 500 x g (4 °C) w celu usunięcia dużych resztek komórek i pozostałych płytek krwi.</li>
	<li>Ostrożnie przenieść supernatanty do nowych i czystych probówek wirówkowych o pojemności 1,5 ml i wirować przez 30 minut w temperaturze 16 800 x g (4 °C). 
	UWAGA: Prędkość wirowania można ustawić na ponad 10 000 x g, aby wyodrębnić EVs12. Im wyższa prędkość wirówki, tym większą ilość EV można uzyskać. Ponieważ ograniczenie prędkości użytej przez nas wirówki wynosi 16 800 x g (patrz Tabela materiałów), wybraliśmy tę prędkość w tym protokole.</li>
	<li>Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić granulki w każdej probówce z 1 ml PBS. Wirować przez 30 minut w temperaturze 16 800 x g (4 °C).</li>
	<li>Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić granulki w każdej probówce z 50 μl PBS. Próbki te należy przechowywać w temperaturze 4 °C krócej niż 24 godziny lub najlepiej natychmiast użyć do następujących analiz (etapy 3–5). 
	UWAGA: Przechowywanie w temperaturze -80 °C jest niedopuszczalne, ponieważ zmniejszy to stężenie EV i zwiększy rozmiary cząstek EVs13, wpływając w ten sposób na następującą analizę EVs.</li>
</ol>
3. Identyfikacja morfologiczna EV
<ol>
	<li>Wykonaj analizę NTA.
	<ol>
		<li>W zależności od ilości EV (w przybliżeniu ocenianej na podstawie wielkości granulek, cząstki osocza o objętości 50 μl są minimalne), przenieś 5-50 μl reprodukcji (krok 2.4), rozcieńcz w 10 ml roztworu buforowego (PBS przefiltrowany filtrem 0,22 μm) i wystarczająco wymieszaj z 1 ml końcówkami mikropipet. Użyj tej końcowej zawiesiny do pomiaru cząstek.</li>
		<li>Za pomocą sterylnej strzykawki o pojemności 1 ml wstrzyknąć co najmniej 5 ml wody destylowanej z umiarkowaną i stałą prędkością, aż liczba cząstek wyświetlanych na interfejsie wykrywania będzie mniejsza niż pięć. 
		UWAGA: Po wstrzyknięciu 1 ml wody destylowanej przez cały kanał, liczba cząstek jest bezpośrednio pokazywana na interfejsie wykrywania. Jeśli liczba nadal przekracza pięć, kontynuuj wstrzykiwanie 1 ml wody destylowanej, aż kryteria zostaną spełnione.</li>
		<li>Rozpuść 1 μl roztworu kalibracyjnego w 1 ml wody destylowanej w celu wytworzenia roztworu podstawowego, a następnie weź 100 μl roztworu podstawowego do 25 ml wody destylowanej w celu przygotowania wzorcowego roztworu podstawowego (1:250 000). Odczynnik roboczy należy przechowywać w temperaturze 4 °C przez 1 tydzień.</li>
		<li>Skalibrować przyrząd NTA z wzorcowym roztworem podstawowym (krok 3.1.3). Wstrzyknąć 1-5 ml roboczego roztworu kalibracyjnego za pomocą sterylnej strzykawki o pojemności 1 ml, aby przepłukać kanał maszyny, aż liczba cząstek wyświetlanych na interfejsie wykrywania będzie mieścić się w zakresie 50-400 (najlepiej około 300). Uruchom program kalibracyjny.</li>
		<li>Powtórz krok 3.1.2, aby przepłukać kanał maszyny przed każdym pomiarem próbki.</li>
		<li>Za pomocą sterylnej strzykawki o pojemności 1 ml wstrzyknąć co najmniej 2 ml roztworu buforowego, przepłukać kanał urządzenia ze stałą prędkością, aż liczba cząstek wyświetlanych na interfejsie wykrywania będzie mniejsza niż 10.</li>
		<li>Wstrzyknąć 1 ml próbki EV przygotowanej w kroku 3.1.1 z umiarkowaną i stałą prędkością (zalecana prędkość to 0,5-1 ml/s). 
		UWAGA: Optymalne stężenie cząstek sprawia, że liczba cząstek wyświetlanych na interfejsie detekcji mieści się w zakresie od 50-400, a najlepiej około 300. Jeśli liczba cząstek jest zbyt duża, powtórz krok 3.1.2, aby natychmiast przepłukać kanał maszyny, aby uniknąć zatrzymywania się cząstek na ściance kanału i dostosuj stężenie próbki EV zgodnie z krokiem 3.1.1, a następnie powtórz od kroku 3.1.5.</li>
		<li>Przeprowadź analizę cząstek i wygeneruj raporty z analizy zgodnie z instrukcjami producenta (patrz tabela materiałów).</li>
		<li>Jeśli próbka jest cenna, odpompuj próbkę EV za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml i zbierz ją do probówek wirówkowych o pojemności 1,5 ml. Powtórz krok 2.2, aby wyodrębnić EVs.</li>
		<li>Po wykryciu wszystkich próbek wstrzyknąć co najmniej 2 ml roztworu buforowego do kanału maszyny, a następnie wstrzyknąć co najmniej 5 ml wody destylowanej, aż liczba cząstek wyświetlanych na interfejsie detekcji będzie mniejsza niż pięć.</li>
		<li>Użyj sterylnej strzykawki o pojemności 5 ml, aby wstrzyknąć co najmniej 10 ml powietrza ze stałą prędkością (zalecana prędkość to 1 ml/s), aby usunąć wodę z kanału.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj analizę TEM. 
	UWAGA: Wykonaj następujące czynności w przypadku nowych zawieszeń EV. Siatka mikroskopu elektronowego pokryta węglem ma dwie strony, przy czym strona robocza jest świecąca w siatkach środkowych. Minimalna objętość osocza do ekstrakcji EV dla poniższej procedury wynosi 50 μl.
	<ol>
		<li>Wymieszać próbkę EV (krok 2.4) z równą objętością 4% paraformaldehydu (PFA). Umieść 4 μl EV na jednej siatce i inkubuj przez 15 minut w temperaturze pokojowej (RT).</li>
		<li>Umieść cztery krople PBS (jedna kropla jest równa 50 μl) na arkuszu folii polietylenowej (patrz tabela materiałów). Przenieś siatki za pomocą czystej, mikroskopijnej pęsety i umyj roboczą stronę siatki w PBS z jednej kropli na drugą.</li>
		<li>Użyj bibuły filtracyjnej, aby usunąć dodatkowe PBS, które pozostały w siatkach.</li>
		<li>Inkubować roboczą stronę siatki w 1% kwasie fosfowolframowym (patrz tabela materiałów) przez 2 minuty, a następnie powtórzyć krok 3.2.2. 
		UWAGA: Ponieważ kwas fosfowolframowy jest trujący, procedura ta musi być wykonywana w dygestorium, a nadmiarowy kwas fosfatungsowy należy specjalnie poddać recyklingowi, a nie bezpośrednio wyrzucać.</li>
		<li>Umieść kratki stroną zadrukowaną do góry w naczyniu o średnicy 10 cm pokrytym bibułą filtracyjną. Siatki mogą być przechowywane w RT przez kilka lat.</li>
		<li>Obserwować siatki pod mikroskopem elektronowym zgodnie z instrukcjami producenta (patrz Tabela materiałów). 
		UWAGA: Aby zapewnić obserwację pojedynczych cząstek, należy dostosować stężenie EV, a zawiesina musi być klarowna, bez widocznego zmętnienia. Przed upuszczeniem próbka powinna być dobrze wymieszana. Reprezentatywne analizy TEM i NTA przedstawiono na rysunku Rysunek 2.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Analiza pochodzenia pojazdów elektrycznych
UWAGA: Identyfikacja komórkowego pochodzenia EV wymaga zastosowania przeciwciał dla typowych markerów błony komórkowej. Minimalna objętość osocza do ekstrakcji EV dla poniższej procedury wynosi 300 μL. W oparciu o dwuwarstwowe struktury lipidowe EV, do ich oznaczania można użyć barwnika membranowego. W przypadku próbek osocza krwi do reprezentacji wybiera się CD18 dla limfocytów14. W przypadku próbek kości szczęki jako przykład wybrano receptor związany z osteoklastami (OSCAR) dla osteoklastów15. Przed FC upewnij się, że cytometr przepływowy jest dostosowany do pomiaru EVs16, ponieważ dolna granica rozmiaru jest znacznie różna między różnymi cytometrami przepływowymi.
<ol>
	<li>Ponownie zawiesić próbki (etap 2.4) za pomocą 500 μl PBS i przenieść 50 μl do nowej i czystej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml jako ślepej próby kontrolnej (probówka A), a kolejne 50 μl do nowej i czystej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml jako prostej probówki do barwienia dla FITC (probówka B). Dodaj 0,5 μl barwnika membranowego do pierwotnej probówki w celu barwienia membrany. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Odwirować probówkę pierwotną przez 30 minut w temperaturze 16 800 x g (4 °C). Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić granulki za pomocą 200 μl PBS.</li>
	<li>Podziel każdą próbkę o objętości 50 μl na cztery probówki wirówkowe o pojemności 1,5 ml do prostych probówek do barwienia PE (probówka C), barwienia markerem powierzchniowym (probówka D) i kontroli tylko wtórnych przeciwciał (probówka E).</li>
	<li>Dodać pierwszorzędowe przeciwciało OSCAR w próbkach EV kości, jak również przeciwciało CD18 w próbkach EV osocza (patrz tabela materiałów) do probówki B (krok 4.1) i probówki D (krok 4.3) oddzielnie (rozcieńczone w stosunku 1:100). Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Wirować probówki przez 30 minut w temperaturze 16 800 x g (4 °C). Odrzucić supernatant, ponownie zawiesić granulki z 500 μl PBS, a następnie ponownie odwirować przez 30 minut w temperaturze 16 800 x g (4 °C) w celu usunięcia dodatkowych przeciwciał pierwszorzędowych.</li>
	<li>Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić granulki z 50 μl PBS, a następnie dodać odpowiednio przeciwciała drugorzędowe sprzężone z FITC (patrz Tabela materiałów) (rozcieńczone w stosunku 1:200) (probówka E). Dodać te same przeciwciała drugorzędowe do probówki B (krok 4.1) i probówki D (krok 4.3). Inkubować wszystkie probówki przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C w ciemności. 
	UWAGA: Przeciwciała znakowane bezpośrednio sprzężone z fluorescencją mogą być również używane do przetwarzania wykrywania FC za pomocą odpowiednich kontroli izotypów.</li>
	<li>Rozcieńczyć jedną kroplę zawiesiny kulek o wielkości 0,2, 0,5 i 1 μm (patrz Tabela materiałów) odpowiednio w 1 ml PBS i najpierw uruchomić każdy rozmiar kulek, aby upewnić się, że bramka została wybrana dla pojazdów elektrycznych. Ustaw próg cytometru przepływowego, aby wyszukać kulki i populację EV za pomocą odpowiedniego rozproszenia do przodu (FSC) i rozrzutu bocznego (SSC).
	<ol>
		<li>Ustaw warunek końcowy jako obliczanie 100 000 cząstek barwionych membranowo. Analizować próbkę za pomocą cytometru przepływowego zgodnie z instrukcjami producenta (patrz tabela materiałów). Reprezentatywne wyniki są pokazane w <silna klasa="xfig">Rysunek 3. 
		UWAGA: Sprzęt NTA z kanałami fluorescencyjnymi może być również używany do analizy pochodzenia, a przygotowanie próbki jest takie samo jak FC.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Analiza zawartości białka w EV
UWAGA: Analiza zawartości białka w EVs jest przeprowadzana za pomocą western blot. Na przykład EV osocza i kości wybrano do analizy dehydrogenazy 6-fosfoglukonianu (PGD) i kinazy pirogronianowej M2 (PKM2) pod kątem stanu metabolicznego. Golgin84 (organelle Golgiego) zastosowano jako kontrolę negatywną, a flotylinę (białko błonowe), kaweolinę (integralne białko kaweoli) i β-aktynę (cytoszkielet) 17 zastosowano jako kontrolę pozytywną w EV w porównaniu z próbkami komórek. Mitofilina i α-aktynina-4 zostały wybrane jako duże markery EV, podczas gdy CD9 i CD81 zostały wybrane jako małe markery EV, aby zademonstrować subpopulacje EV18. Apoa1 został wybrany jako marker lipopcząstek osocza19. Szczegółowe informacje na temat odczynników znajdują się w Tabeli materiałów.
<ol>
	<li>Zawiesić granulki (krok 2.4) w 50 μl buforu do lizy RIPA i inkubować przez 30 minut na lodzie.</li>
	<li>Określić ilościowo stężenia białka we wszystkich próbkach w 96-dołkowej mikropłytce za pomocą testu białka BCA zgodnie z instrukcjami producenta (patrz tabela materiałów).
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć 2 mg/ml albuminy surowicy bydlęcej (BSA) 0,9% soli fizjologicznej (NS) (zawierającej 0,9% (w/v) chlorku sodu) w 0,5 mg/ml. Dodać 0,5 mg/ml BSA i 0,9% NS do trzech zduplikowanych studzienek o określonych objętościach, jak pokazano w Tabeli 1.</li>
		<li>Wrzucić 2 μl próbek (etap 5.1) i dodać 18 μl NS oddzielnie do trzech zduplikowanych studzienek.</li>
		<li>Przygotuj roztwór roboczy, mieszając odczynnik BCA A z odczynnikiem B (odczynnik A:B w proporcji 50:1). Dodaj 200 μl roztworu roboczego do każdej studzienki i delikatnie wstrząsaj przez 30 s.</li>
		<li>Inkubować 96-dołkową mikropłytkę przez 20-25 minut w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Zmierzyć średnicę zewnętrzną przy długości fali 596 nm za pomocą spektrofotometru (patrz tabela materiałów).</li>
		<li>Eksportuj dane.</li>
		<li>Narysuj krzywą wzorcową i oblicz stężenie białka w próbkach.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zgodnie z wynikami rozcieńczyć próbki do 1 μg/μL z 0,9% NS i 5x buforem ładującym SDS-PAGE (250 mM Tris·HCl, pH 6,8, 10% SDS, 30% (v/v) glicerol, 10 mM DTT, 0,05% (w/v) błękit bromofenolowy, patrz tabela materiałów). Szczelnie zamknąć probówki folią i podgrzewać przez 5 minut w temperaturze 100 °C.</li>
	<li>Załaduj próbki i drabinkę białkową do gradientowego stężenia 4%-20% żelu Hepes-Tris (patrz Tabela materiałów). 
	UWAGA: Wybierz procent żelu zgodnie z masą cząsteczkową interesujących Cię białek.</li>
	<li>Uruchom żel w buforze roboczym pod napięciem 80 V, aż białka utworzą linię, a następnie przełącz na 120 V na 1 godzinę, aż barwnik ładujący znajdzie się na dnie żelu. 
	UWAGA: Czas pracy może się różnić w zależności od używanego sprzętu lub rodzaju i stężenia żelu.</li>
	<li>Przenieść żel do membrany z polifluorku winylidenu (PVDF) (patrz tabela materiałów), wstępnie inkubowanej w alkoholu metylowym przez 20 s. Użyć mokrego systemu transferowego do przenoszenia przez 1 godzinę przy 200 mA. 
	UWAGA: Upewnij się, że wewnątrz systemu transferowego nie ma pęcherzyków powietrza i utrzymuj mokrą membranę PVDF. 
	UWAGA: Czas transferu może się różnić w zależności od masy cząsteczkowej białka docelowego; 1 KD zwykle potrzebuje 1 min.</li>
	<li>Przygotować 5% bufor blokujący BSA, dodając 2,5 g BSA (patrz Tabela Materiałów) do 50 ml Tris-buffered soli fizjologicznej (TBST) (2 ml Tween dodano w 2 l roztworu PBS) do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Mieszać aż do rozpuszczenia proszku. Zablokować membrany w tym buforze na 2 godziny w temperaturze pokojowej z mieszaniem.</li>
	<li>Inkubować błony ze specyficznymi przeciwciałami pierwszorzędowymi rozcieńczonymi TBST do odpowiedniego stężenia (Mitofilin, 1:1000; α-Actinin-4, 1:1000; CD9, 1:1000; CD81, 1:1000; Apoa1, 1:1000; Golgin84, 1:1000; Flotylin-1, 1:1000; Kaweolina-1, 1:1000; PGD, 1:1000; PKM2, 1:1000; β-aktyna, 1:3000) przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przemyć błony w buforze płuczącym (2 ml Tween dodane do 2 l roztworu PBS) cztery razy (za każdym razem 15 minut) i inkubować błony z odpowiednimi przeciwciałami drugorzędowymi w stosunku 1:4000 przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej z mieszaniem.</li>
	<li>Umyj membrany w buforze myjącym cztery razy (za każdym razem 15 minut) i zobrazuj membrany za pomocą zestawu do chemiluminescencji i systemu obrazowania żelowego (patrz tabela materiałów).</li>
</ol>

<ol><li>Abels, E. R., Breakefield, X. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+to+extracellular+vesicles%3A+biogenesis%2C+RNA+cargo+selection%2C+content%2C+release%2C+and+uptake%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Introduction to extracellular vesicles: biogenesis, RNA cargo selection, content, release, and uptake.</a> Cellular and Molecular Neurobiology. 36 (3), 301-312 (2016).</li>
<li>Mathieu, M., Martin-Jaular, L., Lavieu, G., Théry, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificities+of+secretion+and+uptake+of+exosomes+and+other+extracellular+vesicles+for+cell-to-cell+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication.</a> Nature Cell Biology. 21 (1), 9-17 (2019).</li>
<li>Van Niel, G., D'Angelo, G., Raposo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shedding+light+on+the+cell+biology+of+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (4), 213-228 (2018).</li>
<li>Witwer, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardization+of+sample+collection%2C+isolation+and+analysis+methods+in+extracellular+vesicle+research%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 2 (1), 20360(2013).</li>
<li>Keshtkar, S., Azarpira, N., Ghahremani, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cell-derived+extracellular+vesicles%3A+novel+frontiers+in+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles: novel frontiers in regenerative medicine.</a> Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 63(2018).</li>
<li>Thietart, S., Rautou, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+as+biomarkers+in+liver+diseases%3A+A+clinician%27s+point+of+view%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles as biomarkers in liver diseases: A clinician's point of view.</a> Journal of Hepatology. 73 (6), 1507-1525 (2020).</li>
<li>Xia, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Damaged+brain+accelerates+bone+healing+by+releasing+small+extracellular+vesicles+that+target+osteoprogenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Damaged brain accelerates bone healing by releasing small extracellular vesicles that target osteoprogenitors.</a> Nature Communications. 12 (1), 6043(2021).</li>
<li>In’t Veld, S. G. J. G., Wurdinger, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-educated+pletelets%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Tumor-educated pletelets.</a> Blood. 133 (22), 2359-2364 (2019).</li>
<li>Schwager, S. C., Reinhart-King, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanobiology+of+microvesicle+release%2C+uptake%2C+and+microvesicle-mediated+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Membranes%22%5BJournal%5D)">Mechanobiology of microvesicle release, uptake, and microvesicle-mediated activation.</a> Current Topics in Membranes. 86, 255-278 (2020).</li>
<li>Brahmer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((endothelial+cells+and+leukocytes+contribute+to+the+exercise-triggered+release+of+extracellular+vesicles+into+the+circulation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">endothelial cells and leukocytes contribute to the exercise-triggered release of extracellular vesicles into the circulation.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 8 (1), 1615820(2019).</li>
<li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+collection+through+subclavian+vein+puncture+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Blood collection through subclavian vein puncture in mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (147), e59556(2019).</li>
<li>Han, L., Lam, E. W., Sun, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+in+the+tumor+microenvironment%3A+old+stories%2C+but+new+tales%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles in the tumor microenvironment: old stories, but new tales.</a> Molecular Cancer. 18 (1), 59(2019).</li>
<li>Gelibter, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+storage+on+extracellular+vesicles%3A+A+systematic+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">The impact of storage on extracellular vesicles: A systematic study.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 11 (2), 12162(2022).</li>
<li>Forsyth, C. B., Mathews, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphocytes+utilize+CD11b%2FCD18+for+adhesion+to+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Immunology%22%5BJournal%5D)">Lymphocytes utilize CD11b/CD18 for adhesion to Candida albicans.</a> Cellular Immunology. 170 (1), 91-100 (1996).</li>
<li>Kodama, J., Kaito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoclast+multinucleation%3A+review+of+current+literature%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Osteoclast multinucleation: review of current literature.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (16), 5685(2020).</li>
<li>Welsh, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MIFlowCyt-EV%3A+a+framework+for+standardized+reporting+of+extracellular+vesicle+flow+cytometry+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">MIFlowCyt-EV: a framework for standardized reporting of extracellular vesicle flow cytometry experiments.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1713526(2020).</li>
<li>Durcin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+adipocyte-derived+extracellular+vesicle+subtypes+identifies+distinct+protein+and+lipid+signatures+for+large+and+small+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Characterisation of adipocyte-derived extracellular vesicle subtypes identifies distinct protein and lipid signatures for large and small extracellular vesicles.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1305677(2017).</li>
<li>Kowal, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+comparison+defines+novel+markers+to+characterize+heterogeneous+populations+of+extracellular+vesicle+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (8), 968-977 (2016).</li>
<li>Noren Hooten, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+extracellular+vesicle+protein+cargo+with+race+and+clinical+markers+of+mortality%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Association of extracellular vesicle protein cargo with race and clinical markers of mortality.</a> Scientific Reports. 9 (1), 17582(2019).</li>
<li>Sidhom, K., Obi, P. O., Saleem, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+exosomal+isolation+methods%3A+is+size+exclusion+chromatography+the+best+option%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">A review of exosomal isolation methods: is size exclusion chromatography the best option.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (18), 6466(2020).</li>
<li>Pietrowska, M., Wlosowicz, A., Gawin, M., Widlak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MS-based+proteomic+analysis+of+serum+and+plasma%3A+problem+of+high+abundant+components+and+lights+and+shadows+of+albumin+removal%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">MS-based proteomic analysis of serum and plasma: problem of high abundant components and lights and shadows of albumin removal.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1073, 57-76 (2019).</li>
<li>Coumans, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methodological+guidelines+to+study+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Methodological guidelines to study extracellular vesicles.</a> Circulation Research. 120 (10), 1632-1648 (2017).</li>
<li>Théry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+%28MISEV2018%29%3A+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).</li>
<li>Witwer, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardization+of+sample+collection%2C+isolation+and+analysis+methods+in+extracellular+vesicle+research%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 2 (1), 20360(2013).</li>
<li>Coumans, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methodological+guidelines+to+study+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Methodological guidelines to study extracellular vesicles.</a> Circulation Research. 120 (10), 1632-1648 (2017).</li>
<li>Görgens, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+storage+conditions+stabilizing+extracellular+vesicles+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Identification of storage conditions stabilizing extracellular vesicles preparations.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 11 (6), 12238(2020).</li>
<li>Maroto, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+storage+temperature+on+airway+exosome+integrity+for+diagnostic+and+functional+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Effects of storage temperature on airway exosome integrity for diagnostic and functional analyses.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1359478(2017).</li>
<li>Zheng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptotic+vesicles+restore+liver+macrophage+homeostasis+to+counteract+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Apoptotic vesicles restore liver macrophage homeostasis to counteract type 2 diabetes.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 10 (7), 12109(2021).</li>
<li>Liu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+apoptotic+bodies+maintain+mesenchymal+stem+cell+homeostasis+and+ameliorate+osteopenia+via+transferring+multiple+cellular+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Circulating apoptotic bodies maintain mesenchymal stem cell homeostasis and ameliorate osteopenia via transferring multiple cellular factors.</a> Cell Research. 28 (9), 918-933 (2018).</li>
<li>Vander Pol, E., van Gemert, M. J., Sturk, A., Nieuwland, R., van Leeuwen, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+vs.+swarm+detection+of+microparticles+and+exosomes+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Single vs. swarm detection of microparticles and exosomes by flow cytometry.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 10 (5), 919-930 (2012).</li>
<li>Dawson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+lipid+rafts+%28detergent-resistant+microdomains%29+and+comparison+to+extracellular+vesicles+%28exosomes%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation of lipid rafts (detergent-resistant microdomains) and comparison to extracellular vesicles (exosomes).</a> Methods in Molecular Biology. 2187, 99-112 (2021).</li>
<li>Zhang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles%3A+Natural+liver-accumulating+drug+delivery+vehicles+for+the+treatment+of+liver+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles: Natural liver-accumulating drug delivery vehicles for the treatment of liver diseases.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 10 (2), 12030(2020).</li>
<li>Vella, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rigorous+method+to+enrich+for+exosomes+from+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">A rigorous method to enrich for exosomes from brain tissue.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1348885(2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podczas badania cech, losu i funkcji pojazdów elektrycznych kluczowe znaczenie ma izolacja pojazdów elektrycznych o wysokiej wydajności i niskim zanieczyszczeniu. Istnieją różne metody ekstrakcji EV, takie jak wirowanie w gradiencie gęstości (DGC), chromatografia wykluczania wielkości (SEC) i testy immunowychwytywania 4,20. Tutaj zastosowano jedną z najczęściej stosowanych metod, wirowanie różnicowe; Zaletą tego rozwiązania jest to, że nie jest czasochłonne, gene...

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV) zostały zaproponowane do zdefiniowania dwuwarstwowych struktur zewnątrzkomórkowych uwalnianych przez komórki1, które odgrywają ważną rolę w różnych zdarzeniach fizjologicznych i patologicznych2. EV uwalniane przez zdrowe komórki można ogólnie podzielić na dwie główne kategorie, a mianowicie egzosomy (lub małe EV) utworzone przez wewnątrzkomórkowy szlak transportu endocytarnego3 i mikropęcherzyki (lub duże EV) powstałe przez zewnętrzne pączkowanie błony plazmatycznej komórki4. Podczas gdy wiele badań koncentruje się na funkcji EV pobranych z komórek hodowanych in vitro5, EV pochodzące z krążenia lub tkanek są bardziej złożone i niejednorodne, co ma tę zaletę, że odzwierciedla prawdziwy stan organizmu in vivo6. Co więcej, prawie wszystkie rodzaje tkanek mogą wytwarzać EV in vivo, a te EV mogą działać jako posłańcy w tkance lub być przenoszone przez różne płyny ustrojowe, zwłaszcza krew obwodową, aby ułatwić komunikację ogólnoustrojową7. EV w krążeniu i tkankach są również celami w diagnostyce i leczeniu chorób8.
Podczas gdy egzosomy były intensywnie badane w ostatnich latach, mikropęcherzyki pełnią również ważne funkcje biologiczne, które można łatwo wydobyć bez ultrawirowania, co sprzyja badaniom podstawowym i klinicznym9. Warto zauważyć, że kluczową kwestią dotyczącą EV wyizolowanych z krążenia i tkanek jest to, że pochodzą one z różnych typów komórek10. Ponieważ mikropęcherzyki są usuwane z błony komórkowej i charakteryzują się dużą ilością cząsteczek na powierzchni komórki9, możliwe jest użycie markerów macierzystej błony komórkowej do identyfikacji pochodzenia komórkowego tych EV. W szczególności technika cytometrii przepływowej (FC) może być stosowana do wykrywania markerów błonowych. Co więcej, naukowcy mogą wyizolować pojazdy elektryczne i przeprowadzić dalsze analizy w oparciu o funkcjonalne ładunki.
Obecny protokół zapewnia dokładną procedurę ekstrakcji i charakteryzowania EV z próbek in vivo. EV są izolowane za pomocą wirowania różnicowego, a charakterystyka EV obejmuje identyfikację morfologiczną za pomocą analizy śledzenia nanocząstek (NTA) i transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM), analizę pochodzenia za pomocą FC oraz analizę ładunku białka za pomocą western blot. Jako przedstawiciele stosuje się osocze krwi i kość szczęki myszy. Badacze mogą odwołać się do tego protokołu dla pojazdów elektrycznych z innych źródeł i wprowadzić odpowiednie modyfikacje.

<table><tbody><tr><td>4% paraformaldehydu&nbsp;</td><td>Transmisyjny mikroskop elektronowy</td> <td>Biosharp</td><td>143174</td></tr><tr><td>Alexa fluor 488 przeciwciało wtórne przeciwko kozom</td><td>Yeason</td><td>34306ES60</td><td>Cytometria przepływowa</td></tr><tr><td>Alexa fluor 488 przeciwciało drugorzędowe przeciwko królikowi</td><td>Invitrogen</td><td>A11008</td><td>Cytometria przepływowa</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-CD18</td><td>Abcam</td><td>ab131044</td><td>Cytometria przepływowa</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-CD81</td><td>Abcam</td><td>ab109201</td><td>Przeciwciało Western blot</td></tr><tr><td>anty-CD9</td><td>Huabio</td><td>ET1601-9</td><td>Przeciwciało Western blot</td></tr><tr><td>anty-mitofiliny</td><td>Abcam</td><td>ab110329</td><td>Western</td></tr><tr><td>blot APOA1 Rabbit pAb</td><td>Abclone</td><td>A14211</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania białka BCA</td><td>TIANGEN</td><td>PA115</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>BLUeye Prestained Protein Ladder</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>94964-500UL</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>MP Biomedical</td><td>218072801</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>Przeciwciało kaweoliny-1</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-53564</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>CellMask Pomarańczowa plama błony plazmatycznej</td><td>Invitrogen</td><td>C10045</td><td>Cytometria przepływowa</td></tr><tr><td>Chemiluminescencja</td><td>Amersham Biosciences</td><td>N/A</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>Zakrzywione nożyce operacyjne</td><td>Instrument chirurgiczny JZ Izolacja</td><td>J21040</td><td>EV</td></tr><tr><td>Waga elektroniczna</td><td>Zhi Ke</td><td>Izolacja ZK-DST</td><td>EV</td></tr><tr><td>Spektrofotometr epokowy</td><td>BioTek</td><td>N/A</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>Probówki Eppendorfa</td><td>Izolacja Eppendorf</td><td>3810X</td><td>EV</td></tr><tr><td>Przeciwciało flotyliny-1</td><td>PTM BIO</td><td>PTM-5369</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>System obrazowania żelowego</td><td>Tanon</td><td>4600</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>Golgin84</td><td>Novus</td><td>nbp1-83352</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>Siatki - Formvar/Carbon Coated - Miedź 200 mesh</td><td>Polysciences</td><td>24915</td><td>Transmisyjny mikroskop elektronowy</td></tr><tr><td>Roztwór heparyny</td><td>StemCell&nbsp;</td><td>Izolacja 7980</td><td>EV</td></tr><tr><td>Liberase Research Grade</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>5401127001</td><td>Izolacja EV</td></tr><tr><td>Mikroskopijna pęseta</td><td>Instrument chirurgiczny JZ Izolacja</td><td>JD1020</td><td>EV</td></tr><tr><td>Cytometr przepływowy NovoCyte</td><td>ACEA</td><td>N/A</td><td>Cytometria przepływowa</td></tr><tr><td>Omni-PAGE Hepes-Tris Gels Hepes 4 ~ 20%, 10 dołków</td><td>Epizyme</td><td>LK206</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>OSCAR( D-19)</td> przeciwciało <td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-34235</td><td>Cytometria przepływowa</td></tr><tr><td>PBS (2x)</td> <td>ZHHC</td><td>PW013</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>Pentobarbital sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>57-33-0</td><td>Znieczulenie</td></tr><tr><td>Peroksydaza AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H + L)</td><td>Jacson</td><td>115-035-003</td><td>Peroksydaza Western blot</td></tr><tr><td>AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)</td><td>Jacson</td><td>111-035-003</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>Kwas fosfatungsowy</td><td>RHAWN</td><td>12501-23-4</td><td>Transmisyjny mikroskop elektronowy</td></tr><tr><td>PKM2(D78a4) xp rabbit&nbsp; mab&nbsp;</td><td>Sygnalizacja komórkowa</td><td>4053t</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>Folia polietylenowa (PE)</td><td>Xiang yi</td><td>200150055</td><td>Transmisyjny mikroskop elektronowy</td></tr><tr><td>Membrany z polifluorku winylidenu&nbsp;</td><td>Roche</td><td>3010040001</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>Inhibitory proteazy</td><td>Roche</td><td>4693132001</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>Rekombinowane przeciwciało anty-PGD</td><td>Abcam</td><td>ab129199</td> Western <td>blot</td></tr><tr><td>Bufor do lizy RIPA</td><td>Beyotime</td><td>P0013</td> Western <td>blot</td></tr><tr><td>Bufor ładujący SDS-PAGE (5x)</td><td>Cwbio</td><td>CW0027S</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>Rozmiar koralików</td><td>Invitrogen</td><td>F13839</td><td>Cytometria przepływowa</td></tr><tr><td>Stołowe mikrowirówki szybkoobrotowe</td><td>Izolacja Hitachi</td><td>CT15E</td><td>EV</td></tr><tr><td>Transmisyjny mikroskop elektronowy</td><td>HITACHI</td><td>H-7650</td><td>Transmisyjny mikroskop elektronowy</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>MP Biomedicals</td><td>19472</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>Vortex Mixer Genie</td><td>Scientific Industries</td><td>SI0425</td><td>Izolacja EV</td></tr><tr><td>ZetaView BASIC NTA - Mikroskop wideo do śledzenia nanocząstek PMX-120</td><td>Particle Metrix</td><td>N/A</td><td>Analiza śledzenia nanocząstek</td></tr><tr><td>&alpha;-Actinin-4 Rabbit mAb</td><td>Abclone</td><td>A3379</td><td>Western blot</td></tr> <tr><td>i beta-aktyna</td><td>Cwbio</td><td>CW0096M</td><td>Western blot</td></tr></tbody></table>

izolacja i analiza identyfikowalnych i funkcjonalizowanych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z osocza i tkanek stałych

Isolation and Analysis of Traceable and Functionalized Extracellular Vesicles from the Plasma and Solid Tissues

Krążące i rezydujące w tkankach pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EVs) stanowią obiecujące cele jako nowe biomarkery teranostyczne i wyłaniają się jako ważni gracze w utrzymaniu homeostazy organizmu i postępie szerokiego spektrum chorób. Podczas gdy obecne badania koncentrują się na charakterystyce endogennych egzosomów o pochodzeniu endosomalnym, mikropęcherzyki pęcherzykowe pęcherzyki pęcherzykowe z błony plazmatycznej zyskują coraz większą uwagę w zdrowiu i chorobie, które charakteryzują się obfitością cząsteczek powierzchniowych rekapitulujących sygnaturę błonową komórek macierzystych. W tym miejscu przedstawiono powtarzalną procedurę opartą na wirowaniu różnicowym w celu ekstrakcji i scharakteryzowania EV z osocza i tkanek stałych, takich jak kości. Protokół opisuje ponadto późniejsze profilowanie antygenów powierzchniowych i ładunków białkowych pojazdów elektrycznych, które są w ten sposób identyfikowalne dla ich pochodzenia i identyfikowane ze składnikami związanymi z potencjalną funkcją. Metoda ta będzie przydatna do korelacyjnej, funkcjonalnej i mechanistycznej analizy EV w badaniach biologicznych, fizjologicznych i patologicznych.

Zgodnie z schematem doświadczalnym, pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EVs) mogą być izolowane z krwi obwodowej oraz tkanek stałych (Rysunek 1). Kość szczęki myszy w wieku 8 tygodni waży około 0,1 ± 0,05 g, a z myszy można pobrać około 300 µL osocza. Postępując zgodnie z krokami protokołu, można uzyskać odpowiednio 0,3 mg oraz 3 µg EVs. Analiza TEM i NTA wykazała, że typowe cechy morfologiczne EVs to okrągłe, wklęsłe pęcherzyki błonowe o średnicy od 50-300 nm (Rysunek 2</stro...

Obecny protokół opisuje metodę ekstrakcji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z krwi obwodowej i tkanek stałych z późniejszym profilowaniem antygenów powierzchniowych i ładunków białkowych.

Izolacja i analiza identyfikowalnych i funkcjonalizowanych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z osocza i tkanek stałych

Circulating and tissue-resident extracellular vesicles (EVs) represent promising targets as novel theranostic biomarkers, and they emerge as important ...

Protokół ten zapewnia realny sposób izolowania i zbierania odpowiednich pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z większości krwi i tkanek stałych, a zwłaszcza analizy ich źródła i zawartości białka, co pomaga w dalszych eksperymentach funkcjonalnych. Oprócz wysokiej wydajności i niskiego zanieczyszczenia, główną zaletą tego protokołu jest analiza antygenów powierzchniowych i ładunków białkowych EV, co jest przydatne w badaniach fizjologicznych i patologicznych. Ułatwia diagnostykę nowotworów lub chorób, takich jak choroby zapalne i osteoporoza poprzez wykrywanie markerów powierzchniowych komórek rodzicielskich pęcherzyków zewnątrzkomórkowych za pomocą cytometru przepływowego.Ilość tkankowego pęcherzyka zewnątrzkomórkowego ma kluczowe znaczenie dla następujących eksperymentów. Upewnij się, że stężenie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych nie jest wysokie. Uzbrój się w cierpliwość, aby wykonać rozcieńczenie.Na początek przygotuj próbki kości szczęki, izolując kość szczęki za pomocą pęsety okulistycznej i nożyczek, a następnie umyj je PBS, aby pozbyć się tkanek miękkich za pomocą pęsety. Następnie włóż kość szczęki do 1,5 mililitrowych probówek wirówkowych i pokrój kość na małe kawałki o średnicy jednego milimetra nożyczkami. Dodaj pewną ilość liberazy, aby przykryć tkankę i inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Następnie odwirować próbkę o sile 800 G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i ostrożnie przenieść supernatant za pomocą pipety do nowych i czystych probówek wirówkowych o pojemności 1,5 mililitra. Po odwirowaniu przygotowanych próbek osocza i kości przez 15 minut w temperaturze 2 500 G i czterech stopniach Celsjusza w celu usunięcia dużych resztek komórek i pozostałych płytek krwi, ostrożnie przenieść supernatanty do nowych i czystych probówek wirówkowych o pojemności 1,5 mililitra i odwirować w temperaturze 16 800 G przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie wyrzuć supernatant i ponownie zawieś granulki w każdej probówce z jednym mililitrem PBS.Po odwirowaniu i odrzuceniu supernatantu, jak wykazano wcześniej, ponownie zawiesić granulki w każdej probówce z 50 mikrolitrami PBS i przechowywać te próbki w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez mniej niż 24 godziny lub najlepiej natychmiast użyć ich do analiz. Ponownie zawiesić próbki z 500 mikrolitrami PBS i przenieść 50 mikrolitrów do nowej i czystej 1,5-mililitrowej probówki wirówkowej jako ślepej próby kontrolnej oznaczonej jako probówka A i kolejne 50 mikrolitrów do innej czystej 1,5-mililitrowej probówki wirówkowej jako prostej probówki do barwienia FITC, oznaczonej jako probówka B. Dodaj 0,5 mikrolitra barwnika membranowego do pierwotnej probówki w celu barwienia membrany podczas inkubacji przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Po odwirowaniu probówki pierwotnej przez 30 minut przy 16 800 G i odrzuceniu supernatantu, ponownie zawiesić granulki z 200 mikrolitrami PBS.Podziel każdą próbkę o pojemności 50 mikrolitrów na cztery 1,5-mililitrowe probówki wirówkowe do prostych probówek do barwienia PE oznaczonych jako probówka C, barwienie markerem powierzchniowym oznaczonym jako probówka D i wtórne kontrole zawierające tylko przeciwciała oznaczone jako probówka E. Dodaj pierwotne przeciwciało z receptora związanego z osteoklastami i próbek pęcherzyków zewnątrzkomórkowych kości, a także przeciwciała CD-18 i próbek pęcherzyków zewnątrzkomórkowych osocza do probówki B i probówki D oddzielnie, inkubacja przez godzinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Odwirować probówki i wyrzucić supernatant, jak wykazano wcześniej, a następnie ponownie zawiesić granulki z 500 mikrolitrami PBS. Ponownie wirować przez 30 minut w temperaturze 16, 800 G i czterech stopniach Celsjusza, aby usunąć dodatkowe przeciwciała pierwszorzędowe.Po odrzuceniu supernatantu ponownie zawiesić granulki z 50 mikrolitrami PBS, a następnie dodać sprzężone z FITC przeciwciała drugorzędowe odpowiednio w probówce E. Inkubować wszystkie probówki przez godzinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza w ciemności. Rozcieńczyć jedną kroplę odpowiednio 0,2, 0,5 i jednej zawiesiny kulek o wielkości jednego mikrometra w jednym mililitrze PBS. Następnie uruchom każdy rozmiar kulek, aby upewnić się, że bramka została wybrana dla pęcherzyków zewnątrzkomórkowych i ustaw próg cytometru przepływowego, aby wyszukać koraliki i populację pęcherzyków zewnątrzkomórkowych za pomocą odpowiedniego rozproszenia do przodu wewnątrz.Ustaw warunek końcowy jako obliczanie 100 000 cząstek barwionych membranowo i przeanalizuj próbkę za pomocą cytometru przepływowego, jak opisano w manuskrypcie. Zawiesić granulki w 50 mikrolitrach buforu do lizy RIPA i inkubować przez 30 minut na lodzie. Aby określić ilościowo stężenia białka we wszystkich próbkach w 96-dołkowej mikropłytce za pomocą testu białka BCA, rozcieńczyć dwa miligramy na mililitr BSA 0,9% normalnej soli fizjologicznej do 0,5 miligrama na mililitr.W ilości 0,5 miligrama na mililitr BSA i 0,9% zwykłej soli fizjologicznej do trzech zduplikowanych studzienek o określonych objętościach. Następnie upuść dwa mikrolitry próbek i dodaj osobno 18 mikrolitrów normalnej soli fizjologicznej do trzech zduplikowanych studzienek. Po przygotowaniu roztworu roboczego przez zmieszanie odczynnika BCA A z odczynnikiem B, dodaj 200 mikrolitrów roztworu roboczego do każdej studzienki i delikatnie wstrząsaj przez 30 sekund.Następnie inkubować 96-dołkową mikropłytkę przez 20 do 25 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza i zmierzyć gęstość optyczną przy 596 nanometrach za pomocą spektrofotometru. Następnie wyeksportuj dane, narysuj krzywą wzorcową i oblicz stężenie białka w próbkach. Zgodnie z wynikami, rozcieńczyć próbki do jednego mikrograma na mikrolitr z 0,9% normalnej soli fizjologicznej i pięciokrotnym stężeniem buforu ładującego SDS-PAGE, a następnie szczelnie zamknąć probówki folią i podgrzewać przez pięć minut w temperaturze 100 stopni Celsjusza.Załaduj próbki do drabinki białkowej do gradientowego stężenia od czterech do 20% żelu tris HEPy. Uruchom żel w buforze do pracy pod napięciem 80 woltów, aż białka utworzą linię. Następnie przełącz się na 120 V na jedną godzinę, aż barwnik ładujący znajdzie się na dnie żelu.Przenieść żel na membranę z polifluorku winylidenu wstępnie inkubowaną w alkoholu metylowym przez 20 sekund przy użyciu mokrego systemu przenoszenia, aby przenieść przez jedną godzinę przy natężeniu 200 miliamperów. Przygotuj 5% bufor blokujący BSA, dodając 2,5 grama BSA i 50 mililitrów TBST do 50-mililitrowej probówki wirówkowej. Zablokuj membrany w tym buforze na dwie godziny w temperaturze pokojowej z mieszaniem.Inkubować błony ze specyficznymi przeciwciałami pierwszorzędowymi rozcieńczonymi TBST do odpowiedniego stężenia przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przemyć błony w buforze płuczącym cztery razy i inkubować błony z odpowiednimi przeciwciałami drugorzędowymi przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej z mieszaniem. Po czterokrotnym umyciu membran w buforze myjącym, należy zobrazować membrany za pomocą zestawu chemiluminescencji w żelowym systemie obrazowania.Transmisyjna mikroskopia elektronowa i analiza śledzenia nanocząstek wykazały, że typowe cechy morfologiczne pęcherzyków zewnątrzkomórkowych były okrągłe i miały kształt miseczki o średnicy od 500 do 300 nanometrów. Analiza cytometrii przepływowej pokazuje procentową zawartość specyficznych markerów błonowych wyrażonych na pęcherzykach zewnątrzkomórkowych, co sugeruje ich pochodzenie z komórek rodzicielskich. Analiza Western blot wykazuje ekspresję PGD i PKM2 odpowiednio jako reprezentatywnych dla zawartości białka i pęcherzyków zewnątrzkomórkowych osocza oraz pęcherzyków zewnątrzkomórkowych kości, co wskazuje na stan metaboliczny.Ujemną ekspresję Golgin-84 w pęcherzykach zewnątrzkomórkowych wykryto przy obecności mitofiliny, alfa-aktyniny-4, flotyliny-1, kaweoliny-1 i beta-aktyny, wraz z markerem pęcherzyków CD9, podczas gdy ekspresja CD81 jest niska lub nieobecna przy braku obecności APO-A-1 w pęcherzykach zewnątrzkomórkowych osocza. Naukowcy, mając więc na uwadze krok 2.2, przygotowanie i trawienie próbek tkanek powinno być wykonane w wystarczającym stopniu. W przeciwnym razie liczba pęcherzyków zewnątrzkomórkowych wyekstrahowanych z tkanek jest ograniczona.Marker oznaczony fluorescencyjnym barwnikiem pęcherzyków zewnątrzkomórkowych może być wstrzykiwany do jamy ustnej w celu leczenia fazy związanej z potencjalną funkcją.

isolation-analysis-traceable-functionalized-extracellular-vesicles

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe obecne we krwi zostały zasugerowane jako nowe biomarkery różnych chorób. W tym miejscu przedstawiamy protokół izolacji dużych mikropęcherzyków pochodzących z błony plazmatycznej z próbek krwi obwodowej i ich późniejszej analizy za pomocą konwencjonalnej cytometrii przepływowej i Western Blotting.

Izolacja i charakterystyka mikropęcherzyków z krwi obwodowej

To jest protokół izolowania tkankowych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) od wątroby. Protokół opisuje dwuetapowy proces obejmujący perfuzję kolagenazy, po której następuje różnicowe ultrawirowanie w celu wyizolowania EV tkanki wątroby.

Izolacja tkankowych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z wątroby

W tym protokole opisujemy kompletny proces szybkiej izolacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych od ludzkiej krwi pełnej i charakteryzacji specyficznych markerów za pomocą analizy nanocząstek opartej na fluorescencji. Przedstawione wyniki wykazują wysoki poziom odtwarzalności i mogą być dostosowane do supernatantów z hodowli komórkowych.

Szybka charakterystyka oparta na fluorescencji pojedynczych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych w ludzkiej krwi z analizą śledzenia nanocząstek

Tutaj udostępniamy szczegółowy protokół izolowania małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) z całych tkanek, w tym próbek mózgu i nowotworów. Metoda ta oferuje powtarzalną technikę ekstrakcji EV z tkanki stałej w celu dalszych analiz.

Ekstrakcja pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z całej tkanki

Niniejszy raport podkreśla chronologiczne wymagania dotyczące izolacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) od mikrogleju lub makrofagów krwi. EV pochodzące z mikrogleju oceniano jako regulatory wzrostu neurytów, podczas gdy EV pochodzące z makrofagów krwi badano w kontroli inwazji komórek glejaka C6 w testach in vitro. Celem jest lepsze zrozumienie tych funkcji EV jako mediatorów immunologicznych w określonych mikrośrodowiskach.

Charakterystyka pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z komórek odpornościowych i badanie funkcjonalnego wpływu na środowisko komórkowe

Protokół tutaj pokazuje, że pęcherzyki zewnątrzkomórkowe mogą być odpowiednio oddzielone od kondycjonowanych pożywek do hodowli komórkowych za pomocą chromatografii wykluczającej rozmiar.

Chromatografia wykluczająca wielkość do oddzielania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych od kondycjonowanych pożywek do hodowli komórkowych

Najnowsza generacja narzędzi do charakteryzacji EV jest w stanie przeprowadzić pojedynczą analizę EV dla wielu parametrów jednocześnie. Cytometria nanoprzepływowa mierzy wszystkie cząstki biologiczne większe niż 45 nm bez znakowania i identyfikuje specyficzne cechy subpopulacji za pomocą różnych technik znakowania fluorescencyjnego.

Charakterystyka białka transbłonowego pojedynczego pęcherzyka zewnątrzkomórkowego za pomocą cytometrii nanoprzepływowej

Obecny protokół zawiera szczegółowe opisy skutecznego izolowania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych moczu za pomocą funkcjonalizowanych kulek magnetycznych. Ponadto obejmuje kolejne analizy, w tym western blotting, proteomikę i fosfoproteomikę.

Izolacja pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z biofluidów na podstawie powinowactwa chemicznego do analizy proteomicznej i fosfoproteomicznej

Ten artykuł opisuje metodologię izolacji, charakterystyki i kwantyfikacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z ludzkiego osocza (EV) i przedstawia przebieg pracy do bezznacznikowej analizy proteomu EV przy użyciu chromatografii cieczowej z tandemową spektrometrią mas (LC-MS/MS).

Izolacja, charakterystyka i analiza proteomiczna pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z osocza w celu odkrycia biomarkerów sercowo-naczyniowych

Tutaj demonstrujemy metodę charakterystyki pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) pobranych z płynów biologicznych, takich jak łzy i ślina, ludzi. Skaner stosowany w tej metodzie jest w stanie wykryć fenotyp, wielkość i całkowitą liczbę cząstek EV z 1 μl próbki.

Charakterystyka pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z płynów biologicznych

Ten protokół opisuje izolację małych dodatkowych pęcherzyków z murzyniego mięśnia szkieletu i szpiku kostnego z wykorzystaniem trawienia enzymatycznego i chromatografii wykluczającej rozmiar, umożliwiającą powtarzalne odzyskiwanie frakcji wzbogaconych w pęcherzyki z tkanek o złożonej strukturze i niskim wydajności, do dalszej analizy molekularnej.

Izolacja małych zewnątrzkomórkowych wezykuł od mysiej tkanki kostnej i szpiku kostnego przez chromatografię wykluczającą na podstawie wielkości

Poznaj metodę izolacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z osocza i tkanek stałych z wysoką wydajnością i niskim zanieczyszczeniem. Protokół umożliwia analizę powierzchniowych antygenów i diagnostykę chorób nowotworowych oraz zapalnych.

Izolacja i analiza identyfikowalnych i funkcjonalizowanych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z osocza i tkanek stałych

Przeglądaj więcej filmów