Zaprojektowana unaczyniona płat mięśniowa
January 11th, 2016
Do tej pory, grube ubytki tkanek są zazwyczaj rekonstruowane za pomocą autologicznych płatów tkankowych lub tkanek zmodyfikowanych. W niniejszym protokole przedstawiamy nową metodę inżynierii unaczynionego płata tkankowego z autologiczną szypułką, która ma służyć jako substytut płatów autologicznych.
Ogólnym celem tego zabiegu jest stworzenie dobrze unaczynionego płata tkankowego, który zostanie wykorzystany do rekonstrukcji pełnogrubych ubytków powłok brzusznych. Osiąga się to poprzez przygotowanie biodegradowalnego rusztowania z kwasem polimlekowym i kwasem polimlekowo-koglikolowym. Następnie wysiewane są komórki śródbłonka, komórki mięśniowe i fibroblasty, a przeszczep jest hodowany in vitro, aby umożliwić komórkom samoorganizację.
Następnie zmodyfikowana tkanka jest wszczepiana wokół tętnicy udowej i żył myszy, gdzie ulega zestrojeniu z naczyniami gospodarza i staje się wysoce unaczyniona. Na koniec tkanka jest przenoszona w postaci uszypułowanego płata do ubytku ściany brzucha o pełnej grubości. Ostatecznie unaczynienie przeszczepu udowadnia się za pomocą ultradźwięków, wstrzyknięcia dekstranu T i barwienia immunologicznego w kierunku CD31, a sztywność płata bada się za pomocą biodynamicznego przyrządu testowego.
Głównymi zaletami tej metody w porównaniu z istniejącymi metodami są mniejsza ruchomość miejsca dawczego i wysoka żywotność zmodyfikowanego płata, który może być stosowany do budowy tkanek miękkich o pełnej grubości. Ta metoda może pomóc pacjentom z pełnogrubymi ubytkami powłok brzucha. Demonstracja procedury zostanie wykonana przez dr Dana Egozi, chirurga plastycznego, współpracującego z moim laboratorium, a Anina Freimann będzie jej asystować.
Po przygotowaniu rusztowań i zatopieniu komórek zgodnie z protokołem tekstowym, autoklaw należy użyć następujących narzędzi chirurgicznych: małych cienkich prostych nożyczek, nożyczek sprężynowych, prostych kleszczy z cienką końcówką, kleszczyków ząbkowanych, kleszczy Hudsona, uchwytu na igłę i skalpela z ostrzem numer 15. Przygotuj mieszaninę 425 mikrolitrów ketaminy i 75 mikrolitrów silodsyny w probówce mikrowirówkowej i przenieś do strzykawki. Następnie rozcieńczyć 0,3 miligrama na mililitr buprenorfiny od jednego do 20 w sterylnym roztworze soli fizjologicznej.
Po znieczuleniu myszy zgodnie z protokołem tekstowym, umieść ją na scenie, podgrzej do 37 stopni Celsjusza, aby utrzymać normalną temperaturę ciała, i użyj bandaża samoprzylepnego, aby przymocować ją do sceny. W przypadku bawełnianych końcówek użyj jodu, a następnie 70% etanolu, aby oczyścić miejsce nacięcia, aby stworzyć aseptyczne pole robocze. Po sprawdzeniu poziomu sedacji za pomocą skalpela wykonać nacięcia przez skórę od kolana do więzadła pachwinowego równolegle do naczyń udowych, aż do odsłonięcia tętnicy udowej i naczyń żylnych.
Użyj klipsów lub igieł, aby przytrzymać skórę. Następnie za pomocą sprężynowych nożyczek i kleszczy, zaczynając od przedsionka kości udowej poniżej przedsionka dolnego i powyżej rozwidlenia do przedsionka piszczelowego i strzałkowego, ostrożnie odizoluj tętnicę udową i naczynia żylne od otaczającej tkanki. Pozostaw profunda nietkniętą, aby zachować przepływ krwi do nogi i zapobiec późniejszemu rozłączeniu.
Następnie złóż wcześniej przygotowany przeszczep wokół odsłoniętej kości udowej AV poniżej profunda i powyżej rozwidlenia do kości piszczelowej i proneszowej AV i użyj 8-0 jedwabne szwy do łączenia jego końców. Aby zapewnić unaczynienie implantu przez naczynia włosowate wyrastające tylko z naczyń przedsionkowo-komorowych kości udowej, umieść kawałek wysterylizowanego lateksu pod przeszczepem, a następnie owiń go wokół przeszczepu i szwu, używając jedwabiu 6-0. Następnie użyj jedwabnych szwów 4-0, aby zamknąć leżącą na powierzchni skórę.
Bupreorfinę należy wstrzykiwać podskórnie dwa razy dziennie przez dwa do trzech dni. Uważnie obserwuj mysz aż do powrotu do zdrowia po znieczuleniu, a następnie codziennie, aż przeszczep zostanie przeniesiony jako płatek. Jeden do dwóch tygodni po implantacji, po znieczuleniu myszy, umieść zwierzę na podgrzewanej scenie i zabezpiecz je.
Po oczyszczeniu miejsca nacięcia, jak pokazano wcześniej w tym filmie, użyj nożyczek i kleszczy, aby ostrożnie otworzyć szwy w skórze, a skalpelem wykonaj nacięcie skóry prostopadle do więzadła pachwinowego, kontynuując przez skórę brzuszną. Za pomocą skalpela wykonaj nacięcie w brzusznej ścianie brzucha. Ostrożnie wyjmij kawałek lateksu i odsłoń unaczynioną klapkę.
Następnie za pomocą nożyczek i kleszczy odetnij płat tkanki od otaczającej tkanki. Z 8-0 szew jedwabny, podwiązać dystalny koniec kości udowej AV, aby zapobiec krwawieniu z AV. Następnie kauteryzuj przedsionkowo-komorowy w kolanie, dystalnie do złożonej wszczepionej tkanki i 8-0 szwy. Delikatnie przenieś przedsionkowo-komorową kość udową otoczoną przeszczepem w kierunku brzusznej ściany jamy brzusznej, unikając uszkodzenia tętnicy, aby określić, w jakiej odległości należy wykonać ubytek pełnej grubości.
Za pomocą nożyczek sprężynowych wykonaj nacięcie w mięśniu prostym brzucha i usuń około jednego centymetra na 0,8 centymetra odcinka mięśnia z leżącą nad nim skórą. Przenieś przedsionkowo-komorową kość udową otoczoną unaczynionym przeszczepem jako płat osiowy do ubytku o pełnej grubości w brzusznej ścianie brzucha, używając 8-0 jedwabne szwy zapobiegające przepuklinie. Zszyj płat do otaczającej tkanki mięśniowej.
Następnie za pomocą jedwabiu 4-0 zszyj skórę nogi. Pozostaw skórę brzuszną odsłoniętą, aby naśladować efekt pełnego ubytku ściany brzucha. Za pomocą gazy jodowej i sterylnego bandaża przykryj ranę skórą, aby zapobiec zanieczyszczeniu odsłoniętego obszaru.
Podawać buprenorfinę w sposób opisany wcześniej w tym filmie. Uważnie obserwować zwierzę do czasu wyzdrowienia po znieczuleniu, a następnie codziennie aż do wyzdrowienia płata w przypadku badań opisanych w protokole tekstowym. Po jednym i dwóch tygodniach od implantacji dokładna obserwacja obszaru przeszczepu ujawniła żywotne i wysoce unaczynione przeszczepy tkankowe, określone przez dodatnie barwienie immunologiczne CD31.
Przeszczepy tkanek były również silnie perfundowane, co widać po wstrzyknięciu żyły ogonowej FITC-dekstranu i pomiarach ultrasonograficznych. Wykres ten pokazuje, że wiele naczyń zaobserwowano już tydzień po implantacji, a liczba ta znacznie wzrosła po dodatkowym tygodniu w pobliżu naczyń przedsionkowo-komorowych. Jak widać tutaj, drożność i integralność po implantacji przeszczepu została potwierdzona za pomocą obrazowania ultrasonograficznego w trybie kolorowego Dopplera.
Niebieski i czerwony reprezentują przepływ krwi w przeszczepie. Ponadto w badaniu ultrasonograficznym stwierdzono perfuzję w obrębie przeszczepu, która po implantacji była nieco wyższa w porównaniu z tygodniem. Ogólne oględziny klap tydzień po przeniesieniu wykazały, że uległy one mocnemu przytwierdzeniu do otoczenia.
Porównując płaty osadzone w komórkach przed unaczynieniem, kontrolne bezkomórkowe przeszczepy nieunaczynione te pierwsze wykazywały lepsze właściwości mechaniczne, w tym sztywność i wytrzymałość, co również skutkowało mniejszym rozejściem się i przepukliną. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w około 30 minut, jeśli jest wykonywana prawidłowo. Po opracowaniu technika ta toruje drogę chirurgom plastycznym do leczenia pacjentów, którzy cierpią na ubytek ściany brzucha na całej grubości, a także inne skomplikowane i znaczące ubytki tkanek miękkich.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten protokół przedstawia nową metodę inżynierii klapy tkankowej z unaczynnioną tkanką i autologicznym trzonkiem, mającą na celu rekonstrukcję defektów ściany brzucha o pełnej grubości. Podejście wykorzystuje biodegradowalny szkielet do wsparcia zespolenia komórek i unaczynnienia.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Inżynieria tkankowa
- Medycyna regeneracyjna
- Biologia naczyniowa
Tło
- Tradycyjne metody rekonstrukcji wykorzystują autologiczne flapy tkankowe.
- Inżynierowane tkanki oferują potencjalną alternatywę dla złożonych defektów tkankowych.
- Unaczynnienie jest kluczowe dla żywotności inżynierowanych tkanek.
- To badanie bada metodę poprawy unaczynnienia w flapach tkankowych.
Cel badania
- Rozwój unaczynionej klapy tkankowej do rekonstrukcji ściany brzucha.
- Wykorzystanie autologicznego trzonka w celu poprawy integracji przeszczepu.
- Ocenienie skuteczności inżynierowanej tkanki w modelu przedklinicznym.
Zastosowane metody
- Przygotowanie biodegradowalnego szkieletu z kwasu polimlekowego.
- Zasianie komórek śródbłonkowych, mięśniowych i fibroblastów na szkielecie.
- Hodowla in vitro w celu promowania samozespolenia komórek.
- Implantacja inżynierowanej tkanki wokół tętnicy udowowej i żył w modelu mysim.
Główne wyniki
- Inżynierowana tkanina pomyślnie przeszła połączenie z naczyniami żywicielskimi.
- Znaczące unaczynnienie zostało potwierdzone za pomocą ultrasonografii i barwienia immunologicznego na CD31.
- Sztywność flapy została oceniona za pomocą biodynamicznego instrumentu testowego.
- Metoda wykazała potencjał jako substytut dla autologicznych flap.
Wnioski
- Badanie przedstawia opcję alternatywną dla tradycyjnych metod rekonstrukcji tkankowej.
- Poprawione unaczynnienie jest osiągalne poprzez opisany podejście inżynieryjne.
- Ta technika może poprawić wyniki w chirurgii rekonstrukcyjnej.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Engineering vascularized muscle flaps addresses a critical barrier in tissue construct viability by enabling oxygen and nutrient delivery at clinically relevant thicknesses. This capability supports translational advancement in reconstructive and regenerative medicine, particularly for full-thickness soft tissue defects. The approach enhances predictive confidence for tissue integration and functional restoration in preclinical models, informing portfolio decisions for next-generation biomaterials.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of vascularization mechanisms in engineered tissues for functional validation.
- Supports biological de-risking by demonstrating in vivo integration and perfusion of constructs.
- Facilitates predictive assessment of tissue viability and mechanical properties in preclinical settings.
Screening & Assay Development
- Provides a reproducible platform for evaluating scaffold-cell combinations under physiological vascularization.
- Standardizes quantitative assessment of graft perfusion and mechanical strength using imaging and biodynamic testing.
- Enables screening of biomaterial formulations for optimal integration and reduced rejection risk.
Translational & Preclinical Research
- Aligns engineered constructs with disease-relevant models for abdominal wall and soft tissue reconstruction.
- Supports continuity from in vitro assembly to in vivo functional validation and integration.
- Informs risk-adjusted advancement of tissue engineering candidates toward clinical translation.
Pipeline & Workflow Integration
This engineered vascularized flap method bridges early discovery, preclinical validation, and translational research for reconstructive tissue engineering.
- Discovery Biology: Demonstrates hypothesis testing for vascular integration and tissue viability in vivo.
- Screening: Delivers quantitative outputs on perfusion, vascularization, and mechanical properties for candidate comparison.
- Analytics: Utilizes ultrasound, immunostaining, and biodynamic testing to generate reproducible readouts.
- Translational Research: Provides a preclinical model for evaluating engineered tissue performance in clinically relevant defects.
- Enterprise Reuse: Establishes a workflow adaptable to various tissue types and biomaterial platforms.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in tissue viability and integration for regenerative applications.
- Operational Value: Standardizes vascularization and mechanical testing protocols for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions for biomaterial and tissue engineering programs.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of candidates with demonstrated in vivo performance.
Implementation Considerations
- Requires expertise in scaffold fabrication, cell culture, and microsurgical implantation.
- Demands access to imaging modalities (ultrasound, immunostaining) and mechanical testing instruments.
- Necessitates cross-team standardization for reproducible construct preparation and analysis.
- Adaptable to different cell types and defect models with protocol optimization.
- Limited by the need for in vivo validation and specialized surgical skills.
