Name: Mikroprzepływowe podejście do badania krystalizacji lodu i hydratów klatratu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: Poznaj mikroprzepływową metodę badania krystalizacji lodu i hydratów klatratu z kontrolowaną wymianą roztworu. Technika umożliwia obserwację wiązania białek przeciwzamarzających z powierzchnią kryształów w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Podziękowania dla Darczyńców Funduszu Badań Naftowych Amerykańskiego Towarzystwa Chemicznego za wsparcie tych badań (numer grantu 60191-UNI5). Autorzy pragną podziękować prof. Ido Braslavsky'emu za pionierskie zastosowanie urządzeń mikroprzepływowych do badania białek płynu niezamarzającego i lodu. Autorzy są wdzięczni prof. Arthurowi DeVriesowi, prof. Konradowi Meisterowi i prof. Peterowi Daviesowi za dostarczenie próbek białek zapobiegających zamarzaniu.

1. Produkcja urządzeń mikroprzepływowych
<ol>
	<li>Przykryj wewnętrzną powierzchnię szalki Petriego folią aluminiową i umieść wcześniej przygotowaną formę na szalce Petriego.
	<ol>
		<li>Wytwarzaj formy przy użyciu technik litograficznych opisanych w piśmiennictwie. Dwa projekty urządzeń użyte w niniejszej pracy są przedstawione w <silna klasa="xfig">Rysunek 1.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować 30-40 ml mieszaniny PDMS, ważąc mieszaninę utwardzacza i elastomeru w proporcji 1:10 (wagowo) (patrz Tabela materiałów) i mieszając w sposób ciągły przez około 5 minut, aż mieszanina stanie się biała i prawie nieprzezroczysta. 
	UWAGA: Umieść plastikowy kubek na wadze, wlej elastomer do kubka, a następnie dodaj utwardzacz, aby uzyskać stosunek wagowy 1:10.</li>
	<li>Wlać mieszaninę PDMS do szalki Petriego z foremką i odgazować w eksykatorze, aż nie pozostaną pęcherzyki (około 30 minut).</li>
	<li>Formę z płynem PDMS pieczemy w piekarniku lub na płycie grzejnej w temperaturze 70 °C, aż do uzyskania konsystencji gumy. Ten proces trwa około godziny.</li>
	<li>Wytnij urządzenie, śledząc elementy skalpelem, uważając, aby pchać skalpelem do przodu zamiast w dół, ponieważ pleśń jest delikatna. Wyjmij wycięte urządzenie PDMS, umieszczając je do góry nogami na nowej szalce Petriego. Usuń cząsteczki kurzu i brudu z dolnej powierzchni, przyklejając i usuwając kawałek taśmy klejącej (patrz Tabela materiałów).</li>
	<li>Za pomocą igły strzykawkowej (20 G) wybij otwory w urządzeniu na podstawie nadrukowanego wzoru, w razie potrzeby używając mikroskopu. Upewnij się, że otwór przechodzi przez drugą stronę urządzenia i użyj pęsety, aby usunąć wybite kawałki.</li>
	<li>Dokładnie umyj szkiełko nakrywkowe (18 x 18 mm, 0,14 mm grubości) wodą z mydłem, a następnie izopropanolem. Użyj ciśnienia powietrza, aby wysuszyć oczyszczone szkiełko nakrywkowe.</li>
	<li>Włóż oczyszczony PDMS i szkiełko nakrywkowe do myjki plazmowej, zamknij zawory i włącz zasilanie, próżnię i pompę. Pozwól czyszczyjce plazmowej pracować przez około minutę, ustaw RF na HI i pozwól, aby trochę powietrza dostało się do odkurzacza plazmowego za pomocą zaworu dokładnego.
	<ol>
		<li>Gdy kolor okienka podglądu zmieni się z fioletowego na różowy, pozwól myjce plazmowej pracować przez 50 sekund i wyłącz RF. Pozostaw pompę włączoną przez minutę, a po jej wyłączeniu stopniowo otwieraj główny zawór, aby powietrze mogło dostać się do myjki plazmowej. 
		UWAGA: Alternatywną metodą osiągania porównywalnych rezultatów jest klejenie na gorąco. W przypadku tej metody należy położyć formę na szkiełku nakrywkowym i umieścić ją na płycie grzejnej ustawionej na 70-80 °C na około 60 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dociśnij powierzchnię PDMS do oczyszczonego szkiełka nakrywkowego i upewnij się, że są one połączone, obserwując brak oderwania podczas lekkiego podciągania szkiełka nakrywkowego.</li>
	<li>Zabezpiecz igłę igły 90° (18 G) szczypcami i zdejmij plastikowe złącze strzykawki, aby je wyjąć. Włóż jeden koniec igły do rurki Tygon (0.020" ID, 0.060" OD, patrz Tabela materiałów), a drugi koniec do jednego z wyciętych otworów urządzenia. Powtórz ten proces dla pozostałych otworów.</li>
	<li>Aby usunąć pęcherzyki powietrza, wstrzyknij wodę/bufor do kanałów za pomocą szklanej strzykawki (pompa jest opcjonalna, ale nie użyto tutaj pompy). Przefiltruj wszystkie płyny za pomocą filtra 0,22 μm przed wstrzyknięciem ich do urządzenia.</li>
	<li>Użyj środka blokującego, takiego jak 1% roztwór BSA, aby zapobiec wiązaniu się znakowanych fluorescencyjnie AFP ze ściankami PDMS. Wstrzyknąć środek blokujący do kanału wlotowego i pozostawić go w mikrokanalikach przez 20 minut. Następnie wstrzyknąć roztwór buforowy do kanału wlotowego, aby wypłukać roztwór BSA. 
	UWAGA: Powstałe urządzenie PDMS jest przymocowane do szkiełka nakrywkowego wzdłuż jego dolnej powierzchni, podłączone do rurki w otworach wlotowych i wylotowych oraz pokryte środkiem blokującym w kanałach.</li>
</ol>
2. Konfiguracja urządzenia mikroprzepływowego
<ol>
	<li>Nałóż niewielką ilość olejku immersyjnego na powierzchnię zimnego etapu miedzi (patrz Tabela materiałów) i rozprowadź za pomocą niestrzępiącej się chusteczki, aby utworzyć cienką warstwę oleju. Następnie umieść czysty dysk szafirowy (patrz Tabela materiałów) na utworzonej warstwie oleju. Nałóż kroplę olejku immersyjnego na środek szafirowej tarczy i umieść urządzenie PDMS na kropli w taki sposób, aby cechy urządzenia były wyrównane nad viewotwór zimnego stage.</li>
	<li>Przytrzymaj urządzenie na miejscu i przymocuj rurkę do zewnętrznych ścianek aluminiowej skrzynki, w której znajduje się zimny skręt, za pomocą taśmy klejącej. Zanotuj położenie każdej konkretnej rurki.</li>
	<li>Za pomocą szklanej strzykawki wstrzyknąć 4-5 μl roztworu AF(G)P (patrz Tabela materiałów) do kanału dolotowego. Zamknij pokrywę zimnego sceny. 
	UWAGA: Stężenie roztworów AFP może być zróżnicowane i ustalane na podstawie ich intensywności fluorescencji. W niniejszym protokole zakres stężeń wynosił 5-40 μL.</li>
</ol>
3. Powstawanie monokryształów w kanałach mikroprzepływowych
<ol>
	<li>Oczyść zimny etap suchym powietrzem/azotem, aby zapobiec tworzeniu się w nim kondensacji. Aktywuj cyrkulacyjną kąpiel chłodzącą, aby cyrkulować wodę przez zimny etap i służyć jako radiator.</li>
	<li>Uruchom program kontroli temperatury i ustaw temperaturę na -25 °C. 
	UWAGA: Zamarzanie nastąpi, gdy próbka osiągnie temperaturę ~-20 °C, co można zaobserwować jako nagłe ciemnienie i szorstkość próbki. W tym momencie można użyć dowolnego obiektywu, najlepiej obiektywu 4x, który umożliwia użytkownikowi obserwację całości kanałów mikroprzepływowych.</li>
	<li>Powoli, zwiększając temperaturę o około 1 °C/5 s, zbliżaj się do temperatury topnienia próbki, która może wynosić od -1 do -0,2 °C w zależności od buforu zastosowanego w roztworze AF(G)P. Gdy temperatura zbliży się do temperatury topnienia, poczekaj, aż kilka pojedynczych kryształów zostanie odizolowanych. 
	UWAGA: W razie potrzeby niechciany lód można miejscowo stopić za pomocą lasera IR (980 nm) (patrz Tabela materiałów), który jest zamocowany na mikroskopie. Laser topi pobliskie kryształki lodu tak długo, jak długo jest włączony.</li>
	<li>W tym momencie zaleca się przełączenie na obiektywy 10x lub 20x, aby lepiej obserwować monokryształy. Po uzyskaniu pojedynczego kryształu w żądanym miejscu, hoduj kryształ, nieznacznie obniżając temperaturę (o ~0,01 °C), aż krawędzie kryształu zetkną się ze ściankami kanału.</li>
	<li>Przełącz się na obiektyw 50x, wstrzyknij roztwór AF(G)P do kanałów i obserwuj wzrost intensywności fluorescencji, co wskazuje, że roztwór białka został pomyślnie wstrzyknięty do kanałów. Wykonaj ten krok ostrożnie, aby uniknąć stopienia kryształu lodu podczas wymiany roztworów. Uważnie monitoruj i reguluj zarówno natężenie przepływu (poprzez większy/mniejszy nacisk na szklaną strzykawkę), jak i temperaturę podczas procesu wymiany roztworu.</li>
	<li>Poczekaj, aż białka zgromadzą się i zwiążą na powierzchni kryształu. 
	UWAGA: Różni się to w zależności od szybkości akumulacji i adsorpcji AF(G)P5,25. W typowym eksperymencie dopuszcza się 5-10 minut na akumulację AFP</li>
</ol>
4. Pomiar aktywności histerezy termicznej (TH)
UWAGA: Ten krok jest opcjonalny.
<ol>
	<li>Określ temperaturę topnienia kryształu, dostosowując temperaturę małymi krokami o 0,002 °C i obserwując najwyższą temperaturę, jakiej może być poddany mały kryształ bez jego topnienia.</li>
	<li>W funkcji RAMP regulatora temperatury ustaw szybkość chłodzenia na -0,05 do -0,01 °C/4 s i aktywuj RAMP. Zwróć uwagę na dokładną temperaturę, w której następuje nagły wzrost kryształów. 
	UWAGA: Ta wartość nazywana jest temperaturą pęknięcia i odpowiada temperaturze zamarzania. Różnica między temperaturą topnienia i zamarzania to aktywność TH 25.</li>
</ol>
5. Wymiana roztworu wokół monokryształów
<ol>
	<li>Upewnij się, że temperatura próbki znajduje się w szczelinie TH, aby zapobiec topnieniu lub wzrostowi kryształu podczas eksperymentu.</li>
	<li>Nagraj proces wymiany roztworu za pomocą programu do obrazowania NIS Elements (patrz Tabela materiałów) w celu późniejszej analizy danych fluorescencyjnych. Powoli wstrzyknąć roztwór buforowy do drugiego wlotu urządzenia mikroprzepływowego i zaobserwować spadek sygnału fluorescencyjnego w szybkości zależnej od ciśnienia przyłożonego do strzykawki.
	<ol>
		<li>Użyj tej reprezentacji wizualnej, aby upewnić się, że zastosowane ciśnienie nie jest zbyt wysokie, aby nie spowodować stopienia kryształu. Zobacz Rysunek 2 przedstawia sekwencję obrazów demonstrujących proces wymiany roztworu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zmierz intensywność fluorescencji w kanale mikroprzepływowym za pomocą programu do obrazowania. 
	UWAGA: Sygnał powinien osiągać szczyt w obszarze w pobliżu powierzchni kryształu, co wskazuje na wiązanie AFP, i powinien być stosunkowo niski w otaczającym roztworze, który został przepłukany buforem.</li>
	<li>Zmierz aktywność TH po wymianie roztworu zgodnie z krokiem 4.</li>
	<li>Powtórz eksperyment, izolując nowy kryształ (kroki 3.3-3.5). Wstrzyknąć roztwór AFP za pomocą szklanej strzykawki i powtórzyć wymianę roztworu (kroki 5.1-5.3). Otrzymać nowy monokryształ (kroki 3.3-3.5) i przelać roztwór AFP do kanałów za pomocą szklanej strzykawki.</li>
</ol>
6. Eksperymenty z hydratami klatratu
<ol>
	<li>Aby uzyskać hydraty THF, należy przygotować roztwór THF/woda o stosunku molowym 1:15, który jest stosunkiem objętości 1:3.326. Utrzymać ten stosunek we wszystkich roztworach stosowanych w poniższych doświadczeniach, w tym w roztworach zawierających AF(G)P lub inne inhibitory.</li>
	<li>Wykonaj kroki 1 i 2, aby przygotować urządzenie mikroprzepływowe i umieścić je w zimnym scenie. Ustaw temperaturę na -25 °C; próbka zamarznie w temperaturze ~-20 °C, jak opisano w kroku 3.2.</li>
	<li>Po zamrożeniu roztworu THF powoli zwiększaj temperaturę, aż cały lód się stopi. 
	UWAGA: Temperatura topnienia lodu jest lekko obniżona przez THF.</li>
	<li>Aby upewnić się, że wszystkie kryształki lodu stopiły się z wyłączeniem hydratów, należy utrzymywać temperaturę 1 °C przez 3 minuty.</li>
	<li>Ustawić temperaturę na -2 °C i obserwować obfitość hydratów, które pojawiają się w kanałach mikroprzepływowych przy braku inhibitorów. 
	UWAGA: Hydraty THF mają kształt ośmiościanów (<silna klasa="xfig">Rysunek 2), aw niektórych przypadkach kryształy są bardzo cienkie; W związku z tym wyraźna obserwacja może być trudna. W takich przypadkach zaleca się powtórzenie kroków 6.4-6.5 w celu uzyskania nowych kryształów.</li>
	<li>Wstrzyknąć inhibitor AF(G)P / do kanału mikroprzepływowego za pomocą szklanej strzykawki, jednocześnie dostosowując temperaturę, aby uzyskać pewność, że otrzymane kryształy nie topią się/nie rosną. Odczekaj kilka minut, aż cząsteczki inhibitora zaadsorbują się na powierzchni kryształu.</li>
	<li>W razie potrzeby zmierz aktywność TH zgodnie z krokiem 4.</li>
	<li>Wymienić roztwór wokół kryształów zgodnie z opisem w krokach 5.2-5.3.</li>
</ol>

<ol><li>Bar Dolev, M., Braslavsky, I., Davies, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ice-Binding+Proteins+and+Their+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Ice-Binding Proteins and Their Function.</a> Annual Review of Biochemistry. 85 (1), 515-542 (2016).</li>
<li>Raymond, J. A., DeVries, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adsorption+inhibition+as+a+mechanism+of+freezing+resistance+in+polar+fishes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Adsorption inhibition as a mechanism of freezing resistance in polar fishes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (6), 2589-2593 (1977).</li>
<li>Celik, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+experiments+reveal+that+antifreeze+proteins+bound+to+ice+crystals+suffice+to+prevent+their+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Microfluidic experiments reveal that antifreeze proteins bound to ice crystals suffice to prevent their growth.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (4), 1309-1314 (2013).</li>
<li>Drori, R., Davies, P. L., Braslavsky, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((When+are+antifreeze+proteins+in+solution+essential+for+ice+growth+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">When are antifreeze proteins in solution essential for ice growth inhibition.</a> Langmuir. 31 (21), 5805-5811 (2015).</li>
<li>Meister, K., DeVries, A. L., Bakker, H. J., Drori, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antifreeze+glycoproteins+bind+irreversibly+to+ice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Antifreeze glycoproteins bind irreversibly to ice.</a> Journal of the American Chemical Society. 140 (30), 9365-9368 (2018).</li>
<li>Braslavsky, I., Drori, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LabVIEW-operated+Novel+Nanoliter+Osmometer+for+Ice+Binding+Protein+Investigations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">LabVIEW-operated Novel Nanoliter Osmometer for Ice Binding Protein Investigations.</a> Journal of Visualized Experiments. (72), e4189(2013).</li>
<li>Ruppel, C. D., Kessler, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interaction+of+climate+change+and+methane+hydrates%5BTitle%5D)+AND+%22Reviews+of+Geophysics%22%5BJournal%5D)">The interaction of climate change and methane hydrates.</a> Reviews of Geophysics. 55 (1), 126-168 (2017).</li>
<li>Mozaffar, H., Anderson, R., Tohidi, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+alcohols+and+diols+on+PVCap-induced+hydrate+crystal+growth+patterns+in+methane+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Fluid+Phase+Equilibria%22%5BJournal%5D)">Effect of alcohols and diols on PVCap-induced hydrate crystal growth patterns in methane systems.</a> Fluid Phase Equilibria. 425, 1-8 (2016).</li>
<li>Sa, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+methane+and+natural+gas+hydrate+formation+by+altering+the+structure+of+water+with+amino+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Inhibition of methane and natural gas hydrate formation by altering the structure of water with amino acids.</a> Scientific Reports. 6, 31582(2016).</li>
<li>Lederhos, J. P., Long, J. P., Sum, A., Christiansen, R. L., Sloan, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+kinetic+inhibitors+for+natural+gas+hydrates%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Engineering+Science%22%5BJournal%5D)">Effective kinetic inhibitors for natural gas hydrates.</a> Chemical Engineering Science. 51 (8), 1221-1229 (1996).</li>
<li>Sun, T., Davies, P. L., Walker, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+Basis+for+the+Inhibition+of+Gas+Hydrates+by+%CE%B1-Helical+Antifreeze+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Structural Basis for the Inhibition of Gas Hydrates by α-Helical Antifreeze Proteins.</a> Biophysical Journal. 109 (8), 1698-1705 (2015).</li>
<li>Zeng, H., Wilson, L. D., Walker, V. K., Ripmeester, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+antifreeze+proteins+on+the+nucleation%2C+growth%2C+and+the+memory+effect+during+tetrahydrofuran+clathrate+hydrate+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Effect of antifreeze proteins on the nucleation, growth, and the memory effect during tetrahydrofuran clathrate hydrate formation.</a> Journal of the American Chemical Society. 128 (9), 2844-2850 (2006).</li>
<li>Zeng, H., Wilson, L. D., Walker, V. K., Ripmeester, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+inhibition+of+tetrahydrofuran+clathrate-hydrate+formation+with+antifreeze+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Physics%22%5BJournal%5D)">The inhibition of tetrahydrofuran clathrate-hydrate formation with antifreeze protein.</a> Canadian Journal of Physics. 81 (1-2), 17-24 (2003).</li>
<li>Walker, V. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antifreeze+proteins+as+gas+hydrate+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Antifreeze proteins as gas hydrate inhibitors.</a> Canadian Journal of Chemistry. 93 (8), 839-849 (2015).</li>
<li>Gordienko, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+a+green+hydrate+inhibitor%3A+imaging+antifreeze+proteins+on+clathrates%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Towards a green hydrate inhibitor: imaging antifreeze proteins on clathrates.</a> PloS One. 5 (2), 8953(2010).</li>
<li>Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origins+and+the+future+of+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The origins and the future of microfluidics.</a> Nature. 442 (7101), 368-373 (2006).</li>
<li>Cole, R. H., Tran, T. M., Abate, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double+emulsion+generation+using+a+polydimethylsiloxane+%28PDMS%29+co-axial+flow+focus+device%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Double emulsion generation using a polydimethylsiloxane (PDMS) co-axial flow focus device.</a> Journal of Visualized Experiments. (106), e53516(2015).</li>
<li>Dutse, S. W., Yusof, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics-based+lab-on-chip+systems+in+DNA-based+biosensing%3A+An+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors%22%5BJournal%5D)">Microfluidics-based lab-on-chip systems in DNA-based biosensing: An overview.</a> Sensors. 11 (6), 5754-5768 (2011).</li>
<li>Burklund, A., Tadimety, A., Nie, Y., Hao, N., Zhang, J. X. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+diagnostic+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Advances in diagnostic microfluidics.</a> Advances in Clinical Chemistry. 95, 1-72 (2020).</li>
<li>Sui, S., Perry, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics%3A+From+crystallization+to+serial+time-resolved+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Structural+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Microfluidics: From crystallization to serial time-resolved crystallography.</a> Structural Dynamics. 4 (3), 032202(2017).</li>
<li>Haleva, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+cold-finger+device+for+the+investigation+of+ice-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+Journal%22%5BJournal%5D)">Microfluidic cold-finger device for the investigation of ice-binding proteins.</a> Biophys Journal. 111 (6), 1143-1150 (2016).</li>
<li>Vlasic, T. M., Servio, P. D., Rey, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((THF+hydrates+as+model+systems+for+natural+gas+hydrates%3A+Comparing+their+mechanical+and+vibrational+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Industrial+and+Engineering+Chemistry+Research%22%5BJournal%5D)">THF hydrates as model systems for natural gas hydrates: Comparing their mechanical and vibrational properties.</a> Industrial and Engineering Chemistry Research. 58 (36), 16588-16596 (2019).</li>
<li>Chen, W., Pinho, B., Hartman, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flash+crystallization+kinetics+of+methane+%28sI%29+hydrate+in+a+thermoelectrically-cooled+microreactor%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Flash crystallization kinetics of methane (sI) hydrate in a thermoelectrically-cooled microreactor.</a> Lab on a Chip. 17 (18), 3051-3060 (2017).</li>
<li>Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft+lithography+for+micro-+and+nanoscale+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Soft lithography for micro- and nanoscale patterning.</a> Nature Protocols. 5 (3), 491-502 (2010).</li>
<li>Drori, R., Celik, Y., Davies, P. L., Braslavsky, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ice-binding+proteins+that+accumulate+on+different+ice+crystal+planes+produce+distinct+thermal+hysteresis+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Royal+Society+Interface%22%5BJournal%5D)">Ice-binding proteins that accumulate on different ice crystal planes produce distinct thermal hysteresis dynamics.</a> Journal of the Royal Society Interface. 11 (98), 20140526(2014).</li>
<li>Soussana, T. N., Weissman, H., Rybtchinski, B., Drori, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adsorption-inhibition+of+clathrate+hydrates+by+self-assembled+nanostructures%5BTitle%5D)+AND+%22ChemPhysChem%22%5BJournal%5D)">Adsorption-inhibition of clathrate hydrates by self-assembled nanostructures.</a> ChemPhysChem. 22 (21), 2182-2189 (2021).</li>
<li>Drori, R., Holmes-Cerfon, M., Kahr, B., Kohn, R. v, Ward, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+and+unsteady+morphologies+at+ice+interfaces+driven+by+D2O-H2O+exchange%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Dynamics and unsteady morphologies at ice interfaces driven by D2O-H2O exchange.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (44), 11627-11632 (2017).</li>
<li>Deng, J., Apfelbaum, E., Drori, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ice+growth+acceleration+by+antifreeze+proteins+leads+to+higher+thermal+hysteresis+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physical+Chemistry+B%22%5BJournal%5D)">Ice growth acceleration by antifreeze proteins leads to higher thermal hysteresis activity.</a> Journal of Physical Chemistry B. 124 (49), 11081-11088 (2020).</li>
</ol>

Obecny protokół został zaprojektowany w celu wykorzystania połączenia przepływu mikroprzepływowego z mikroskopijnymi kryształami w celu ujawnienia nowych informacji na temat wzrostu kryształów i jego hamowania. Zimny stopień27 z regulacją temperatury o rozdzielczości milikelwinów umożliwia kontrolę pojedynczych mikroskopijnych kryształów znajdujących się wewnątrz kanałów mikroprzepływowych, umożliwiając w ten sposób wymianę roztworów wokół nich. Podczas gdy wytwarzanie urządzeń mikroprzepływowych jest standardowe i podobne do powszechnych praktyk 17,18, kontrola nad wzrostem i topnieniem kryształów wewnątrz urządzenia jest wyjątkowa i nowatorska. Najbardziej krytycznym elementem tego systemu jest doskonała kontrola temperatury, którą uzyskuje się dzięki zastosowaniu chłodnic termoelektrycznych Peltiera, sprzężenia zwrotnego z termistora znajdującego się blisko próbki oraz regulatora temperatury o wysokiej rozdzielczości, który zarządza pętlą sprzężenia zwrotnego.
Kolejnym krytycznym krokiem jest sama wymiana roztworu, ponieważ kryształy mogą się stopić lub urosnąć podczas tego procesu; W związku z tym temperatura musi być dostosowana podczas wymiany roztworu, aby zapobiec wzrostowi/topnieniu. Tworzenie się kryształów w kanałach mikroprzepływowych zakłóca przepływ cieczy i stanowi główne wyzwanie tego systemu; Stąd wzrost tych kryształów musi być kontrolowany. W tym przypadku laser IR (980 nm) został zamontowany na odwróconym mikroskopie i został użyty do lokalnego stopienia niechcianych kryształów lodu/hydratu28. Jeśli taki laser nie może być użyty, metalowe łączniki urządzenia mikroprzepływowego mogą być podgrzewane przez dodatkową chłodnicę termoelektryczną Peltiera, która stopi lód na wlocie/wylocie urządzenia.
Opisana tutaj metoda obejmuje przyrządy opracowane przez siebie (etap zimny) i wymaga szkolenia, ponieważ niektóre z wyżej wymienionych kroków są trudne. Ponieważ stężenie roztworu otaczającego kryształy może się zmieniać nawet wtedy, gdy przepływ nie jest zamierzony, prosty krokkalibracji 5 może zapewnić wiarygodne oszacowanie stężenia na podstawie sygnału fluorescencji. Innym możliwym rozwiązaniem problemu niepożądanego przepływu (na przykład podczas pomiarów TH) są zawory mikroprzepływowe, które są opisane w odnośniku4.
System ten został również wykorzystany do zbadania zachowania wzrostu lodu D2O w cieczy H2O, badanie, które ujawniło nowe zjawisko mikroskopijnych, ząbkowanych powierzchni lodu27. Dzięki temu mikrofluidyka może być wykorzystywana w badaniu różnych układów krystalicznych, które dobrze reagują na zmiany temperatury.

Białka zapobiegające zamarzaniu (AFP) i glikoproteiny przeciw zamarzaniu (AFGPs) chronią różne organizmy przystosowane do zimna przed uszkodzeniami spowodowanymi mrozem1. AFP i AFGP (uogólnione jako AF(G)Ps) hamują wzrost kryształków lodu, wiążąc się nieodwracalnie z ich powierzchnią i hamując dalszy wzrost z powodu efektu Gibbsa-Thomsona2,3,4,5. Powstała w ten sposób luka, która tworzy się między temperaturą topnienia, która jest w dużej mierze niezmieniona, a nowo obniżoną temperaturą zamarzania, nazywana jest histerezą termiczną (TH) i stanowi mierzalny parametr odpowiadający aktywności AFP6. Stosowanie AFP do hamowania wzrostu lodu ma daleko idące i różnorodne zastosowania, oferując potencjalne ulepszenia w różnych dziedzinach, w tym w krioprezerwacji, jakości mrożonej żywności i ochronie upraw narażonych na zimno.
Krystalizacja wody w niskich temperaturach i pod wysokim ciśnieniem w obecności małych cząsteczek organicznych powoduje powstawanie hydratów klatratu (lub hydratów gazowych), gdzie najobfitszym hydratem jest hydrat metanu7. Krystalizacja hydratów metanu w przewodach przepływu gazu/ropy może powodować powstawanie korków, które mogą powodować eksplozje w wyniku zapłonu gazu8,9,10. Obecne wysiłki mające na celu zapobieganie krystalizacji hydratów w liniach przepływowych obejmują stosowanie inhibitorów termodynamicznych (alkohole i glikole) i kinetycznych (głównie polimerów)11,12,13,14. Stwierdzono również, że AFP wiążą się z kryształami hydratów klatratu i hamują ich wzrost, co wskazuje na potencjalne zastosowanie AFP do utrudniania tworzenia się czopów, zapewniając w ten sposób bardziej ekologiczne rozwiązanie15.
Mikrofluidyka jest powszechnie stosowaną metodą do badania właściwości płynów o niewielkich objętościach próbek (do fL), które przepływają przez sieć mikrokanałów16. Mikrokanały są zgodne ze wzorem utworzonym na płytce krzemowej (formie) za pomocą litografii17. Powszechnie stosowanym materiałem do wytwarzania urządzeń mikroprzepływowych jest polidimetylosiloksan (PDMS), który jest niedrogi i stosunkowo prosty w obsłudze w laboratoriach badawczych. Konstrukcja funkcji (kanałów) jest skomponowana z uwzględnieniem konkretnego przeznaczenia urządzenia; dzięki temu może być wykorzystywany do różnych zastosowań, w tym do wykrywania DNA18, diagnostyki medycznej19 i procesów krystalizacji3,20,21.
Obecny protokół opisuje unikalną metodę mikroprzepływową hodowli mikronowych kryształów lodu i hydratów za pomocą różnych inhibitorów, w tym AFP i AFGP. W tych eksperymentach użyto hydratów tetrahydrofuranu (THF), aby naśladować właściwości hydratów metanu gazowego22, które wymagają specjalistycznego sprzętu do kontroli ciśnienia i temperatury23. Znakowane fluorescencyjnie AF(G)P wykorzystano do wizualizacji i analizy adsorpcji białek na powierzchni kryształu, a w połączeniu z obrazowaniem fluorescencyjnym, podejście mikroprzepływowe pozwoliło na uzyskanie kluczowych cech procesu wiązania tych cząsteczek z powierzchniami kryształów.

<table><tbody><tr><td>Filtry 0,22 mikrona</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>igły</td><td></td><td></td> wygięte pod kątem 90 stopni <td>Gauge 18</td></tr><tr><td>Białka przeciw zamarzaniu i glikoproteiny przeciw zamarzaniu</td><td>Prezent</td><td></td><td>Zobacz referencje 5 i 28</td></tr><tr><td>igły</td><td></td><td></td> Albumina surowicy bydlęcej <td>18 i 20 Gauge</td></tr><tr><td>(BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cold scena</td><td>Domowa robota</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe</td><td>Globe Scientific</td><td></td><td>18 X 18 mm, grubość 0,14 mm</td></tr><tr><td>Szklana strzykawka</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laser na podczerwień 980 nm</td><td>Opto Engine LLC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony, Eclipse Ti - S</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Niewidoczna taśma</td><td>Zszywki</td><td></td><td></td></tr><tr><td>niestrzępiąca się chusteczka</td><td>Regulator temperatury Kimwipes</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Newport 3040</td> Oprogramowanie do obrazowania <td>Newport</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NIS-Elements Pompa</td> próżniowa <td>oleju Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Harrick Plasma</td> Środek do czyszczenia plazmy Harrick Plasma <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>PDC-32G</td><td></td></tr><tr><td>Polidimetylosiloksan (zestaw elastomerów silikonowych Dow Corning Sylgard 184)</td><td>Dow Corning Syglard</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Safranine O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2255-25G</td><td></td></tr><tr><td>Szafirowy dysk</td><td>Ted Pella Inc</td><td>16005-1010</td><td>&nbsp; Średnica 25,4 mm, grubość 0,3 mm</td></tr><tr><td>Kamera sCMOS, Neo 5.5</td><td>Andor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tetrahydrofuran (THF)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>401757-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Tygon Microbore rurka do urządzenia mikroprzepływowego</td><td>Cole-Parmer</td><td></td><td>&nbsp; 0,020" ID, 0,060"OD, 100 stóp/rolkę.</td></tr><tr><td>Wężyk Tygon do cyrkulacji wody i azotu</td><td>Cole-Parmer</td><td></td><td>1/8" Identyfikator, 3/16" OD</td></tr></tbody></table>

mikroprzepływowe podejście do badania krystalizacji lodu i hydratów klatratu

A Microfluidic Approach for the Study of Ice and Clathrate Hydrate Crystallization

Dokładny mechanistyczny opis krystalizacji wody jest trudny i wymaga kilku kluczowych elementów: doskonałej kontroli temperatury, która pozwala na tworzenie pojedynczych mikroskopijnych kryształów oraz odpowiedniego systemu mikroskopowego sprzężonego z zimnym etapem. Opisana tutaj metoda dodaje kolejną ważną cechę, która obejmuje wymianę roztworów wokół lodu i kryształów hydratów klatratu. Opisany system składa się z połączenia unikalnych i opracowanych przez nas urządzeń, w tym mikrofluidyki, zimnych stopni o wysokiej rozdzielczości i mikroskopii fluorescencyjnej. Etap zimny został zaprojektowany dla urządzeń mikroprzepływowych i pozwala na tworzenie mikronowych kryształów lodu/hydratu wewnątrz kanałów mikroprzepływowych i wymianę roztworów wokół nich. Rozdzielczość temperaturowa i stabilność zimnego etapu wynosi jeden milikelwin, co ma kluczowe znaczenie dla kontrolowania wzrostu tych małych kryształów. Ten zróżnicowany system jest wykorzystywany do badania różnych procesów krystalizacji lodu i hydratów oraz mechanizmu, za pomocą którego wzrost tych kryształów jest hamowany. Protokół opisuje, jak przygotować urządzenia mikroprzepływowe, jak hodować i kontrolować mikroskopijne kryształy w kanałach mikroprzepływowych oraz w jaki sposób wykorzystanie przepływu cieczy wokół kryształów lodu/hydratu dostarcza nowych informacji na temat krystalizacji wody.

Wymiana roztworu z kryształami lodu 
Pomyślną wymianę roztworu wokół kryształu lodu przedstawiono na Rysunku 3. Znaczniki czasu na każdym ujęciu wskazują, że wymiana roztworu przebiegała stosunkowo szybko; możliwa jest jednak wolniejsza wymiana. Intensywność fluorescencji pochodząca od cząsteczek AFGP zaadsorbowanych na lodzie jest wyraźnie widoczna po zakończeniu wymiany (Rysunek 3, po prawej). Ilościowa analiza stężenia AFP na powierzchni lodu jest monitorowana przy użyciu narzędzia do wyznaczania obszaru zainteresowania (ROI) (Rysunek 4). W tym eksperymencie4 zastosowano AFP typu III (izoforma QAE) rozcieńczone w 50 mM Tris-HCl (pH 7.8) i 100 mM NaCl. Roztwór wymieniono wokół kryształu o kształcie bipiramidalnym, monitorując intensywność fluorescencji w roztworze oraz na lodzie. Czerwony wykres wskazujący sygnał fluorescencji w roztworze zmniejszył się 100-krotnie podczas wymiany roztworu, podczas gdy obliczony sygnał (wykres zielony) na powierzchni lodu pozostał stały. Obliczony sygnał cząsteczek zaadsorbowanych na lodzie uzyskano poprzez odjęcie sygnału pochodzącego z roztworu (pomnożonego przez stałą odnoszącą się do grubości kanału mikrofluidycznego) od sygnału pochodzącego z lodu4.
Wymiana roztworu w przypadku hydratów THF 
Eksperymenty mikrofluidyczne z hydratami THF przeprowadzono w sposób analogiczny do eksperymentów z lodem. Po tym, jak kryształom hydratu pozwolono na adsorpcję cząsteczek inhibitora z roztworu, do kanałów wstrzyknięto roztwór wolny od inhibitora. Rysunek 5 przedstawia hydraty THF po wymianie roztworu z dwoma typami inhibitorów: AFGP1-5 znakowanym izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC) (Rysunek 5A) oraz safraniną O (patrz Tabela materiałów), która jest barwnikiem fluorescencyjnym26 (Rysunek 5B). Jest to pierwsza demonstracja wiązania białka AFGP z powierzchnią hydratu klatratowego.
<img alt="Schemat komór wzrostu kryształów; wloty, wyloty; projekt mikrofluidyczny, układ doświadczalny." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64072/64072fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Schematyczne przedstawienie kanałów mikrofluidycznych użytych w niniejszym badaniu. Oba projekty obejmują dwa wloty i jeden wylot. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64072/64072fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Mikroskopia kryształów białek; obraz eksperymentalny do analizy krystalograficznej i badań strukturalnych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64072/64072fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Hydraty THF powstałe w kanale mikrofluidycznym po schłodzeniu temperatury do ~-2 °C. Morfologia wszystkich przedstawionych kryształów to czworościan; jednak niektóre kryształy są zorientowane inaczej. Pasek skali = 20 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64072/64072fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Obrazowanie fluorescencyjne wpływu stężenia AFP w czasie w układzie mikroprzepływowym, seria eksperymentów." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64072/64072fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Reprezentatywny eksperyment wykazujący wymianę roztworu wokół pojedynczego kryształu lodu w kanale mikroprzepływowym. Początkowo roztwór zawierał AFGP1-5 znakowane FITC, a adsorbowanych na lodzie AFGP nie zaobserwowano. Po wymianie na roztwór wolny od AFGP wyraźnie wykryto białka, które wcześniej zaadsorbowały się na powierzchni lodu (obraz po prawej). Pasek skali = 25 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64072/64072fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wyniki mikroskopii fluorescencyjnej; analiza próbki trioktaedrycznej; wykres intensywności w czasie." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64072/64072fig04v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Ilościowa i jakościowa analiza stężenia AFP na powierzchni lodu. (A) Kryształ lodu przy wysokim stężeniu roztworu AFP (przed wymianą roztworu). (B) Ten sam kryształ po wymianie roztworu AFP na roztwór buforowy wolny od AFP. Pasek skali = 20 µm. (C) Analiza ilościowa intensywności fluorescencji na powierzchni lodu (czarny) i w roztworze (czerwony) podczas wymiany roztworu. Zielna krzywa przedstawia obliczoną intensywność na powierzchni lodu. Rycina została dostosowana za zgodą z referencji4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64072/64072fig04largev2.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Mikroskopia fluorescencyjna, struktury krystaliczne; analiza emisji zielonej i czerwonej, wyniki badań optycznych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64072/64072fig05.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5: Pojedyncze kryształy hydratu THF w kanałach mikroprzepływowych po wymianie roztworu wokół nich (A, AFGP1-5) lub (B, Safranine O). Obraz w (B) został powielony z referencji26. Pasek skali = 25 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64072/64072fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Obecny protokół opisuje krystalizację mikroskopijnych kryształków lodu i hydratów klatratu w urządzeniach mikroprzepływowych, umożliwiając wymianę cieczy wokół utworzonych kryształów. Daje to niezrównane możliwości badania procesu krystalizacji i mechanizmów wiązania inhibitorów.

Mikroprzepływowe podejście do badania krystalizacji lodu i hydratów klatratu

An accurate mechanistic description of water crystallization is challenging and requires a few key elements: superb temperature control to allow the ...

Ten protokół jest wyjątkowy, ponieważ pozwala użytkownikowi badać, badać i mierzyć interakcję między rozpuszczalnymi cząsteczkami a powierzchniami kryształów. Mocne dowody na nieodwracalne wiązanie białek płynu niezamarzającego z lodem lub uzyskane przy użyciu tej metody. Główną zaletą tej techniki jest możliwość kontrolowania wzrostu kryształów lodu i hydratów o wielkości mikronów oraz kontrolowanej wymiany roztworu wokół nich.Na początek umieść wcześniej przygotowaną foremkę na szklanej szalce Petriego pokrytej folią aluminiową. Następnie przygotuj od 30 do 40 mililitrów mieszaniny PDMS, ważąc od 1 do 10 mieszaniny utwardzacza i elastomeru i mieszając w sposób ciągły przez około pięć minut, aż mieszanina stanie się biała i prawie nieprzezroczysta. Następnie wlej mieszaninę PDMS do szalki Petriego z foremką i odgazuj w eksykatorze, aż nie pozostaną żadne pęcherzyki.Formę z płynem PDMS pieczemy w piekarniku lub na gorącej płycie w temperaturze 70 stopni Celsjusza, aż do uzyskania konsystencji gumy. Następnie wytnij urządzenie, śledząc elementy skalpelem, uważając, aby pchnąć skalpelem do przodu zamiast w dół, ponieważ forma jest delikatna. Po wyjęciu wyciętego urządzenia PDMS umieść je do góry nogami na nowej szalce Petriego.Za pomocą strzykawki, igły o rozmiarze 20, wybij otwory w urządzeniu na podstawie nadrukowanego wzoru. Następnie włóż oczyszczony PDMS i szkiełko nakrywkowe do myjki plazmowej. Zamknij zawory i włącz zasilanie, próżnię i pompę.Pozwól myjce plazmowej pracować przez około minutę. Ustaw RF na wysoki i pozwól, aby trochę powietrza dostało się do odkurzacza plazmowego za pomocą zaworu precyzyjnego. Gdy kolor okien zmieni się z fioletowego na różowy, pozwól odkurzaczowi plazmowemu działać przez 50 sekund, aby wyłączyć RF.Pozostaw pompę włączoną przez minutę, a po jej wyłączeniu stopniowo otwieraj główny zawór, aby umożliwić dopływ powietrza do odkurzacza plazmowego. Następnie dociśnij powierzchnię PDMS do oczyszczonego szkiełka nakrywkowego i upewnij się, że są one połączone, obserwując brak oderwania podczas lekkiego podciągania szkiełka nakrywkowego. Po zabezpieczeniu igły igły pod kątem 90 stopni za pomocą szczypiec, włóż jeden koniec igły do rurki Tygon, a drugi koniec do jednego z wybitych otworów urządzenia, powtarzając proces dla pozostałych otworów.Nałóż niewielką ilość olejku immersyjnego na powierzchnię miedzianego zimnego etapu i rozprowadź go za pomocą niestrzępiącej się chusteczki, aby utworzyć cienką warstwę oleju. Następnie umieść czysty dysk szafirowy na utworzonej warstwie oleju. Następnie nałóż kroplę olejku immersyjnego na środek szafirowej tarczy i umieść urządzenie PDMS na kropli tak, aby cechy urządzenia były wyrównane nad otworem viewzimnego sceny.Po przytrzymaniu urządzenia na miejscu przymocuj rurkę do zewnętrznych ścianek aluminiowego pudełka, w którym znajduje się taśma samoprzylepna. Za pomocą szklanej strzykawki wstrzyknąć od czterech do pięciu mikrolitrów roztworu białka zapobiegającego zamarzaniu do kanału wlotowego i zamknąć pokrywę zimnego sceny. Uruchom program kontroli temperatury i ustaw temperaturę na minus 25 stopni Celsjusza.Następnie powoli zwiększaj temperaturę o około jeden stopień Celsjusza na pięć sekund. Zbliżyć się do temperatury topnienia próbek, która może wynosić od minus 1 do minus 0,2 stopnia Celsjusza, w zależności od buforu zastosowanego w roztworze białka zapobiegającego zamarzaniu. Aby lepiej obserwować monokryształy, przełącz się na obiektywy 10x lub 20x.A po uzyskaniu pojedynczego kryształu w żądanym miejscu, wyhoduj kryształ, nieznacznie obniżając temperaturę, aż końce kryształu zetkną się ze ściankami kanału. Po przełączeniu na obiektyw 50x wstrzyknij roztwór białka zapobiegającego zamarzaniu do kanałów i obserwuj wzrost intensywności fluorescencji, co wskazuje, że roztwór białkowy został pomyślnie wstrzyknięty do kanałów. Aby zarejestrować proces wymiany roztworu, należy użyć programu do obrazowania elementów NIS, upewniając się, że zastosowane ciśnienie nie jest zbyt wysokie i powoli wstrzyknąć roztwór buforowy do drugiego wlotu urządzenia mikroprzepływowego.Zauważyć spadek sygnału fluorescencyjnego z szybkością zależną od nacisku przyłożonego do strzykawki. Aby uzyskać hydraty THF po przygotowaniu roztworu wodnego THF o stosunku molowym od 1 do 15, należy wstrzyknąć roztwór do urządzenia mikroprzepływowego. Po zamrożeniu roztworu wodnego THF powoli zwiększaj temperaturę, aż cały lód stopi się z wyłączeniem hydratów i utrzymuj temperaturę jednego stopnia Celsjusza przez trzy minuty.Ustaw temperaturę na minus dwa stopnie Celsjusza i obserwuj obfitość hydratów, które pojawiają się w kanałach mikroprzepływowych przy braku inhibitorów. Następnie wstrzyknij białko lub inhibitor płynu niezamarzającego do kanału mikroprzepływowego za pomocą szklanej strzykawki, jednocześnie dostosowując temperaturę, aby uzyskać pewność, że otrzymane kryształy nie stopią się ani nie urosną i odczekaj kilka minut, aby cząsteczki inhibitora zaadsorbowały się na powierzchni kryształu. Przeprowadzić wymianę roztworu, wstrzykując roztwór wolny od inhibitora do kanału.Wykonaj zdjęcia kryształu przed i po wymianie roztworu i przeanalizuj intensywność fluorescencji na krysztale i w roztworze za pomocą programu do obrazowania. Przeprowadzono udaną wymianę roztworu wokół kryształu lodu, co wskazuje, że wymiana roztworu była stosunkowo szybka. Możliwa jest jednak wolniejsza wymiana.Intensywność fluorescencji pochodząca z zaadsorbowanych w lodzie cząsteczek glikoprotein przeciw zamarzaniu była wyraźnie obserwowana po zakończeniu wymiany. Monitorowano ilościową analizę stężenia białek zapobiegających zamarzaniu i określono intensywność fluorescencji w roztworze i na lodzie, wskazując, że sygnał fluorescencji w roztworze zmniejsza się 100-krotnie podczas wymiany roztworu, podczas gdy obliczony sygnał na powierzchni lodu pozostaje stały. Przeprowadzono eksperymenty mikroprzepływowe z hydratami THF, w których roztwór wolny od inhibitora wstrzyknięto do kanałów po tym, jak kryształy hydratów mogły zaadsorbować cząsteczki inhibitora.Hydraty THF obserwowano po wymianie roztworu z dwoma typami inhibitorów, w tym glikoproteinami przeciw zamarzaniu znakowanymi izotiocyjanianem fluoresceiny i barwnikiem fluorescencyjnym Safranina O. Krytycznymi etapami tej procedury są utworzenie i wyizolowanie monokryształu w kanałach mikroprzepływowych oraz wymiana roztworu wokół niego. Metoda ta może być stosowana z innymi materiałami kryształowymi, które są bardzo wrażliwe na temperaturę, w celu zrozumienia mechanizmu, za pomocą którego inhibitory oddziałują z tymi kryształami.Możliwość wymiany roztworów wokół kryształów utorowała naukowcom drogę do zidentyfikowania kluczowych informacji na temat mechanizmu wiązania białek zapobiegających zamarzaniu oraz do odkrycia nowego zjawiska wpływu izotopów na wzrost lodu.

a-microfluidic-approach-for-study-ice-clathrate-hydrate

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Białka wiążące lód (IBPs), znane również jako białka przeciwzamrożeniowe, hamują wzrost kryształków lodu i stanowią obiecujący dodatek do stosowania w krio konserwacji tkanek. Głównym narzędziem wykorzystywanym do badania białek IBPs jest osmometr nanolitrowy. Opracowaliśmy autorską platformę chłodzącą zamontowaną na mikroskopie optycznym, sterowaną za pomocą dedykowanej procedury w programie LabVIEW. Opisany tutaj osmometr nanolitrowy umożliwia ultrazieczulną manipulację temperaturą próbki.

Nowoczesny osmometr nanolitrowy sterowany programem LabVIEW do badań nad białkami wiążącymi lód

Tutaj opisujemy wytwarzanie i działanie dwuwarstwowego systemu mikroprzepływowego wykonanego z polidimetylosiloksanu (PDMS). Pokazujemy potencjał tego urządzenia w zakresie wychwytywania, kierowania szlakiem koordynacyjnym krystalicznego materiału molekularnego i kontrolowania reakcji chemicznych na uwięzionych strukturach na chipie.

Mikroprzepływowe klatki pneumatyczne: nowatorskie podejście do wychwytywania kryształów w chipach, manipulacji i kontrolowanej obróbki chemicznej

Tutaj prezentujemy protokół kontrolowanej produkcji mikrokryształów białka. W procesie wykorzystuje się zautomatyzowane urządzenie pozwalające na kontrolowaną manipulację kilkoma parametrami krystalizacji. Krystalizacja białka odbywa się poprzez kontrolowane i zautomatyzowane dodawanie roztworów krystalizacyjnych przy jednoczesnym monitorowaniu i badaniu rozkładu promienia cząstek w kropli krystalizacji.

Hodowla kryształów białkowych o różnych wymiarach przy użyciu automatycznej krystalizacji połączonej z dynamicznym rozpraszaniem światła in situ

Ten protokół opisuje szczegółowo, jak wytwarzać i obsługiwać urządzenia mikroprzepływowe do zbierania danych dyfrakcji rentgenowskiej w temperaturze pokojowej. Dodatkowo opisano, w jaki sposób monitorować krystalizację białek poprzez dynamiczne rozpraszanie światła oraz jak przetwarzać i analizować uzyskane dane dyfrakcyjne.

Chipy mikroprzepływowe do dyfrakcji rentgenowskiej kryształów in situ i dynamicznego rozpraszania światła in situ do krystalografii szeregowej

Ten artykuł opisuje proces mikroprzepływowy i parametry przygotowania cząstek uruchamiających z elastomerów ciekłokrystalicznych. Proces ten pozwala na przygotowanie cząstek uruchamiających oraz zmianę ich wielkości i kształtu (od spłaszczonej do silnie prolate, morfologii rdzeń-powłoka i janus), a także wielkość aktywacji.

Przygotowanie mikroprzepływowe siłowników z elastomeru ciekłokrystalicznego

Przedstawiamy protokół do badania powstawania hydratów w obecności niejonowych środków powierzchniowo czynnych na granicy kropel wody zanurzonych w cyklopentanie. Protokół polega na zbudowaniu taniego, programowalnego regulatora temperatury. System kontroli temperatury jest połączony z technikami wizualizacji i pomiarami ciśnienia wewnętrznego.

Badanie wpływu środków powierzchniowo czynnych na krystalizację hydratów na granicy faz olej-woda przy użyciu niedrogiego, zintegrowanego modułowego urządzenia Peltiera

Ten artykuł szczegółowo opisuje protokół wytwarzania mikroprzepływowych chipów opracowanych do krystalizacji białek na chipie metodą dializy i eksperymentów dyfrakcji rentgenowskiej in situ. Proces mikroprodukcji umożliwia zintegrowanie półprzepuszczalnej membrany do dializy z regenerowanej celulozy z dowolnym odcięciem masy cząsteczkowej między dwiema warstwami chipa.

Krystalizacja białek na chipie za pomocą mikrodializy do badań dyfrakcji rentgenowskiej in situ

W artykule przedstawiono metodę generowania kryształów białek pochodzonych z I3C (5-amino-2,4,6-trijodoizoftalowy) za pomocą mikrozasiewania do generowania nowych warunków krystalizacji w rzadkich przesiewach matrycowych. Tacy można ustawić za pomocą robotów do dyspensowania płynów lub ręcznie.

Deriwatyzacja kryształów białek za pomocą I3C za pomocą losowego przesiewania macierzy mikronasion

Opisano wszechstronne urządzenie mikroprzepływowe, które umożliwia krystalizację enzymu za pomocą metody przeciwdyfuzyjnej, wprowadzenie substratu do kryształów poprzez moczenie, oraz określenie struktury 3D kompleksu enzym:substrat poprzez seryjną analizę kryształów wewnątrz chipa w temperaturze pokojowej.

Krystalizacja i oznaczanie strukturalne kompleksu enzyma:substrat za pomocą krystalografii szeregowej w uniwersalnym chipie mikroprzepływowym

Opisujemy metodę tworzenia hydratu gazu na kropelkach wody siedzącej, aby zbadać wpływ różnych inhibitorów, promotorów i substratów na morfologię kryształu hydratu.

Krystalizacja hydratu metanu na siedzących kropelkach wody

Prezentowany protokół opisuje proste podejście do badania przesiewowego warunków krystalizacji białek i wzrostu kryształów przy użyciu 96-dołkowej płytki do dializy o wysokiej przepustowości. Zastosowanie probówek dializatorów do hodowli mikrokryształów na dużą skalę wykazano również w krystalografii seryjnej i zastosowaniach MicroED.

Wysokoprzepustowa krystalizacja białek za pomocą mikrodializy

Poznaj mikroprzepływową metodę badania krystalizacji lodu i hydratów klatratu z kontrolowaną wymianą roztworu. Technika umożliwia obserwację wiązania białek przeciwzamarzających z powierzchnią kryształów w czasie rzeczywistym.

Mikroprzepływowe podejście do badania krystalizacji lodu i hydratów klatratu

Przeglądaj więcej filmów