Mikroprzepływowe podejście do badania krystalizacji lodu i hydratów klatratu

Ten protokół jest wyjątkowy, ponieważ pozwala użytkownikowi badać, badać i mierzyć interakcję między rozpuszczalnymi cząsteczkami a powierzchniami kryształów. Mocne dowody na nieodwracalne wiązanie białek płynu niezamarzającego z lodem lub uzyskane przy użyciu tej metody. Główną zaletą tej techniki jest możliwość kontrolowania wzrostu kryształów lodu i hydratów o wielkości mikronów oraz kontrolowanej wymiany roztworu wokół nich.

Na początek umieść wcześniej przygotowaną foremkę na szklanej szalce Petriego pokrytej folią aluminiową. Następnie przygotuj od 30 do 40 mililitrów mieszaniny PDMS, ważąc od 1 do 10 mieszaniny utwardzacza i elastomeru i mieszając w sposób ciągły przez około pięć minut, aż mieszanina stanie się biała i prawie nieprzezroczysta. Następnie wlej mieszaninę PDMS do szalki Petriego z foremką i odgazuj w eksykatorze, aż nie pozostaną żadne pęcherzyki.

Formę z płynem PDMS pieczemy w piekarniku lub na gorącej płycie w temperaturze 70 stopni Celsjusza, aż do uzyskania konsystencji gumy. Następnie wytnij urządzenie, śledząc elementy skalpelem, uważając, aby pchnąć skalpelem do przodu zamiast w dół, ponieważ forma jest delikatna. Po wyjęciu wyciętego urządzenia PDMS umieść je do góry nogami na nowej szalce Petriego.

Za pomocą strzykawki, igły o rozmiarze 20, wybij otwory w urządzeniu na podstawie nadrukowanego wzoru. Następnie włóż oczyszczony PDMS i szkiełko nakrywkowe do myjki plazmowej. Zamknij zawory i włącz zasilanie, próżnię i pompę.

Pozwól myjce plazmowej pracować przez około minutę. Ustaw RF na wysoki i pozwól, aby trochę powietrza dostało się do odkurzacza plazmowego za pomocą zaworu precyzyjnego. Gdy kolor okien zmieni się z fioletowego na różowy, pozwól odkurzaczowi plazmowemu działać przez 50 sekund, aby wyłączyć RF.

Pozostaw pompę włączoną przez minutę, a po jej wyłączeniu stopniowo otwieraj główny zawór, aby umożliwić dopływ powietrza do odkurzacza plazmowego. Następnie dociśnij powierzchnię PDMS do oczyszczonego szkiełka nakrywkowego i upewnij się, że są one połączone, obserwując brak oderwania podczas lekkiego podciągania szkiełka nakrywkowego. Po zabezpieczeniu igły igły pod kątem 90 stopni za pomocą szczypiec, włóż jeden koniec igły do rurki Tygon, a drugi koniec do jednego z wybitych otworów urządzenia, powtarzając proces dla pozostałych otworów.

Nałóż niewielką ilość olejku immersyjnego na powierzchnię miedzianego zimnego etapu i rozprowadź go za pomocą niestrzępiącej się chusteczki, aby utworzyć cienką warstwę oleju. Następnie umieść czysty dysk szafirowy na utworzonej warstwie oleju. Następnie nałóż kroplę olejku immersyjnego na środek szafirowej tarczy i umieść urządzenie PDMS na kropli tak, aby cechy urządzenia były wyrównane nad otworem viewzimnego sceny.

Po przytrzymaniu urządzenia na miejscu przymocuj rurkę do zewnętrznych ścianek aluminiowego pudełka, w którym znajduje się taśma samoprzylepna. Za pomocą szklanej strzykawki wstrzyknąć od czterech do pięciu mikrolitrów roztworu białka zapobiegającego zamarzaniu do kanału wlotowego i zamknąć pokrywę zimnego sceny. Uruchom program kontroli temperatury i ustaw temperaturę na minus 25 stopni Celsjusza.

Następnie powoli zwiększaj temperaturę o około jeden stopień Celsjusza na pięć sekund. Zbliżyć się do temperatury topnienia próbek, która może wynosić od minus 1 do minus 0,2 stopnia Celsjusza, w zależności od buforu zastosowanego w roztworze białka zapobiegającego zamarzaniu. Aby lepiej obserwować monokryształy, przełącz się na obiektywy 10x lub 20x.

A po uzyskaniu pojedynczego kryształu w żądanym miejscu, wyhoduj kryształ, nieznacznie obniżając temperaturę, aż końce kryształu zetkną się ze ściankami kanału. Po przełączeniu na obiektyw 50x wstrzyknij roztwór białka zapobiegającego zamarzaniu do kanałów i obserwuj wzrost intensywności fluorescencji, co wskazuje, że roztwór białkowy został pomyślnie wstrzyknięty do kanałów. Aby zarejestrować proces wymiany roztworu, należy użyć programu do obrazowania elementów NIS, upewniając się, że zastosowane ciśnienie nie jest zbyt wysokie i powoli wstrzyknąć roztwór buforowy do drugiego wlotu urządzenia mikroprzepływowego.

Zauważyć spadek sygnału fluorescencyjnego z szybkością zależną od nacisku przyłożonego do strzykawki. Aby uzyskać hydraty THF po przygotowaniu roztworu wodnego THF o stosunku molowym od 1 do 15, należy wstrzyknąć roztwór do urządzenia mikroprzepływowego. Po zamrożeniu roztworu wodnego THF powoli zwiększaj temperaturę, aż cały lód stopi się z wyłączeniem hydratów i utrzymuj temperaturę jednego stopnia Celsjusza przez trzy minuty.

Ustaw temperaturę na minus dwa stopnie Celsjusza i obserwuj obfitość hydratów, które pojawiają się w kanałach mikroprzepływowych przy braku inhibitorów. Następnie wstrzyknij białko lub inhibitor płynu niezamarzającego do kanału mikroprzepływowego za pomocą szklanej strzykawki, jednocześnie dostosowując temperaturę, aby uzyskać pewność, że otrzymane kryształy nie stopią się ani nie urosną i odczekaj kilka minut, aby cząsteczki inhibitora zaadsorbowały się na powierzchni kryształu. Przeprowadzić wymianę roztworu, wstrzykując roztwór wolny od inhibitora do kanału.

Wykonaj zdjęcia kryształu przed i po wymianie roztworu i przeanalizuj intensywność fluorescencji na krysztale i w roztworze za pomocą programu do obrazowania. Przeprowadzono udaną wymianę roztworu wokół kryształu lodu, co wskazuje, że wymiana roztworu była stosunkowo szybka. Możliwa jest jednak wolniejsza wymiana.

Intensywność fluorescencji pochodząca z zaadsorbowanych w lodzie cząsteczek glikoprotein przeciw zamarzaniu była wyraźnie obserwowana po zakończeniu wymiany. Monitorowano ilościową analizę stężenia białek zapobiegających zamarzaniu i określono intensywność fluorescencji w roztworze i na lodzie, wskazując, że sygnał fluorescencji w roztworze zmniejsza się 100-krotnie podczas wymiany roztworu, podczas gdy obliczony sygnał na powierzchni lodu pozostaje stały. Przeprowadzono eksperymenty mikroprzepływowe z hydratami THF, w których roztwór wolny od inhibitora wstrzyknięto do kanałów po tym, jak kryształy hydratów mogły zaadsorbować cząsteczki inhibitora.

Hydraty THF obserwowano po wymianie roztworu z dwoma typami inhibitorów, w tym glikoproteinami przeciw zamarzaniu znakowanymi izotiocyjanianem fluoresceiny i barwnikiem fluorescencyjnym Safranina O. Krytycznymi etapami tej procedury są utworzenie i wyizolowanie monokryształu w kanałach mikroprzepływowych oraz wymiana roztworu wokół niego. Metoda ta może być stosowana z innymi materiałami kryształowymi, które są bardzo wrażliwe na temperaturę, w celu zrozumienia mechanizmu, za pomocą którego inhibitory oddziałują z tymi kryształami.

Możliwość wymiany roztworów wokół kryształów utorowała naukowcom drogę do zidentyfikowania kluczowych informacji na temat mechanizmu wiązania białek zapobiegających zamarzaniu oraz do odkrycia nowego zjawiska wpływu izotopów na wzrost lodu.