C. elegans (C. elegans) Rozwarstwienie gonad i pęknięcie zamrażające do barwienia immunofluorescencyjnego i DAPI
16 września 2022
To jest powszechnie stosowana metoda do sekcji gonad C. elegans, po której następuje pęknięcie zamrażające, która wytwarza próbki linii zarodkowej do immunofluorescencji poprzez barwienie przeciwciał, lub do prostego barwienia DAPI w celu wizualizacji DNA. Protokół ten okazał się skuteczny w przypadku studentów studiów licencjackich w laboratorium badawczym i w ramach badań licencjackich opartych na kursach.
Ta metoda preparacji i immunofluorescencji jest stosowana przez wiele laboratoriów C.elegans. Może być stosowany do wykrywania dowolnego białka, dla którego dostępne jest przeciwciało lub znakowane białko fuzyjne. Chociaż wymaga to pewnej praktyki, aby prawidłowo przeprowadzić tę sekcję, ten protokół jest elastyczny i łatwy do rozwiązania.
Dla nas barwienie DAPI zawsze działa i zwykle możemy znaleźć warunek, który działa na każde przeciwciało. Największym wyzwaniem dla tej techniki jest etap sekcji. Musisz pracować szybko, ale pewnie, aby uzyskać dobre ekstruzje linii zarodkowej.
Praktyka jest kluczowa. Aby rozpocząć, umieść szkiełko przytrzymujące na stoliku mikroskopu preparacyjnego i umieść szkiełko nakrywkowe na szkiełku przytrzymującym. Następnie odpipetuj cztery mikrolitry roztworu preparacyjnego do środka szkiełka nakrywkowego i przesuń szkiełko przytrzymujące na jedną stronę stolika, aby zwolnić widok.
Zbierz od 10 do 20 hermafrodytów z płytki NGM do kropli roztworu preparacyjnego. Najlepiej wybrać około 10 na szkiełko, ale nie na tyle, aby nie można było ich wyciąć w ciągu pięciu minut. Aby wypreparować zwierzęta, skrzyżuj końcówki igieł, aby uzyskać kształt X i użyj dolnej części X, aby przygwoździć dorosłego człowieka do powierzchni szkiełka nakrywkowego.
Następnie umieść kształt litery X bezpośrednio za gardłem, około jednej piątej długości ciała młodego dorosłego lub tuż poniżej przezroczystej części głowy. Następnie odetnij zwierzę jednym ruchem nożycowym, całkowicie uwalniając się z jamy ciała wraz z jedną lub obiema połówkami jelita. Aby utrwalić próbkę formaldehydem, należy odpipetować cztery mikrolitry roztworu utrwalającego na szkiełku nakrywkowym, bardzo blisko kropli w przypadku zwierząt, unikając pipetowania bezpośrednio do kropli rozwarstwiającej i przemieszczania wypreparowanych tusz.
Przypnij szkiełko nakrywkowe do szkiełka przytrzymującego jednym palcem. Drugą ręką delikatnie strzepnij kilka razy szkiełko nakrywkowe, aby wymieszać krople. Trzymając dodatnio naładowany szkiełko przodem do dołu, użyj go, aby podnieść szkiełko nakrywkowe na środku szkiełka, delikatnie dotykając kropli próbki, a napięcie powierzchniowe kropli podniesie szkiełko nakrywkowe.
Ustaw szkiełko na ławce i zamocuj dokładnie przez pięć minut w temperaturze pokojowej. W tym czasie oznacz slajd ołówkiem. Aby zamrozić, rozbij próbkę za pomocą ciekłego azotu, przytrzymując oznaczoną krawędź szkiełka pęsetą, delikatnie zanurz ją w ciekłym azocie.
Zwolnij szkiełko w taki sposób, aby opierało się o bok zlewki szkiełkiem nakrywkowym do góry, a szkiełka zostaną zamrożone w ciągu 10 sekund. W przypadku używania suchego lodu do zamrażania, po zeskrobaniu szronu z powierzchni aluminiowego bloku za pomocą brzytwy, mocno chwyć oznaczoną krawędź szkiełka i połóż ją na oczyszczonej powierzchni, wywierając lekki nacisk w dół, aby zapewnić pełny kontakt z blokiem. Zamrożenie następuje w ciągu 10 sekund, gdy próbka pod szkiełkiem nakrywkowym zamienia się w lód.
Usuń zamrożoną prowadnicę, mocno chwytając krótszą krawędź prowadnicy oznaczoną etykietą i przymocuj jedną długą krawędź do stołu. Drugą ręką mocno chwyć maszynkę do golenia i przesuń krawędź brzytwy w dół szkiełka, aby strzepnąć szkiełko nakrywkowe i odsunąć je od próbki. Natychmiast umieść szkiełko w słoiku Coplin zawierającym 95% etanolu i pozostaw szkiełka w etanolu na co najmniej pięć minut.
Następnie umyj szkiełka w PBST trzy razy przez pięć minut w temperaturze pokojowej, używając świeżego PBST do każdego prania. Wyniki obrazowania fluorescencyjnego jąder linii zarodkowej wykazały, że DAPI silnie wiąże się z DNA. Barwienie immunofluorescencyjne było skuteczne, gdy przeciwciało skierowane przeciwko RAD-51, markerowi pęknięć dwuniciowych, było obecne jako dyskretne ogniska w jądrach miotycznych, kolokalizowane na chromosomach oznaczonych DAPI.
Mutanty heterozygot kle-2 mają niewielkie defekty w budowie chromosomów, o czym świadczy nieznacznie nieuporządkowane barwienie DAPI i wzrost liczby pęknięć dwuniciowych, co znajduje odzwierciedlenie w większej liczbie ognisk RAD-51. Zarówno etapy preparacji, jak i zamrażania pękania mogą być trudne, dlatego ważne jest, aby pracować szybko i płynnie. Zalecamy przećwiczenie tych kroków przed przystąpieniem do całego protokołu.
Na przykład możesz ćwiczyć preparowanie większej objętości płynu, na przykład 200 mikrolitrów, i stopniowo zmniejszać się do zalecanej objętości czterech mikrolitrów na szkiełku nakrywkowym. Technika ta może być stosowana do obrazowania w wysokiej rozdzielczości na mikroskopie konfokalnym lub strukturalnym lub może być stosowana w połączeniu z DNA lub RNA-FISH, fluorescencyjna hybrydyzacja in situ, w celu wizualizacji, w jaki sposób białka lokalizują się w odniesieniu do określonych sekwencji.
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje metodę wycinania gonad C. elegans z następującym po niej rozrywaniem zamrażaniem, co umożliwia przygotowanie próbek linii zarodkowej do immunofluorescencji lub barwienia DAPI. Metoda ta została opracowana z myślą o dostępności zarówno dla studentów w laboratoriach badawczych, jak i w ramach zajęć dydaktycznych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Genetyka
Wstęp
- C. elegans jest organizmem modelowym powszechnie stosowanym w badaniach biologicznych.
- Immunofluorescencja i barwienie DAPI są kluczowymi technikami wizualizacji struktur komórkowych.
- Techniki sekcji wymagają precyzji i praktyki w celu uzyskania optymalnych wyników.
- Zrozumienie struktury linii zarodkowej jest niezbędne do badania procesów genetycznych.
Cel badania
- Aby dostarczyć niezawodną metodę preparowania gonad C. elegans.
- Aby ułatwić wizualizację jąder komórkowych linii zarodkowej za pomocą immunofluorescencji i barwienia DAPI.
- Aby wzbogacić proces nauki badaczy na poziomie studiów licencjackich.
Zastosowane metody
- Disekcja hermafrodytów C. elegans przy użyciu mikroskopu.
- Fiksacja próbek formaldehydem.
- Kriopękanie próbek przy użyciu ciekłego azotu lub suchego lodu.
- Barwienie DAPI oraz specyficznymi przeciwciałami w celu obrazowania.
Główne wyniki
- DAPI skutecznie wiąże się z DNA, umożliwiając wizualizację jąder linii zarodkowej.
- Barwienie immunofluorescencyjne ujawnia ogniska RAD-51, wskazujące na pęknięcia dwuniciowe.
- Mutanty heterozygotyczne Kle-2 wykazują defekty w strukturze chromosomów.
- Skuteczne obrazowanie można osiągnąć za pomocą mikroskopii konfokalnej lub mikroskopii z oświetleniem strukturalnym.
Wnioski
- Protokół jest elastyczny i może zostać dostosowany do różnych przeciwciał.
- Praktyka jest niezbędna do opanowania techniki sekcji.
- Metoda ta umożliwia obrazowanie o wysokiej rozdzielczości oraz dalsze badania genetyczne.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Immunofluorescencja o wysokiej rozdzielczości oraz barwienie DAPI gonad C. elegans umożliwiają precyzyjną wizualizację przebiegu mejozy i architektury chromosomów, co wspomaga walidację celów na wczesnym etapie badań nad biologią linii zarodkowej. Niniejszy schemat pracy zapewnia stabilny i powtarzalny dostęp do wszystkich stadiów mejozy w ramach jednego preparatu, ułatwiając redukcję ryzyka mechanistycznego oraz analizę porównawczą zaburzeń genetycznych. Elastyczność i adaptacyjność protokołu sprawiają, że jest on cennym narzędziem dla zespołów badawczych zajmujących się lokalizacją białek, naprawą DNA i integralnością chromosomów.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednią wizualizację lokalizacji białek oraz zdarzeń chromosomalnych we wszystkich etapach mejozy.
- Wspiera walidację funkcjonalną celów genetycznych zaangażowanych w naprawę DNA i strukturę chromosomów.
- Ułatwia minimalizację ryzyka mechanistycznego poprzez umożliwienie bezpośredniego porównania fenotypów typu dzikiego i mutantów.
- Stanowi platformę do weryfikacji hipotez dotyczących szlaków specyficznych dla linii zarodkowej.
Przesiewy i opracowanie testów
- Zapewnia zwalidowane preparaty całych tkanek (whole-mount), odpowiednie do ilościowych analiz immunofluorescencyjnych.
- Gwarantuje powtarzalność i standaryzację dzięki solidnym etapom fiksacji i permeabilizacji.
- Umożliwia skalowalne procesy obrazowania w celu weryfikacji specyficzności przeciwciał i lokalizacji sygnału.
- Wspiera późniejszą integrację z metodami DNA/RNA-FISH oraz zaawansowanymi platformami mikroskopowymi.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodne z modelami istotnymi dla chorób w badaniach nad stabilnością genomu i wadami mejozy.
- Zapewnia ciągłość od odkryć genetycznych po walidację przedkliniczną interwencji w linii zarodkowej.
- Umożliwia dostosowany do ryzyka rozwój celów terapeutycznych wpływających na integralność chromosomową i naprawę DNA.
- Oferuje wartość prognostyczną dla rozwoju biomarkerów translacyjnych w biologii rozrodu.
Integracja potoku i przepływu pracy
Niniejszy protokół łączy wczesną fazę odkryć z badaniami przedklinicznymi, umożliwiając ilościową i powtarzalną analizę zdarzeń w linii zarodkowej C. elegans. Wspiera on przepływy pracy od walidacji celu, poprzez identyfikację związków wiodących, aż po badania mechanistyczne.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków w rozwoju linii zarodkowej i naprawie DNA.
- Screening: Dostarcza próbek gotowych do analizy w celu walidacji przeciwciał i obrazowania ilościowego.
- Analityka: Generuje wiarygodne wyniki dotyczące lokalizacji białek, struktury chromosomowej i markerów uszkodzeń DNA.
- Badania translacyjne: Łączy odkrycia genetyczne z modelami przedklinicznymi niestabilności genomu.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Możliwość adaptacji dla różnych białek docelowych oraz kompatybilność z wieloma modalnościami obrazowania.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach linii zarodkowej.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje przygotowanie próbek dla powtarzalnych i skalowalnych procesów obrazowania.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji typu go/no-go, umożliwiając bezpośrednie porównanie wariantów genetycznych i interwencji.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację celów wpływających na integralność chromosomową i naprawę DNA w oparciu o analizę ryzyka.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga biegłości w technikach obchodzenia się z C. elegans oraz technikach sekcji.
- Wymagany dostęp do mikroskopii fluorescencyjnej oraz zwalidowanych przeciwciał lub białek z etykietą.
- Wymagana standaryzacja protokołów fiksacji, permeabilizacji i barwienia pomiędzy zespołami.
- Metoda jest adaptowalna do różnych tła genetycznych i kompatybilna z procedurami DNA/RNA-FISH.
- Kroki sekcji i rozszczelniania przez zamrażanie (freeze crack) wymagają praktyki w celu zapewnienia spójnej jakości próbek.
