Name: C. elegans (C. elegans) Rozwarstwienie gonad i pęknięcie zamrażające do barwienia immunofluorescencyjnego i DAPI (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-16T13:50:00.000+00:00
Duration: 6 min 4 s
Description: Naucz się rozwarstwiania gonad i pęknięcia zamrażającego C. elegans do barwienia immunofluorescencyjnego i DAPI. Ta metoda umożliwia wizualizację jąder linii płciowej i badanie struktury chromosomów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca w laboratorium Lee była wspierana przez National Institute of General Medical Sciences pod numerem nagrody 1R15GM144861 oraz National Institute for Child and Human Development pod numerem nagrody 1R15HD104115, oba National Institutes of Health. DA był wspierany przez program UML Kennedy College of Sciences Science Scholars. NW był wspierany przez UML Honors College Fellowship oraz stypendium UMLSAMP (finansowane przez National Science Foundation w ramach grantu o numerze HRD-1712771). Dziękujemy firmie A. Gartner za przeciwciało RAD-51. Wszystkie szczepy C. elegans zostały dostarczone przez Caenorhabditis Genetics Center, które jest finansowane przez Biuro Programów Infrastruktury Badawczej National Institutes of Health pod numerem nagrody P40 OD010440.

<ol><li>Newman, D. L., Wright, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meiosis%3A+A+play+in+three+acts%2C+starring+DNA+sequence%5BTitle%5D)+AND+%22CourseSource%22%5BJournal%5D)">Meiosis: A play in three acts, starring DNA sequence.</a> CourseSource. 4, (2017).</li>
<li>Ohkura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meiosis%3A+An+overview+of+key+differences+from+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Meiosis: An overview of key differences from mitosis.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (5), 015859(2015).</li>
<li>Hassold, T., Hunt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((To+err+%28meiotically%29+is+human%3A+the+genesis+of+human+aneuploidy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy.</a> Nature Reviews Genetics. 2 (4), 280-291 (2001).</li>
<li>Keeney, S., Giroux, C. N., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meiosis-specific+DNA+double-strand+breaks+are+catalyzed+by+Spo11%2C+a+member+of+a+widely+conserved+protein+family%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Meiosis-specific DNA double-strand breaks are catalyzed by Spo11, a member of a widely conserved protein family.</a> Cell. 88 (3), 375-384 (1997).</li>
<li>Rabitsch, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetochore+recruitment+of+two+nucleolar+proteins+is+required+for+homolog+segregation+in+meiosis+I%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Kinetochore recruitment of two nucleolar proteins is required for homolog segregation in meiosis I.</a> Developmental Cell. 4 (4), 535-548 (2003).</li>
<li>Brown, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Some+misconceptions+in+meiosis+shown+by+students+responding+to+an+advanced+level+practical+examination+question+in+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Education%22%5BJournal%5D)">Some misconceptions in meiosis shown by students responding to an advanced level practical examination question in biology.</a> Journal of Biological Education. 24 (3), 182-186 (1990).</li>
<li>Kalas, P., O'Neill, A., Pollock, C., Birol, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+meiosis+concept+inventory%5BTitle%5D)+AND+%22CBE-Life+Sciences+Education%22%5BJournal%5D)">Development of a meiosis concept inventory.</a> CBE-Life Sciences Education. 12 (4), 655-664 (2013).</li>
<li>McDonnel, L. M., Klenz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Teaching+genetic+linkage+and+recombination+through+mapping+with+molecular+markers%5BTitle%5D)+AND+%22CourseSource%22%5BJournal%5D)">Teaching genetic linkage and recombination through mapping with molecular markers.</a> CourseSource. 2, (2015).</li>
<li>Wright, L. K., Cortez, P., Franzen, M. A., Newman, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Teaching+meiosis+with+the+DNA+triangle+framework%3A+A+classroom+activity+that+changes+how+students+think+about+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+and+Molecular+Biology+Education%22%5BJournal%5D)">Teaching meiosis with the DNA triangle framework: A classroom activity that changes how students think about chromosomes.</a> Biochemistry and Molecular Biology Education. 50 (1), 44-54 (2021).</li>
<li>Shortlidge, E. E., Bangera, G., Brownell, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Each+to+their+own+CURE%3A+Faculty+who+teach+course-based+undergraduate+research+experiences+report+why+you+too+should+teach+a+CURE%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiology+%26+Biology+Education%22%5BJournal%5D)">Each to their own CURE: Faculty who teach course-based undergraduate research experiences report why you too should teach a CURE.</a> Journal of Microbiology & Biology Education. 18 (2), 18(2017).</li>
<li>Auchincloss, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+course-based+undergraduate+research+experiences%3A+A+meeting+report%5BTitle%5D)+AND+%22CBE-Life+Sciences+Education%22%5BJournal%5D)">Assessment of course-based undergraduate research experiences: A meeting report.</a> CBE-Life Sciences Education. 13 (1), 29-40 (2014).</li>
<li>Lee, T. W., Carpenter, B. S., Birol, O., Katz, D. J., Schmeichel, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pipeline+CURE%3A+An+iterative+approach+to+introduce+all+students+to+research+throughout+a+biology+curriculum%5BTitle%5D)+AND+%22CourseSource%22%5BJournal%5D)">The pipeline CURE: An iterative approach to introduce all students to research throughout a biology curriculum.</a> CourseSource. 6, (2019).</li>
<li>Lu, F. -M., Eliceiri, K. W., Stewart, J., White, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WormClassroom.org%3A+an+inquiry-rich+educational+web+portal+for+research+resources+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22CBE+Life+Sciences+Education%22%5BJournal%5D)">WormClassroom.org: an inquiry-rich educational web portal for research resources of Caenorhabditis elegans.</a> CBE Life Sciences Education. 6 (2), 98-108 (2007).</li>
<li>Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Transparent+window+into+biology%3A+A+primer+on+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A Transparent window into biology: A primer on Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 200 (2), 387-407 (2015).</li>
<li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+I%3A+yeast%2C+Drosophila+and+C.+elegans.+An+Introduction+to+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE+Science+Education+Database%22%5BJournal%5D)">Biology I: yeast, Drosophila and C. elegans. An Introduction to Caenorhabditis elegans.</a> JoVE Science Education Database. , JoVE. Cambridge, MA. (2022).</li>
<li>JoVE. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Science+Education+Database.+Biology+I%3A+yeast%2C+Drosophila+and+C.+elegans.+C.+elegans+Maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE+Science+Education+Database%22%5BJournal%5D)">Science Education Database. Biology I: yeast, Drosophila and C. elegans. C. elegans Maintenance.</a> JoVE Science Education Database. , JoVE. Cambridge, MA. (2022).</li>
<li>Lee, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Web+resources+for+C.+elegans+studies%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Web resources for C. elegans studies.</a> WormBook. , (2005).</li>
<li>JoVE. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Science+Education+Database.+Biology+I%3A+yeast%2C+Drosophila+and+C.+elegans.+RNAi+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE+Science+Education+Database%22%5BJournal%5D)">Science Education Database. Biology I: yeast, Drosophila and C. elegans. RNAi in C. elegans.</a> JoVE Science Education Database. , JoVE. Cambridge, MA. (2022).</li>
<li>Meneely, P. M., Dahlberg, C. L., Rose, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Working+with+worms%3A+Caenorhabditis+elegans+as+a+model+organism%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+Essential+Laboratory+Techniques%22%5BJournal%5D)">Working with worms: Caenorhabditis elegans as a model organism.</a> Current Protocols Essential Laboratory Techniques. 19 (1), 35(2019).</li>
<li>Lemons, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+inquiry-based+approach+to+study+the+synapse%3A+Student-driven+experiments+using+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Undergraduate+Neuroscience+Education%22%5BJournal%5D)">An inquiry-based approach to study the synapse: Student-driven experiments using C. elegans.</a> Journal of Undergraduate Neuroscience Education. 15 (1), 44-55 (2016).</li>
<li>Kowalski, J. R., Hoops, G. C., Johnson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implementation+of+a+collaborative+series+of+classroom-based+undergraduate+research+experiences+spanning+chemical+biology%2C+biochemistry%2C+and+neurobiology%5BTitle%5D)+AND+%22CBE-Life+Sciences+Education%22%5BJournal%5D)">Implementation of a collaborative series of classroom-based undergraduate research experiences spanning chemical biology, biochemistry, and neurobiology.</a> CBE-Life Sciences Education. 15 (4), 55(2016).</li>
<li>Mordacq, J., Drane, D., Swarat, S., Lo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Research+and+teaching%3A+Development+of+course-based+undergraduate+research+experiences+using+a+design-based+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+College+Science+Teaching%22%5BJournal%5D)">Research and teaching: Development of course-based undergraduate research experiences using a design-based approach.</a> Journal of College Science Teaching. 46 (4), (2017).</li>
<li>Palmisano, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+laboratory+module+that+explores+RNA+interference+and+codon+optimization+through+fluorescence+microscopy+using+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">A laboratory module that explores RNA interference and codon optimization through fluorescence microscopy using Caenorhabditis elegans.</a> bioRxiv. , 344069(2021).</li>
<li>Hillers, K. J., Villeneuve, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+meiotic+recombination+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Meiosis%22%5BJournal%5D)">Analysis of meiotic recombination in Caenorhabditis elegans.</a> Meiosis. 557, 77-97 (2009).</li>
<li>Phillips, C. M., McDonald, K. L., Dernburg, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytological+analysis+of+meiosis+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Meiosis%22%5BJournal%5D)">Cytological analysis of meiosis in Caenorhabditis elegans.</a> Meiosis. 558, 171-195 (2009).</li>
<li>Gervaise, A. L., Arur, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+temporal+analysis+of+active+ERK+in+the+C.+elegans+germline%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Spatial and temporal analysis of active ERK in the C. elegans germline.</a> Journal of Visualized Experiments. (117), e54901(2016).</li>
<li>Shakes, D. C., Miller, D. M., Nonet, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunofluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Immunofluorescence microscopy.</a> Methods in Cell Biology. 107, 35-66 (2012).</li>
<li>Hillers, K. J., Jantsch, V., Martinez-Perez, E., Yanowitz, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Wormbook%22%5BJournal%5D)">Meiosis.</a> Wormbook. , ed. The C. elegans Research Community (2017).</li>
<li>Hunter, A. -B., Seymour, E., Laursen, S., Thiry, H., Melton, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHunter%2C+A-B+%22Undergraduate+Research+in+the+Sciences%3A+Engaging+Students+in+Real+Science%22">Undergraduate Research in the Sciences: Engaging Students in Real Science</a>. , John Wiley & Sons. (2010).</li>
<li>Wei, C. A., Woodin, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Undergraduate+research+experiences+in+biology%3A+Alternatives+to+the+apprenticeship+model%5BTitle%5D)+AND+%22CBE-Life+Sciences+Education%22%5BJournal%5D)">Undergraduate research experiences in biology: Alternatives to the apprenticeship model.</a> CBE-Life Sciences Education. 10 (2), 123-131 (2011).</li>
<li>Elgin, S. C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+from+a+convocation%3A+Integrating+discovery-based+research+into+the+undergraduate+curriculum%5BTitle%5D)+AND+%22CBE-Life+Sciences+Education%22%5BJournal%5D)">Insights from a convocation: Integrating discovery-based research into the undergraduate curriculum.</a> CBE-Life Sciences Education. 15 (2), (2016).</li>
<li>Stiernagle, T. Maintenance of C. Elegant. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStiernagle%2C+T+%22WormBook%22">WormBook</a>. , ed. The C. elegans Research Community (2006).</li>
<li>Jaramillo-Lambert, A., Ellefson, M., Villeneuve, A. M., Engebrecht, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+timing+of+S+phases%2C+X+chromosome+replication%2C+and+meiotic+prophase+in+the+C.+elegans+germ+line%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Differential timing of S phases, X chromosome replication, and meiotic prophase in the C. elegans germ line.</a> Developmental Biology. 308 (1), 206-221 (2007).</li>
<li>Stamper, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+DSB-1%2C+a+protein+required+for+initiation+of+meiotic+recombination+in+Caenorhabditis+elegans%2C+illuminates+a+crossover+assurance+checkpoint%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Identification of DSB-1, a protein required for initiation of meiotic recombination in Caenorhabditis elegans, illuminates a crossover assurance checkpoint.</a> PLoS Genetics. 9 (8), 1003679(2013).</li>
<li>Libuda, D. E., Uzawa, S., Meyer, B. J., Villeneuve, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meiotic+chromosome+structures+constrain+and+respond+to+designation+of+crossover+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Meiotic chromosome structures constrain and respond to designation of crossover sites.</a> Nature. 502 (7473), 703-706 (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów. Wyłączną odpowiedzialność za treść tego manuskryptu ponoszą autorzy. Niekoniecznie reprezentuje oficjalne poglądy National Institutes of Health lub National Science Foundation.

Rozmnażanie płciowe wymaga stworzenia haploidalnych gamet, które są wytwarzane w wyniku wyspecjalizowanego podziału komórkowego mejozy. C. elegans stał się popularnym modelem do cytologicznego badania mejozy ze względu na jego przezroczystość optyczną, wygodną anatomię linii zarodkowej i potężną genetykę28. Proste eksperymenty organizmowe oceniające płodność i śmiertelność zarodków można połączyć z genetyką molekularną, aby odpowiedzieć na wiele pytań w laboratorium lub w klasie. Na przykład, ponieważ krzyżowanie jest niezbędne do prawidłowej segregacji chromosomów, procesy, które zakłócają ich powstawanie lub rozdzielczość, generują gamety aneuploidalne. Z kolei aneuploidia prowadzi do niezdolnego do życia potomstwa, które można łatwo ocenić poprzez liczenie potomstwa lub za pomocą nieco bardziej skomplikowanej metody określania śmiertelności zarodka. Cytologicznie brak krzyżówek wpłynie na liczbę ciał barwiących DAPI obserwowanych podczas diakinezy. Solidność barwienia DAPI i łatwość punktacji sprawiają, że jest to idealny eksperyment do nauki technik cytologicznych. Czasowo-przestrzenny układ jąder w hermafrodytycznej linii zarodkowej zapewnia migawkę każdego etapu mejozy w jednym momencie. Jądra potrzebują około 54 godzin, aby przejść od dystalnego mitotycznego końca linii zarodkowej do bliższego końca (dla przykładów, patrz Jaramillo-Lambert i wsp.33, Stamper i wsp.34 oraz Libuda i wsp.35). Ten dobrze ugruntowany czas postępu mejotycznego pozwala na znakowanie impulsowe lub eksperymenty uszkadzające DNA.
Ponieważ barwienie DAPI prawie zawsze działa, służy jako użyteczna kontrola techniczna dla mikroskopii fluorescencyjnej (i może zapewnić satysfakcję dla szkolących się mikroskopistów). Barwienie przeciwciał może być bardziej zmienne i jest dobrą miarą odtwarzalności między kontrpróbami. Gonady C.elegans mogą być trudne do konsekwentnego naprawiania, ponieważ ten krok wymaga równowagi między zachowaniem struktury chromosomów, a jednocześnie umożliwieniem wystarczającej dyfuzji przeciwciał. Utrwalanie formaldehydem najlepiej zachowuje morfologię chromosomów, a przygotowanie formaldehydu świeżo z ampułek paraformaldehydu zapewniło najbardziej powtarzalne wyniki. Możliwe jest również stosowanie formaldehydu przygotowanego z formaliny (37% wodnego roztworu formaldehydu i metanolu). Dla każdego przeciwciała może być konieczne empiryczne określenie siły i czasu wiązania. Alternatywne metody polegają na pominięciu wiązania formaldehydu w kroku 2.4 i, po krakingu zamrażalnym, zanurzeniu w 100% etanolu w temperaturze -20 °C lub zanurzeniu w 100% metanolu na 10 minut, a następnie zanurzeniu w 100% acetonie na 10 minut w temperaturze -20 °C. Te warunki utrwalenia pozwalają na lepszą penetrację przeciwciał, ale negatywnie wpływają na morfologię tkanek (chromosomy będą wyglądać na wydmuchane i bardziej opuchnięte).
Czas jest bardzo ważny dla sekcji i kroków naprawy opisanych w kroku 2. Ponieważ objętość roztworu preparacyjnego jest tak mała, parowanie może wpływać na końcowe stężenie utrwalenia, co spowoduje zmienne barwienie przeciwciał. Doświadczony treser C. elegans może przygotować szkiełko w mniej niż 2 minuty od rozpoczęcia (krok 2.3) do naprawy (krok 2.4). Główną przeszkodą techniczną jest możliwość wybierania zwierząt do kropli roztworu preparacyjnego i szybkiego ich preparowania. Może być łatwiej nauczyć się analizować w większych ilościach. Nowi stażyści najpierw zaczynają od pobrania zwierząt do 50-200 μl roztworu preparacyjnego w szklanym naczyniu do barwienia zarodków (ryc. 2D); Szersza powierzchnia zapewnia większe pole manewru podczas określania idealnej pozycji igły dla dobrych wytłaczania gonad, a większa objętość cieczy sprawia, że parowanie jest mniejszym problemem. Gdy już oswoiają się z ruchami preparacyjnymi, stażyści rozpoczynają preparację, używając tylko 50 μl w naczyniu, a następnie przechodzą do sekcji w 20 μl na szkiełku. Po przeprowadzeniu analizy na szkiełkach kursanci mogą szybko zacząć zmniejszać ilość roztworu, aż do momentu, gdy będą wystarczająco szybcy w pracy w 4 μl, aby parowanie było znikome. 
Jeśli czas przeprowadzenia sekcji pozostaje problemem, uczestnicy szkolenia mogą przeprowadzić sekcję w 8 μl roztworu preparacyjnego podczas kroku 2.3. Następnie, w kroku 2.4, mogą dodać 8 μl roztworu utrwalającego, delikatnie pipetując w celu dokładnego wymieszania (uważnie obserwując, aby tusze nie zostały zakłócone lub odpipetowane) i usuwając 8 μl z wymieszanego roztworu. To alternatywne podejście doprowadzi do uzyskania tej samej końcowej objętości 8 μl i tego samego końcowego stężenia wiązanego; Objętość ta jest istotna dla zapewnienia, że tusze stykają się zarówno ze szkiełkiem nakrywkowym, jak i z powierzchnią ślizgu podczas pękania zamrażającego w kroku 2.5. Jeśli czas przygotowania każdego preparatu pozostaje problemem nawet w przypadku większych objętości sekcji, metoda zawiesiny w protokole immunofluorescencji linii zarodkowej została opisana przez Gervaise'a i Arura26.
Głównym ograniczeniem stosowania immunofluorescencji do wizualizacji białek in situ jest dostępność pierwszorzędowych przeciwciał ukierunkowanych na określone białko będące przedmiotem zainteresowania. Jeśli jednak zmodyfikowano znakowaną wersję białka, protokół ten można dostosować do wizualizacji znacznika białkowego. Powszechnie dostępne są przeciwciała skierowane przeciwko popularnym znacznikom, takim jak FLAG, HA lub GFP. Znaczniki fluorescencyjne, takie jak GFP, mogą być często wygaszane przez etapy fiksacji, dlatego zaleca się stosowanie pierwszorzędowego przeciwciała ukierunkowanego na GFP, zamiast polegania na samym natywnym sygnale fluorescencyjnym. Innym ograniczeniem tego protokołu jest to, że przechwytuje on linię zarodkową w ciągu jednego czasu (chociaż wszystkie etapy oogenezy będą reprezentowane w linii zarodkowej). Dlatego ta technika może pominąć dynamiczne zmiany, które mogą wystąpić w miarę postępu oocytu w procesie oogenezy. Jednak czas gametogenezy został dobrze zbadany u C. elegans; U młodego dorosłego osobnika typu dzikiego oocyt potrzebuje około 60 godzin, aby przejść od dystalnego końca linii zarodkowej (strefy mitotycznej) do diakinezy33. Dlatego pogoń za pulsem lub specyficzna interwencja, taka jak napromienianie, po którym następuje przebieg w czasie, pozwoliłaby na obserwację efektów na różnych etapach mejozy.
Podsumowując, protokół ten opisuje rozwarstwienie gonad C. elegans , a następnie barwienie DAPI i przeciwciał do mikroskopii fluorescencyjnej. Wypreparowanie i utrwalenie (krok 2) trwa 60-90 minut, w zależności od liczby wygenerowanych preparatów. Barwienie przeciwciał (krok 3) odbywa się głównie bez użycia rąk i może trwać od 7 godzin do 1,5 dnia, w zależności od czasu inkubacji przeciwciał. Montaż (kroki 4.1-4.7) trwa około 15 minut. To ogólne podejście do wizualizacji chromosomów linii zarodkowej i gonady może być wykorzystane do badań cytologicznych dowolnego białka, jeśli istnieje przeciwciało lub odczynnik znacznika fluorescencyjnego. W najprostszej formie barwienie DAPI jąder diakinezy może być stosowane do badań przesiewowych pod kątem czynników wpływających na rekombinację mejotyczną. W połączeniu z analizami organizmów dotyczącymi liczby potomstwa, częstości występowania samców (fenotyp Him) i śmiertelności zarodka, to podejście cytologiczne stanowi jednokomórkowy kontrapunkt dla analiz populacyjnych.

Mejoza to wyspecjalizowany podział komórek używany do tworzenia gamet (jaj i plemników/pyłku) we wszystkich organizmach rozmnażających się płciowo1,2. Rekombinacja krzyżowa to wzajemna wymiana DNA między chromosomami homologicznymi; Jest niezbędna dla mejozy, zarówno stanowiąc ważne źródło różnorodności genetycznej, jak i promując stabilność genomu przez pokolenia. Chromosomy, które nie utworzą co najmniej jednego skrzyżowania podczas mejozy, będą segregować losowo, co może skutkować brakiem dysjunkcji chromosomów, tworząc gamety o nieprawidłowej liczbie chromosomów – stan, który zwykle jest śmiertelny dla powstałego potomstwa3. Podczas mejozy krzyżowanie się jest indukowane przez zaprogramowane dwuniciowe pęknięcia DNA4. Podzbiór tych pęknięć zostanie naprawiony jako skrzyżowania, które zapewniają fizyczne połączenia DNA, zwane chiasmata, które pomagają orientować chromosomy homologiczne w przygotowaniu do podziału komórki5. Stadia mejotyczne są wysoce konserwatywne u wszystkich eukariontów, a ich konformacja chromosomalna pozwala na ich łatwą identyfikację.
Jako podstawowe pojęcie w biologii, mejoza jest tematem, z którym studenci spotykają się wiele razy na różnych kursach biologii. Często są wprowadzani w mechanikę segregacji chromosomów mejotycznych w szkole średniej, podczas gdy kursy na poziomie college'u koncentrują się na biologii komórki segregacji i genetycznym wpływie rekombinacji krzyżowej. Jednak mejoza jest bardzo trudnym pojęciem dla wielu studentów1. Niezrozumienie związku między genami, DNA, chromosomami i mejozą może generować błędne przekonania uczniów i luki w zrozumieniu, które utrudniają pełne zrozumienie dziedziczenia genetycznego6,7. Jednym ze sposobów na poprawę zrozumienia przez uczniów abstrakcyjnych tematów jest zapewnienie konkretnych, praktycznych zajęć. Na przykład, ucząc mejozy, instruktorzy mogą wybierać spośród ćwiczeń, które emulują analizę molekularną8, modeli 3D, które pozwalają uczniom manipulować cząsteczkami9, lub odgrywania ról, w których uczniowie sami odgrywają choreografię molekularną1. Włączenie badań o nieznanych wynikach jest szczególnie skutecznym sposobem na poprawę zrozumienia przez uczniów. Praktyka ta jest znana jako doświadczenie badawcze na studiach licencjackich (CURE) i ma dodatkową zaletę w postaci wzmocnienia postaw i sprawczości studentów, szczególnie w przypadku osób należących do grup, które pozostają niedostatecznie reprezentowane w klasie STEM<sup="xref">10,11. Nicienie Caenorhabditis elegans są szczególnie podatne na badania nad zachowaniem, płodnością i krzyżówkami genetycznymi w klasie, a także są skutecznym modelem wprowadzającym uczniów do badań biologicznych12.
C. elegans tworzy potężny organizm modelowy dla biologii komórki, łącząc genetykę molekularną z prostą analizą cytologiczną. Szczególnie dobrze nadaje się również do użytku w klasie biologicznej 13,14,15. Są łatwe i ekonomiczne w utrzymaniu w laboratorium, produkując setki potomstwa co 3 dni, zarówno w standardowej temperaturze pokojowej, jak i w 20 °C, najczęstszej temperaturze inkubacji. Co ważne, można je zamrozić w postaci zapasu glicerolu i przechowywać w zamrażarce o temperaturze -80 °C, co oznacza, że wszelkie błędy hodowlane popełnione przez początkujących badaczy można łatwo poprawić16. Co więcej, jego dobrze opisany genom pozwala na stosowanie technik genetycznych do przodu i do tyłu17,18, co pozwala na wykorzystanie C. elegans do rozwiązywania problemów biologicznych, od molekularnych po ewolucyjne. Wreszcie, badacze C. elegans stworzyli wspierającą społeczność, która często jest chętna do udzielania pomocy i porad początkującym naukowcom19. Te zalety doprowadziły do tego, że C. elegans został włączony do wielu CUREs w różnych typach instytucji12,19,20,21,22,23.
Oprócz korzyści dla badań i nauczania, C. elegans stał się popularnym modelem do badań nad mejozą i rozwojem linii zarodkowej24,25,26. Przejrzystość optyczna tych zwierząt upraszcza podejścia cytologiczne27, a u dorosłych gonady stanowią prawie połowę zwierzęcia, dostarczając setki komórek mejotycznych do badania. W gonadach jądra mejotycznej linii zarodkowej są ułożone jak linia montażowa (<silna klasa="xfig">Ryc. 1); Replikacja mitotyczna zachodzi na dystalnym końcu gonady, a jądra przechodzą przez etapy mejotyczne, migrując w kierunku bliższego końca gonady, gdzie zapłodnione zarodki wyłaniają się ze sromu. Ponieważ stereotypowa organizacja przestrzenna reprezentuje również postęp czasowy poprzez mejozę, różne etapy można łatwo zidentyfikować na podstawie ich organizacji chromosomalnej i lokalizacji w gonadzie. Wreszcie, procesy, które zaburzają mejozę i powodują aneuploidię, tworzą fenotypy, które są łatwe do scharakteryzowania, nawet dla nowicjuszy: bezpłodność, śmiertelność embrionalna lub wysoka częstość występowania samców (fenotyp Him)28.
To jest prosty protokół do wizualizacji chromosomów mejotycznych u C. elegans. Montaż, rozwarstwienie, utrwalanie i barwienie przeciwciał są wykonywane na tym samym szkiełku mikroskopowym, co upraszcza protokół i umożliwia niemal idealne odzyskanie próbki. Ta metoda działa w przypadku prostego barwienia DAPI w celu wizualizacji chromosomów i może być stosowana do immunofluorescencji w celu wizualizacji lokalizacji białek w gonadzie. Studenci analizują gonady za pomocą podstawowych mikroskopów preparacyjnych, generują preparaty do wizualizacji DNA lub immunofluorescencji w całości i obrazują je na złożonym mikroskopie fluorescencyjnym. Protokół ten został nauczony uczniom szkół średnich i studentom pracującym w laboratorium badawczym C. elegans i włączony do CURE w college'u sztuk wyzwolonych12. Chociaż CURE miał stosunkowo małą liczebność klas, protokół ten byłby dostępny dla zajęć w wielu instytucjach ze względu na stosunkowo niski koszt szczepów robaków i odczynników. Instruktorzy byliby ograniczeni jedynie liczbą dostępnych do użytku mikroskopów preparacyjnych. Poprzednie wdrożenie polegało na tym, że studenci pracowali w trzyosobowych grupach, aby dzielić się jednym mikroskopem i odbyło się w ciągu trzech 90-minutowych sesji: pierwsza polegała na ćwiczeniu sekcji, druga na implementacji sekcji i barwienia DAPI, a trzecia polegała na obrazowaniu preparatów pod szerokokątnym mikroskopem fluorescencyjnym. Udział w badaniach licencjackich przynosi studentom wiele korzyści11,29, zarówno akademickich, jak i osobistych. Osadzenie badań w kursach za pośrednictwem CURE pozwala studentom uczestniczyć w badaniach w normalnych godzinach zajęć11,30,31, co sprawia, że dostęp do tych korzyści jest bardziej dostępny i sprawiedliwy.

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit IgG Wtórne sondy</td><td>molekularne</td> przeciwciał <td>711-545-152</td><td></td></tr><tr><td>Aluminiowy blok grzewczo-chłodzący</td><td>Millipore Sigma</td><td>Z743497</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Peptone</td><td>Gibco</td><td>DF0118 17 0</td><td></td></tr><tr><td>Pipety Pasteura ze szkła borokrzemianowego, jednorazowe, 5,75 cala</td><td>Fisherbrand</td><td>13 678 20B</td><td>Służy do produkcji kilofów do robaków</td></tr><tr><td>BSA, Surowica bydlęca Albumina</td><td>VWR</td><td>97061 420</td><td></td></tr><tr><td>C. elegans typ dziki (przodek)</td><td>Caenorhabditis Centrum Genetyki</td><td>N2 (przodkowie)</td><td></td></tr><tr><td>C. elegans kle-2 (ok1151) mutanty</td><td>Caenorhabditis Centrum Genetyki</td><td>VC768</td><td>Pełny genotyp tego szczepu to: kle-2(ok1151) III/hT2 [bli-4(e937) let-?( q782) qIs48] (I;III). Ma kle-2 zrównoważony z chromosomem równoważącym oznaczonym falowym GFP. Wybierz zwierzęta inne niż zielone, aby zidentyfikować homozygotyczne mutanty kle-2.</td></tr><tr><td>C. elegans spo-11 (ME44) mutanty</td><td>Caenorhabditis Centrum Genetyki</td><td>TY4342</td><td>Pełny genotyp tego szczepu to: spo-11(me44)&nbsp; IV / nT1[qIs51] (IV:V). Ma spo-11 zrównoważony chromosomem równoważącym oznaczonym pharangeal GFP. Wybierz zwierzęta inne niż zielone, aby zidentyfikować homozygotyczne mutanty spo-11.</td></tr><tr><td>Chlorek wapnia bezwodny</td><td>VWR</td><td>97062 590</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>501848300</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Life Technologies</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>EDTA, Sól disodowa dwuwodna</td><td>Apex Bioresearch Products</td><td>20 147</td><td></td></tr><tr><td>Naczynie na zarodki, szkło, wnęka 30 mm</td><td>Usługi mikroskopii elektronowej</td><td>100492-980</td><td>Używany do ćwiczenia sekcji; Szkło jest preferowane, ponieważ wypreparowane zwierzęta mogą przyklejać się do plastiku</td></tr><tr><td>Escherichia coli</td><td>Caenorhabditis Centrum Genetyki</td><td>OP50</td><td></td>Pojemnik</tr> do <tr><td>przechowywania żywności, plastikowy</td><td>różne</td><td>nie dotyczy</td><td>Plastikowe pojemniki z (1) stosunkowo płaskim dnem, aby umożliwić zjeżdżalnie spoczynek na poziomie; (2) preferowane są pokrywki, które są szczelne, ale nadal można je łatwo zdjąć bez naruszania zawartości pojemnika, oraz (3) mają około 9 cali długości i 6 cali szerokości</td></tr><tr><td>Szklany słoik Coplin</td><td>DWK Nauki przyrodnicze&nbsp; Wheaton</td><td>08-813E</td><td></td></tr><tr><td>Bariera hydrofobowa PAP Pen</td><td>ImmEdge</td><td>NC9545623</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimtech Science</td><td>06 666A</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek lewamizolu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L0380000</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan magnezu bezwodny</td><td>Fisher Chemical</td><td>M65 500</td><td></td></tr><tr><td>Igły, jednorazowe, 25 G</td><td>BD PrecisionGlide</td><td>14 821 13D</td><td>niebieski, 1-calowy</td></tr><tr><td>agar NGM, granulowany</td><td>Apex Bioresearch Products</td><td>20 249NGM</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis</td><td>16 101</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd (16% w/v) Wodny roztwór</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>50 980 487</td><td></td></tr><tr><td>PBS, sól fizjologiczna buforowana fosforanami (10x roztwór)</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP399500</td><td></td></tr><tr><td>szalki Petriego, 60 mm</td><td>Tritech Research</td><td>NC9321999</td> Drut platynowy bez <td>wentylacji, z ostrą krawędzią</td></tr><tr><td>(90% platyna, 10% iryd)</td><td>Tritech Research</td><td>PT 9010</td><td>Służy do produkcji kilofów do robaków</td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Fisher</td><td>BP366-500</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan potasu dwuzasadowy</td><td>VWR BDH Chemicals</td><td>BDH9266 500G</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan potasu jednozasadowy</td><td>VWR BDH Chemicals</td><td>BDH9268 500G</td><td></td></tr><tr><td>Okulary korekcyjne premium 18 mm x 18 mm</td><td>Fisherbrand</td><td>12-548-AP</td><td>0,13&ndash; Żyletki o grubości 0,17 mm</td></tr><tr><td>, jednokrawędziowe</td><td>Sondy</td> molekularne VWR <td>55411 055</td><td></td></tr><tr><td>SlowFade Gold Antifade Mountant</td><td></td><td>S36937</td><td>Alternatywy: VectaShield Antifade Mounting Medium (Vector Laboratories, H-1000-10) lub ProLong Diamond Antifade (Thermo Fisher Scientific, P36970). W przypadku stosowania ProLong Diamond do uszczelnienia nie jest wymagany lakier do paznokci, ale szkiełka muszą utwardzać się przez 24 godziny przed obrazowaniem.</td></tr><tr><td>Odczynniki biologiczne azydku sodu</td><td>Fisher</td><td>BP922I 500</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Fisher Chemical</td><td>S271 500</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan sodu dwuzasadowy</td><td>bezwodny Sigma Aldrich</td><td>7558 79 4</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan sodu dwuzasadowy siedmiowodny</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9390</td><td></td></tr><tr><td>Pudełko styropianowe</td><td>różne</td><td>n/a</td><td>Przybliżone wymiary wnętrza: 12 cali długości, 9 cali szerokości, 8 cali głębokości</td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe Superfrost Plus</td><td>Fisherbrand</td><td>22 037 246</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP151 500</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>Apex Bioresearch Products</td><td>20 251</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fisher Chemical</td><td>BP337 500</td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt drożdżowy</td><td>Apex Produkty badań biologicznych</td><td>20 254</td><td></td></tr></tbody></table>

c. elegans (c. elegans) rozwarstwienie gonad i pęknięcie zamrażające do barwienia immunofluorescencyjnego i dapi

C. elegans Gonad Dissection and Freeze Crack for Immunofluorescence and DAPI Staining

Linia zarodkowa C. elegans stanowi doskonały model do badania mejozy, częściowo ze względu na łatwość przeprowadzania analiz cytologicznych na wypreparowanych zwierzętach. Preparaty całych wierzchowców zachowują strukturę jąder mejotycznych, a co ważne, każde ramię gonady zawiera wszystkie etapy mejozy, zorganizowane w progresję czasowo-przestrzenną, która ułatwia identyfikację jąder na różnych etapach. Dorosłe hermafrodyty mają dwa ramiona gonad, z których każde jest zorganizowane jako zamknięta rurka z proliferującymi komórkami macierzystymi linii rozrodczej na dystalnym zamkniętym końcu i komórkowymi oocytami na bliższym otwartym końcu, które łączą się w środku macicy. Rozwarstwienie uwalnia jedno lub oba ramiona gonady z jamy ciała, umożliwiając wizualizację całej mejozy. W tym miejscu przedstawiono powszechny protokół immunofluorescencji przeciwko białku będącemu przedmiotem zainteresowania, a następnie barwienie DAPI w celu oznaczenia wszystkich chromosomów. Młodzi dorośli są unieruchamiani w lewamizolu i szybko wycinani za pomocą dwóch igieł strzykawkowych. Po wytłoczeniu linii zarodkowej próbka jest utrwalana przed poddaniem jej pękaniu zamrażającemu w ciekłym azocie, co pomaga w przepuszczalności naskórka i innych tkanek. Próbkę można następnie odwodnić w etanolu, ponownie uwodnić i inkubować z przeciwciałami pierwszorzędowymi i drugorzędowymi. DAPI jest dodawany do próbki w podłożu montażowym, co umożliwia wiarygodną wizualizację DNA i ułatwia znalezienie zwierząt do zobrazowania pod mikroskopem fluorescencyjnym. Technika ta jest chętnie stosowana przez osoby zaznajomione z obchodzeniem się z C. elegans po kilku godzinach spędzonych na ćwiczeniu samej metody sekcji. Protokół ten został nauczony uczniom szkół średnich i studentom pracującym w laboratorium badawczym i włączony do opartego na kursie doświadczenia badawczego na studiach licencjackich w college'u sztuk wyzwolonych.

DAPI silnie wiąże się z DNA, a jego barwienie jest stabilne nawet w szerokim zakresie warunków (Ryc. 3A,B). Powinien on być obecny we wszystkich jądrach komórkowych, dzięki czemu stanowi skuteczną kontrolę pozytywną obecności jakiejkolwiek tkanki nicienia na szkiełku oraz zdolności mikroskopu do detekcji fluorescencji. Barwienie jest skuteczne, gdy przeciwciało znajduje się w jądrach meiotycznych (Ryc. 3A,B). Na przykład Ryc. 3A,B przedstawia jądra w fazie środkowej pachytenu, zabarwione DAPI oraz przeciwciałem skierowanym przeciwko RAD-51, który jest markerem pęknięć dwuniciowych. KLE-2 jest komponentem kondensyny, wysoce konserwatywnego kompleksu białkowego, który strukturyzuje chromosomy w przygotowaniu do mitozy i mejozy. Mutanty kle-2/+ wykazują niewielkie defekty w strukturze chromosomów, co objawia się lekko zaburzonym barwieniem DAPI oraz zwiększoną liczbą pęknięć dwuniciowych, odzwierciedloną w większej liczbie ognisk RAD-51 (Ryc. 3B). Częstym błędem w immunofluorescencji jest zbyt długie pozostawienie próbki w roztworze utrwalającym. Nadmierne utrwalenie może prowadzić do niepowodzenia barwienia, ponieważ zazwyczaj uniemożliwia ono dyfuzję przeciwciał do jąder komórkowych. Błąd ten można zidentyfikować, gdy przeciwciało jest rozproszone w obszarach cytoplazmatycznych gonady, ale wydaje się być wykluczone z jąder.
W linii zarodkowej (Rycina 1) jądra proliferują mitotycznie w dystalnej części, wchodzą w mejozę w strefie przejściowej i przechodzą przez pachiten (który często dzieli się na trzy równe stadia na podstawie liczby rzędów jąder), zanim wejdą w diploten, a ostatecznie w diakinezę. Oocyty w stadium diakinezy są numerowane w zależności od ich bliskości względem spermateki, przy czym oocyt -1 znajduje się najbliżej spermateki, oocyt -2 jest kolejnym w kierunku dystalnym i tak dalej. C. elegans posiada sześć chromosomów, które w jądrach w stadium diakinezy przejawiają się jako zwarte owale. Każdy z nich reprezentuje parę homologicznych chromatyd siostrzanych połączonych chiasmą, co nazywa się bivalentem (Rycina 3C). Mutanty, takie jak spo-11, u których zaburzona jest formacja crossing-over, nie tworzą chiasmat; w związku z tym jądra w stadium diakinezy będą posiadały 12 oddzielnych ciał DAPI (zwanych również univalentami), po jednym dla każdej chromatydy siostrzanej (Rycina 3D).
<img alt="Gonada C. elegans, stadia cyklu komórkowego, mikroskopia fluorescencyjna, strefa mitotyczna, pachitena, diakineza." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64204/64204fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Jądra linii zarodkowej są rozmieszczone w sposób przestrzenno-czasowy, co odzwierciedla ich progresję przez mejozę. (A) Cały preparat młodego dorosłego hermafrodyty barwiony DAPI. Zaznaczono gonadę i stadia mejozy, od dystalnego końca (gwiazdka) do regionu proksymalnego (oocyt -1, zaznaczony strzałką), który zawiera spermatekę (trójkąt). Pasek skali reprezentuje 100 µm. (B) Projekcyjny obraz fluorescencyjny wypreparowanej gonady hermafrodyty barwionej DAPI. Oznaczono stadia mejozy, a reprezentatywne jądra przedstawiono na wstawkach (wszystkie wstawki zachowują tę samą skalę względem siebie). Stadia jąder można łatwo określić na podstawie ich lokalizacji w linii zarodkowej oraz charakterystycznej morfologii chromosomów, postępując od strefy mitotycznej przy dystalnym końcu (gwiazdka), przez strefę przejścia, pachitenę, diplotenę i diakinezę. Spermateka jest zaznaczona trójkątem. Rysunek został opracowany na podstawie pracy Hillers et al. na licencji CC BY 3.028. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64204/64204fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Metoda sekcji nicieni, schemat wyciągania gonad, wyniki mikroskopowe, procedura laboratoryjna." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64204/64204fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Prezentacja konfiguracji do sekcji. (A) Przedmiotowy stolik mikroskopu podczas sekcji. Zwierzęta są sekcjonowane w 4 µL roztworu do sekcji na szkiełku nakrywowym umieszczonym na szkiełku nośnym, które służy do przesuwania szkiełka nakrywowego w pole widzenia. Schemat przedstawia optymalne rozmieszczenie igieł. Igły trzyma się ściętą krawędzią skierowaną w dół, skrzyżowane nad regionem gardzieli. Różowe strzałki obrazują ruch igieł przypominający pracę nożyczek. Różowa przerywana linia wskazuje optymalne miejsce cięcia. (B) Zdjęcia sekcjonowanych zwierząt, z przykładem pełnego oraz niepełnego wyciągnięcia tkanek. Oznaczono fragmenty wyciągniętych gonad i jelit. (C) Zdjęcie demonstrujące etap zamrażania i pękania (freeze-crack). Szkiełko należy trzymać mocno w jednej ręce, stroną z szkiełkiem nakrywowym skierowaną od ciała. Przeciwna krawędź jest oparta o blat. Żyletkę należy trzymać w drugiej ręce. Różowa strzałka wskazuje kierunek ruchu żyletki, aby odrzucić szkiełko nakrywową ze szkiełka przedmiotowego, z lekkim obrotem, tak aby szkiełko nakrywową odskoczyło od ciała. Należy zauważyć, że szkiełko nakrywową zostało umieszczone tak, aby jeden z jego narożników wystawał poza długą krawędź szkiełka przedmiotowego. (D) Zdjęcie konfiguracji do ćwiczeń z sekcji w szklanej szalce do barwienia embrionów. Zwierzęta umieszcza się w 50-200 µL roztworu do sekcji, co eliminuje problem parowania i wydłuża czas sekcji. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64204/64204fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Obraz mikroskopowy struktur chromosomowych z barwieniem DAPI i RAD-51; typ dziki vs. mutanty." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64204/64204fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Reprezentatywne wyniki fluorescencji jąder linii zarodkowej. (A,B) Projekcje Z-stack jąder w późnym pachytenie barwionych przeciwciałem RAD-51 (zielony) i DAPI (czerwony) u (A) typu dzikiego oraz (B) heterozygot kle-2/+. (C,D) Projekcje Z-stack pojedynczego jądra w diakinezie barwionego DAPI u (C) typu dzikiego (z sześcioma ciałami barwionymi DAPI) i (D) mutantów spo-11 (z 12 ciałami barwionymi DAPI). Paski skali reprezentują 5 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64204/64204fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

To jest powszechnie stosowana metoda do sekcji gonad C. elegans, po której następuje pęknięcie zamrażające, która wytwarza próbki linii zarodkowej do immunofluorescencji poprzez barwienie przeciwciał, lub do prostego barwienia DAPI w celu wizualizacji DNA. Protokół ten okazał się skuteczny w przypadku studentów studiów licencjackich w laboratorium badawczym i w ramach badań licencjackich opartych na kursach.

C. elegans (C. elegans) Rozwarstwienie gonad i pęknięcie zamrażające do barwienia immunofluorescencyjnego i DAPI

The C. elegans germline makes an excellent model for studying meiosis, in part due to the ease of conducting cytological analyses on dissected animals. ...

Ta metoda preparacji i immunofluorescencji jest stosowana przez wiele laboratoriów C.elegans. Może być stosowany do wykrywania dowolnego białka, dla którego dostępne jest przeciwciało lub znakowane białko fuzyjne. Chociaż wymaga to pewnej praktyki, aby prawidłowo przeprowadzić tę sekcję, ten protokół jest elastyczny i łatwy do rozwiązania.Dla nas barwienie DAPI zawsze działa i zwykle możemy znaleźć warunek, który działa na każde przeciwciało. Największym wyzwaniem dla tej techniki jest etap sekcji. Musisz pracować szybko, ale pewnie, aby uzyskać dobre ekstruzje linii zarodkowej.Praktyka jest kluczowa. Aby rozpocząć, umieść szkiełko przytrzymujące na stoliku mikroskopu preparacyjnego i umieść szkiełko nakrywkowe na szkiełku przytrzymującym. Następnie odpipetuj cztery mikrolitry roztworu preparacyjnego do środka szkiełka nakrywkowego i przesuń szkiełko przytrzymujące na jedną stronę stolika, aby zwolnić widok.Zbierz od 10 do 20 hermafrodytów z płytki NGM do kropli roztworu preparacyjnego. Najlepiej wybrać około 10 na szkiełko, ale nie na tyle, aby nie można było ich wyciąć w ciągu pięciu minut. Aby wypreparować zwierzęta, skrzyżuj końcówki igieł, aby uzyskać kształt X i użyj dolnej części X, aby przygwoździć dorosłego człowieka do powierzchni szkiełka nakrywkowego.Następnie umieść kształt litery X bezpośrednio za gardłem, około jednej piątej długości ciała młodego dorosłego lub tuż poniżej przezroczystej części głowy. Następnie odetnij zwierzę jednym ruchem nożycowym, całkowicie uwalniając się z jamy ciała wraz z jedną lub obiema połówkami jelita. Aby utrwalić próbkę formaldehydem, należy odpipetować cztery mikrolitry roztworu utrwalającego na szkiełku nakrywkowym, bardzo blisko kropli w przypadku zwierząt, unikając pipetowania bezpośrednio do kropli rozwarstwiającej i przemieszczania wypreparowanych tusz.Przypnij szkiełko nakrywkowe do szkiełka przytrzymującego jednym palcem. Drugą ręką delikatnie strzepnij kilka razy szkiełko nakrywkowe, aby wymieszać krople. Trzymając dodatnio naładowany szkiełko przodem do dołu, użyj go, aby podnieść szkiełko nakrywkowe na środku szkiełka, delikatnie dotykając kropli próbki, a napięcie powierzchniowe kropli podniesie szkiełko nakrywkowe.Ustaw szkiełko na ławce i zamocuj dokładnie przez pięć minut w temperaturze pokojowej. W tym czasie oznacz slajd ołówkiem. Aby zamrozić, rozbij próbkę za pomocą ciekłego azotu, przytrzymując oznaczoną krawędź szkiełka pęsetą, delikatnie zanurz ją w ciekłym azocie.Zwolnij szkiełko w taki sposób, aby opierało się o bok zlewki szkiełkiem nakrywkowym do góry, a szkiełka zostaną zamrożone w ciągu 10 sekund. W przypadku używania suchego lodu do zamrażania, po zeskrobaniu szronu z powierzchni aluminiowego bloku za pomocą brzytwy, mocno chwyć oznaczoną krawędź szkiełka i połóż ją na oczyszczonej powierzchni, wywierając lekki nacisk w dół, aby zapewnić pełny kontakt z blokiem. Zamrożenie następuje w ciągu 10 sekund, gdy próbka pod szkiełkiem nakrywkowym zamienia się w lód.Usuń zamrożoną prowadnicę, mocno chwytając krótszą krawędź prowadnicy oznaczoną etykietą i przymocuj jedną długą krawędź do stołu. Drugą ręką mocno chwyć maszynkę do golenia i przesuń krawędź brzytwy w dół szkiełka, aby strzepnąć szkiełko nakrywkowe i odsunąć je od próbki. Natychmiast umieść szkiełko w słoiku Coplin zawierającym 95% etanolu i pozostaw szkiełka w etanolu na co najmniej pięć minut.Następnie umyj szkiełka w PBST trzy razy przez pięć minut w temperaturze pokojowej, używając świeżego PBST do każdego prania. Wyniki obrazowania fluorescencyjnego jąder linii zarodkowej wykazały, że DAPI silnie wiąże się z DNA. Barwienie immunofluorescencyjne było skuteczne, gdy przeciwciało skierowane przeciwko RAD-51, markerowi pęknięć dwuniciowych, było obecne jako dyskretne ogniska w jądrach miotycznych, kolokalizowane na chromosomach oznaczonych DAPI.Mutanty heterozygot kle-2 mają niewielkie defekty w budowie chromosomów, o czym świadczy nieznacznie nieuporządkowane barwienie DAPI i wzrost liczby pęknięć dwuniciowych, co znajduje odzwierciedlenie w większej liczbie ognisk RAD-51. Zarówno etapy preparacji, jak i zamrażania pękania mogą być trudne, dlatego ważne jest, aby pracować szybko i płynnie. Zalecamy przećwiczenie tych kroków przed przystąpieniem do całego protokołu.Na przykład możesz ćwiczyć preparowanie większej objętości płynu, na przykład 200 mikrolitrów, i stopniowo zmniejszać się do zalecanej objętości czterech mikrolitrów na szkiełku nakrywkowym. Technika ta może być stosowana do obrazowania w wysokiej rozdzielczości na mikroskopie konfokalnym lub strukturalnym lub może być stosowana w połączeniu z DNA lub RNA-FISH, fluorescencyjna hybrydyzacja in situ, w celu wizualizacji, w jaki sposób białka lokalizują się w odniesieniu do określonych sekwencji.

c-elegans-gonad-dissection-freeze-crack-for-immunofluorescence-dapi

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Ten film opisuje freeze-cracking, metodę umożliwiającą barwienie tkanek C. elegans do barwienia przeciwciałami poprzez naruszanie naskórka.

Kraking zamrażalny nicieni: metoda wystawiania wewnętrznych tkanek robaków do barwienia

Ten film opisuje metodę preparowania gonad od dorosłych hermafrodytów C. elegans, w wyniku czego powstają tkanki odpowiednie do barwienia immunologicznego i obrazowania fluorescencyjnego.

C. elegans (C. elegans) Wytłaczanie gonad: technika szybkiej sekcji

Tutaj opisujemy technikę używaną do wizualizacji genomowego DNA u stałych, nienaruszonych nicieni. Film zawiera przykładowy protokół liczenia chromatyny w niezapłodnionych oocytach C. elegans.

Utrwalanie etanolu i barwienie DAPI: metoda wizualizacji DNA u C. elegans

"Freeze-cracking", metoda wystawiania wewnętrznych tkanek nicienia C. elegans na działanie przeciwciał w celu lokalizacji białek.

Barwienie przeciwciał u C. elegans za pomocą "krakingu zamrażalnego"

Metody izolowania i przygotowywania próbek jąder Drosophila (żywych i stałych) do obrazowania za pomocą mikroskopii kontrastu fazowego i fluorescencji są opisane tutaj.

Cytologiczna analiza spermatogenezy: żywe i utrwalone preparaty jąder Drosophila

Ten protokół opisuje, jak obrazować dzielące się komórki w tkance w zarodkach Caenorhabditis elegans. Podczas gdy kilka protokołów opisuje, jak obrazować podział komórek we wczesnym zarodku, ten protokół opisuje, jak obrazować podział komórek w rozwijającej się tkance podczas środkowej późnej embriogenezy.

Wizualizacja cytokinezy neuroblastów podczas embriogenezy C. elegans

Barwienie immunologiczne jest skuteczną techniką wizualizacji określonych typów komórek i białek w tkankach. Wykorzystując sonikację, opisany tutaj protokół łagodzi potrzebę preparowania tkanek Drosophila melanogaster z zarodków i larw w późnym stadium przed barwieniem immunologicznym. Zapewniamy skuteczną metodologię barwienia immunologicznego całych larw utrwalonych formaldehydem.

Wspomagane sonikacją barwienie immunofluorescencyjne tkanek drobnoustrojowych i larwalnych drobnoustrojowych i larwalnych Drosophila in situ

Prezentujemy metodę obrazowania immunofluorescencyjnego opartą na przestrzennej i czasowej lokalizacji aktywnego ERK w wypreparowanej gonadzie C. elegans. Opisany tutaj protokół może być dostosowany do wizualizacji dowolnego białka sygnalizacyjnego lub strukturalnego w gonadzie C. elegans, pod warunkiem, że dostępny jest odpowiedni odczynnik przeciwciała.

Analiza przestrzenna i czasowa aktywnego ERK w linii rozrodczej C. elegans

Przezroczyste jelito C. elegans może służyć jako "komora tkankowa in vivo" do badania biogenezy błony wierzchołkowej i światła na poziomie pojedynczej komórki i subkomórkowej podczas tubulingenezy wielokomórkowej. Protokół ten opisuje, w jaki sposób połączyć standardowe znakowanie, genetykę utraty funkcji/RNAi i podejścia mikroskopowe w celu przeanalizowania tych procesów na poziomie molekularnym.

Jelito C. elegans jako model morfogenezy światła międzykomórkowego i biogenezy błony spolaryzowanej in vivo na poziomie pojedynczej komórki: znakowanie przez barwienie przeciwciałami, analiza utraty funkcji RNAi i obrazowanie

Tutaj udostępniamy protokół sekcji wymagany do zobrazowania na żywo późnej embrionalnej męskiej gonady Drosophila. Protokół ten pozwoli na obserwację dynamicznych procesów komórkowych w normalnych warunkach lub po manipulacji transgenicznej lub farmakologicznej.

Sekcja i obrazowanie na żywo późnej embrionalnej gonady Drosophila

Mikroskopia superrozdzielcza może dostarczyć szczegółowych informacji na temat organizacji komponentów w kompleksie synaptonemalnym w mejozie. Tutaj demonstrujemy protokół rozwiązywania poszczególnych białek kompleksu synaptonemalnego Caenorhabditis elegans.

Mikroskopia superrozdzielcza kompleksu synaptonemalnego w obrębie linii zarodkowej Caenorhabditis elegans

Naucz się rozwarstwiania gonad i pęknięcia zamrażającego C. elegans do barwienia immunofluorescencyjnego i DAPI. Ta metoda umożliwia wizualizację jąder linii płciowej i badanie struktury chromosomów.

C. elegans (C. elegans) Rozwarstwienie gonad i pęknięcie zamrażające do barwienia immunofluorescencyjnego i DAPI

Przeglądaj więcej filmów