C. elegans (C. elegans) Rozwarstwienie gonad i pęknięcie zamrażające do barwienia immunofluorescencyjnego i DAPI

Ta metoda preparacji i immunofluorescencji jest stosowana przez wiele laboratoriów C.elegans. Może być stosowany do wykrywania dowolnego białka, dla którego dostępne jest przeciwciało lub znakowane białko fuzyjne. Chociaż wymaga to pewnej praktyki, aby prawidłowo przeprowadzić tę sekcję, ten protokół jest elastyczny i łatwy do rozwiązania.

Dla nas barwienie DAPI zawsze działa i zwykle możemy znaleźć warunek, który działa na każde przeciwciało. Największym wyzwaniem dla tej techniki jest etap sekcji. Musisz pracować szybko, ale pewnie, aby uzyskać dobre ekstruzje linii zarodkowej.

Praktyka jest kluczowa. Aby rozpocząć, umieść szkiełko przytrzymujące na stoliku mikroskopu preparacyjnego i umieść szkiełko nakrywkowe na szkiełku przytrzymującym. Następnie odpipetuj cztery mikrolitry roztworu preparacyjnego do środka szkiełka nakrywkowego i przesuń szkiełko przytrzymujące na jedną stronę stolika, aby zwolnić widok.

Zbierz od 10 do 20 hermafrodytów z płytki NGM do kropli roztworu preparacyjnego. Najlepiej wybrać około 10 na szkiełko, ale nie na tyle, aby nie można było ich wyciąć w ciągu pięciu minut. Aby wypreparować zwierzęta, skrzyżuj końcówki igieł, aby uzyskać kształt X i użyj dolnej części X, aby przygwoździć dorosłego człowieka do powierzchni szkiełka nakrywkowego.

Następnie umieść kształt litery X bezpośrednio za gardłem, około jednej piątej długości ciała młodego dorosłego lub tuż poniżej przezroczystej części głowy. Następnie odetnij zwierzę jednym ruchem nożycowym, całkowicie uwalniając się z jamy ciała wraz z jedną lub obiema połówkami jelita. Aby utrwalić próbkę formaldehydem, należy odpipetować cztery mikrolitry roztworu utrwalającego na szkiełku nakrywkowym, bardzo blisko kropli w przypadku zwierząt, unikając pipetowania bezpośrednio do kropli rozwarstwiającej i przemieszczania wypreparowanych tusz.

Przypnij szkiełko nakrywkowe do szkiełka przytrzymującego jednym palcem. Drugą ręką delikatnie strzepnij kilka razy szkiełko nakrywkowe, aby wymieszać krople. Trzymając dodatnio naładowany szkiełko przodem do dołu, użyj go, aby podnieść szkiełko nakrywkowe na środku szkiełka, delikatnie dotykając kropli próbki, a napięcie powierzchniowe kropli podniesie szkiełko nakrywkowe.

Ustaw szkiełko na ławce i zamocuj dokładnie przez pięć minut w temperaturze pokojowej. W tym czasie oznacz slajd ołówkiem. Aby zamrozić, rozbij próbkę za pomocą ciekłego azotu, przytrzymując oznaczoną krawędź szkiełka pęsetą, delikatnie zanurz ją w ciekłym azocie.

Zwolnij szkiełko w taki sposób, aby opierało się o bok zlewki szkiełkiem nakrywkowym do góry, a szkiełka zostaną zamrożone w ciągu 10 sekund. W przypadku używania suchego lodu do zamrażania, po zeskrobaniu szronu z powierzchni aluminiowego bloku za pomocą brzytwy, mocno chwyć oznaczoną krawędź szkiełka i połóż ją na oczyszczonej powierzchni, wywierając lekki nacisk w dół, aby zapewnić pełny kontakt z blokiem. Zamrożenie następuje w ciągu 10 sekund, gdy próbka pod szkiełkiem nakrywkowym zamienia się w lód.

Usuń zamrożoną prowadnicę, mocno chwytając krótszą krawędź prowadnicy oznaczoną etykietą i przymocuj jedną długą krawędź do stołu. Drugą ręką mocno chwyć maszynkę do golenia i przesuń krawędź brzytwy w dół szkiełka, aby strzepnąć szkiełko nakrywkowe i odsunąć je od próbki. Natychmiast umieść szkiełko w słoiku Coplin zawierającym 95% etanolu i pozostaw szkiełka w etanolu na co najmniej pięć minut.

Następnie umyj szkiełka w PBST trzy razy przez pięć minut w temperaturze pokojowej, używając świeżego PBST do każdego prania. Wyniki obrazowania fluorescencyjnego jąder linii zarodkowej wykazały, że DAPI silnie wiąże się z DNA. Barwienie immunofluorescencyjne było skuteczne, gdy przeciwciało skierowane przeciwko RAD-51, markerowi pęknięć dwuniciowych, było obecne jako dyskretne ogniska w jądrach miotycznych, kolokalizowane na chromosomach oznaczonych DAPI.

Mutanty heterozygot kle-2 mają niewielkie defekty w budowie chromosomów, o czym świadczy nieznacznie nieuporządkowane barwienie DAPI i wzrost liczby pęknięć dwuniciowych, co znajduje odzwierciedlenie w większej liczbie ognisk RAD-51. Zarówno etapy preparacji, jak i zamrażania pękania mogą być trudne, dlatego ważne jest, aby pracować szybko i płynnie. Zalecamy przećwiczenie tych kroków przed przystąpieniem do całego protokołu.

Na przykład możesz ćwiczyć preparowanie większej objętości płynu, na przykład 200 mikrolitrów, i stopniowo zmniejszać się do zalecanej objętości czterech mikrolitrów na szkiełku nakrywkowym. Technika ta może być stosowana do obrazowania w wysokiej rozdzielczości na mikroskopie konfokalnym lub strukturalnym lub może być stosowana w połączeniu z DNA lub RNA-FISH, fluorescencyjna hybrydyzacja in situ, w celu wizualizacji, w jaki sposób białka lokalizują się w odniesieniu do określonych sekwencji.