Name: Automatyczna analiza wewnątrzkomórkowych fenotypów salmonelli za pomocą ImageJ (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-09T14:15:00.000+00:00
Duration: 10 min 39 s
Description: Poznaj zautomatyzowaną analizę fenotypów Salmonella w komórkach nabłonka jelitowego przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej i ImageJ. Ta ilościowa metoda wysokoprzepustowa umożliwia skalowalne badanie wielu szczepów bakteryjnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować dr Olivii Steele-Mortimer za udostępnienie plazmidu pCHAR-Duo. Prace te zostały sfinansowane przez włoskie Ministerstwo Zdrowia, granty PRC2019014 i PRC2021004.

<ol><li>European Food Safety Authority & European Centre for Disease Prevention and Control. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+European+Union+One+Health+2020+Zoonoses+Report%5BTitle%5D)+AND+%22EFSA+Journal%22%5BJournal%5D)">The European Union One Health 2020 Zoonoses Report.</a> EFSA Journal. 19 (12), 6971(2021).</li>
<li>Fattinger, S. A., Sellin, M. E., Hardt, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salmonella+effector+driven+invasion+of+the+gut+epithelium%3A+breaking+in+and+setting+the+house+on+fire%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Salmonella effector driven invasion of the gut epithelium: breaking in and setting the house on fire.</a> Current Opinion in Microbiology. 64, 9-18 (2021).</li>
<li>Knodler, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissemination+of+invasive+Salmonella+via+bacterial-induced+extrusion+of+mucosal+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Dissemination of invasive Salmonella via bacterial-induced extrusion of mucosal epithelia.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (41), 17733-17738 (2010).</li>
<li>Fulde, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salmonella+SPI2+T3SS+mediates+transcytosis+in+polarized+enterocytes+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+%26+Microbe%22%5BJournal%5D)">Salmonella SPI2 T3SS mediates transcytosis in polarized enterocytes in vivo.</a> Cell Host & Microbe. , (2019).</li>
<li>Cooper, K. G., Chong, A., Starr, T., Finn, C. E., Steele-Mortimer, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predictable%2C+tunable+protein+production+in+Salmonella+for+studying+host-pathogen+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+and+Infection+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Predictable, tunable protein production in Salmonella for studying host-pathogen interactions.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 475(2017).</li>
<li>Klein, J. A., Grenz, J. R., Slauch, J. M., Knodler, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+activity+of+the+Salmonella+invasion-associated+injectisome+reveals+its+intracellular+role+in+the+cytosolic+population%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Controlled activity of the Salmonella invasion-associated injectisome reveals its intracellular role in the cytosolic population.</a> mBio. 8 (6), 01931(2017).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li>
<li>Ibarra, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+Salmonella+pathogenicity+island+1+under+different+growth+conditions+can+affect+Salmonella-host+cell+interactions+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Induction of Salmonella pathogenicity island 1 under different growth conditions can affect Salmonella-host cell interactions in vitro.</a> Microbiology. 156 (4), 1120-1133 (2010).</li>
<li>Tambassi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutation+of+hilD+in+a+Salmonella+Derby+lineage+linked+to+swine+adaptation+and+reduced+risk+to+human+health%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Mutation of hilD in a Salmonella Derby lineage linked to swine adaptation and reduced risk to human health.</a> Scientific Reports. 10 (1), 21539(2020).</li>
<li>Finn, C. E., Chong, A., Cooper, K. G., Starr, T., Steele-Mortimer, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+second+wave+of+Salmonella+T3SS1+activity+prolongs+the+lifespan+of+infected+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">A second wave of Salmonella T3SS1 activity prolongs the lifespan of infected epithelial cells.</a> PLoS Pathogens. 13 (4), 1006354(2017).</li>
<li>Knodler, L. A., Nair, V., Steele-Mortimer, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+assessment+of+cytosolic+Salmonella+in+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Quantitative assessment of cytosolic Salmonella in epithelial cells.</a> PLoS One. 9 (1), 84681(2014).</li>
<li>Chong, A., Starr, T., Finn, C. E., Steele-Mortimer, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+the+Salmonella+Type+III+Secretion+System+1+in+bacterial+adaptation+to+the+cytosol+of+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A role for the Salmonella Type III Secretion System 1 in bacterial adaptation to the cytosol of epithelial cells.</a> Molecular Microbiology. 112 (4), 1270-1283 (2019).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają sprzecznych interesów.

Sposób, w jaki Salmonella kolonizuje komórki nabłonka jelitowego, wpływa na wynik infekcji. Po inwazji hiperreplikacja cytozolowa indukuje stan zapalny jelit3, podczas gdy replikacja wakuolarna może prowadzić do rozprzestrzeniania się ogólnoustrojowego4. Szczepy Salmonelli mogą różnić się pod względem zdolności do inwazji i replikacji wewnątrz komórek nabłonka jelitowego9. Rzeczywiście, Salmonella jest niezwykle różnorodnym rodzajem obejmującym ponad 2500 serowarów, które mają różne zdolności do wywoływania chorób. Ponadto salmonella jest najczęściej zgłaszaną przyczyną epidemii przenoszonych przez żywność w Unii Europejskiej, co wskazuje na duże rozprzestrzenianie się w populacji ludzkiej1. W związku z tym dostępność wiarygodnych, wysokoprzepustowych metod ilościowego oznaczania wewnątrzkomórkowych fenotypów Salmonelli ma ogromne znaczenie dla oceny różnic w zjadliwości wśród dużej liczby szczepów Salmonelli i ostatecznie umożliwia dokładną i specyficzną dla szczepu ocenę ryzyka tego patogenu.
Opisany tutaj protokół mierzy zachowanie Salmonelli w komórkach nabłonka w szybki i zautomatyzowany sposób. Infekcja komórek nabłonka odbywa się w 96-dołkowych mikropłytkach obrazowych, a do akwizycji obrazu wykorzystuje się automatyczny mikroskop fluorescencyjny, dzięki czemu protokół nadaje się do zastosowań o wysokiej przepustowości. Protokół ten wykorzystuje plazmid pCHAR-Duo, który umożliwia odróżnienie salmonelli wakuolarnych od cytozolowych poprzez różnicową ekspresję dwóch reporterów fluorescencyjnych5. Wewnątrzkomórkowe fenotypy Salmonelli są często analizowane za pomocą ręcznej oceny, co jest czasochłonną procedurą, która nie nadaje się do analizy dużej liczby szczepów i kultur komórkowych na szczep oraz jest podatna na błędy operatora i zmienność międzyoperatorską. Aby przezwyciężyć te ograniczenia, opracowano dwie uzupełniające się i zautomatyzowane analizy obrazu: analizę obszaru i analizę pojedynczych komórek. Do opracowania obu analiz wykorzystano ogólnodostępne oprogramowanie ImageJ. W celu przyspieszenia wykonywania protokołu, skrypty ImageJ do analizy wsadowej wielu plików akwizycji bez interwencji operatora są dostarczane jako pliki uzupełniające.
Analiza obszaru została zaprojektowana w celu ilościowego określenia, w kilku krokach, ogólnej kolonizacji komórek nabłonkowych (współczynnik infekcji) i poziomu hiperreplikacji (współczynnik hiperreplikacji) poprzez pomiar obszarów specyficznie zajmowanych przez jądra komórek nabłonkowych i przez Salmonelle wykazujące ekspresję mCherry lub mCherry wraz z GFP. Analiza obszaru jest stosowana do obrazów uzyskanych w małym powiększeniu, gdzie zarówno wakuolne, jak i hiperreplikujące się Salmonelle są ostre w tej samej płaszczyźnie z, a w polu mikroskopowym wyświetlana jest duża liczba komórek nabłonkowych, co zmniejsza rozmiar i liczbę plików akwizycji. Analiza obszaru pozwala na zautomatyzowaną, szybką i lekką obliczeniowo analizę dużej liczby próbek, dzięki czemu nadaje się do testów o wysokiej przepustowości, takich jak eksperymenty przesiewowe.
Analiza pojedynczych komórek została zaprojektowana w celu ilościowego określenia fenotypów Salmonelli wewnątrz komórek nabłonkowych z rozdzielczością pojedynczej komórki, uzyskaną poprzez segmentację komórek i pomiar obszaru komórkowego oraz procentu obszaru zajmowanego przez wakuolarne i cytozolowe hiperreplikujące się Salmonelle. Ogólna kolonizacja komórek nabłonkowych scharakteryzowana za pomocą analizy obszaru jest tutaj podzielona na trzy parametry ilościowe: procent zakażonych komórek, średnie obciążenie wakuolarne i szybkość hiperreplikacji, co pozwala ocenić i określić ilościowo wkład każdego fenotypu w ogólną kolonizację, uzupełniając w ten sposób wyniki analizy obszarowej. Większa szczegółowość oferowana przez analizę pojedynczych komórek odbywa się kosztem wolniejszego pozyskiwania i analizy obrazu. W rzeczywistości, aby osiągnąć rozdzielczość pojedynczej komórki, akwizycja obrazu odbywa się przy dużym powiększeniu. Oznacza to, że do obserwacji zarówno wakuolarnych, jak i cytozolowych Salmonelli w centrum uwagi potrzebnych jest wiele płaszczyzn z oraz że do uzyskania dużej liczby komórek nabłonkowych potrzebne jest uzyskanie dużej liczby pól na próbkę, wydłużając w ten sposób czas akwizycji w porównaniu z analizą obszaru. Ponadto analiza kilku dużych plików akwizycji jest wymagająca obliczeniowo, a co za tym idzie wymaga odpowiedniej stacji roboczej (zastosowano 6-rdzeniową stację roboczą o pojemności 32 GB RAM). W związku z tym analiza pojedynczych komórek może być stosowana jako samodzielna metoda w warunkach ograniczonej przepustowości lub jako metoda drugiego poziomu sprzężona z analizą obszaru w celu lepszego zrozumienia fenotypów Salmonelli wewnątrz komórek nabłonkowych.
Dwie uzupełniające się analizy zostały zweryfikowane przy użyciu S. Tm, S. Derby wt i S. Derby ΔsipA, wybrane, ponieważ ich zachowanie wewnątrz komórek nabłonkowych było już znane z tego, że różni się pod względem inwazji lub replikacji 9,10. Wyniki analiz obszarowych i jednokomórkowych wskazują, że protokół pozwolił na ilościowe rozróżnienie różnic w wewnątrzkomórkowych fenotypach Salmonelli zgodnie z charakterystyką badanych szczepów. Co więcej, wyniki te pokazują, że analiza pojedynczej komórki pozwala na ilościowe określenie udziału każdego fenotypu wewnątrzkomórkowego (inwazja, obciążenie wakuolarne i replikacja cytozolowa) w ogólnej kolonizacji uzyskanej za pomocą analizy obszaru.
Protokół ten został zastosowany do badania patogenności in vitro różnych szczepów Salmonelli, ale może mieć inne zastosowania, takie jak badanie losowych mutantów w celu identyfikacji genów zaangażowanych w inwazję i/lub replikację wewnątrz komórek nabłonkowych. Ponadto protokół można dostosować do analizy zachowania Salmonelli w innych liniach komórkowych niż komórki INT407. Może być również wykorzystany jako punkt wyjścia do opracowania podobnych metod badania interakcji komórka-patogen innych mikroorganizmów wewnątrzkomórkowych.

Salmonella jest najczęściej zgłaszanym czynnikiem bakteryjnym powodującym wybuchy chorób przenoszonych drogą pokarmową w Unii Europejskiej1. Pierwotnym patologicznym objawem zakażenia Salmonellą jest zapalenie jelit, które jest wynikiem zachowania patogenu w jelitach po spożyciu i wynikającej z tego miejscowej odpowiedzi zapalnej2. Jednak Salmonella może również rozprzestrzeniać się do miejsc pozajelitowych i powodować infekcje ogólnoustrojowe, szczególnie u osób z obniżoną odpornością. Rodzaj interakcji między Salmonellą a nabłonkiem jelitowym warunkuje wynik infekcji. Po dostaniu się do światła jelita Salmonella atakuje i replikuje się w komórkach nabłonka jelitowego. Na poziomie wewnątrzkomórkowym Salmonella może prezentować dwa różne fenotypy replikacji, hiperreplikację cytozolową i powolną replikację wewnątrzwakuolarną w wakuolach zawierających Salmonellę (SCV). Hiperreplikacja cytozolowa indukuje śmierć komórek gospodarza w stanie zapalnym i ekstruzję Salmonelli do światła jelita3; Replikacja wakuolarna prowadzi do penetracji nabłonka i rozprzestrzeniania się ogólnoustrojowego4. W związku z tym zakres inwazji i replikacji wakuolarnej i cytozolowej wpływa na przebieg infekcji.
Rodzaj Salmonella jest bardzo różnorodny, zawiera tysiące serotypów o różnych zakresach żywicieli i zdolnościach do wywoływania chorób. Na przykład S. Typhimurium jest definiowane jako serowar ogólny, ponieważ infekuje wielu niespokrewnionych gospodarzy i stanowi jedną z głównych przyczyn salmonellozy u ludzi. Inaczej, S. Derby jest uważany za serowar przystosowany do świń, ponieważ jest w większości izolowany od świń, ale jest również zgłaszany w pierwszej piątce serowarów odpowiedzialnych za zakażenie ludzi1. Jednak wiedza na temat zachowania bakterii wewnątrz komórek nabłonkowych jest zasadniczo ograniczona do badania kilku szczepów referencyjnych, takich jak S. Typhimurium SL1344, które nie reprezentują ogromnej naturalnej różnorodności patogeniczności Salmonelli. Scharakteryzowanie interakcji różnych szczepów Salmonelli z komórkami nabłonkowymi przyczyniłoby się do zrozumienia ich różnej patogenności. Z tego powodu opracowano wysokoprzepustowy protokół oparty na mikroskopii fluorescencyjnej, aby analizować zachowanie wewnątrzkomórkowe dużej liczby szczepów w szybki i w dużej mierze zautomatyzowany sposób. W tym protokole zakażenie komórek nabłonkowych przeprowadzono na 96-dołkowych płytkach obrazowych, a akwizycji obrazu dokonano za pomocą automatycznego mikroskopu fluorescencyjnego. Plazmid pCHAR-Duo wykorzystano do obserwacji fenotypów inwazji i replikacji Salmonelli wewnątrz komórek nabłonkowych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej5. Plazmid ten przenosi gen kodujący czerwony fluorescencyjny reporter mCherry, konstytutywnie wyrażany przez wszystkie przekształcone komórki bakteryjne, oraz gen kodujący zielony fluorescencyjny reporterowy GFP, którego ekspresja jest aktywowana przez glukozo-6-fosforan obecny wyłącznie w cytozolu komórek eukariotycznych i nieobecny w SCV. Dlatego plazmid umożliwia rozróżnienie między bakteriami wakuolarnymi i cytozolowymi poprzez różnicową ekspresję reporterów mCherry i GFP.
Bakterie wakuolarne i cytozolowe na obrazach mikroskopowych są zwykle oznaczane ilościowo za pomocą ręcznego oceniania6, ale jest to czasochłonna metoda, która ogranicza analizę do niewielkiej liczby próbek. W związku z tym opracowano dwie uzupełniające się i zautomatyzowane analizy obrazów – analizę obszarową i analizę pojedynczych komórek – przy użyciu ImageJ7, ogólnodostępnego oprogramowania do analizy obrazu. Analiza obszaru mierzy całkowite wewnątrzkomórkowe obciążenie bakteryjne i zakres hiperreplikacji cytozolowej przy użyciu danych z obszarów zajmowanych przez komórki nabłonkowe, czerwone i zielone Salmonelle w każdym uzyskanym obrazie mikroskopowym. Metodę tę można zastosować do obrazów uzyskanych w małym powiększeniu; W związku z tym pozwala na uzyskanie dużej liczby komórek nabłonkowych przy użyciu niewielu obrazów, skracając czas akwizycji. Analiza pojedynczych komórek wykorzystuje segmentację komórek do określenia procentu zakażonych komórek, średniego obciążenia wakuolarnego oraz odsetka zakażonych komórek poddawanych hiperreplikacji cytozolowej z rozdzielczością pojedynczej komórki.
W tym protokole wszystkie etapy analizy obrazu są szczegółowo opisane do wykonania ręcznie, ale ta sama analiza może być zautomatyzowana przez nasze specjalnie zaprojektowane skrypty ImageJ. Skrypty te pozwalają również na uruchamianie analiz wsadowych w celu automatycznej analizy wielu obrazów, a tym samym przyspieszenia wykonania metody.

<table><tbody><tr><td>96-dołkowa mikropłytka obrazowa</td><td>Eppendorf</td><td>30741030</td><td>Hodowla komórkowa i infekcja</td></tr><tr><td>Ampicylina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>59349</td><td>Hodowla bakterii</td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony obserwatora Axio</td><td>ZEISS</td><td></td><td>Automatyczny mikroskop fluorescencyjny</td></tr><tr><td>Axiocam 305 Mono</td><td>Kamera mikroskopowa</td><td>ZEISS</td><td></td></tr><tr><td>Oddychająca membrana</td> <td>uszczelniającaSigma-Aldrich</td><td>Z380059</td><td>Test infekcji</td></tr><tr><td>Colibr&igrave; 5/7</td><td>ZEISS</td><td></td><td>Źródło światła LED</td></tr><tr><td>Kolagen I ogon szczura</td> Life <td>Technologies</td><td>A1048301</td><td>Powłoka kolagenowa</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D3571</td><td>Barwienie komórek</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>płodu Gibco</td><td>10099-141</td><td>Hodowla komórkowa i zakażenie</td></tr><tr><td>Gentamycyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G12664</td><td>Test infekcji</td></tr><tr><td>Lodowaty kwas octowy</td><td>Carlo Erba</td><td>401391</td><td>Powłoka kolagenowa</td></tr><tr><td>HCS CellMask Blue</td><td>Invitrogen</td><td>H32720</td><td>Barwienie komórek</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>National Institutes of Health i Laboratorium Oprzyrządowania Optycznego i Obliczeniowego (LOCI, University of Wisconsin)</td><td></td><td>Oprogramowanie do przetwarzania obrazu</td></tr><tr><td>Minimum Niezbędne Eagle's Medium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5650-500ML</td><td>Hodowla komórkowa i infekcja</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd 4%</td><td>Invitrogen</td><td>FB002</td><td>Utrwalanie komórek</td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>PanReac AppliChem</td><td>131494.1211</td><td>Preparat PBS</td></tr><tr><td>Fosforan potasu jednozasadowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60220</td><td>PBS</td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>PanReac AppliChem</td><td>131659.1214</td><td>Hodowla bakterii i preparat PBS</td></tr><tr><td>Fosforan sodu dwuzasadowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71640</td><td>Preparat PBS</td></tr><tr><td>Kolba do hodowli tkankowych 25 cm2 korek uszczelka nakrętka</td><td>Euroclone</td><td>ET7025</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Biorad</td><td>1610407</td><td>Barwienie komórek</td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA (0,25%)</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td>Hodowla komórkowa i infekcja</td></tr><tr><td>Trypton</td><td>Oxoid</td><td>LP0042B</td><td>Kultura bakterii</td></tr><tr><td>Ekstrakt drożdżowy</td><td>Biolife</td><td>4122202</td><td>Kultura bakterii</td></tr></tbody></table>

automatyczna analiza wewnątrzkomórkowych fenotypów salmonelli za pomocą imagej

Automated Analysis of Intracellular Phenotypes of Salmonella Using ImageJ

Salmonella jest patogenem jelitowym zdolnym do inwazji nabłonka jelitowego i replikacji w enterocytach, zarówno wewnątrz wakuoli specyficznych dla Salmonelli, jak i wolnych w cytozolu (hiperreplikacja cytozolu). Te różne fenotypy replikacji wewnątrzkomórkowej napędzają różne szlaki patogenezy, tj. hiperreplikacja cytozolowa indukuje śmierć komórek zapalnych i ekstruzję do światła jelita, podczas gdy replikacja wakuolarna prowadzi do penetracji nabłonka i rozprzestrzeniania się ogólnoustrojowego. Podjęto znaczne wysiłki w celu stworzenia narzędzi mikroskopowych do badania zachowania Salmonelli wewnątrz zaatakowanych komórek, takich jak fluorescencyjny plazmid reporterowy pCHAR-Duo, który umożliwia rozróżnienie między bakteriami wakuolarnymi i cytozolowymi poprzez różnicową ekspresję mCherry i GFP. Jednak fenotypy wewnątrzkomórkowe są często oceniane ręcznie, co jest czasochłonną procedurą, która ogranicza analizę do niewielkiej liczby próbek i komórek. Aby przezwyciężyć te ograniczenia, opracowano dwie uzupełniające się i zautomatyzowane analizy obrazu przy użyciu ImageJ, bezpłatnego oprogramowania do analizy obrazu. W protokole wysokoprzepustowym komórki nabłonkowe zostały zakażone Salmonellą przenoszącą pCHAR-Duo przy użyciu 96-dołkowych płytek. Obrazowanie wykonano przy użyciu automatycznego mikroskopu fluorescencyjnego. Następnie zastosowano dwie metody analizy obrazu w celu zmierzenia wewnątrzkomórkowego zachowania Salmonelli na różnych poziomach szczegółowości. Pierwsza metoda mierzy całkowite wewnątrzkomórkowe obciążenie bakteryjne i zakres hiperreplikacji cytozolowej. Jest szybki i umożliwia ocenianie dużej liczby komórek i próbek, dzięki czemu nadaje się do testów o wysokiej przepustowości, takich jak eksperymenty przesiewowe. Druga metoda przeprowadza analizę pojedynczych komórek w celu określenia procentu zakażonych komórek, średniego obciążenia wakuolarnego Salmonelli i szybkości hiperreplikacji cytozolu, dostarczając więcej szczegółów na temat zachowania Salmonelli w komórkach nabłonkowych. Protokoły mogą być wykonywane przez specjalnie zaprojektowane skrypty ImageJ w celu automatycznego przeprowadzania analiz wsadowych głównych etapów interakcji Salmonella-enterocyty.

Zakażanie komórek nabłonkowych szczepami Salmonella 
Niniejszy protokół został opracowany w celu analizy inwazji komórkowej oraz replikacji cytozolowej (Rysunek 1A) w stosunku do obciążenia wakuolarnego (Rysunek 1B) Salmonella wewnątrz komórek nabłonkowych. Protokół został zwalidowany z użyciem trzech następujących szczepów Salmonella: szczepu referencyjnego S. Typhimurium SL1344 (S. Tm), szczepu dzikiego S. Derby ER1175 (S. Derby wt) oraz izogenicznego mutanta S. Derby ER1175 pozbawionego genu sipA (S. Derby ΔsipA). Szczep S. Derby ER1175 wyizolowano od świń; należy on do kolekcji nadzorczej izolatów Salmonella IZSLER. Szczepy wybrano tak, aby reprezentowały różnorodność fenotypową objętą protokołem. W szczególności wybrano te szczepy, ponieważ ich zachowanie wewnątrz komórek nabłonkowych było już znane jako różniące się pod kątem inwazji lub replikacji9; stanowiły one zatem cenne kontrole do sprawdzenia, czy protokół pozwala na ilościowe rozróżnienie różnic w wewnątrzkomórkowych fenotypach Salmonella. W szczególności włączono S. Tm i S. Derby wt, ponieważ wcześniej wykazano, że S. Tm wykazuje wyższą wydajność inwazji i replikacji wewnątrzkomórkowej niż S. Derby wt9, natomiast S. Derby ΔsipA dodano jako szczep z upośledzoną hiperreplikacją, ponieważ efektor wirulencji SipA odgrywa kluczową rolę w zapoczątkowaniu hiperreplikacji10,11. Wcześniej zgłaszano w przypadku S. Tm, że replikacja cytozolowa rozpoczyna się 4 h po inwazji, a następnie populacja cytozolowa szybko ulega hiperreplikacji, wypełniając komórkę nabłonkową do 8 h11,12. Zgodnie z tym, 8-godzinna infekcja była odpowiednia do obserwacji i ilościowego określenia fenotypu hiperreplikacji cytozolowej również w przypadku S. Derby wt i S. Derby ΔsipA.
Analiza powierzchni 
Analiza powierzchni w kroku 4.1 dostarcza pomiaru ogólnej kolonizacji komórek nabłonkowych przez Salmonella (wskaźnik infekcji) oraz pomiaru hiperreplikacji (wskaźnik hiperreplikacji). W procesie analizy powierzchni opisanym na Rysunku 2, szumy losowe są redukowane, a następnie kanały są rozdzielane i przetwarzane niezależnie. Dla każdego kanału ustawiany jest próg w celu wykluczenia tła z pomiaru powierzchni. Następnie mierzona jest powierzchnia zajęta przez piksele powyżej progu dla każdego kanału. Wynikiem analizy powierzchni jest tabela zawierająca dla każdego pliku akwizycji wielkość obszarów zajętych przez jądra komórek nabłonkowych (kanał niebieski), wewnątrzkomórkowe Salmonellae wykazujące ekspresję mCherry (kanał czerwony) oraz cytozolowe hiperreplikujące się Salmonellae wykazujące ekspresję GFP (kanał zielony) wraz z mCherry. Wskaźnik infekcji oblicza się, dzieląc powierzchnię zajętą przez Salmonellae wykazujące ekspresję mCherry przez powierzchnię zajętą przez jądra komórek gospodarza. Wyniki przetestowanych szczepów wykazały, zgodnie z oczekiwaniami, że S. Tm wykazuje znacznie wyższy wskaźnik infekcji w porównaniu do obu szczepów S. Derby (Rysunek 3A). Zatem wyniki te potwierdzają skuteczność analizy powierzchni w wykrywaniu różnic w zdolności szczepów Salmonella do kolonizacji komórek nabłonkowych. Wskaźnik hiperreplikacji Salmonella mierzy się, dzieląc powierzchnię zajętą przez Salmonellae wykazujące ekspresję GFP przez powierzchnię zajętą przez wewnątrzkomórkowe Salmonellae wykazujące ekspresję mCherry. Zgodnie z rolą białka SipA w określaniu hiperreplikacji, dla szczepu S. Derby ΔsipA zmierzono znacznie obniżony wskaźnik hiperreplikacji w porównaniu do S. Derby wt (Rysunek 3B). Nie zaobserwowano różnic w hiperreplikacji między S. Tm a S. Derby wt. Ogólnie rzecz biorąc, analiza powierzchni skutecznie ujawniła różne poziomy hiperreplikacji wśród badanych szczepów.
Analiza pojedynczych komórek 
Analiza pojedynczych komórek pozwala na ilościowe określenie inwazji Salmonella oraz obciążenia wakuolarnego w stosunku do replikacji cytozolowej wewnątrz komórek nabłonkowych z rozdzielczością pojedynczej komórki. Jak opisano w kroku 4.2, dla każdego pliku z akwizycją kanały niebieski, czerwony i zielony były przetwarzane niezależnie (Rycina 4). W szczególności kanał niebieski, odpowiadający komórkom nabłonkowym, został przetworzony w kroku 4.2.3 w celu uzyskania segmentacji komórek. Następnie posegmentowane komórki dodano do Menedżera Regionów Zainteresowania (ROI Manager), aby uzyskać listę ROI odpowiadającą wszystkim posegmentowanym komórkom, unikalnie oznaczonych współrzędnymi y-x. Aby usunąć nieostre piksele hiperreplikujących się Salmonellae wykazujących ekspresję GFP, piksele kanału zielonego odjęto od pikseli kanału czerwonego. Tabela wynikowa analizy pojedynczych komórek raportuje dla każdego ROI powierzchnię oraz procent powierzchni ROI zajęty przez Salmonellae wykazujące ekspresję wyłącznie konstytutywnego reportera mCherry lub reportera GFP reagującego na cytozol. Procent powierzchni komórki zajęty przez Salmonellae wykazujące ekspresję wyłącznie mCherry został przetworzony w kroku 4.2.4 w celu obliczenia odsetka zainfekowanych komórek oraz średniego obciążenia wakuolarnego (Rycina 5A). Analiza obciążenia wakuolarnego wykazała, że szczepy S. Derby generują średnie obciążenie wakuolarne istotnie niższe niż S. Tm (Rycina 5B). Odwrotnie, zaobserwowano jedynie niewielki i nieistotny statystycznie spadek odsetka zainfekowanych komórek w szczepach S. Derby w porównaniu z S. Tm (Rycina 5A). Procent powierzchni komórki zajęty przez Salmonellae wykazujące ekspresję GFP został przetworzony w kroku 4.2.5 w celu uzyskania wskaźnika hiperreplikacji. Nie zaobserwowano różnic między S. Tm a S. Derby wt, podczas gdy S. Derby ΔsipA wykazały istotny spadek hiperreplikacji, co jest zgodne z wynikiem analizy powierzchni (Rycina 5C) oraz rolą SipA w indukowaniu hiperreplikacji.
<img alt="Mikroskopia hiperreplikacji cytozolowej i obciążenia wakuolarnego; wewnątrzkomórkowe, cytozolowe Salmonella, komórki INT407." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64263/64263fig1v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Hiperreplikacja cytozolowa i obciążenie wakuolarne Salmonella. Przedstawiono reprezentatywne obrazy (A) hiperreplikacji Salmonella oraz (B) obciążenia wakuolarnego wykonane przy dużym powiększeniu (40x). Panel B pokazuje różne płaszczyzny ogniskowania komórek zawierających hiperreplikujące się Salmonellae (z:7/8) w porównaniu do Salmonellae niewykazujących hiperreplikacji (z:4/8). Białe paski skali odpowiadają 10 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64263/64263fig1v2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat procesu analizy powierzchni; kanały mikroskopii fluorescencyjnej: jądra komórkowe, wewnątrzkomórkowe, cytozolowe Salmonella." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64263/64263fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Schemat analizy powierzchni. Schemat analizy powierzchni przedstawiono dla reprezentacyjnego obrazu o niskim powiększeniu (10x) komórek INT407 zainfekowanych przez 8 h bakteriami Salmonella niosącymi plazmid pCHAR-Duo (MOI 100). Najpierw redukowany jest szum losowy, a następnie kanały są rozdzielane na C1, C2 i C3 oraz przetwarzane niezależnie. Dla każdego kanału ustawiany jest próg w celu wykluczenia tła z obszaru pomiarowego. Następnie dla każdego kanału mierzona jest powierzchnia zajmowana wyłącznie przez piksele powyżej progu — odpowiadająca jądrom komórkowym w C1, wszystkim wewnątrzkomórkowym Salmonellae w C2 oraz cytozolowym Salmonellae w C3. Obrazy analizowane w tym przypadku są wynikiem połączenia (stitching) czterech pól widzenia zarejestrowanych przy powiększeniu 10x. Białe paski skali oznaczają 100 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64263/64263fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykres punktowy stosunków infekcji i replikacji; Salmonella Derby vs. S. Tm; wyniki statystyczne." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64263/64263fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Wyniki analizy powierzchniowej. Przedstawiono wyniki analizy powierzchniowej. (A) Stosunek infekcji obliczono, dzieląc powierzchnię zajmowaną przez Salmonellae wykazujące ekspresję mCherry (kanał C2), reprezentujące wszystkie bakterie wewnątrzkomórkowe, przez powierzchnię zajmowaną przez jądra komórek gospodarza (kanał C1). (B) Stosunek hiperreplikacji zmierzono, dzieląc powierzchnię zajmowaną przez Salmonellae wykazujące ekspresję GFP (kanał C3), reprezentujące wyłącznie bakterie hiperreplikujące się w cytozolu, przez powierzchnię zajmowaną przez wszystkie wewnątrzkomórkowe Salmonellae wykazujące ekspresję mCherry. Każda kropka reprezentuje powtórzenie. Analizę przeprowadzono na trzech powtórzeniach biologicznych, z których każde przetestowano w trzech powtórzeniach technicznych. Czarne linie wskazują wartości średnie. Istotność obliczono za pomocą dwustronnego testu t, a podane są wartości p. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64263/64263fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat workflow analizy pojedynczych komórek; segmentacja Salmonella i ROI w metodzie dla komórek INT407." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64263/64263fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Workflow analizy pojedynczych komórek. Workflow analizy pojedynczych komórek przedstawiono dla reprezentatywnego obrazu uzyskanego przy dużym powiększeniu (40x) komórek INT407 zainfekowanych przez 8 h bakteriami Salmonella niosącymi plazmid pCHAR-Duo (MOI 100). Najpierw kanały są dzielone na C1, C2 i C3 i przetwarzane niezależnie. Kanał niebieski (C1), odpowiadający komórkom nabłonkowym, jest przetwarzany w celu uzyskania segmentacji komórek, a następnie każda segmentowana komórka jest definiowana jako obszar zainteresowania (ROI) jednoznacznie oznaczony współrzędnymi y-x. Kanał czerwony (C2) jest przetwarzany poprzez odjęcie kanału zielonego (C3), aby usunąć znajdujące się poza ogniskiem, hiperreplikujące się w cytozolu bakterie Salmonellae, pozostawiając jedynie wakuolarne Salmonellae wykazujące ekspresję mCherry; następnie zredukowano szum losowy i ustawiono próg w celu wykluczenia tła z pomiarów. Na koniec mierzony jest obszar zajmowany przez wakuolarne Salmonellae dla każdego ROI. Kanał zielony (C3), odpowiadający całkowitej liczbie cytosolicznych Salmonellae wykazujących ekspresję GFP, jest przetwarzany w podobny sposób. Obrazy analizowane w tym przypadku są wynikiem połączenia 16 płytek (tiles) za pomocą metody stitching. Białe paski skali oznaczają 100 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64263/64263fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza infekcji Salmonella; wykresy słupkowe; % zainfekowanych komórek, średnie obciążenie wakuol, stopień hiperreplikacji." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64263/64263fig05.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Wyniki analizy pojedynczych komórek. Przedstawiono wyniki analizy pojedynczych komórek. (A) Procent zainfekowanych komórek uzyskano poprzez podzielenie liczby komórek, w których procent powierzchni zajmowanej przez Salmonellae wykazujące ekspresję wyłącznie mCherry był &gt; 0,2, przez całkowitą liczbę komórek. (B) Średnie obciążenie wakuol uzyskano poprzez obliczenie średniego procentu powierzchni zajmowanej przez Salmonellae wykazujące ekspresję wyłącznie mCherry w zainfekowanych komórkach. (C) Stopień hiperreplikacji obliczono poprzez podzielenie liczby komórek, w których procent powierzchni zajmowanej przez Salmonellae wykazujące ekspresję GFP wynosił ≥20%, przez całkowitą liczbę zainfekowanych komórek. Przedstawiono dane z trzech do czterech powtórzeń biologicznych, badanych w trzech powtórzeniach technicznych. Słupki oznaczają standardowy błąd pomiaru. Istotność obliczono za pomocą dwustronnego testu t, a podane zostały wartości p. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64263/64263fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Plik uzupełniający 1: Skrypt do analizy powierzchni. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64263/REVIEWED_Area%20analysis%20script.zip" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Plik uzupełniający 2: Skrypt do analizy pojedynczych komórek. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64263/REVIEWED_Single-cell%20analysis%20script.zip" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Salmonella atakuje i replikuje się wewnątrz komórek nabłonka jelitowego zarówno w wakuolach specyficznych dla Salmonelli, jak i w wolnych w cytozolu (hiperreplikacja). Opisano tutaj wysokoprzepustowy protokół oparty na mikroskopii fluorescencyjnej w celu ilościowego określenia wewnątrzkomórkowych fenotypów Salmonelli za pomocą dwóch uzupełniających się analiz obrazu za pomocą ImageJ, osiągając rozdzielczość pojedynczej komórki i punktację.

Automatyczna analiza wewnątrzkomórkowych fenotypów salmonelli za pomocą ImageJ

Salmonella is an enteric pathogen able to invade the intestinal epithelium and replicate in enterocytes, both inside Salmonella-specific vacuoles and free ...

Ta metoda mikroskopii fluorescencyjnej określa ilościowo fenotypy salmonelli w komórkach nabłonka jelitowego w zautomatyzowany sposób, umożliwiając badanie salmonelli na dużej liczbie szczepów ze skalowalną rozdzielczością. Nasza metoda ma tę zaletę, że jest ilościowa, wysokoprzepustowa i jednocześnie zautomatyzowana, opierając się zarówno na analizie obszarowej, jak i pojedynczej komórki. Zachowanie wewnątrzkomórkowe ma kluczowe znaczenie dla interakcji gospodarz-patogen wielu bakterii.Naszą metodę można łatwo dostosować do patogenów bakteryjnych innych niż salmonella, przyczyniając się do zrozumienia ich patogenezy. Po uzyskaniu obrazów przeprowadź analizę pojedynczej komórki, otwierając akwizycję. czi w ImageJ.Podziel kanały, klikając obraz i wybierając Kolor, a następnie Podziel kanały. W przypadku segmentacji komórek wybierz obraz płaszczyzny Z w oknie tytułu akwizycji C1. Wybierz okno tytułu akwizycji C1 i kliknij obraz, a następnie duplikat.Następnie wpisz numer wybranej płaszczyzny Z. Wpisz C1Zplane w polu tytułu, odznacz Duplikuj stos i kliknij OK, aby zduplikować tylko wybrany obraz płaszczyzny Z. Otworzy się okno o nazwie C1Zplane pokazujące wybrany obraz płaszczyzny Z.Teraz zwiększ kontrast uzyskanego obrazu C1Zplane, wybierając opcję Process (Przetwarzaj) i klikając przycisk Enhance Contrast (Zwiększ kontrast). Dostosuj nasycone piksele, zaznacz opcję Normalizuj i kliknij przycisk OK, aby zastosować technikę poprawy kontrastu w celu uzyskania obrazu C1Zplane ze znormalizowanym kontrastem. Przejdź do Procesu i kliknij Znajdź maksima, aby podzielić komórki nabłonka na znormalizowany kontrastowo obraz C1Zplane.Następnie, aby przypisać tylko jeden punkt maksimum do każdej komórki nabłonka, oznacz flagę wyboru Punkt podglądu i ustaw tolerancję szumu. Aby uzyskać obraz podzielony na segmenty C1Zplane, nowy obraz przypominający maskę binarną, który pokazuje każdą cząstkę podzieloną na segmenty na zaznaczony punkt maksimum, oznacz maksima krawędzi wykluczenia, wybierz cząstki podzielone na segmenty jako typ wyjściowy i kliknij przycisk OK. Następnie utwórz maskę komórek podzielonych na segmenty w obrazie podzielonym na segmenty C1Zplane. Kliknij przycisk Analizuj, a następnie Analizuj cząstki, a następnie wybierz opcje Pokaż maski i Wyklucz na krawędziach.Ustaw przedział rozmiaru i kliknij OK, aby uzyskać maskę segmentowanej maski binarnej C1Zplane. Kliknij tabelę odnośników i wybierz opcję Odwróć tabelę przeglądową na pasku narzędzi. Aby określić próg obrazu C1Zplane ze znormalizowanym kontrastem, przejdź do obrazu, wybierz Dostosuj, wybierz Próg i sprawdź ciemne tło.Ustaw ustawienie automatycznego progu na domyślne i wybierz opcję czerwoną. Dostosuj minimalną wartość odcięcia, aż komórki staną się całkowicie czerwone, pozostawiając ciemne tło. Kliknij przycisk Zastosuj, aby przekonwertować obraz C1Zplane ze znormalizowanym kontrastem na obraz binarny z komórkami w kolorze białym i tłem w kolorze czarnym.Ponadto, aby poprawić segmentację komórek w masce segmentowanej maski binarnej C1Zplane, wybierz Proces i kliknij Kalkulator obrazów. Następnie wybierz maskę C1Zplane podzieloną na segmenty jako obraz pierwszy, wybierz operację AND z listy rozwijanej i wybierz progową płaszczyznę C1Zplane ze znormalizowanym kontrastem jako obraz drugi. Kliknij przycisk OK, a ImageJ automatycznie nazwie obraz wyjściowy jako wynik Maska C1Zplane Segmented.Aby oznaczyć każdą pojedynczą komórkę C1Zplane jako obszar zainteresowania, kliknij przycisk Analizuj, a następnie pozycję Analizuj cząstki. Dostosuj rozmiar, jak pokazano wcześniej, i wybierz opcję pokaż nic. Dodaj wszystkie cząsteczki do narzędzia do zarządzania zwrotem z inwestycji, zaznaczając opcję Dodaj do menedżera.Zaznacz również opcję Wyklucz na krawędziach i kliknij przycisk OK. Zapisz dane ROI jako roi-cells-acquisitiontitle. Przejrzyj menu menedżera ROI, klikając Więcej i wybierając Zapisz. Po zakończeniu segmentacji komórek pracuj nad oknem tytułu akwizycji C2, aby przeanalizować salmonellę wakuolarną.Najpierw przejdź do Procesu, kliknij Kalkulator obrazów, wybierz tytuł akwizycji C2 jako obraz pierwszy i wybierz operację Odejmij z listy rozwijanej. Następnie wybierz tytuł akwizycji C3 jako obraz drugi, zaznacz opcję Utwórz nowe okno i kliknij przycisk OK. Zastosuj odejmowanie do całego stosu Z, klikając przycisk Tak w oknie Process Stack (Stos procesów). Zduplikuj wyniki w oknie tytułu akwizycji C2, klikając menu Obraz i wybierając Duplikuj.Następnie zaznacz zduplikowany stos i naciśnij OK, aby uzyskać wyniki akwizycji C2 title one window. Zastosuj rozmycie gaussowskie do wyników akwizycji C2 w jednym oknie, przechodząc do Procesu, klikając Filtr i wybierając Rozmycie gaussowskie. Pozostaw wartość Sigma jako dwa lub dostosuj ją.Kliknij OK i zastosuj rozmycie gaussowskie do całego stosu Z, klikając Tak w oknie Stosu procesów. Odejmij przefiltrowane Gaussa wyniki tytułu akwizycji C2 od wyników tytułu akwizycji C2, klikając Process (Proces) i wybierając Image Calculator (Kalkulator obrazów). Teraz wybierz wyniki tytułu akwizycji C2 jako obraz pierwszy, wybierz operację Odejmij z listy rozwijanej, wybierz wyniki tytułu akwizycji C2 jeden jako obraz drugi i kliknij OK. Zastosuj odejmowanie do całego stosu Z, klikając przycisk Tak w oknie Process Stack (Stos procesów), aby uzyskać okno automatycznie nazwane przez ImageJ jako wyniki wyników akwizycji C2 title.Aby oddzielić salmonelle od tła wyników wyników akwizycji C2 tytuł, kliknij obraz, wybierz Dostosuj, a następnie kliknij Próg. Następnie sprawdź ciemne tło i ustaw automatyczny próg na Otsu. Dostosuj minimalną wartość odcięcia, aż salmonelle staną się całkowicie czerwone, pozostawiając ciemne tło.Kliknij Zastosuj, a otworzy się okno o nazwie Konwertuj na binarne. Sprawdź czarne tło i kliknij OK. Wybierz środkową płaszczyznę Z odpowiadającą wewnątrzkomórkowej płaszczyźnie ogniskowania salmonelli w wynikach binarnego okna wyników akwizycji C2. Kliknij obraz, a następnie Stosy, a następnie wybierz Ustaw plasterek.Teraz wpisz numer wybranej płaszczyzny Z i kliknij OK. Następnie ustaw pomiary do zarejestrowania dla każdego zwrotu z inwestycji, klikając przycisk Analizuj i wybierając opcję Ustaw pomiar. Następnie sprawdź obszar odpowiadający całkowitemu obszarowi każdego ROI. Aby zarejestrować ułamek obszaru zajmowany przez piksele progowe dla każdego ROI, sprawdź Ułamek powierzchni i Ogranicz do progu.Sprawdź etykietę Wyświetlanie, aby oznaczyć każdy zwrot z inwestycji tytułem obrazu, kanałem, płaszczyzną Z i współrzędnymi X/Y. Użyj wybranej płaszczyzny Z wewnątrzkomórkowych salmonelli, aby zapisać etykiety, obszar i procentowy obszar zajmowany przez salmonelle dla każdej pojedynczej komórki. Otwórz roi-cells-acquisitiontitle.zip, klikając menu Plik i wybierając opcję Otwórz. Następnie kliknij Mierz w menu Menedżer ROI. Wynikiem jest tabela przedstawiająca wybrane pomiary.Na koniec zapisz tabelę wyników, wybierając plik i klikając Zapisz jako w oknie wyników. Inwazję komórkową, obciążenie wakuolarne i cytozolową hiperreplikację salmonelli uwidoczniono wewnątrz komórek nabłonkowych. Analiza obszaru wykazała znacznie wyższy współczynnik infekcji Salmonella typhimurium w porównaniu z obydwoma szczepami Salmonella derby, wykazując skuteczność analizy obszaru w wykrywaniu różnic w zdolności szczepów salmonelli do kolonizacji komórek nabłonka.Zmutowany szczep Salmonella derby z delecją sipA wykazywał zmniejszony współczynnik hiperreplikacji w porównaniu z Salmonella derby typu dzikiego, co jest zgodne z rolą sipA w indukowaniu hiperreplikacji. Nie zaobserwowano różnicy w hiperreplikacji między Salmonellą typhimurium a Salmonellą derby typu dzikiego. Analiza pojedynczych komórek nie wykazała istotnej różnicy w odsetku zakażonych komórek w szczepach Salmonella derby w porównaniu z Salmonellą typhimurium.W przeciwnym razie szczepy Salmonella derby generowały średnie obciążenie wakuolarne znacznie niższe niż Salmonella typhimurium. Nie zaobserwowano różnicy między Salmonellą typhimurium a Salmonellą derby typu dzikiego, podczas gdy Salmonella derby sipA wykazywała znaczny spadek hiperreplikacji, zgodny z wynikiem analizy obszaru. Salmonella obejmuje kilka serowarów o zróżnicowanej zjadliwości.Badanie dużej liczby szczepów za pomocą tej szybkiej i zautomatyzowanej metody w znacznym stopniu przyczynia się do zrozumienia rzeczywistego potencjału wirulencji tego patogenu.

automated-analysis-intracellular-phenotypes-salmonella-using

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Opisujemy opracowanie systemu do zautomatyzowanego obrazowania i analizy transgenicznych embrionów zebrafish w płytkach wielodołkowych. System ten wykazuje możliwość pomiaru efektów zależnych od dawki małej cząsteczki, BCI, na ekspresję genu reporterowego Fibroblast Growth Factor i dostarcza technologii do tworzenia wysokoprzepustowych skriningów chemicznych na zebrafish.

Opracowanie zautomatyzowanego obrazowania i analizy dla chemicznych badań przesiewowych na daniowiczkach Zebrafish.

W niniejszym artykule opisujemy metodę wykorzystującą multispektralną przepływową cytometrię obrazową do ilościowego oznaczenia internalizacji nanocząstek polianhydrydowych lub bakterii przez komórki RAW 264.7.

Analiza internalizacji komórkowej nanocząsteczek i bakterii przy użyciu wielospektralnej obrazującej cytometrii przepływowej

Tutaj opisujemy test fenotypowy mający zastosowanie do wysokoprzepustowych/wysokotreściowych ekranów małych interferujących bibliotek syntetycznego RNA (siRNA), związków chemicznych i Mycobacterium tuberculosis. Metoda ta polega na wykrywaniu znakowanych fluorescencyjnie Mycobacterium tuberculosis w znakowanej fluorescencyjnie komórce gospodarza za pomocą zautomatyzowanej mikroskopii konfokalnej.

Mikroskopowy test fenotypowy do oznaczania ilościowego prątków wewnątrzkomórkowych przystosowany do badań przesiewowych o wysokiej przepustowości/wysokiej zawartości

Opracowano wysokoprzepustowy test in vitro fenotypu Salmonelli lub innych bakterii asocjacyjnych, inwazyjnych i replikacyjnych w komórkach fagocytarnych o wysokiej przepustowości. Metodę wykorzystano do oceny zmutowanych szczepów z nokautem genu Salmonelli pod kątem ich udziału w interakcjach gospodarz-patogen.

Wysokoprzepustowy test na fenotyp Salmonella enterica Typhimurium asocjacji, inwazji i replikacji w makrofagach

Ten artykuł opisuje metody syntezy i fluorescencyjnego znakowania nanocząstek (NP). Nanocząsteczki zastosowano w eksperymentach z pogonią za impulsami w celu oznaczenia układu endolizosomalnego komórek eukariotycznych. Manipulację układu endo-lizosomalnego przez aktywność wewnątrzkomórkowego patogenu Salmonella enterica przeprowadzono następnie za pomocą obrazowania żywych komórek i określono ilościowo.

Zastosowanie nanocząstek fluorescencyjnych do badania przebudowy układu endolizosomalnego przez bakterie wewnątrzkomórkowe

Opisujemy kwantyfikację cytozolowej i wakuolarnej Salmonella typhimurium w makrofagach pochodzących ze szpiku kostnego za pomocą różnicowej przepuszczalności digitoniny.

Kwantyfikacja cytozolowej i wakuolarnej salmonelli w pierwotnych makrofagach przez różnicową przepuszczalność

Celem przedstawionej tutaj metody jest pokazanie, jak mikromacierze mikrośrodowiskowe (MEMA) mogą być wytwarzane i wykorzystywane do badania wpływu tysięcy prostych mikrośrodowisk kombinatorycznych na fenotyp hodowanych komórek.

Wykorzystanie mikromacierzy do badania wpływu mikrośrodowiska na fenotypy komórkowe w raku

To badanie przedstawia ilościowe pomiary wielkości i lokalizacji synaptycznej, morfologii mięśni i kształtu mitochondriów u C. elegans przy użyciu swobodnie dostępnych narzędzi do przetwarzania obrazów. Takie podejście pozwala przyszłym badaniom nad C. elegans na ilościowe porównanie zakresu zmian strukturalnych tkanek i organelli w wyniku mutacji genetycznych.

Ilościowe podejścia do badania struktur komórkowych i morfologii organelli u Caenorhabditis elegans

Poniższy protokół opisuje rozwój i optymalizację wysokoprzepustowego przepływu pracy dla hodowli robaków, obrazowania fluorescencyjnego i automatycznego przetwarzania obrazów w celu ilościowego określenia agregatów poliglutaminy jako oceny zmian w proteostazie.

Automatyzacja zagregowanej kwantyfikacji u Caenorhabditis elegans

Drożdże rozszczepienia są tutaj używane jako heterologiczne gospodarze do ekspresji bakteryjnych białek cytoszkieletu, takich jak FtsZ i MreB, jako translacyjnych białek fuzyjnych z GFP, aby uwidocznić ich polimeryzację. Również związki, które wpływają na polimeryzację, są identyfikowane przez obrazowanie za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.

Drożdże rozszczepieniowe jako platforma do badań przesiewowych leków przeciwbakteryjnych ukierunkowanych na białka cytoszkieletu bakteryjnego

Tutaj przedstawiamy instrukcje dotyczące skutecznego wykorzystania SegElegans, systemu głębokiego uczenia, który opracowaliśmy do automatycznego segmentowania pojedynczych robaków na mikroskopii szerokopolowej, do późniejszego wykorzystania w oprogramowaniu do analizy obrazów, takiego jak ImageJ. Oferujemy możliwości korzystania z systemu zarówno online, jak i offline.

Automatyczna analiza obrazów fluorescencyjnych C. elegans z użyciem SegElegans

Poznaj zautomatyzowaną analizę fenotypów Salmonella w komórkach nabłonka jelitowego przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej i ImageJ. Ta ilościowa metoda wysokoprzepustowa umożliwia skalowalne badanie wielu szczepów bakteryjnych.

Automatyczna analiza wewnątrzkomórkowych fenotypów salmonelli za pomocą ImageJ

Przeglądaj więcej filmów