Automatyczna analiza wewnątrzkomórkowych fenotypów salmonelli za pomocą ImageJ
9 sierpnia 2022
Salmonella atakuje i replikuje się wewnątrz komórek nabłonka jelitowego zarówno w wakuolach specyficznych dla Salmonelli, jak i w wolnych w cytozolu (hiperreplikacja). Opisano tutaj wysokoprzepustowy protokół oparty na mikroskopii fluorescencyjnej w celu ilościowego określenia wewnątrzkomórkowych fenotypów Salmonelli za pomocą dwóch uzupełniających się analiz obrazu za pomocą ImageJ, osiągając rozdzielczość pojedynczej komórki i punktację.
Ta metoda mikroskopii fluorescencyjnej określa ilościowo fenotypy salmonelli w komórkach nabłonka jelitowego w zautomatyzowany sposób, umożliwiając badanie salmonelli na dużej liczbie szczepów ze skalowalną rozdzielczością. Nasza metoda ma tę zaletę, że jest ilościowa, wysokoprzepustowa i jednocześnie zautomatyzowana, opierając się zarówno na analizie obszarowej, jak i pojedynczej komórki. Zachowanie wewnątrzkomórkowe ma kluczowe znaczenie dla interakcji gospodarz-patogen wielu bakterii.
Naszą metodę można łatwo dostosować do patogenów bakteryjnych innych niż salmonella, przyczyniając się do zrozumienia ich patogenezy. Po uzyskaniu obrazów przeprowadź analizę pojedynczej komórki, otwierając akwizycję. czi w ImageJ.
Podziel kanały, klikając obraz i wybierając Kolor, a następnie Podziel kanały. W przypadku segmentacji komórek wybierz obraz płaszczyzny Z w oknie tytułu akwizycji C1. Wybierz okno tytułu akwizycji C1 i kliknij obraz, a następnie duplikat.
Następnie wpisz numer wybranej płaszczyzny Z. Wpisz C1Zplane w polu tytułu, odznacz Duplikuj stos i kliknij OK, aby zduplikować tylko wybrany obraz płaszczyzny Z. Otworzy się okno o nazwie C1Zplane pokazujące wybrany obraz płaszczyzny Z.
Teraz zwiększ kontrast uzyskanego obrazu C1Zplane, wybierając opcję Process (Przetwarzaj) i klikając przycisk Enhance Contrast (Zwiększ kontrast). Dostosuj nasycone piksele, zaznacz opcję Normalizuj i kliknij przycisk OK, aby zastosować technikę poprawy kontrastu w celu uzyskania obrazu C1Zplane ze znormalizowanym kontrastem. Przejdź do Procesu i kliknij Znajdź maksima, aby podzielić komórki nabłonka na znormalizowany kontrastowo obraz C1Zplane.
Następnie, aby przypisać tylko jeden punkt maksimum do każdej komórki nabłonka, oznacz flagę wyboru Punkt podglądu i ustaw tolerancję szumu. Aby uzyskać obraz podzielony na segmenty C1Zplane, nowy obraz przypominający maskę binarną, który pokazuje każdą cząstkę podzieloną na segmenty na zaznaczony punkt maksimum, oznacz maksima krawędzi wykluczenia, wybierz cząstki podzielone na segmenty jako typ wyjściowy i kliknij przycisk OK. Następnie utwórz maskę komórek podzielonych na segmenty w obrazie podzielonym na segmenty C1Zplane. Kliknij przycisk Analizuj, a następnie Analizuj cząstki, a następnie wybierz opcje Pokaż maski i Wyklucz na krawędziach.
Ustaw przedział rozmiaru i kliknij OK, aby uzyskać maskę segmentowanej maski binarnej C1Zplane. Kliknij tabelę odnośników i wybierz opcję Odwróć tabelę przeglądową na pasku narzędzi. Aby określić próg obrazu C1Zplane ze znormalizowanym kontrastem, przejdź do obrazu, wybierz Dostosuj, wybierz Próg i sprawdź ciemne tło.
Ustaw ustawienie automatycznego progu na domyślne i wybierz opcję czerwoną. Dostosuj minimalną wartość odcięcia, aż komórki staną się całkowicie czerwone, pozostawiając ciemne tło. Kliknij przycisk Zastosuj, aby przekonwertować obraz C1Zplane ze znormalizowanym kontrastem na obraz binarny z komórkami w kolorze białym i tłem w kolorze czarnym.
Ponadto, aby poprawić segmentację komórek w masce segmentowanej maski binarnej C1Zplane, wybierz Proces i kliknij Kalkulator obrazów. Następnie wybierz maskę C1Zplane podzieloną na segmenty jako obraz pierwszy, wybierz operację AND z listy rozwijanej i wybierz progową płaszczyznę C1Zplane ze znormalizowanym kontrastem jako obraz drugi. Kliknij przycisk OK, a ImageJ automatycznie nazwie obraz wyjściowy jako wynik Maska C1Zplane Segmented.
Aby oznaczyć każdą pojedynczą komórkę C1Zplane jako obszar zainteresowania, kliknij przycisk Analizuj, a następnie pozycję Analizuj cząstki. Dostosuj rozmiar, jak pokazano wcześniej, i wybierz opcję pokaż nic. Dodaj wszystkie cząsteczki do narzędzia do zarządzania zwrotem z inwestycji, zaznaczając opcję Dodaj do menedżera.
Zaznacz również opcję Wyklucz na krawędziach i kliknij przycisk OK. Zapisz dane ROI jako roi-cells-acquisitiontitle. Przejrzyj menu menedżera ROI, klikając Więcej i wybierając Zapisz. Po zakończeniu segmentacji komórek pracuj nad oknem tytułu akwizycji C2, aby przeanalizować salmonellę wakuolarną.
Najpierw przejdź do Procesu, kliknij Kalkulator obrazów, wybierz tytuł akwizycji C2 jako obraz pierwszy i wybierz operację Odejmij z listy rozwijanej. Następnie wybierz tytuł akwizycji C3 jako obraz drugi, zaznacz opcję Utwórz nowe okno i kliknij przycisk OK. Zastosuj odejmowanie do całego stosu Z, klikając przycisk Tak w oknie Process Stack (Stos procesów). Zduplikuj wyniki w oknie tytułu akwizycji C2, klikając menu Obraz i wybierając Duplikuj.
Następnie zaznacz zduplikowany stos i naciśnij OK, aby uzyskać wyniki akwizycji C2 title one window. Zastosuj rozmycie gaussowskie do wyników akwizycji C2 w jednym oknie, przechodząc do Procesu, klikając Filtr i wybierając Rozmycie gaussowskie. Pozostaw wartość Sigma jako dwa lub dostosuj ją.
Kliknij OK i zastosuj rozmycie gaussowskie do całego stosu Z, klikając Tak w oknie Stosu procesów. Odejmij przefiltrowane Gaussa wyniki tytułu akwizycji C2 od wyników tytułu akwizycji C2, klikając Process (Proces) i wybierając Image Calculator (Kalkulator obrazów). Teraz wybierz wyniki tytułu akwizycji C2 jako obraz pierwszy, wybierz operację Odejmij z listy rozwijanej, wybierz wyniki tytułu akwizycji C2 jeden jako obraz drugi i kliknij OK. Zastosuj odejmowanie do całego stosu Z, klikając przycisk Tak w oknie Process Stack (Stos procesów), aby uzyskać okno automatycznie nazwane przez ImageJ jako wyniki wyników akwizycji C2 title.
Aby oddzielić salmonelle od tła wyników wyników akwizycji C2 tytuł, kliknij obraz, wybierz Dostosuj, a następnie kliknij Próg. Następnie sprawdź ciemne tło i ustaw automatyczny próg na Otsu. Dostosuj minimalną wartość odcięcia, aż salmonelle staną się całkowicie czerwone, pozostawiając ciemne tło.
Kliknij Zastosuj, a otworzy się okno o nazwie Konwertuj na binarne. Sprawdź czarne tło i kliknij OK. Wybierz środkową płaszczyznę Z odpowiadającą wewnątrzkomórkowej płaszczyźnie ogniskowania salmonelli w wynikach binarnego okna wyników akwizycji C2. Kliknij obraz, a następnie Stosy, a następnie wybierz Ustaw plasterek.
Teraz wpisz numer wybranej płaszczyzny Z i kliknij OK. Następnie ustaw pomiary do zarejestrowania dla każdego zwrotu z inwestycji, klikając przycisk Analizuj i wybierając opcję Ustaw pomiar. Następnie sprawdź obszar odpowiadający całkowitemu obszarowi każdego ROI. Aby zarejestrować ułamek obszaru zajmowany przez piksele progowe dla każdego ROI, sprawdź Ułamek powierzchni i Ogranicz do progu.
Sprawdź etykietę Wyświetlanie, aby oznaczyć każdy zwrot z inwestycji tytułem obrazu, kanałem, płaszczyzną Z i współrzędnymi X/Y. Użyj wybranej płaszczyzny Z wewnątrzkomórkowych salmonelli, aby zapisać etykiety, obszar i procentowy obszar zajmowany przez salmonelle dla każdej pojedynczej komórki. Otwórz roi-cells-acquisitiontitle.
zip, klikając menu Plik i wybierając opcję Otwórz. Następnie kliknij Mierz w menu Menedżer ROI. Wynikiem jest tabela przedstawiająca wybrane pomiary.
Na koniec zapisz tabelę wyników, wybierając plik i klikając Zapisz jako w oknie wyników. Inwazję komórkową, obciążenie wakuolarne i cytozolową hiperreplikację salmonelli uwidoczniono wewnątrz komórek nabłonkowych. Analiza obszaru wykazała znacznie wyższy współczynnik infekcji Salmonella typhimurium w porównaniu z obydwoma szczepami Salmonella derby, wykazując skuteczność analizy obszaru w wykrywaniu różnic w zdolności szczepów salmonelli do kolonizacji komórek nabłonka.
Zmutowany szczep Salmonella derby z delecją sipA wykazywał zmniejszony współczynnik hiperreplikacji w porównaniu z Salmonella derby typu dzikiego, co jest zgodne z rolą sipA w indukowaniu hiperreplikacji. Nie zaobserwowano różnicy w hiperreplikacji między Salmonellą typhimurium a Salmonellą derby typu dzikiego. Analiza pojedynczych komórek nie wykazała istotnej różnicy w odsetku zakażonych komórek w szczepach Salmonella derby w porównaniu z Salmonellą typhimurium.
W przeciwnym razie szczepy Salmonella derby generowały średnie obciążenie wakuolarne znacznie niższe niż Salmonella typhimurium. Nie zaobserwowano różnicy między Salmonellą typhimurium a Salmonellą derby typu dzikiego, podczas gdy Salmonella derby sipA wykazywała znaczny spadek hiperreplikacji, zgodny z wynikiem analizy obszaru. Salmonella obejmuje kilka serowarów o zróżnicowanej zjadliwości.
Badanie dużej liczby szczepów za pomocą tej szybkiej i zautomatyzowanej metody w znacznym stopniu przyczynia się do zrozumienia rzeczywistego potencjału wirulencji tego patogenu.
Przegląd
Ten artykuł przedstawia metodę fluorescencyjnej mikroskopii o wysokiej wydajności do ilościowego określania fenotypów Salmonella wewnątrz komórek nabłonka jelitowego. Protokół pozwala na zautomatyzowaną analizę, umożliwiając badanie wielu szczepów z skalowalną rozdzielczością.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Mikrobiologia
- Interakcje patogen-gospodarz
- Wizualizacja komórkowa
Tło
- Salmonella inwazja na komórki nabłonka jelitowego, replikując się w wakuolach i cytozolu.
- Zrozumienie zachowania wewnątrzkomórkowego jest kluczowe dla badania interakcji gospodarz-patogen.
- Istniejące metody mogą brakować automatyzacji i skalowalności.
- To badanie radzi sobie z tymi luki za pomocą ilościowego podejścia.
Cel badania
- Rozwój metody o wysokiej wydajności do ilościowego określania fenotypów Salmonella.
- Ułatwienie analizy dużej liczby szczepów bakteryjnych.
- Dostarczenie protokołu przystosowanego do innych patogenów bakteryjnych.
Stosowane metody
- Mikroskopia fluorescencyjna do pozyskiwania obrazów.
- Oprogramowanie ImageJ do analizy pojedynczych komórek i obszarów.
- Segmentacja komórek nabłonkowych i ilościowa ocena Salmonella wewnątrzkomórkowej.
- Automatyczne przetwarzanie stosów Z do kompleksowej analizy.
Główne wyniki
- Sukces w ilościowym określaniu fenotypów Salmonella na poziomie pojedynczych komórek.
- Zudokumentowana skalowalność dla analizy wielu szczepów.
- Dostarczenie robustnej metody przystosowanej do innych badań bakteryjnych.
- Ulepszone zrozumienie zachowania Salmonella wewnątrz komórek.
Wnioski
- Rozwijana metoda jest ilościowa, o wysokiej wydajności i zautomatyzowana.
- W znacznym stopniu przyczynia się do badania patogenezy bakteryjnej.
- Przyszłe zastosowania mogą obejmować różne patogeny bakteryjne.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Automated quantification of intracellular Salmonella phenotypes using ImageJ enables scalable, high-throughput analysis of host-pathogen interactions in epithelial cells. This approach supports robust, quantitative assessment of bacterial replication modes, directly informing early discovery and target validation for anti-infective strategies. The method's adaptability and throughput facilitate portfolio-wide screening and mechanistic de-risking in infectious disease R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables quantitative interrogation of Salmonella replication phenotypes within host cells.
- Supports mechanistic de-risking by distinguishing vacuolar versus cytosolic bacterial behavior.
- Facilitates comparative analysis across multiple strains for functional target validation.
- Provides data-driven insights for prioritizing anti-infective targets.
Screening & Assay Development
- Delivers high-throughput, automated scoring of infection phenotypes suitable for screening campaigns.
- Standardizes image analysis workflows, improving reproducibility and assay scalability.
- Generates quantitative outputs for reliable compound or genetic perturbation evaluation.
- Enables batch processing and platform reuse across diverse experimental sets.
Translational & Preclinical Research
- Aligns phenotypic outputs with disease-relevant intracellular infection models.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by enabling large-scale strain comparisons.
- Provides mechanistic data to inform risk-adjusted advancement decisions in anti-infective pipelines.
Pipeline & Workflow Integration
This automated image analysis protocol integrates from early discovery through lead identification, supporting both hypothesis testing and screening in infectious disease research.
- Discovery Biology: Quantifies intracellular bacterial load and replication mode, clarifying host-pathogen pathways.
- Screening: Enables high-throughput, reproducible scoring of infection phenotypes for compound or genetic screens.
- Analytics: Provides single-cell and population-level quantitative outputs for robust statistical comparison.
- Translational Research: Connects in vitro phenotypes to disease-relevant infection models for preclinical alignment.
- Enterprise Reuse: Adaptable to other bacterial pathogens, supporting broad R&D utility.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation and reduces mechanistic ambiguity in infection models.
- Operational Value: Automates and standardizes image analysis, enhancing reproducibility and throughput.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by enabling robust, scalable phenotypic screening.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of anti-infective candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescence microscopy and image analysis using ImageJ.
- Needs access to automated imaging platforms and computational infrastructure for batch processing.
- Demands cross-team standardization of imaging and analysis parameters for reproducibility.
- Adaptable to various bacterial pathogens and cell models with protocol optimization.
- Throughput and resolution may be limited by imaging hardware and sample preparation quality.
