Zastosowanie nanocząstek fluorescencyjnych do badania przebudowy układu endolizosomalnego przez bakterie wewnątrzkomórkowe

Ogólnym celem tej procedury jest zbadanie przebudowy końcowego układu lizosomalnego przez bakterie wewnątrzkomórkowe wykorzystujące nanocząstki fluorescencyjne jako znaczniki. Osiąga się to poprzez pierwszy wysiew komórek heela w szkiełku z ośmioma dołkami i inkubację przez noc. Drugim krokiem jest zakażenie komórek salmonellą i taricą.

Następnie przeprowadza się znakowanie impulsowe zainfekowanych komórek gospodarza poprzez inkubację z nanocząstkami złota BSA Rumine. Ostatnim krokiem jest obserwacja zmian w układzie endosomalnym komórki gospodarza za pomocą mikroskopii konfokalnej. Ostatecznie kwantyfikacja wewnątrzkomórkowego rozmieszczenia nanocząstek odbywa się przy użyciu pakietu oprogramowania MRS.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak mikroskopia immunologiczna, jest to, że n zakażonych komórek jest analizowanych za pomocą metody, która może zapewnić wgląd w wewnątrzkomórkowy styl życia terica. Jednak może być również stosowany do innych patogenów wewnątrzkomórkowych, takich jak gatunki Gaia, Ella Prolia lub mycobacterium tuberculosis. Może być również stosowany do innych typów komórek gospodarza, takich jak mikro feh, linie komórkowe lub komórki pierwotne.

Synteza 10-nanometrowych nanocząstek złota lub NPS wymaga dwóch roztworów, roztworu A i roztworu, B.To przygotować roztwór A, dodaj dwa mililitry 1% wodnego chlorku złota do 160 mililitrów mili Q wody. Przygotuj roztwór B, dodając osiem mililitrów 1% dwuwodnego cytrynianu trisodowego i 160 mikrolitrów 1% kwasu garbnikowego do 32 mililitrów wody mili Q. Roztwory A i B podgrzewamy do 60 stopni Celsjusza, a następnie mieszamy mieszając.

Ciemnoniebieski kolor należy zaobserwować natychmiast po około 15 minutach. W tym momencie roztwór powinien przybrać czerwony kolor. Podgrzej roztwór do 95 stopni Celsjusza.

Trzymaj go w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez pięć minut, a następnie schłodzić roztwór do temperatury pokojowej. Przygotuj złoty kawałek do powlekania i etykietowania, dodając 900 mikrolitrów złota MPS do 1,5-mililitrowej probówki einor i odwirowując przy 15 000 Gs przez 30 minut. Wyrzuć supernatant i ponownie zawieś osad w 900 mikrolitrach wysterylizowanej wody MQ.

Dodaj 100 mikrolitrów roztworu BSA i mieszaj w wirze przy 800 obr./min przez 30 minut. Usunąć nadmiar BSA, odwirowując preparat w temperaturze 15 000 g przez 60 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić złoty BSA NPS i 125 mikrolitrów PBS.

Dodaj 12,5 mikrolitra jednego molowego wodorowęglanu. R domine n hydroksy CIN roztwór lub roztwór NHS przygotowuje się w DMSO bezpośrednio przed. Stosować w 15 mikrolitrach roztworu R DOMINE N-H-S-D-M-S-O na 0,5 mililitra złotej zawiesiny BSA NP.

Inkubować reakcję przez dwie godziny w temperaturze pokojowej, mieszając z prędkością 800 obr./min i unikając ekspozycji na światło. Następnie oczyść złoto BSA żwacz NPS poprzez dializę przeciwko PBS w temperaturze czterech stopni Celsjusza z pięcioma zmianami bufora w okresie od 36 do 48 godzin po oczyszczeniu, ustabilizować NPS, dodając 10 mikrolitrów B-S-A-P-B-S do każdego mililitra złota BSA RUMINE NPS, aby usunąć wolną lub uwolnioną wirówkę BSA Rumine w temperaturze 15, 000 GS przez 16 minut w czterech stopniach Celsjusza. Resus zawiesić osad w dwóch miligramach na mililitr B-S-A-P-B-S po zmierzeniu gęstości optycznej przy 520 nanometrach lub OD pięciu 20.

Przechowuj złoty BSA Rod Domine NPS w temperaturze czterech stopni Celsjusza, unikając ekspozycji na światło, komórki do tego eksperymentu trwale eksprymują zielone białko fluorescencyjne oznaczone lizosomalną lampą glikoproteinową jedną GFP i są hodowane w DMEM z 10% płodową surowicą cielęcą w temperaturze 37 stopni Celsjusza w atmosferze zawierającej 5% dwutlenku węgla, zasiewaj komórki o gęstości 50, 000 na studzienkę w ośmiodołkowym szkiełku i inkubować przez noc. Bakterią do infekowania komórek hela jest ludzki patogen przewodu pokarmowego, salmonella i tarica. Dla porównania stosuje się dwa zmutowane szczepy.

Wszystkie trzy szczepy zawierają plazmid do konstytutywnej ekspresji wzmocnionego GFP i są hodowane w bulionie LB z odpowiednimi antybiotykami w celu utrzymania plazmidów dla każdego szczepu. Zaszczep pojedynczą kolonię bakterii w trzech mililitrach bulionu LB odpowiednim antybiotykiem i hoduj przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. W warunkach wstrząsania w celu napowietrzenia następnego dnia rozcieńczyć każdą kulturę od jednego do 31 w świeżym bulionie LB i kontynuować wzrost przez trzy i pół godziny.

Aby rozpocząć tę procedurę, zmierz OD 600 bakterii subkultury i rozcieńcz do OD 600 0,2. W jednym mililitrze PBS dodaj odpowiednie ilości bakterii do komórek hela w szkiełku komorowym A 12, aby uzyskać wielokrotność infekcji 100. Inkubować przez 30 minut w inkubatorze komórkowym.

Umyj komórki hela trzykrotnie PBS, aby usunąć niezinternalizowane bakterie. Ten punkt czasu jest ustawiany jako godzina zero po infekcji lub godzina zero pi. Dodaj 300 mikrolitrów świeżej pożywki hodowlanej zawierającej 100 mikrogramów na mililitr gentamycyny do komórek i utrzymuj przez godzinę.

Po godzinie. Zastąp pożywkę pożywką obrazową zawierającą 10 mikrogramów na mililitr gentamycyny. Dodać złoto BSA żwacza NPS do komórek hela, aby uzyskać końcowe stężenie OD pięć 20 0,1.

Inkubować przez godzinę po jednej godzinie. Usuń podłoże i umyj trzy razy PBS. Na koniec dodaj 300 mikrolitrów świeżej pożywki obrazowej zawierającej 10% FCS i 10 mikrogramów na mililitr gentamycyny.

Przez pozostałą część czasu inkubacji obrazowanie komórek w wysokiej rozdzielczości w różnych punktach czasowych odbywa się za pomocą systemu obrazowania konfokalnego, takiego jak konfokalny skaning laserowy lub mikroskop z wirującym dyskiem, z komorą nawilżanego środowiska, przełącznikiem w systemie kontroli temperatury i czekaniem, aż się ustabilizuje. Zoptymalizuj ustawienia obrazowania, takie jak powiększenie, rozdzielczość i rozmiar kroku Z. Stosować odpowiednie ustawienia emisji wzbudzenia dla GFP i złotego BSA w pociągu NPS we wskazanych punktach czasowych po zakażeniu.

Zamontuj 12-komorowy szkiełko podstawowe zawierające zakażone komórki na stoliku mikroskopu i zapisz obrazy w celu analizy obrazów i zbadania przebudowy układu endosomalnego przez wewnątrzkomórkową salmonellę. Korzystaj z oprogramowania do analizy obrazu. Otwórz dane, klikając przycisk Otwórz i wybierając plik na pasku narzędzi obiektów w widoku przewyższającym.

Kliknij ikonę, aby dodać nowy element powierzchni. Aby przeanalizować obszar zainteresowania lub zwrot z inwestycji, wybierz segment tylko regionu zainteresowania, a następnie kliknij przycisk Dalej jako kanał źródłowy. Wybierz kanał trzeci.

Zaznacz opcję wygładzania, aby ustawić gładkość powstałego obszaru. Zdefiniuj wartość ręcznie lub zaakceptuj wartość wygenerowaną automatycznie. Dla progu.

Wybierz opcję intensywności bezwzględnej dla regulacji progu. Wybierz opcję ręczną i ustaw wartość w obszarze wyświetlania. Podgląd progu powierzchni jest wyświetlany w kolorze szarym.

Kliknij dalej na zakładce Klasyfikuje powierzchnie. Uzyskaną powierzchnię można filtrować według różnych kryteriów. Domyślny filtr to liczba otworów w kształcie litery V większa niż 10 innych filtrów można również uwzględnić, klikając przycisk dodaj.

W tym przykładzie filtr domyślny jest używany do ukończenia tworzenia powierzchni. Kliknij Zakończ na liście obiektów. Usuń zaznaczenie pola wyboru dla woluminu elementu.

Nowo utworzona powierzchnia jest teraz wyświetlana w obszarze wyświetlania. Na czerwono wyeksportuj statystyki do pliku Excel, klikając przycisk Zapisz. Złote NPS zsyntetyzowane za pomocą tego protokołu miały kształt quasi-sferyczny i rozmiar około 10 nanometrów.

Powłoka BSA i znakowanie rho dominą nie miały wpływu na ich morfologię ani wielkość. Badanie przebudowy komórkowego układu endosomalnego gospodarza przez salmonellę wewnątrzkomórkową. Komórki Heli zostały pozorowane lub zakażone salmonellą typu dzikiego lub dwoma zmutowanymi szczepami i pulsem ścigano je 10-nanometrowym złotem.

Pręcik BSA dominuje i groszek w niezakażonych komórkach, NPS równomiernie rozmieszczony w późnych endosomach lub lizosomach. W przeciwieństwie do tego, NPS w komórkach zakażonych salmonellą typu dzikiego uległ znacznemu przegrupowaniu po ośmiu godzinach od zakażenia. Utworzono ustabilizowaną sieć włókien lub przesiewów wywołanych salmonellą, a większość mp stwierdzono nagromadzoną w strukturach rurkowych.

Zmutowane szczepy wykazywały odmienne zachowania po ośmiu godzinach od infekcji. Zmutowany szczep SSAV był zamknięty w salmonelli zawierającej VAE lub SCV. Chociaż nie utworzono żadnych przesiewów, większość mp nadal znajdowała się w wolnych późnych endosomach lub lizosomach dla sif.

Nastąpiła ucieczka zmutowanego szczepu salmonelli do cytoplazmy i nie zaobserwowano związku między NPS a bakteriami. Kiedy zbadano dostępność końcowego układu lizosomalnego w różnych fazach zakażenia salmonellą, wyniki pokazują, że we wszystkich przypadkach większość zinternalizowanych NPS nagromadziła się w SCV lub SIF. Można wykonać inne metody, mikroskopijną transmisję szyi.

Może to odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak ultrastruktura lub przedziały błonowe w niektórych nanoinfekowanych komórkach gospodarza. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przygotować nanocząstki fluorescencyjne. Można je wykorzystać do oznaczania przedziałów hostera zmodyfikowanych przez wewnątrzkomórkową salmonellę.