Name: Zastosowanie nanocząstek fluorescencyjnych do badania przebudowy układu endolizosomalnego przez bakterie wewnątrzkomórkowe (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 38 s
Description: Odkryj metodę badania przebudowy układu endolizosomalnego przez Salmonella enterica przy użyciu fluorescencyjnych nanocząstek złota i mikroskopii konfokalnej. Technika umożliwia ilościową analizę zmian w komórkach HeLa.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Deutsche Forschungsgemeinschaft przez grant Z w ramach Sonderforschungsbereich 944 'Fizjologia i dynamika mikrokompartmentów komórkowych' oraz HE1964/18 w ramach programu priorytetowego 1580.

1. Synteza 10 nm nanocząsteczek złota (Au NPs)15
<ol>
	<li>Przygotować roztwór A: dodać 2 ml 1% wodnego chlorku złota do 160 ml wody Milli-Q lub wody dwukrotnie destylowanej.</li>
	<li>Przygotować roztwór B: dodać 8 ml 1% cytrynianu trisodowego x 2 H2O oraz 160 µl 1% kwasu taninowego do 32 ml wody Milli-Q lub wody dwukrotnie destylowanej.</li>
	<li>Podgrzać roztwory A i B do 60 °C, a następnie zmieszać je podczas mieszania. Natychmiast pojawi się ciemnoniebieski kolor. Po około 15 min zaobserwować kolor czerwony. Następnie podgrzać do 95 °C, utrzymać przez 5 min i schłodzić roztwór do RT.</li>
	<li>Nanieść kroplę zawiesiny NP na siatkę pokrytą węglem i pozostawić do wyschnięcia na powietrzu. Sprawdzić wielkość i morfologię NP za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej.</li>
</ol>
2. Powlekanie nanocząsteczek złota BSA i znakowanie rhodaminą z estrem N-hydroksysuccynimidylowym (NHS)16
<ol>
	<li>Do probówki Eppendorf o pojemności 1,5 ml dodać 900 μl nanocząsteczek (NPs) złota, a następnie wirować przy 15 000 x g przez 30 min. Opcjonalnie można przygotować kilka probówek jednocześnie.</li>
	<li>Odlać nadsącz, zawiesić osad w 900 μl sterylnej wody Milli-Q i dodać 100 μl roztworu BSA/PBS o stężeniu 2 mg/ml, a następnie mieszać na vortexie przy 800 rpm przez 30 min.</li>
	<li>Aby usunąć nadmiar BSA, wirować preparat przy 15 000 x g przez 60 min.</li>
	<li>Odlać nadsącz i ponownie zawiesić nanocząsteczki złota-BSA w 125 μl PBS, dodając 12,5 µl wodorowęglanu 1 M.</li>
	<li>Bezpośrednio przed użyciem przygotować roztwór rhodamine NHS/DMSO o stężeniu 10 mg/ml, a następnie dodać 30 µl roztworu rhodamine NHS/DMSO do 1 ml zawiesiny nanocząsteczek złota-BSA. Inkubować reakcję przez 2 h (lub przez noc) w temperaturze pokojowej (RT), mieszając przy 800 rpm i unikając ekspozycji na światło.</li>
	<li>Oczyścić nanocząsteczki złota-BSA-rhodamine poprzez dializę przeciwko PBS w temperaturze 4 ºC z 5-krotną wymianą buforu w okresie od 36 do 48 h.</li>
	<li>Aby ustabilizować nanocząsteczki, dodać 10 μl BSA/PBS o stężeniu 200 mg/ml do każdego 1 ml nanocząsteczek złota-BSA-rhodamine. Aby usunąć wolną lub uwolnioną BSA-rhodamine, wirować przy 15 000 x g przez 60 min. Zawiesić osad w BSA/PBS o stężeniu 2 mg/ml, zmierzyć OD520 i przechowywać w temperaturze 4 °C, unikając ekspozycji na światło.</li>
	<li>Rozcieńczyć nanocząsteczki 10-krotnie wodą Milli-Q lub wodą dwukrotnie destylowaną, nanieść kroplę na siatkę pokrytą węglem i pozostawić do wyschnięcia na powietrzu. Sprawdzić rozmiar i morfologię nanocząsteczek za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM). 
	UWAGA: Wszystkie materiały użyte do przygotowania nanocząsteczek zostały wysterylizowane, a operację przeprowadzono w komorze do hodowli komórek lub na blacie obok płomienia.</li>
</ol>
3. Hodowla komórek HeLa
<ol>
	<li>Komórki HeLa trwale eksponujące LAMP1-GFP hoduje się w pożywce DMEM z 10% płodowej surowicy cielęcej (FCS) w temperaturze 37 °C w atmosferze zawierającej 5% CO2.</li>
	<li>Komórki wysiewa się w gęstości 50 000 na dołek w 8-dołkowej szkiełku z komorami (Ibidi) i inkubuje przez noc (O/N).</li>
</ol>
4. Hodowla bakterii
<ol>
	<li>Użyć szczepu dzikiego (WT) Salmonella enterica serowaru Typhimurium NCTC 12023. Do porównania należy użyć szczepów mutantów ΔssaV z defektem w SPI2-T3SS oraz ΔsifA pozbawionych kluczowego efektora SifA dla SIF. Należy wykorzystać szczepy zawierające plazmid pFPV25.1 do konstytutywnej ekspresji ulepszonego GFP. 
	UWAGA: Szczepy bakteryjne są rutynowo hodowane w bulionie Luria-Bertani (LB) z dodatkiem 50 µg/ml karbenicyliny (WT) oraz LB z dodatkiem 50 µg/ml karbenicyliny i/lub 50 µg/ml kanamycyny (ΔssaV, ΔsifA) w celu utrzymania plazmidów.</li>
	<li>Pojedynczą kolonię bakterii zaszczepić w 3 ml LB z odpowiednimi antybiotykami i inkubować przez noc (O/N) w temperaturze 37 ºC w warunkach wytrząsania w celu napowietrzania, a następnie rozcieńczyć 1:31 w świeżym LB i kontynuować hodowlę przez 3,5 hr. W tym punkcie czasowym kultury osiągają późną fazę logarytmiczną, a bakterie wykazują wysoką inwazyjność. Do inkubacji kultur w probówkach z napowietrzaniem wygodne jest zastosowanie „walca do inkubacji” (roller drum).</li>
</ol>
5. Infekcja komórek HeLa bakteriami Salmonella oraz znakowanie metodą pulse-chase z użyciem nanocząsteczek Gold-BSA-Rhodamine (schemat przedstawiono na Rysunku 1)
<ol>
	<li>Zmierz OD600 subkultur bakterii i rozcieńcz do OD600 = 0.2 w 1 ml PBS (~3 × 108 cfu/ml), a następnie dodaj odpowiednią ilość bakterii do komórek HeLa w szkiełkach komorowych 8-dołkowych, aby uzyskać wielokrotność infekcji (MOI) równą 100.</li>
	<li>Inkubuj przez 30 min w inkubatorze do hodowli komórkowej, przemyj 3 razy PBS w celu usunięcia bakterii niezinternalizowanych (ten punkt czasowy wyznaczono jako 0 h po infekcji, lub 0 h p.i.). Dodaj 300 µl świeżej pożywki hodowlanej zawierającej 100 µg/ml gentamycyny i utrzymuj przez 1 h. Następnie wymień pożywkę na świeżą pożywkę zawierającą 10 µg/ml gentamycyny na pozostały czas inkubacji.</li>
	<li>Po 1-godzinnej inkubacji w pożywce zawierającej 100 µg/ml gentamycyny, pożywkę wymienia się na pożywkę do obrazowania (Eagles MEM bez FCS, L-glutaminy, czerwieni fenolowej i wodorowęglanu sodu, z 30 mM HEPES, pH 7.4) zawierającą 10 µg/ml gentamycyny. Do komórek HeLa dodaje się NP Gold-BSA-rhodamine, aby uzyskać stężenie końcowe OD520 = 0.1. 
	UWAGA: NP Gold-BSA-rhodamine można dodać do komórek również przed infekcją lub w różnych punktach czasowych p.i.</li>
	<li>Po 1 h inkubacji usuń pożywkę, przemyj 3 razy PBS i dodaj 300 µl świeżej pożywki do obrazowania zawierającej 10% FCS i 10 µg/ml gentamycyny na pozostały czas inkubacji. 
	UWAGA: Czas inkubacji może się różnić w zależności od stężenia NP i użytych linii komórkowych. W przypadku makrofagów RAW264.7 zaobserwowano, że 30-minutowa inkubacja z NP w stężeniu OD520 = 0.05 pozwoliła na wystarczającą internalizację.</li>
</ol>
6. Obrazowanie
<ol>
	<li>Do obrazowania o wysokiej rozdzielczości w różnych punktach czasowych należy użyć systemu obrazowania konfokalnego, takiego jak konfokalny mikroskop skanujący (CLSM) lub mikroskop z dyskiem obrotowym (SD), wyposażonego w komorę z kontrolowaną wilgotnością środowiska.</li>
	<li>Włączyć system kontroli temperatury i odczekać do momentu jej stabilizacji. Zoptymalizować ustawienia obrazowania, takie jak powiększenie, prędkość skanowania, rozdzielczość, stos Z (Z-stack) itp. Zastosować odpowiednie ustawienia wzbudzenia/emisji dla GFP oraz nanocząsteczek złoto-BSA-rodamina. W niniejszym protokole należy zastosować prędkość skanowania 400 Hz, rozdzielczość 512 x 512 pikseli oraz wielkość kroku Z wynoszącą 0.25 µm. GFP oraz złoto-BSA-rodaminę należy wzbudzać odpowiednio laserem Ar (488 nm) oraz laserem HeNe (543 nm). Należy dołączyć kanał w świetle przechodzącym (BF) w celu obserwacji kształtu komórek. W przypadku innych systemów mikroskopowych i warunków infekcji ustawienia należy odpowiednio dostosować. 
	UWAGA: Jako źródło światła dla kanału BF zastosowano ten sam laser Ar, a sygnał był wykrywany za pomocą detektora z fotopowielaczem (PMT).</li>
	<li>W wyznaczonych punktach czasowych po infekcji (p.i.) należy umieścić na stole mikroskopu szkiełka z komorami 8-dołkowymi zawierającymi zainfekowane komórki i zarejestrować obrazy.</li>
</ol>
7. Analiza obrazów
<ol>
	<li>Użyj oprogramowania do analizy obrazów mikroskopowych (patrz Tabela Materiały i Sprzęt), aby przeanalizować przebudowę systemu endo-lizosomalnego wywołaną przez wewnątrzkomórkowe Salmonella. Otwórz dane, klikając „Open” i wybierając odpowiedni plik. 
	UWAGA: Do ilościowej analizy obrazów można alternatywnie wykorzystać otwarte pakiety oprogramowania, takie jak ImageJ lub FIJI.</li>
	<li>W pasku narzędzi obiektów w widoku Surpass kliknij ikonę<img alt="Diagram orbitali molekularnych H₂, ilustrujący orbitale wiążące i antywiążące w chemii kwantowej." fo:content-width=".1in" src="/files/ftp_upload/52058/52058icon1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Ikona">, aby dodać nowy element powierzchni. Kliknij <img alt="diagram równowagi statycznej, ΣFx=0, układ mechaniczny, równowaga sił, edukacja fizyczna, analiza wektorowa" fo:content-width=".1in" src="/files/ftp_upload/52058/52058icon2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Ikona"> (Dalej).</li>
	<li>Aby przeanalizować obszar zainteresowania (ROI), wybierz segmentację ROI. W obszarze podglądu ROI jest reprezentowane przez zaznaczony prostokątem fragment nałożony na obraz. Wprowadź wartości w odpowiednie pola x, y i z lub kliknij bezpośrednio strzałki w prostokącie podglądu, aby zmienić rozmiar i położenie ROI. Następnie kliknij <img alt="diagram równowagi statycznej, ΣFx=0, układ mechaniczny, równowaga sił, edukacja fizyczna, analiza wektorowa" fo:content-width=".1in" src="/files/ftp_upload/52058/52058icon2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Ikona"> (Dalej).</li>
	<li>Jako kanał źródłowy wybierz Kanał 3 (sygnał dla NP Gold-BSA-Rhodamine). Zaznacz opcję „smooth”, aby ustawić wygładzenie wynikowego obszaru. Zdefiniuj wartość ręcznie lub zaakceptuj wartość wygenerowaną automatycznie. W przypadku Progu (Threshold) wybierz opcję Intensywności Bezwzględnej (Absolute Intensity).</li>
	<li>W celu dostosowania progu wybierz opcję ręczną i ustaw wartość. W obszarze podglądu podgląd progu powierzchni jest wyświetlany w kolorze szarym.</li>
	<li>W zakładce Klasyfikuj Powierzchnie (Classify Surfaces) wynikową powierzchnię można filtrować według różnych kryteriów. Domyślnym filtrem jest „number of voxels &gt;10”; inne filtry można dodać, klikając „add”. Jeśli filtrowanie nie jest konieczne, usuń wszystkie filtry, klikając przycisk usuwania. Kliknij <img alt="diagram równowagi statycznej, ΣFx=0, układ mechaniczny, równowaga sił, edukacja fizyczna, analiza wektorowa" fo:content-width=".1in" src="/files/ftp_upload/52058/52058icon2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Ikona"> (Dalej).</li>
	<li>Aby zakończyć tworzenie Powierzchni, kliknij <img alt="Diagram równowagi statycznej; równania ΣFx=0, ΣFy=0; analiza układu dźwigni; edukacja fizyczna." fo:content-width=".1in" src="/files/ftp_upload/52058/52058icon3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Ikona"> (Zakończ). W liście Obiektów odznacz teraz pole elementu Volume, a nowo utworzona powierzchnia zostanie wyświetlona w obszarze podglądu.</li>
	<li>Wyeksportuj statystyki. Teraz w widoku Surpass kolor obiektów zmienia się od fioletowego do czerwonego w zależności od ich powierzchni. Tabela „Plot Numbers Area” wyświetla informacje statystyczne (np. numer ID i powierzchnię obiektów). Wyeksportuj wszystkie statystyki powierzchni 1 do pliku Excel, klikając <img alt="Diagram spektroskopowy: rejestracja danych optycznych; niebieski dysk, reprezentacja pamięci cyfrowej." fo:content-width=".1in" src="/files/ftp_upload/52058/52058icon4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Ikona"> (Zapisz).</li>
</ol>

<ol><li>Coto-Garcia, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoparticles+as+fluorescent+labels+for+optical+imaging+and+sensing+in+genomics+and+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Bioanal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Nanoparticles as fluorescent labels for optical imaging and sensing in genomics and proteomics.</a> Anal. Bioanal. Chem. 399, 29-42 (2011).</li>
<li>Xie, J., Lee, S., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoparticle-based+theranostic+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Drug+Deliv.+Rev%22%5BJournal%5D)">Nanoparticle-based theranostic agents.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 62, 1064-1079 (2010).</li>
<li>Ruedas-Rama, M. J., Walters, J. D., Orte, A., Hall, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+nanoparticles+for+intracellular+sensing%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chim.+Acta%22%5BJournal%5D)">Fluorescent nanoparticles for intracellular sensing: a review.</a> Anal. Chim. Acta. 751, 1-23 (2012).</li>
<li>Wu, C., Chiu, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+fluorescent+semiconducting+polymer+dots+for+biology+and+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed.+Engl%22%5BJournal%5D)">Highly fluorescent semiconducting polymer dots for biology and medicine.</a> Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 52, 3086-3109 (2013).</li>
<li>Giepmans, B. N., Deerinck, T. J., Smarr, B. L., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlated+light+and+electron+microscopic+imaging+of+multiple+endogenous+proteins+using+Quantum+dots%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Correlated light and electron microscopic imaging of multiple endogenous proteins using Quantum dots.</a> Nat. Methods. 2, 743-749 (2005).</li>
<li>Kumar, D., Saini, N., Jain, N., Sareen, R., Pandit, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gold+nanoparticles%3A+an+era+in+bionanotechnology%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin.+Drug+Deliv%22%5BJournal%5D)">Gold nanoparticles: an era in bionanotechnology.</a> Expert Opin. Drug Deliv. 10, 397-409 (2013).</li>
<li>Dykman, L. A., Khlebtsov, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uptake+of+engineered+gold+nanoparticles+into+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Rev%22%5BJournal%5D)">Uptake of engineered gold nanoparticles into mammalian cells.</a> Chem. Rev. 114, 1258-1288 (2014).</li>
<li>Chithrani, B. D., Ghazani, A. A., Chan, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+the+size+and+shape+dependence+of+gold+nanoparticle+uptake+into+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Determining the size and shape dependence of gold nanoparticle uptake into mammalian cells.</a> Nano Lett. 6, 662-668 (2006).</li>
<li>Finlay, B. B., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploitation+of+mammalian+host+cell+functions+by+bacterial+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Exploitation of mammalian host cell functions by bacterial pathogens.</a> Science. 276, 718-725 (1997).</li>
<li>Bhavsar, A. P., Guttman, J. A., Finlay, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manipulation+of+host-cell+pathways+by+bacterial+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Manipulation of host-cell pathways by bacterial pathogens.</a> Nature. 449, 827-834 (2007).</li>
<li>Malik-Kale, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salmonella+-+at+home+in+the+host+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Salmonella - at home in the host cell.</a> Front. Microbiol. 2, 125(2011).</li>
<li>Rajashekar, R., Liebl, D., Seitz, A., Hensel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+remodeling+of+the+endosomal+system+during+formation+of+Salmonella-induced+filaments+by+intracellular+Salmonella+enterica%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Dynamic remodeling of the endosomal system during formation of Salmonella-induced filaments by intracellular Salmonella enterica.</a> Traffic. 9, 2100-2116 (2008).</li>
<li>Schroeder, N., Mota, L. J., Meresse, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salmonella-induced+tubular+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Salmonella-induced tubular networks.</a> Trends Microbiol. 19, 268-277 (2011).</li>
<li>Drecktrah, D., Knodler, L. A., Howe, D., Steele-Mortimer, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salmonella+trafficking+is+defined+by+continuous+dynamic+interactions+with+the+endolysosomal+system%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Salmonella trafficking is defined by continuous dynamic interactions with the endolysosomal system.</a> Traffic. 8, 212-225 (2007).</li>
<li>Slot, J. W., Geuze, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+method+of+preparing+gold+probes+for+multiple-labeling+cytochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A new method of preparing gold probes for multiple-labeling cytochemistry.</a> Eur. J. Cell Biol. 38, 87-93 (1985).</li>
<li>Zhang, Y., Hensel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+nanoparticles+as+endocytic+tracers+in+cellular+microbiology%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Evaluation of nanoparticles as endocytic tracers in cellular microbiology.</a> Nanoscale. 5, 9296-9309 (2013).</li>
<li>Pollard, T. D., Earnshaw, W. C., Lippincott-Schwartz, J. Chapter 22. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPollard%2C+TD+%22Cell+Biology%22">Cell Biology</a>. , (2007).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22LysoTracker+and+LysoSensor+Probes%22">LysoTracker and LysoSensor Probes</a>. , Life Technologies Corporation. Carlsbad, CA. (2013).</li>
<li>Shi, H., He, X., Yuan, Y., Wang, K., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoparticle-based+biocompatible+and+long-life+marker+for+lysosome+labeling+and+tracking%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Nanoparticle-based biocompatible and long-life marker for lysosome labeling and tracking.</a> Anal. Chem. 82, 2213-2220 (2010).</li>
<li>Hensel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+encoding+putative+effector+proteins+of+the+type+III+secretion+system+of+Salmonella+pathogenicity+island+2+are+required+for+bacterial+virulence+and+proliferation+in+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Genes encoding putative effector proteins of the type III secretion system of Salmonella pathogenicity island 2 are required for bacterial virulence and proliferation in macrophages.</a> Mol. Microbiol. 30, 163-174 (1998).</li>
<li>Beuzon, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salmonella+maintains+the+integrity+of+its+intracellular+vacuole+through+the+action+of+SifA%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Salmonella maintains the integrity of its intracellular vacuole through the action of SifA.</a> EMBO J. 19, 3235-3249 (2000).</li>
</ol>

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Endolizosomalny układ komórek ssaków kontroluje ważne procesy fizjologiczne, w tym wchłanianie składników odżywczych, transdukcję sygnału za pośrednictwem hormonów, nadzór immunologiczny i prezentację antygenu17. Do tej pory do znakowania szlaku endocytarnego i śledzenia badań stosowano różne markery. Na przykład sondy LysoTracker to fluorescencyjne sondy acidotropowe opracowane przez Molecular Probes (Life Technologies, USA) do znakowania lizosomów, które mogą selektywnie gromadzić się w przedziałach komórkow...

Fluorescencyjne nanocząstki (NPs), w tym nanocząsteczki metali, kropki kwantowe, NP-NP-y polimerowe, NP-y krzemionkowe, kropki węglowe, itd., przyciągnęły znaczną uwagę w ciągu ostatnich dziesięcioleci1,2. W porównaniu z tradycyjnymi barwnikami organicznymi, fluorescencyjne nanocząsteczki wykazują pożądane właściwości chemiczne, optyczne i mechaniczne, takie jak silna siła sygnału, odporność na fotowybielanie i wysoka biokompatybilność3,4. Te zalety sprawiają, że są one metodą z wyboru do wykrywania wewnątrzkomórkowego i obrazowania żywych komórek. Co więcej, za pomocą mikroskopii elektronowej (EM) można dostrzec różne gęste elektronowo nanocząsteczki, co ułatwia ich wykorzystanie do skorelowanej analizy mikroskopowej, co umożliwia połączenie śledzenia żywych komórek z mikroskopią świetlną (LM) i wyższą rozdzielczość na poziomie ultrastrukturalnym za pomocą EM5. Na przykład nanocząsteczki złota od dawna są skutecznie wykorzystywane jako bioczujniki w żywych komórkach do czułej diagnostyki, a także w dziedzinie znakowania immunologicznego6. Ostatnie badania wskazują, że nanocząsteczki złota o różnej wielkości i kształcie mogą być łatwo wchłaniane przez wiele różnych linii komórkowych i rutynowo transportowane przez szlak endosomalny, dlatego mają ogromny potencjał do zastosowania w śledzeniu transportu pęcherzyków wewnątrzkomórkowych i znakowaniu systemu endolizomalnego7,8.
Patogeny mikrobiologiczne, takie jak Salmonella enterica, Shigella flexneri i Listeria monocytogenes, rozwinęły różne mechanizmy inwazji na niefagocytarne komórki gospodarza9. Po internalizacji patogeny, zlokalizowane w cytozolu lub sekwestrowane w przedziałach związanych z błoną, intensywnie oddziałują ze środowiskiem gospodarza i modulują je, aby sprzyjać własnemu przetrwaniu10. Na przykład Salmonella enterica rezyduje i replikuje się w wewnątrzkomórkowym przedziale fagosomalnym zwanym wakuolą zawierającą Salmonellę (SCV) po zakażeniu11. Dojrzewający SCV przemieszcza się w kierunku aparatu Golgiego, przechodząc ciągłe interakcje ze szlakiem endocytarnym i indukuje tworzenie rozległych struktur kanalikowych, takich jak włókna indukowane przez Salmonellę (SIF), kanaliki sortujące nexiny, kanaliki wydzielnicze białka błony nośnej 3 indukowane przez Salmonellę (SCAMP3) itp.12-14. Badanie, w jaki sposób te patogeny bakteryjne manipulują szlakami komórkowymi gospodarza, jest niezbędne do zrozumienia chorób zakaźnych.
Tutaj NPs gold-BSA-rhodamine zostały użyte jako znaczniki płynów do oznaczania komórkowego systemu endo-lizosomalnego gospodarza, a ludzki patogen żołądkowo-jelitowy Salmonella enterica serowar Typhimurium (Salmonella) został użyty jako bakteria modelowa do badania interakcji patogenu ze szlakiem endocytarnym gospodarza. Wewnątrzkomórkowe nanocząsteczki złota-BSA-rodaminy w komórkach niezakażonych i komórkach zakażonych WT Salmonellą lub zmutowanymi szczepami obrazowano za pomocą konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego (CLSM). Następnie wykorzystano oprogramowanie Imaris do ilościowego określenia rozmieszczenia nanocząsteczek, co wskazuje, że zakażenie Salmonellą wywołało ekstremalną rearanżację endosomów/lizosomów. Podążając za opisem tej metody, analogiczne eksperymenty można zaprojektować w celu śledzenia długoterminowych losów zinternalizowanych nanocząsteczek oraz zbadania wpływu różnych substancji egzogennych lub czynników endogennych na szlak endocytarny komórek eukariotycznych.

<table><tbody><tr><td>Chlorek złota</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>520918</td><td></td></tr><tr><td>Kwas garbnikowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>403040</td><td></td></tr><tr><td>Cytrynian trójsodowy</td><td>Sigma</td><td>C8532</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>NHS-Rhodamine</td><td>Pierce</td><td>46406</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Gentamycyna</td><td>Applichem</td><td>A1492</td><td></td></tr><tr><td>Kanamcyin</td><td>Roth</td><td>T832</td><td></td></tr><tr><td>Carbenicillin</td><td>Roth</td><td>6344</td><td></td></tr><tr><td>8-dołkowe szkiełka komorowe</td><td>Ibidi</td><td>80826</td><td>poddane hodowli tkankowej, sterylne</td></tr><tr><td>oprogramowanie Imaris</td><td>Bitplane</td><td>w wersji 7.6</td><td>dostępne różne konfiguracje</td></tr></tbody></table>

zastosowanie nanocząstek fluorescencyjnych do badania przebudowy układu endolizosomalnego przez bakterie wewnątrzkomórkowe

Application of Fluorescent Nanoparticles to Study Remodeling of the Endo-lysosomal System by Intracellular Bacteria

Fluorescencyjne nanocząstki (NP) o pożądanych właściwościach chemicznych, optycznych i mechanicznych są obiecującymi narzędziami do oznaczania organelli wewnątrzkomórkowych. W tym miejscu wprowadzamy metodę wykorzystującą nanocząsteczki złoto-BSA-rodaminy do znakowania endo-lizosomalnego układu komórek eukariotycznych i monitorowania manipulacji szlakami komórkowymi gospodarza przez wewnątrzkomórkowy patogen Salmonella enterica. Nanocząsteczki były łatwo internalizowane przez komórki HeLa i lokalizowane w późnych endosomach / lizosomach. Zakażenie Salmonellą wywołało przegrupowanie pęcherzyków i akumulację NP w strukturach błonowych wywołanych przez Salmonellę. Wdrożyliśmy pakiet oprogramowania Imaris do analiz ilościowych obrazów z mikroskopii konfokalnej. Liczba obiektów i ich rozkład wielkości w komórkach niezakażonych różniły się od tych w komórkach zakażonych Salmonellą, co wskazuje na ekstremalną przebudowę układu endolizomalnego przez WT Salmonella.

Nanocząstki złota (Au NPs) zostały wytworzone przy użyciu sprawdzonej metody redukcji kwasu chloroaurowego cytrynianem i kwasem taninowym. Jak pokazano na Rysunku 2A, zsyntetyzowane nanocząstki złota miały kształt quasi-sferyczny o rozmiarze około 10 nm. Powlekanie BSA i znakowanie rodaminą nie wpłynęło na ich morfologię ani rozmiar (Rysunek 2B).
Doniesiono, że nanocząsteczki (NP) złota mogą być łatwo pobierane przez różne komórki ssaków i trafiać do systemów ...

Ten artykuł opisuje metody syntezy i fluorescencyjnego znakowania nanocząstek (NP). Nanocząsteczki zastosowano w eksperymentach z pogonią za impulsami w celu oznaczenia układu endolizosomalnego komórek eukariotycznych. Manipulację układu endo-lizosomalnego przez aktywność wewnątrzkomórkowego patogenu Salmonella enterica przeprowadzono następnie za pomocą obrazowania żywych komórek i określono ilościowo.

Zastosowanie nanocząstek fluorescencyjnych do badania przebudowy układu endolizosomalnego przez bakterie wewnątrzkomórkowe

Fluorescent nanoparticles (NPs) with desirable chemical, optical and mechanical properties are promising tools to label intracellular organelles. Here, we ...

Ogólnym celem tej procedury jest zbadanie przebudowy końcowego układu lizosomalnego przez bakterie wewnątrzkomórkowe wykorzystujące nanocząstki fluorescencyjne jako znaczniki. Osiąga się to poprzez pierwszy wysiew komórek heela w szkiełku z ośmioma dołkami i inkubację przez noc. Drugim krokiem jest zakażenie komórek salmonellą i taricą.Następnie przeprowadza się znakowanie impulsowe zainfekowanych komórek gospodarza poprzez inkubację z nanocząstkami złota BSA Rumine. Ostatnim krokiem jest obserwacja zmian w układzie endosomalnym komórki gospodarza za pomocą mikroskopii konfokalnej. Ostatecznie kwantyfikacja wewnątrzkomórkowego rozmieszczenia nanocząstek odbywa się przy użyciu pakietu oprogramowania MRS.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak mikroskopia immunologiczna, jest to, że n zakażonych komórek jest analizowanych za pomocą metody, która może zapewnić wgląd w wewnątrzkomórkowy styl życia terica. Jednak może być również stosowany do innych patogenów wewnątrzkomórkowych, takich jak gatunki Gaia, Ella Prolia lub mycobacterium tuberculosis. Może być również stosowany do innych typów komórek gospodarza, takich jak mikro feh, linie komórkowe lub komórki pierwotne.Synteza 10-nanometrowych nanocząstek złota lub NPS wymaga dwóch roztworów, roztworu A i roztworu, B.To przygotować roztwór A, dodaj dwa mililitry 1% wodnego chlorku złota do 160 mililitrów mili Q wody. Przygotuj roztwór B, dodając osiem mililitrów 1% dwuwodnego cytrynianu trisodowego i 160 mikrolitrów 1% kwasu garbnikowego do 32 mililitrów wody mili Q. Roztwory A i B podgrzewamy do 60 stopni Celsjusza, a następnie mieszamy mieszając.Ciemnoniebieski kolor należy zaobserwować natychmiast po około 15 minutach. W tym momencie roztwór powinien przybrać czerwony kolor. Podgrzej roztwór do 95 stopni Celsjusza.Trzymaj go w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez pięć minut, a następnie schłodzić roztwór do temperatury pokojowej. Przygotuj złoty kawałek do powlekania i etykietowania, dodając 900 mikrolitrów złota MPS do 1,5-mililitrowej probówki einor i odwirowując przy 15 000 Gs przez 30 minut. Wyrzuć supernatant i ponownie zawieś osad w 900 mikrolitrach wysterylizowanej wody MQ.Dodaj 100 mikrolitrów roztworu BSA i mieszaj w wirze przy 800 obr./min przez 30 minut. Usunąć nadmiar BSA, odwirowując preparat w temperaturze 15 000 g przez 60 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić złoty BSA NPS i 125 mikrolitrów PBS.Dodaj 12,5 mikrolitra jednego molowego wodorowęglanu. R domine n hydroksy CIN roztwór lub roztwór NHS przygotowuje się w DMSO bezpośrednio przed. Stosować w 15 mikrolitrach roztworu R DOMINE N-H-S-D-M-S-O na 0,5 mililitra złotej zawiesiny BSA NP.Inkubować reakcję przez dwie godziny w temperaturze pokojowej, mieszając z prędkością 800 obr./min i unikając ekspozycji na światło. Następnie oczyść złoto BSA żwacz NPS poprzez dializę przeciwko PBS w temperaturze czterech stopni Celsjusza z pięcioma zmianami bufora w okresie od 36 do 48 godzin po oczyszczeniu, ustabilizować NPS, dodając 10 mikrolitrów B-S-A-P-B-S do każdego mililitra złota BSA RUMINE NPS, aby usunąć wolną lub uwolnioną wirówkę BSA Rumine w temperaturze 15, 000 GS przez 16 minut w czterech stopniach Celsjusza. Resus zawiesić osad w dwóch miligramach na mililitr B-S-A-P-B-S po zmierzeniu gęstości optycznej przy 520 nanometrach lub OD pięciu 20.Przechowuj złoty BSA Rod Domine NPS w temperaturze czterech stopni Celsjusza, unikając ekspozycji na światło, komórki do tego eksperymentu trwale eksprymują zielone białko fluorescencyjne oznaczone lizosomalną lampą glikoproteinową jedną GFP i są hodowane w DMEM z 10% płodową surowicą cielęcą w temperaturze 37 stopni Celsjusza w atmosferze zawierającej 5% dwutlenku węgla, zasiewaj komórki o gęstości 50, 000 na studzienkę w ośmiodołkowym szkiełku i inkubować przez noc. Bakterią do infekowania komórek hela jest ludzki patogen przewodu pokarmowego, salmonella i tarica. Dla porównania stosuje się dwa zmutowane szczepy.Wszystkie trzy szczepy zawierają plazmid do konstytutywnej ekspresji wzmocnionego GFP i są hodowane w bulionie LB z odpowiednimi antybiotykami w celu utrzymania plazmidów dla każdego szczepu. Zaszczep pojedynczą kolonię bakterii w trzech mililitrach bulionu LB odpowiednim antybiotykiem i hoduj przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. W warunkach wstrząsania w celu napowietrzenia następnego dnia rozcieńczyć każdą kulturę od jednego do 31 w świeżym bulionie LB i kontynuować wzrost przez trzy i pół godziny.Aby rozpocząć tę procedurę, zmierz OD 600 bakterii subkultury i rozcieńcz do OD 600 0,2. W jednym mililitrze PBS dodaj odpowiednie ilości bakterii do komórek hela w szkiełku komorowym A 12, aby uzyskać wielokrotność infekcji 100. Inkubować przez 30 minut w inkubatorze komórkowym.Umyj komórki hela trzykrotnie PBS, aby usunąć niezinternalizowane bakterie. Ten punkt czasu jest ustawiany jako godzina zero po infekcji lub godzina zero pi. Dodaj 300 mikrolitrów świeżej pożywki hodowlanej zawierającej 100 mikrogramów na mililitr gentamycyny do komórek i utrzymuj przez godzinę.Po godzinie. Zastąp pożywkę pożywką obrazową zawierającą 10 mikrogramów na mililitr gentamycyny. Dodać złoto BSA żwacza NPS do komórek hela, aby uzyskać końcowe stężenie OD pięć 20 0,1.Inkubować przez godzinę po jednej godzinie. Usuń podłoże i umyj trzy razy PBS. Na koniec dodaj 300 mikrolitrów świeżej pożywki obrazowej zawierającej 10% FCS i 10 mikrogramów na mililitr gentamycyny.Przez pozostałą część czasu inkubacji obrazowanie komórek w wysokiej rozdzielczości w różnych punktach czasowych odbywa się za pomocą systemu obrazowania konfokalnego, takiego jak konfokalny skaning laserowy lub mikroskop z wirującym dyskiem, z komorą nawilżanego środowiska, przełącznikiem w systemie kontroli temperatury i czekaniem, aż się ustabilizuje. Zoptymalizuj ustawienia obrazowania, takie jak powiększenie, rozdzielczość i rozmiar kroku Z. Stosować odpowiednie ustawienia emisji wzbudzenia dla GFP i złotego BSA w pociągu NPS we wskazanych punktach czasowych po zakażeniu.Zamontuj 12-komorowy szkiełko podstawowe zawierające zakażone komórki na stoliku mikroskopu i zapisz obrazy w celu analizy obrazów i zbadania przebudowy układu endosomalnego przez wewnątrzkomórkową salmonellę. Korzystaj z oprogramowania do analizy obrazu. Otwórz dane, klikając przycisk Otwórz i wybierając plik na pasku narzędzi obiektów w widoku przewyższającym.Kliknij ikonę, aby dodać nowy element powierzchni. Aby przeanalizować obszar zainteresowania lub zwrot z inwestycji, wybierz segment tylko regionu zainteresowania, a następnie kliknij przycisk Dalej jako kanał źródłowy. Wybierz kanał trzeci.Zaznacz opcję wygładzania, aby ustawić gładkość powstałego obszaru. Zdefiniuj wartość ręcznie lub zaakceptuj wartość wygenerowaną automatycznie. Dla progu.Wybierz opcję intensywności bezwzględnej dla regulacji progu. Wybierz opcję ręczną i ustaw wartość w obszarze wyświetlania. Podgląd progu powierzchni jest wyświetlany w kolorze szarym.Kliknij dalej na zakładce Klasyfikuje powierzchnie. Uzyskaną powierzchnię można filtrować według różnych kryteriów. Domyślny filtr to liczba otworów w kształcie litery V większa niż 10 innych filtrów można również uwzględnić, klikając przycisk dodaj.W tym przykładzie filtr domyślny jest używany do ukończenia tworzenia powierzchni. Kliknij Zakończ na liście obiektów. Usuń zaznaczenie pola wyboru dla woluminu elementu.Nowo utworzona powierzchnia jest teraz wyświetlana w obszarze wyświetlania. Na czerwono wyeksportuj statystyki do pliku Excel, klikając przycisk Zapisz. Złote NPS zsyntetyzowane za pomocą tego protokołu miały kształt quasi-sferyczny i rozmiar około 10 nanometrów.Powłoka BSA i znakowanie rho dominą nie miały wpływu na ich morfologię ani wielkość. Badanie przebudowy komórkowego układu endosomalnego gospodarza przez salmonellę wewnątrzkomórkową. Komórki Heli zostały pozorowane lub zakażone salmonellą typu dzikiego lub dwoma zmutowanymi szczepami i pulsem ścigano je 10-nanometrowym złotem.Pręcik BSA dominuje i groszek w niezakażonych komórkach, NPS równomiernie rozmieszczony w późnych endosomach lub lizosomach. W przeciwieństwie do tego, NPS w komórkach zakażonych salmonellą typu dzikiego uległ znacznemu przegrupowaniu po ośmiu godzinach od zakażenia. Utworzono ustabilizowaną sieć włókien lub przesiewów wywołanych salmonellą, a większość mp stwierdzono nagromadzoną w strukturach rurkowych.Zmutowane szczepy wykazywały odmienne zachowania po ośmiu godzinach od infekcji. Zmutowany szczep SSAV był zamknięty w salmonelli zawierającej VAE lub SCV. Chociaż nie utworzono żadnych przesiewów, większość mp nadal znajdowała się w wolnych późnych endosomach lub lizosomach dla sif.Nastąpiła ucieczka zmutowanego szczepu salmonelli do cytoplazmy i nie zaobserwowano związku między NPS a bakteriami. Kiedy zbadano dostępność końcowego układu lizosomalnego w różnych fazach zakażenia salmonellą, wyniki pokazują, że we wszystkich przypadkach większość zinternalizowanych NPS nagromadziła się w SCV lub SIF. Można wykonać inne metody, mikroskopijną transmisję szyi.Może to odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak ultrastruktura lub przedziały błonowe w niektórych nanoinfekowanych komórkach gospodarza. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przygotować nanocząstki fluorescencyjne. Można je wykorzystać do oznaczania przedziałów hostera zmodyfikowanych przez wewnątrzkomórkową salmonellę.

application-fluorescent-nanoparticles-to-study-remodeling-endo

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Źródło: Zhang, Y., et al. Zastosowanie nanocząstek fluorescencyjnych do badania przebudowy układu endolizosomalnego przez bakterie wewnątrzkomórkowe. J. Vis. Exp. (2015)Ten film pokazuje zastosowanie nanocząstek fluorescencyjnych do wizualizacji endolizosomalnej przebudowy w ludzkich komórkach nabłonka zakażonych przez bakterie wewnątrzkomórkowe. Po inwazji bakteryjnej patogeny manipulują cytoszkieletem gospodarza i układem endolizosomalnym, tworząc wakuole z wypustkami rurkowymi, które...

Wizualizacja endo-lizosomalnej przebudowy za pośrednictwem nanocząstek w komórkach zakażonych bakteriami

Opisujemy metody obrazowania, których używamy do badania dystrybucji i ruchliwości transfekowanych białek fluorescencyjnych rezydujących w retikulum endoplazmatycznym (ER) za pomocą konfokalnego obrazowania żywych komórek. Analizujemy również ultrastrukturalnie wpływ ich ekspresji na architekturę tego przedziału subkomórkowego.

Wizualizacja subdomen retikulum endoplazmatycznego w hodowanych komórkach

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome ...

Badanie biogenezy fagolizosomów w żywych makrofagach

Badanie transportu błonowego jest kluczowe dla zrozumienia funkcji neuronalnych. W tym miejscu przedstawiamy metodę ilościowego określania ruchliwości pęcherzyków w neuronach. Jest to wygodna metoda, którą można dostosować do ilościowego oznaczania transportu błonowego w układzie nerwowym.

Kwantyfikacja ruchliwości endosomów i lizosomów w hodowanych neuronach za pomocą sond fluorescencyjnych

Opisana tutaj jest metoda analizy ekspresji genów bakteryjnych w tkankach zwierzęcych na poziomie komórkowym. Metoda ta stanowi źródło do badania różnorodności fenotypowej występującej w populacji bakterii w odpowiedzi na środowisko tkankowe podczas infekcji.

Oparta na fluorescencji metoda badania regulacji genów bakteryjnych w zakażonych tkankach

Wsteczny transport białek z powierzchni komórki do Golgiego jest niezbędny do utrzymania homeostazy błony. W tym miejscu opisujemy metodę biochemicznej analizy transportu białek rekombinowanych z powierzchni komórki do Golgiego przy użyciu funkcjonalizowanych nanociał w komórkach HeLa.

Analiza wychwytu endocytarnego i transportu wstecznego do sieci trans-Golgiego z wykorzystaniem funkcjonalizowanych nanociał w hodowanych komórkach

Ten artykuł zawiera przewodnik krok po kroku do badania dynamiki lokalizacji subkomórkowej białek i monitorowania zmian morfologicznych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej o wysokiej rozdzielczości u Bacillus subtilis i Staphylococcus aureus.

Mikroskopia fluorescencyjna żywych komórek w celu zbadania lokalizacji białek subkomórkowych i zmian morfologii komórek u bakterii

Endosomy recyklingowe są częścią endosomalnej sieci kanalikowej. W tym miejscu przedstawiamy metodę ilościowego określania dynamiki recyklingu endosomów przy użyciu GFP-STX13 jako markera organelli.

Test oparty na mikroskopii do badania i analizy endosomów recyklingu przy użyciu transportu SNARE

Endocytowy i retrogradacyjny transport białek z błony plazmatycznej do sieci trans-Golgiego jest niezbędny do utrzymania homeostazy błony i regulacji sygnalizacji. Tutaj opisujemy metodę obrazowania i ilościowego transportu endocytarnego białek transbłonowych za pomocą mikroskopii komórek żywych, wykorzystując deriwatyzowane nanociała anty-GFP w komórkach HeLa.

Obrazowanie transportu endocytarnego na żywych komórkach z wykorzystaniem funkcjonalizowanych nanociał w hodowanych komórkach

Opisujemy metodę multipleksową do wykrywania mikroorganizmów w próbce z wykorzystaniem kulek fluorescencyjnych sprzężonych z oligonukleotydami. Amplikony wszystkich organizmów w próbce są hybrydyzowane z panelem kulek sprzężonych z sondami. Do analizy typu każdej kulki oraz sygnału hybrydyzacji wykorzystywany jest instrument Luminex lub Bio-Plex.

Multipleksowa detekcja bakterii w złożonych próbkach klinicznych i środowiskowych z wykorzystaniem mikrosfer fluorescencyjnych sprzężonych z oligonukleotydami

Odkryj metodę badania przebudowy układu endolizosomalnego przez Salmonella enterica przy użyciu fluorescencyjnych nanocząstek złota i mikroskopii konfokalnej. Technika umożliwia ilościową analizę zmian w komórkach HeLa.

Zastosowanie nanocząstek fluorescencyjnych do badania przebudowy układu endolizosomalnego przez bakterie wewnątrzkomórkowe

Przeglądaj więcej filmów