Analiza internalizacji komórkowej nanocząstek i bakterii za pomocą cytometrii przepływowej obrazowania wielospektralnego

Analiza komórkowych mechanizmów internalizacji nanocząstek i bakterii za pomocą obrazowania wielospektralnego cytometrii przepływowej. Makrofagi są najpierw poddawane wstępnej obróbce cyto klainą D w celu zahamowania polimeryzacji aktyny. Nanocząstki lub salmonella są dodawane do makrofagów, jednowarstwowe i inkubowane.

Następnie makrofagi są zbierane, utrwalane i oznaczane do analizy za pomocą strumienia obrazu. Komórki cytometru przepływowego do obrazowania wielospektralnego, które mają zinternalizowane nanocząstki i/lub salmonellę, odróżniają się od tych z nanocząstkami związanymi powierzchniowo i/lub salmonellą. Uzyskane dane wskazują, że zarówno salmonella, jak i nanocząstki są internalizowane tylko przez komórki, które nie były leczone cyto klainą.

D sugerujące, że internalizacja jest zależna od aktyny. Technika ta ma kilka zalet w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak cytometria przepływowa i mikroskopia konfokalna. Przede wszystkim zapewnia dokładny pomiar intensywności sygnału fluorescencyjnego i rozdzielczości przestrzennej między różnymi cechami komórkowymi z dużą prędkością.

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania zarówno w badaniach nad szczepionkami biomateriałowymi i dostarczaniem leków, jak i w wielu badaniach nad interakcjami patogenów. Obejmuje to nakreślenie szlaków internalizacji wykorzystywanych przez nanocząstki polibezwodnika i bakterie. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają korzystać z tej metody, często mają problemy.

Ważne jest, aby poświęcić czas na miareczkowanie barwników w celu uzyskania optymalnych sygnałów fluorescencyjnych. Również zapoznanie się z oprogramowaniem i tworzenie szablonów analiz wymaga czasu. Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, gdy odkryliśmy, że nanocząstki polihydro wykazują cechy naśladujące patogeny przy użyciu mikroskopii i innych technik.

Następnie potrzebowaliśmy systemu o wysokiej przepustowości, aby porównać procesy internalizacji stosowane przez salmonellę i nanocząstki wodorku pyłku przed wykonaniem testu. Należy zebrać wszystkie hodowle komórek ssaków i bakterii oraz przygotować zawiesiny nanocząstek. Zacznij od zebrania zbiegających się komórek RA W2 64,7 za pomocą skrobaka do komórek.

Określ liczbę komórek za pomocą hemocytometru. Następnie umieść komórki w 24-dołkowym naczyniu hodowlanym o gęstości pięć razy 10 do piątej komórki na studzienkę w 0,5 mililitra. Pełna inkubacja DMEM przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza i inkubator 5% CO2.

Aby przygotować salmonellę tarica, rozcieńczyć transformację salmonelli w C-D-M-E-M, aby uzyskać wielokrotność infekcji stu na RA W2 64,7 komórek w szklanej probówce hodowlanej autoklawu o wymiarach 16 na 125 milimetrów. Następnie, używając wysterylizowanego bibuły serwatkowej, odważ pięć miligramów nanocząstek bezwodnika poli obciążonych 1% FITC wygenerowanych zgodnie z opisem kolegów z 2009 r. w publikacji z 2009 r. i badaniach farmaceutycznych w 1,5-mililitrowej mikroprobówce wirówkowej. Dodaj nanocząstki do 0,5 mililitra soli fizjologicznej buforowanej zimnymi fosforanami i umieść ją na lodzie.

Utrzymywanie rurki na lodzie. Użyj ultradźwiękowego procesora cieczy z mikrokońcówką, aby sonikować zawiesinę przez około 25 sekund z prędkością od czterech do sześciu dżuli. Teraz, gdy wszystkie potrzebne komórki i odczynniki są gotowe, można przeprowadzić test fagocytozy.

Oznaczyć 24, dobrze osadzone płytki do hodowli tkankowych zawierające hodowane komórki RA W2 64,7 w ramach przygotowań do testu na pierwszej płytce. Każda z następujących próbek zostanie oznaczona w trzech powtórzeniach, cyto i D z nanocząstkami, cyto i D z salmonellą, pożywką z nanocząstkami, pożywką z samymi nanocząstkami salmonelli, tylko salmonellą i AF sześć komórek barwiących 60 tylko w czterech stopniach Celsjusza zostanie oznaczonych na drugiej płytce i będzie obejmować inkubację pożywki plus nanocząstki i pożywki plus salmonelli w tej niskiej temperaturze, powolne procesy komórkowe, takie jak fagocytoza, na godzinę przed indukcją. Dodać pięć mikrogramów na mililitr cyto i D oraz C-D-M-E-M do odpowiednich studzienek i inkubować komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Po inkubacji należy odwirować zawiesinę nanocząstek i dodać 10 mikrolitrów do odpowiednich studzienek. Następnie zwiruj salmonellę i dodaj ją do odpowiednich studzienek przy MOI 100. Postukaj kilka razy w talerz, aby wymieszać.

Następnie umieścić płytki z próbkami w temperaturze 37 stopni Celsjusza, a płytki kontroli ujemnej w temperaturze czterech stopni Celsjusza na 45 minut. Po inkubacji umieścić płytki na lodzie, dwukrotnie przemyć komórki lodowatym PBS bez wapnia i magnezu, odsysając i odrzucając starą pożywkę w celu usunięcia niezwiązanych cząstek, salmonelli oraz martwych lub oderwanych komórek. Stosowanie magnezu w płatkach.

Pre PBS na tym etapie jest niezbędne, ponieważ ułatwia odrywanie komórek od podłoża Aby zebrać komórki, dodaj 250 mikrolitrów lodowatego PBS i delikatnie zeskrob dołki, pipetuj zebrane komórki do silikonowanych mikroprobówek wirówkowych typu snap cap i trzymaj je na lodzie. Umyj komórki, dodając jeden mililitr buforu do płukania na zimno, a następnie odwiruj w temperaturze 250 razy G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po odrzuceniu supernatantu usunąć pozostały bufor, stukając w papier odwróconą probówką mikrowirówki.

Ręcznikiem ponownie zawiesić osad komórkowy, delikatnie przesuwając probówkę z mikrowirówką po stojaku na probówki. Aby utrwalić komórki, dodaj 100 mikrolitrów 4% paraformaldehydu do PBS i pozostaw komórki na 15 minut. W temperaturze pokojowej umyj komórki, dodając jeden mililitr buforu do trwałej ondulacji, a następnie odwiruj w temperaturze 250 razy G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Po odrzuceniu supernatantu usunąć pozostały bufor jak poprzednio. Następnie wybarwić komórki RA W2 64,7. W przypadku aktyny dodaj 100 mikrolitrów buforu do mycia po trwałej ondulacji zawierającego Alexa Fluora foid w sześciu 60 przez 15 minut.

W temperaturze pokojowej niebarwione próbki należy inkubować z trwałą ondulacją, przemywać buforem bez phin. Po zabarwieniu umyj i ponownie odwiruj komórki, a następnie ponownie zawieś je w 50 mikrolitrach PBS zawierających 1% PFA i przechowuj w ciemności w temperaturze czterech stopni Celsjusza do momentu nabycia. Włącz zasilanie, strumień obrazu i uruchom.

Zainspiruj i zainicjuj fluidykę w menu plików. Wybierz opcję załaduj szablon domyślny. W galerii obrazów, menu widoku, wybierz wszystko i naciśnij uruchom ustawienia, aby rozpocząć obrazowanie koralików, jeśli to konieczne, dostosuj śledzenie rdzenia, aby wyśrodkować obrazy na boki.

Wybierz kanał jasnego pola i kliknij przycisk Ustaw intensywność. Poczekaj, aż współczynnik zmienności prędkości przepływu będzie stale mniejszy niż 0,2%Na karcie wspomagania kliknij przycisk Rozpocznij wszystko, aby uruchomić kalibracje i testy oraz sprawdzić, czy wszystkie przeszły pomyślnie w oprogramowaniu. Kliknij załaduj próbkę.

Następnie, zgodnie z instrukcją, umieść fiolkę zawierającą najjaśniejszą próbkę. Mając wszystkie fluorochromy w ładowarce próbek, wybierz powiększenie 40x. Po ustaleniu ustawień przyrządu nie zmieniaj ich przez cały eksperyment.

Włącz każdy laser w eksperymencie, klikając ikony lasera w oprogramowaniu i ustaw moc lasera tak, aby każdy fluorochrom miał maksymalne wartości pikseli w zakresie 104 000 zliczeń, mierzone na wykresach rozrzutu. Aby wyeliminować gromadzenie się niechcianych obiektów, kliknij okno klasyfikatora komórek w oprogramowaniu. Następnie, aby zebrać tylko dane komórki, wybierz dolny kanał limitu obszaru pierwszy dla jasnego pola i ustaw wartość na 50 mikrometrów obiekty o powierzchni mniejszej niż 50 mikrometrów zostaną uznane za szczątki i nie zostaną pobrane.

Wybierz kanały, które mają zostać zebrane, klikając odpowiednie ikony kanałów w oprogramowaniu tutaj. Kanały 1, 2, 3, 4, 5 i sześć są wybierane na karcie ustawień. Wprowadź numer pliku i folder docelowy.

Ustaw numer sekwencyjny na jeden, a liczbę zdarzeń do pobrania na 5 000. Kliknij uruchom, pobierz, aby zebrać i zapisać pierwszy plik danych eksperymentu. Kliknij pozycję FLL i uruchom następny przykład eksperymentalny.

Powtarzać tę czynność, aż wszystkie próbki doświadczalne zostaną zebrane. Następnie, aby uruchomić kontrolki, kliknij ustawienia kompozycji. Spowoduje to wyłączenie jasnego pola i rozproszenia lasera oraz umożliwi zbieranie wszystkich kanałów fluorescencyjnych pod zakładką akwizycji.

Zmień wartość wejściową na 500. Następnie umieść rurkę kontrolną i kliknij uruchom. Zdobądź aby zebrać 500 dodatnich komórek w pojedynczych barwionych kontrolach.

Powtórz dla każdego fluorochromu w eksperymencie, aby uzyskać matrycę kompensacyjną. Po pobraniu wszystkich przykładowych obrazów uruchom oprogramowanie do analizy pomysłów na osobnym komputerze analitycznym, klikając dwukrotnie ikonę pomysłów na pulpicie. Kliknij dwukrotnie kreatora internalizacji i załaduj jeden z przykładowych plików RIF testu.

Wyskakujące okienko będzie zawierało instrukcje dotyczące ładowania plików testowych. Postępuj zgodnie z instrukcjami i kliknij przycisk Dalej. Następnie kliknij nową matrycę.

Spowoduje to uruchomienie kreatora wynagrodzeń. Po wyświetleniu monitu wybierz pliki danych dla kontrolek pojedynczego koloru, aby je dodać. Kliknij dalej w kreatorze, postępując zgodnie z instrukcjami, aż plik macierzy wynagrodzeń zostanie zapisany i załadowany do pola w kroku drugim kreatora internalizacji.

Kliknij przycisk Dalej i postępuj zgodnie z instrukcjami, aż zostanie wygenerowany plik DAF. Ustaw właściwości wyświetlania obrazu, wybierając kanały obrazu używane podczas akwizycji. Kliknij kanał drugi dla FITC i kanał piąty dla AF six 60.

Jasne pole i rozproszenie boczne są zaznaczone domyślnie. Wybierz kanał O kanału jasnego pola, aby utworzyć granicę komórki i kanał O2, w którym zebrano nanocząstki lub bakterie, aby sonda internalizująca zdefiniowała populację pojedynczej komórki, generowany jest wykres punktowy obszaru jasnego pola w stosunku do proporcji jasnego pola wszystkich komórek. Analiza wielu plików danych o wysokiej przepustowości wymaga pliku szablonu, dlatego niezwykle ważne jest staranne zdefiniowanie bramek podczas tworzenia pliku szablonu.

Każda kropka reprezentuje wartości dla pojedynczego obrazu komórki. Kliknij na pojedynczy. na wykresie, aby wybrać obraz tej konkretnej komórki w galerii obrazów.

Następnie narysuj bramkę wokół komórek o powierzchni i proporcjach odpowiadających zdarzeniom z pojedynczą komórką. Pojedyncze komórki mają proporcje okrągłej pierwszej i dubletów. Mają współczynnik proporcji około 0,5.

Kliknij wiele komórek, aby odróżnić obszar zawierający pojedyncze komórki od dubletów lub szczątków. Aby wygenerować histogram gradientu jasnego pola, pierwiastek oznacza kwadrat obrazu w jasnym polu. Kliknij następny przycisk.

Następnie na karcie zaludnienie wybierz opcję kosza, aby wyświetlić wybrany kosz. Kliknij pojemniki, aby określić, gdzie znajdują się komórki i na których najlepiej się skupić. Rozpocznij i narysuj obszar linii, aby ochodzić skoncentrowane komórki.

Im wyższy gradient RMS, tym lepiej skoncentrowany, pomiń następny krok, chyba że są inne plamy do przejścia. Generowany jest nowy wykres rozrzutu intensywności kanału drugiego na osi x w funkcji maksymalnego piksela kanału drugiego na osi Y. Kliknij kropki i wyświetl obrazy, aby pomóc określić obszar do narysowania wokół komórek, które są dodatnie dla nanocząstek lub bakterii.

Generowany jest histogram funkcji internalizacji z regionem zaczynającym się od zera, który należy dostosować, obserwując obrazy. Cecha internalizacji to stosunek intensywności wewnątrz komórki do intensywności całej komórki. Jest wyskalowany w taki sposób, że przy wartości zero połowa intensywności znajduje się w środku.

Kreator utworzył region każdej komórki, który wyznacza wnętrze, tworząc maskę, która jest używana, dane wejściowe obrazu komórki w celu znalezienia powierzchni komórki i zerodowania jej o cztery piksele. Zwróć uwagę, że tę maskę można w razie potrzeby ręcznie dostosować do różnych typów komórek, tworząc najpierw maskę obiektu na obrazie w jasnym polu i zmniejszając ją o więcej lub mniej pikseli. Funkcja internalizacji jest obliczana na podstawie tej zerodowanej maski obiektu przy użyciu algorytmu w oprogramowaniu.

Ta cecha pozwala nam odróżnić zinternalizowane cząstki i bakterie, które mają większość swojego sygnału fluorescencyjnego w granicach maski, od cząstek związanych z powierzchnią, a bakterie, które mają większość swojego sygnału fluorescencyjnego poza granicą maski, jak pokazano w tym przykładzie, tworzą nowy histogram z nową funkcją internalizacji opartą na zerodowanej masce obiektu. Narysuj region do bramki w zinternalizowanych komórkach, wyświetlając zobrazowania w wybranym trybie kosza. Ustaw bramkę na 0.3.Tutaj.

Komórki z wynikiem niższym niż 0,3 są uważane za komórki dodatnie pod względem cząstek związanych powierzchniowo. Aby wyeliminować komórki z etykietowaniem tła i zidentyfikować określone zinternalizowane nanocząstki lub bakterie, wybierz funkcje z menu analizy. Kliknij menu analizy.

Następnie kliknij funkcję zliczania punktów obok, aby dodać średnią liczbę punktów do raportu statystycznego. W menu raportów kliknij ikonę raportów. Następnie zdefiniuj raport statystyczny, a następnie dodaj kolumny, a następnie wybierz odpowiednią populację komórek.

Kliknij w porządku. Kreator internalizacji automatycznie doda statystyki do tego raportu, aby zapisać plik danych jako plik szablonu, który będzie używany do analizy wsadowej wszystkich plików eksperymentalnych. Kliknij menu pliku i wybierz zapisz jako szablon.

Pliki szablonów. Miej kropkę rozszerzenia AST do analizowania wielu plików danych w oprogramowaniu do pomysłów. Kliknij Narzędzia i wybierz pliki danych wsadowych i wprowadź wszystkie pliki RIF.

Dodaj plik macierzy wynagrodzeń i plik szablonu w odpowiednich sekcjach, aby przesłać partię do przetworzenia, kliknij przycisk Prześlij. Po zakończeniu etapu przetwarzania analizowane są wszystkie pliki RAF i generowane są pliki DAF dla każdego z poszczególnych plików raw. Generowany jest raport końcowy ze statystykami dla wszystkich próbek w celu porównania wpływu hamowania aktyny i niskiej temperatury na fagocytozę salmonelli i nanocząstek.

Komórki RA W2 64,7 inkubowano w temperaturze 37 stopni Celsjusza w pożywce, z cyto klainą D lub bez, lub inkubowano w pożywce w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Zarówno manipulacje temperaturą, jak i aktyną zmniejszyły internalizację zarówno nanocząstek, jak i salmonelli. Jednak inkubacja komórek w cyto i D zwiększa odsetek komórek z nanocząstkami związanymi z powierzchnią, jednocześnie zmniejszając odsetek komórek z salmonellą związaną powierzchniowo.

Odsetek komórek z dodatnim wynikiem nanocząstek związanych z powierzchnią wzrasta z około 8% w temperaturze 37 stopni Celsjusza do ponad 35% po traktowaniu cyto i D lub czterema stopniami Celsjusza. W przeciwieństwie do tego, odsetek komórek z salmonellą związaną z powierzchnią zmniejszył się z 35% do 15% Po leczeniu cyto i D, inkubacja komórek RA W2 64,7 z salmonellą w temperaturze czterech stopni Celsjusza, zmniejszyła internalizację bez widocznego wzrostu ilości bakterii związanych z powierzchnią w porównaniu z kontrolą 37 stopni Celsjusza. Łącznie dane te pokazują, że salmonella i nanocząsteczki są internalizowane przez podobny proces komórkowy, który wymaga aktyny i jest zależny od temperatury.

Co więcej, dane wskazują, że trwałe przyłączenie salmonelli do makrofagów wymaga polimeryzacji aktyny. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak eksa internalizacji komórkowej nanocząstek i bakterii za pomocą wielospektralnej obrazowania cytometrii przepływowej. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że inhibitory są cytotoksyczne.

W związku z tym konieczne są wcześniejsze eksperymenty z profilowaniem cytotoksyczności w celu określenia optymalnych stężeń do zastosowania. Nie zapominaj, że praca z salmonellą może wiązać się z niebezpiecznymi środkami ostrożności, takimi jak noszenie odpowiedniego sprzętu ochrony osobistej i unikanie tworzenia aerozoli, których należy przestrzegać podczas wykonywania tej procedury.