Name: Analiza internalizacji komórkowej nanocząstek i bakterii za pomocą cytometrii przepływowej obrazowania wielospektralnego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 18 min 7 s
Description: Poznaj metodę analizy internalizacji nanocząstek i bakterii przez makrofagi RAW 264.7 przy użyciu wielospektralnej cytometrii przepływowej obrazowania. Technika ta pozwala odróżnić cząstki wewnątrzkomórkowe od powierzchniowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy chcieliby podziękować za wsparcie finansowe w ramach grantu ONR-MURI (NN00014-06-1-1176) oraz U.S. Army Medical Research and Materiel Command (numery grantów W81XWH-09-1-0386 i W81XWH-10-1-0806).

<ol><li>Ulery, B. D., Kumar, D., Ramer-Tait, A. E., Metzger, D. W., Wannemuehler, M. J., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+of+a+protective+single-dose+intranasal+nanoparticle-based+vaccine+platform+for+respiratory+infectious+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Design of a protective single-dose intranasal nanoparticle-based vaccine platform for respiratory infectious diseases.</a> PLoS One. 6, e17642(2011).</li>
<li>Kasturi, S. P., Skountzou, I., Albrecht, R. A., Koutsonanos, D., Hua, T., Nakaya, H. I., Ravindran, R., Stewart, S., Alam, M., Kwissa, M., Villinger, F., Murthy, N., Steel, J., Jacob, J., Hogan, R. J., García-Sastre, A., Compans, R., Pulendran, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programming+the+magnitude+and+persistence+of+antibody+responses+with+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Programming the magnitude and persistence of antibody responses with innate immunity.</a> Nature. 470, 543-547 (2011).</li>
<li>Rice-Ficht, A. C., Arenas-Gamboa, A. M., Kahl-McDonagh, M. M., Ficht, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymeric+particles+in+vaccine+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Polymeric particles in vaccine delivery.</a> Curr. Opin. Microbiol. 13, 106-112 (2010).</li>
<li>Jain, J. P., Chitkara, D., Kumar, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyanhydrides+as+localized+drug+delivery+carrier%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22Expert.+Opin.+Drug.+Deliv%22%5BJournal%5D)">Polyanhydrides as localized drug delivery carrier: an update.</a> Expert. Opin. Drug. Deliv. 5, 889-907 (2008).</li>
<li>Pfeifer, B. A., Burdick, J. A., Little, S. R., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly%28ester-anhydride%29%3Apoly%28beta-amino+ester%29+micro-+and+nanospheres%3A+DNA+encapsulation+and+cellular+transfection%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Pharm%22%5BJournal%5D)">Poly(ester-anhydride):poly(beta-amino ester) micro- and nanospheres: DNA encapsulation and cellular transfection.</a> Int. J. Pharm. 304, 210-219 (2005).</li>
<li>Ahmed, F., Friend, S., George, T. C., Barteneva, N., Lieberman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Numbers+matter%3A+quantitative+and+dynamic+analysis+of+the+formation+of+an+immunological+synapse+using+imaging+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Numbers matter: quantitative and dynamic analysis of the formation of an immunological synapse using imaging flow cytometry.</a> J. Immunol. Methods. 347, 79-86 (2009).</li>
<li>Hampton, M. B., Winterbourn, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+quantifying+phagocytosis+and+bacterial+killing+by+human+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Methods for quantifying phagocytosis and bacterial killing by human neutrophils.</a> J. Immunol. Methods. 232, 15-22 (1999).</li>
<li>Rieger, A. M., Hall, B. E., Barreda, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+activation+differentially+modulates+particle+binding%2C+phagocytosis+and+downstream+antimicrobial+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Comp.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Macrophage activation differentially modulates particle binding, phagocytosis and downstream antimicrobial mechanisms.</a> Dev. Comp. Immunol. 34, 1144-1159 (2010).</li>
<li>Murphy, K. C., Campellone, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lambda+Red-mediated+recombinogenic+engineering+of+enterohemorrhagic+and+enteropathogenic+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22BMC.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Lambda Red-mediated recombinogenic engineering of enterohemorrhagic and enteropathogenic E. coli.</a> BMC. Mol. Biol. 4, 11(2003).</li>
<li>Karsi, A., Lawrence, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broad+host+range+fluorescence+and+bioluminescence+expression+vectors+for+Gram-negative+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Plasmid%22%5BJournal%5D)">Broad host range fluorescence and bioluminescence expression vectors for Gram-negative bacteria.</a> Plasmid. 57, 286-295 (2007).</li>
<li>Ulery, B. D., Phanse, Y., Sinha, A., Wannemuehler, M. J., Narasimhan, B., Bellaire, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymer+chemistry+influences+monocytic+uptake+of+polyanhydride+nanospheres%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm.+Res%22%5BJournal%5D)">Polymer chemistry influences monocytic uptake of polyanhydride nanospheres.</a> Pharm. Res. 26, 683-690 (2009).</li>
<li>Doherty, G. J., McMahon, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of endocytosis.</a> Annu. Rev. Biochem. 78, 857-902 (2009).</li>
<li>Vercauteren, D., Vandenbroucke, R. E., Jones, A. T., Rejman, J., Demeester, J., De Smedt, S. C., Sanders, N. N., Braeckmans, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+inhibitors+to+study+endocytic+pathways+of+gene+carriers%3A+optimization+and+pitfalls%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">The use of inhibitors to study endocytic pathways of gene carriers: optimization and pitfalls.</a> Mol. Ther. 18, 561-569 (2010).</li>
<li>Di Marzio, L., Marianecci, C., Cinque, B., Nazzarri, M., Cimini, A. M., Cristiano, L., Cifone, M. G., Alhaique, F., Carafa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pH-sensitive+non-phospholipid+vesicle+and+macrophage-like+cells%3A+binding%2C+uptake+and+endocytotic+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">pH-sensitive non-phospholipid vesicle and macrophage-like cells: binding, uptake and endocytotic pathway.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1778, 2749-2756 (2008).</li>
<li>Torres, M. P., Vogel, B. M., Narasimhan, B., Mallapragada, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+characterization+of+novel+polyanhydrides+with+tailored+erosion+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater.+Res.+A%22%5BJournal%5D)">Synthesis and characterization of novel polyanhydrides with tailored erosion mechanisms.</a> J. Biomed. Mater. Res. A. 76, 102-110 (2006).</li>
</ol>

Sherree L. Friend jest zatrudniona w firmie Amnis Corporation, która produkuje system ImageStreamX.

Badania wykazały, że biodegradowalne nanocząsteczki oparte na kopolimerze kwasu mlekowego i glikolowego (PLGA) lub polianhydrydach mogą być wykorzystane do dostarczania enkapsulowanych antygenów lub leków do komórek docelowych. Pobieranie tych nanocząsteczek przez komórki fagocytarne jest kluczowe dla ich skuteczności, co sprawia, że ilościowa analiza internalizacji jest krytyczna przy projektowaniu nowych systemów dostarczania nanocząsteczek. Dzięki zastosowaniu tej metody można z łatwością analizować zróżnicowane pobie...

<table><tbody><tr><td>Linia komórkowa RAW 264.7</td><td>American Type Culture Collection (ATCC)</td><td>TIB-71</td><td></td></tr><tr><td>Podłoże DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)</td><td>Cellgro</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S 11150</td><td>Klasa Premium</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Płytka 24-dołkowa</td><td>Techno Plastic Products</td><td>92024</td><td></td></tr><tr><td>Kolby do hodowli komórkowej</td><td>Techno Plastic Products</td><td>90151</td><td></td></tr><tr><td>Skrobacz do komórek</td><td>Techno Plastic Products</td><td>99002</td><td>24 cm</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Salmonella enterica&lt;/em&gt; serowar Typhimurium</td><td>ATCC</td><td>14028</td><td></td></tr><tr><td>Elektroporator BTX ECM630 Electro Cell Manipulator</td><td>BTX Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP308</td><td></td></tr><tr><td>Bufor fosforanowy (PBS)</td><td>Cellgro</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Ultradźwiękowy procesor cieczy</td><td>Misonix</td><td>S-4000</td><td></td></tr><tr><td>Cytochalazyna-D</td><td>Sigma-Aldrich,</td><td>C8273</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyd</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>04018</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do płukania</td><td>2% inaktywowana ciepłem FBS, 0,1% azydek sodu w PBS.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bufor do permeabilizacji i płukania</td><td>BD Biosciences</td><td>554714</td><td></td></tr><tr><td>Przezroczyste probówki mikrocentryfugowe z zatrzaskową zakrętką</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4816</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor faloidyna 660</td><td>Invitrogen</td><td>A22285</td><td></td></tr><tr><td>ImageStream&lt;sup&gt;X&lt;/sup&gt;</td><td>Amnis Corporation</td><td>100200</td><td>Opcje: laser 658nm, autopodajnik</td></tr><tr><td>Azydek sodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>S 227I-500</td><td></td></tr></tbody></table>

analiza internalizacji komórkowej nanocząsteczek i bakterii przy użyciu wielospektralnej obrazującej cytometrii przepływowej

Analyzing Cellular Internalization of Nanoparticles and Bacteria by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

Systemy nanopartykularne stały się cennymi narzędziami w dostarczaniu szczepionek dzięki swojej zdolności do efektywnego transportu ładunku, w tym białek, do komórek prezentujących antygen1-5. Internalizacja nanopartykuł (NP) przez komórki prezentujące antygen jest krytycznym krokiem w generowaniu skutecznej odpowiedzi immunologicznej na enkapsulowany antygen. Aby określić, w jaki sposób zmiany w formulacji nanopartykuł wpływają na ich funkcję, dążyliśmy do opracowania wysokoprzepustowego, ilościowego protokołu eksperymentalnego, który byłby kompatybilny z wykrywaniem zinternalizowanych nanopartykuł, jak również bakterii. Do tej pory dwiema niezależnymi technikami stosowanymi do badania fagocytozy nanopartykuł były mikroskopia oraz cytometria przepływowa. Wysokoprzepustowy charakter cytometrii przepływowej pozwala na uzyskanie wiarygodnych danych statystycznych. Jednak ze względu na niską rozdzielczość, metoda ta nie pozwala na dokładne ilościowe rozróżnienie nanopartykuł zinternalizowanych od tych związanych z powierzchnią komórki. Mikroskopia generuje obrazy o wysokiej rozdzielczości przestrzennej, jednak jest czasochłonna i wiąże się z analizą małych prób6-8. Wielospektralna cytometria przepływowa z obrazowaniem (MIFC) to nowa technologia łącząca aspekty mikroskopii i cytometrii przepływowej, która jednocześnie wykonuje wielokolorową spektralną fluorescencję oraz obrazowanie w polu jasnym w rdzeniu laminarnym. Możliwość ta zapewnia dokładną analizę intensywności sygnałów fluorescencyjnych oraz relacji przestrzennych między różnymi strukturami a cechami komórkowymi przy wysokiej prędkości pomiaru.
	W niniejszej pracy opisujemy metodę wykorzystującą MIFC do charakterystyki populacji komórek, które zinternalizowały nanocząstki polianhydrydu lub Salmonella enterica serowaru Typhimurium. Opisujemy również przygotowanie zawiesin nanocząstek, znakowanie komórek, akwizycję danych w systemie ImageStreamX oraz analizę danych przy użyciu aplikacji IDEAS. Przedstawiamy ponadto zastosowanie techniki, która może służyć do rozróżnienia dróg internalizacji nanocząstek i bakterii poprzez użycie cytochalazyny-D jako inhibitora fagocytozy zależnej od aktyny.

W niniejszym artykule opisujemy metodę wykorzystującą multispektralną przepływową cytometrię obrazową do ilościowego oznaczenia internalizacji nanocząstek polianhydrydowych lub bakterii przez komórki RAW 264.7.

Analiza internalizacji komórkowej nanocząsteczek i bakterii przy użyciu wielospektralnej obrazującej cytometrii przepływowej

Systemy nanopartykułowe stały się wartościowymi narzędziami w dostarczaniu szczepionek dzięki ich zdolności do efektywnego transportu ładunku, w tym białek, do ...

W celu analizy komórkowych mechanizmów internalizacji nanocząsteczek i bakterii za pomocą multispektralnej cytometrii przepływowej z obrazowaniem. Makrofagi są najpierw poddawane wstępnej obróbce cytochalasiną D w celu zahamowania polimeryzacji aktyny. Do monowarstwy makrofagów dodaje się nanocząsteczki lub salmonellę, a następnie inkubuje.Następnie makrofagi są zbierane, utrwalane i znakowane w celu analizy z wykorzystaniem systemu ImageStream. Dzięki wielospektralnej cytometrii przepływowej obrazującej można odróżnić komórki, które zinternalizowały nanocząsteczki i/lub salmonellę, od tych, w których nanocząsteczki i/lub salmonella są związane jedynie z powierzchnią. Otrzymane dane wskazują, że zarówno salmonella, jak i nanocząsteczki są internalizowane wyłącznie przez komórki, które nie zostały poddane działaniu cyto klain.D sugeruje, że internalizacja jest zależna od aktyny. Technika ta posiada kilka zalet w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak cytometria przepływowa i mikroskopia konfokalna. Przede wszystkim zapewnia dokładny pomiar intensywności sygnałów fluorescencyjnych oraz rozdzielczość przestrzenną między różnymi strukturami komórkowymi przy wysokiej prędkości.M

analyzing-cellular-internalization-nanoparticles-bacteria-multi

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Analiza wewnętrznej internalizacji nanocząstek i bakterii przez cytometrię przepływową z wielospektralnym obrazowem

Źródło: Zhang, Y., et al. Zastosowanie nanocząstek fluorescencyjnych do badania przebudowy układu endolizosomalnego przez bakterie wewnątrzkomórkowe. J. Vis. Exp. (2015)Ten film pokazuje zastosowanie nanocząstek fluorescencyjnych do wizualizacji endolizosomalnej przebudowy w ludzkich komórkach nabłonka zakażonych przez bakterie wewnątrzkomórkowe. Po inwazji bakteryjnej patogeny manipulują cytoszkieletem gospodarza i układem endolizosomalnym, tworząc wakuole z wypustkami rurkowymi, które...

Wizualizacja endo-lizosomalnej przebudowy za pośrednictwem nanocząstek w komórkach zakażonych bakteriami

Przeglądamy nasze ostatnie wyniki dotyczące integracji mikroskopii fluorescencyjnej i narzędzi do obrazowania cytometrii przepływowej w telefonie komórkowym przy użyciu kompaktowych i opłacalnych przystawek opto-fluidycznych. Te urządzenia do mikroanalizy oparte na telefonach komórkowych mogą być przydatne do analizy cytometrycznej, takiej jak wykonywanie różnych zadań związanych z liczeniem komórek, a także do wysokoprzepustowych badań przesiewowych, np. próbek wody w warunkach ograniczonych...

Szerokokątna mikroskopia fluorescencyjna i obrazowanie fluorescencyjne Cytometria przepływowa w telefonie komórkowym

W tym badaniu, głównym celem było monitorowanie wychwytu komórkowego i ewentualnej egzocytozy nanorurek węglowych (CNT). Z tej perspektywy zaproponowaliśmy tutaj unikalną metodę wykorzystującą obrazowanie wielospektralne cytometrii przepływowej, pozwalającą na kwantyfikację i lokalizację CNT w statystycznie istotnej liczbie komórek.

Lokalizacja i względna kwantyfikacja nanorurek węglowych w komórkach za pomocą cytometrii przepływowej obrazowania wielospektralnego

Analiza interakcji nanocząsteczek z określonymi subpopulacjami komórek odpornościowych za pomocą cytometrii przepływowej.

Wykrywanie oddziaływań nanocząstek fluorescencyjnych z pierwotnymi subpopulacjami komórek odpornościowych za pomocą cytometrii przepływowej

Ten artykuł opisuje metody syntezy i fluorescencyjnego znakowania nanocząstek (NP). Nanocząsteczki zastosowano w eksperymentach z pogonią za impulsami w celu oznaczenia układu endolizosomalnego komórek eukariotycznych. Manipulację układu endo-lizosomalnego przez aktywność wewnątrzkomórkowego patogenu Salmonella enterica przeprowadzono następnie za pomocą obrazowania żywych komórek i określono ilościowo.

Zastosowanie nanocząstek fluorescencyjnych do badania przebudowy układu endolizosomalnego przez bakterie wewnątrzkomórkowe

Ta metoda demonstruje technikę oceny funkcji granulocytów poprzez jednoczesny pomiar fagocytozy bakterii i wybuchu oksydacyjnego. Cytometria przepływowa oparta na obrazie pozwoliła na zidentyfikowanie trzech odrębnych podzbiorów aktywowanych granulocytów, z których każdy różnił się względną zdolnością funkcjonalną.

Technika cytometrii przepływowej opartej na obrazie do oceny zmian w funkcji granulocytów in vitro

Analiza cytometryczna przepływu okazała się przydatna do badania czystych kultur i monitorowania dynamiki społeczności mikroorganizmów. Przedstawiamy trzy kompleksowe przepływy pracy, od próbkowania po analizę danych, dla czystych kultur i złożonych społeczności, odpowiednio w przezroczystym podłożu, jak i w trudnych matrycach.

Charakterystyka dynamiki mikrobiomu – przepływy pracy oparte na cytometrii przepływowej od czystych kultur do naturalnych społeczności

Test mikrojądrowy in vitro jest dobrze znaną metodą oceny genotoksyczności i cytotoksyczności, ale ocena testu za pomocą mikroskopii manualnej jest pracochłonna i cierpi z powodu subiektywności i zmienności między punktorami. W artykule opisano protokół opracowany w celu przeprowadzenia w pełni zautomatyzowanej wersji testu z wykorzystaniem cytometrii przepływowej obrazowania wielospektralnego.

Zautomatyzowana metoda wykonywania testu mikrojądrowego in vitro przy użyciu cytometrii przepływowej obrazowania wielospektralnego

Ten artykuł przedstawia integrację modułu spektralnego ogniskowania i lasera impulsowego o podwójnym wyjściu, umożliwiającego szybkie obrazowanie hiperspektralne nanocząsteczek złota i komórek rakowych. Praca ta ma na celu zademonstrowanie szczegółów multimodalnych nieliniowych technik optycznych na standardowym laserowym mikroskopie skaningowym.

Obrazowanie biomolekularne wychwytu komórkowego nanocząstek przy użyciu multimodalnej nieliniowej mikroskopii optycznej

Ten protokół opisuje ilościowe podejście do pomiaru autoagregacji drobnoustrojów za pomocą obrazowej cytometrii przepływowej.

Obrazowa cytometria przepływowa do badania autoagregacji drobnoustrojów

Badanie to wyjaśnia przetwarzanie fagocytarne cząstek Godanti Bhasma (GB) w komórkach ssaków, charakteryzując ich wychwyt komórkowy, dynamikę wakuoli, zakwaszenie i degradację. Odkrycia te nie tylko pogłębiają naszą wiedzę na temat podstawowych mechanizmów fagocytozy, ale także sprawiają, że GB jest obiecującym systemem modelowym do opracowywania nowych strategii terapeutycznych.

Badanie sekwencyjnych zdarzeń komórkowych fagocytozy wywołanej przez Godanti Bhasma w komórkach ssaków

Poznaj metodę analizy internalizacji nanocząstek i bakterii przez makrofagi RAW 264.7 przy użyciu wielospektralnej cytometrii przepływowej obrazowania. Technika ta pozwala odróżnić cząstki wewnątrzkomórkowe od powierzchniowych.

Analiza internalizacji komórkowej nanocząsteczek i bakterii przy użyciu wielospektralnej obrazującej cytometrii przepływowej

Przeglądaj więcej filmów