Mikroskopia superrozdzielcza kompleksu synaptonemalnego w obrębie linii zarodkowej Caenorhabditis elegans

Kompleks synaptonemalny jest kluczowym składnikiem mejozy. Aby zbadać jego funkcję, musimy również zrozumieć jego strukturę, dla której mikroskopia superrozdzielcza okazała się niezwykle przydatna. Zoptymalizowaliśmy nasz protokół, aby stabilnie przyczepić immunobarwioną gonadę C.elegans do szkiełka nakrywkowego, co pomaga poprawić rozdzielczość do 30 nanometrów w nienaruszonych tkankach.

Projektowanie eksperymentów z mikroskopią lokalizacji pojedynczych cząsteczek, późniejsza analiza, a także interpretacja danych mogą być dość trudne i najlepiej jest je ustalić wspólnie z ekspertem. Procedurę zademonstruje Ivana Cavka, doktor habilitowany w laboratorium. Akwizycja obrazów z mikroskopii lokalizacji pojedynczej cząsteczki zostanie również pokazana przez Rory'ego Powera, inżyniera optycznego z MBL Imaging Center.

Zacznij od zebrania dopasowanych do wieku robaków Caenorhabditis elegans z płytek agarowych NGM. Przenieś robaki do 30-mikrolitrowej kropli EBTT na szkiełku nakrywkowym. Umyj robaki dodatkowymi 30 mikrolitrami EBTT.

Usuń 30 mikrolitrów roztworu, pozostawiając 30 mikrolitrów kropli z robakami na szkiełku nakrywkowym. Użyj ostrza skalpela, aby odciąć głowy i/lub ogony robaków, aby wycisnąć gonadę. W udanej sekcji tkanka gonady zostanie w pełni wytłoczona na zewnątrz ciała robaka.

Odpipetować 30 mikrolitrów roztworu utrwalającego do kropli wypreparowanych robaków. Wymieszać pipetując i pozostawić próbki do utrwalenia na jedną minutę. Zatrzymaj utrwalanie dokładnie po jednej minucie, przenosząc robaki za pomocą pipety o pojemności 20 mikrolitrów na probówkę do PCR wypełnioną TBST.

Następnie wykonaj mycie, obracając wypreparowane próbki na mini wirówce stołowej. Po usunięciu supernatantu ponownie zawieś robaki w 200 mikrolitrach świeżego TBST. Po ostatnim umyciu ponownie zawieś robaki w 200 mikrolitrach PBST i umieść probówkę PCR na lodzie.

Odwiruj wypreparowane próbki na mini wirówce stołowej i usuń supernatant. Dodać od 50 do 100 mikrolitrów zimnego metanolu, wymieszać pipetując i pozostawić próbki w metanolu na 30 do 60 sekund na lodzie. Przemyć próbki dwukrotnie 200 mikrolitrami PBST.

Po odwirowaniu próbek i usunięciu supernatantu dodać do nich roztwór blokujący i przechowywać go w temperaturze pokojowej przez 45 do 60 minut. Rozcieńczyć pierwszorzędowe przeciwciała przeciwko roztworom roboczym w buforze blokującym. Odwiruj próbki na mini wirówce stołowej, usuwając roztwór blokujący, i dodaj od 30 do 50 mikrolitrów roztworu przeciwciała pierwotnego.

Inkubować przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Pod koniec inkubacji przemyć próbki trzykrotnie w PBST. Rozcieńczyć oznaczone dwa fragmenty Fab prime do roztworów roboczych w buforze blokującym.

Po trzecim płukaniu odwirować próbki, usunąć supernatant i dodać od 30 do 50 mikrolitrów roztworu przeciwciał wtórnych. Umieścić próbkę w ciemnej komorze i inkubować przez 30 minut do dwóch godzin w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie przemyć próbki trzykrotnie PBST przez pięć do 15 minut.

Odwirować poplamione próbki i usunąć supernatant. Dodać 50 mikrolitrów PBST i przenieść poplamione robaki na szkiełko nakrywkowe. Odpipetować od 5,7 do 6,3 mikrolitrów roztworu po utrwaleniu na szkiełko nakrywkowe z poli-l-licyny.

Odpipetować wypreparowane robaki w tej samej objętości i przenieść do kropli utrwalacza na szkiełku nakrywkowym z poli-l-lizyny. Przykryj próbkę małym szkiełkiem nakrywkowym. Usuń nadmiar płynu za pomocą małego kawałka bibuły filtracyjnej i utrwal próbkę na trzy do pięciu minut w ciemnej komorze.

Zamrozić próbki, umieszczając je na aluminiowym bloku w suchym lodzie. Po co najmniej 20 minutach usuń mniejsze szkiełko nakrywkowe za pomocą maszynki do golenia. Zanurz szkiełko nakrywkowe w 50-mililitrowej stożkowej probówce zawierającej lodowaty PBS lub metanol schłodzony w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez około 10 sekund.

Umieścić szkiełko nakrywkowe w studzience na sześciodołkowej płytce wypełnionej buforem PBST. Usunąć PBST z dołka, dodać świeży PBST i pozostawić próbkę na pięć minut. Po ponownym umyciu PBST należy pozostawić próbki w temperaturze czterech stopni Celsjusza do czasu wykonania obrazowania.

Przed obrazowaniem oceń jakość mocowania próbki pod mikroskopem stereoskopowym. Jeśli używasz pokazanego tutaj niestandardowego uchwytu na próbkę, owiń pierścień magnetyczny parafilmem, a następnie przygotuj jeden mililitr bufora do obrazowania. Weź szkiełko nakrywkowe z płytki sześciodołkowej.

Umieść go w specjalnie wykonanym uchwycie i przymocuj szkiełko nakrywkowe w uchwycie za pomocą pierścienia magnetycznego owiniętego folią parafoliową. Delikatnie odpipetować bufor obrazowania w komorze utworzonej przez pierścień magnetyczny na górze próbki i uszczelnić komorę za pomocą parafilmu. Aby zamontować próbkę, dodaj jedną kroplę olejku immersyjnego do obiektywu z czystym olejem.

Nie wprowadzając powietrza do olejku immersyjnego, delikatnie umieść uchwyt na próbkę z zamontowaną próbką na stoliku mikroskopu. Korzystając z okna wtyczki EMU w MicroManager 2, przesuwaj stolik piezoelektryczny, aż sygnał z lasera blokady ostrości zostanie wykryty na fotodiodzie kwadrantowej. Uzyskaj obraz tylnej płaszczyzny ogniskowej przy niższej mocy za pomocą lasera o wzbudzeniu 640 nanometrów, aby potwierdzić brak pęcherzyków powietrza w olejku immersyjnym.

Zlokalizuj tkankę gonady za pomocą oświetlenia jasnego pola. Używając oświetlenia o niskiej intensywności przy 640 nanometrach, skup się na sekcji tkanki zawierającej wiele kompleksów synaptonemalnych. Kontynuuj naświetlanie próbki przy wysokim natężeniu promieniowania z oświetleniem o długości 640 nanometrów przez około 30 sekund, aż do uzyskania odpowiedniej częstotliwości mrugania.

Uchwyć 200 000 klatek z czasem naświetlania 20 milisekund za pomocą narzędzia do akwizycji wielowymiarowej w MicroManager 2. W międzyczasie skonfiguruj aktywację UV za pomocą opcji aktywacji wtyczki EMU, aby utrzymać żądaną częstotliwość. Najniższą płaszczyznę jąder mejotycznych zawierających kompleksy synaptonemalne uwidoczniono w gonadzie Caenorhabditis elegans przy użyciu barwienia HTP-3 i SYP-5.

Osie chromosomów w C-końcu SYP-5 HA były dobrze rozdzielone we wszystkich trzech wymiarach w kompleksach synaptonemalnych zlokalizowanych w pobliżu szkiełka nakrywkowego. Jednak rozdzielczość pogarsza się w kompleksach synaptonemalnych znajdujących się w odległości pięciu mikrometrów od szkiełka nakrywkowego z powodu rozpraszania światła i aberracji sferycznych. Obrazy uzyskane w różnych piezoelektrycznych odległościach od szkiełka nakrywkowego ujawniły, że obrazowana tkanka nie powinna znajdować się dalej niż dwa mikrometry od szkiełka nakrywkowego.

Protokół przygotowania próbki może być również stosowany w mikroskopii TauTED. Dzięki zoptymalizowanemu przygotowaniu próbki, HTP-3 w osiach chromosomów i C-końce SYP-5 w regionie centralnym zostały rozwiązane w widoku frontalnym i lekko pochylonym. Aby uzyskać najlepszą rozdzielczość, gonady muszą być ściśle połączone ze szkiełkiem nakrywkowym, aby zapewnić, że kompleksy synaptonemalne nie znajdują się dalej niż dwa mikrometry od szkiełka nakrywkowego.

Używamy tego protokołu nie tylko do mikroskopii lokalizacji pojedynczych cząsteczek, ale także do mikroskopii wymuszonej deprymcji emisji. Może być również przydatny w innych technikach mikroskopii superrozdzielczej.