Name: Mikroskopia superrozdzielcza kompleksu synaptonemalnego w obrębie linii zarodkowej Caenorhabditis elegans (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-13T14:15:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: Poznaj mikroskopię superrozdzielczą kompleksu synaptonemalnego w linii zarodkowej Caenorhabditis elegans. Ta metoda umożliwia wizualizację białek z rozdzielczością 30 nanometrów w nienaruszonych tkankach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Jonasowi Riesowi i laboratorium Riesa za udostępnienie obrazowania SMLM. Dziękujemy również Yumi Kim za szczep C. elegans użyty w tym protokole oraz Abby F. Dernburg za przeciwciało anty-HTP-3 kurczaka. Dziękujemy Marko Lampe i Stefanowi Terjungowi z Zakładu Zaawansowanej Mikroskopii Świetlnej w EMBL Heidelberg za wsparcie w korzystaniu z mikroskopu konfokalnego Olympus iXplore SPIN SR. Prace te były wspierane przez Europejskie Laboratorium Biologii Molekularnej oraz Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Niemiecka Fundacja Badawcza - 452616889, SK). Doceniamy dostęp i usługi świadczone przez Centrum Obrazowania w Europejskim Laboratorium Biologii Molekularnej (EMBL IC), hojnie wspierane przez Fundację Boehringer Ingelheim.

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Drabinkowata organizacja SC, która jest niezbędna do prawidłowej rekombinacji i segregacji chromosomów homologicznych, została po raz pierwszy zaobserwowana prawie 70 lat temu w mikroskopii elektronowej 3,4. Podczas gdy ogólna organizacja SC jest łatwo rozwiązana w mikroskopii elektronowej, lokalizacja poszczególnych składników w tym kompleksie wymaga bardziej ukierunkowanego podejścia. Przy szerokości zaledwie ~100 nm, podstruktura SC nie może być rozdzielona za pomocą konwencjonalnej mikroskopii fluorescencyjnej. Jednak mikroskopia superrozdzielcza stała się główną siłą napędową nowych odkryć dotyczących struktury i funkcji kompleksu synaptonemalnego 16,19,24,25,26,27,28,29,30. Aby ułatwić te badania, zademonstrowaliśmy procedurę mocowania, która umożliwia badanie architektury SC w tkance gonady C. elegans za pomocą mikroskopii SMLM i STED.
Kluczowym krokiem w celu optymalizacji rozdzielczości w obrazowaniu SMLM jest bezpośrednie usieciowanie tkanki linii zarodkowej z szkiełkiem nakrywkowym pokrytym poli-L-lizyną (krok 4). Kowalencyjne przyleganie tkanki do szkiełka nakrywkowego jest niezbędne do zmniejszenia ruchów w próbce, które skutkowałyby dużymi dryftami i uniemożliwiłyby obrazowanie przez długi czas w kierunku SMLM. Dodatkowo, nawet nieoptymalne przyłączenie, które pozostawia jądra zawierające SC w pewnej odległości od szkiełka nakrywkowego, prowadzi do znacznego spadku osiągalnej rozdzielczości wynikającego z aberracji sferycznych (ryc. 4). Alternatywnie do zastosowanego tutaj mocowania kowalencyjnego, wybarwiona tkanka linii rozrodczej może być również unieruchomiona między dwoma uszczelnionymi szkiełkami nakrywkowymi w małej kropli buforu obrazowego19,30. Jednak ta metoda immobilizacji znacznie zmniejsza objętość buforu obrazowania w próbce z 1 ml zastosowanego w zoptymalizowanym protokole do zaledwie kilku μl, co spowoduje zakwaszenie buforu obrazowania i znacznie skróci czas, w którym próbka może być obrazowana 38,53,54.
Długie czasy akwizycji zarówno w przypadku mikroskopii SMLM, jak i STED ograniczają stosowanie tych metod do obrazowania próbek utrwalonych chemicznie. W tym przypadku utrwalanie paraformaldehydu zapewnia, że struktura SC jest zachowana podczas przygotowywania próbki i obrazowania. Jednak pomimo podjętych tutaj środków ostrożności w celu zobrazowania SC w nienaruszonej tkance, wynikowa struktura SC po utrwaleniu niekoniecznie jest identyczna ze strukturą w stanie naturalnym w żywym organizmie. Co więcej, ponieważ pojedynczy obraz stałego SC stanowi pojedynczą "migawkę" struktury biologicznej, podejście to pozostaje ślepe na dynamikę struktury natywnej in vivo.
Jednak informacje na temat dynamiki i zmienności struktur makromolekularnych można również uzyskać, uzyskując nie tylko jedną, ale wiele "migawek". Chociaż takie podejście może rozwiązać zmiany w strukturze SC podczas pachytenu19, istnieje kilka czynników, które ograniczają liczbę obrazów, które można uzyskać z pojedynczej próbki przygotowanej przy użyciu tego protokołu. Po pierwsze, wysokie moce lasera używane podczas akwizycji obrazu prowadzą do trwałego wybielenia fluoroforów i uniemożliwiają obrazowanie sąsiednich obszarów zainteresowania lub wielu płaszczyzn z, co znacznie zmniejsza liczbę obrazów, które można uzyskać z pojedynczej próbki. Po drugie, gęstość próbki/tkanki na szkiełku nakrywkowym przygotowanym tą metodą jest niska, co znacznie ogranicza liczbę obrazów, które można uzyskać z pojedynczego szkiełka nakrywkowego. Niska gęstość próbki uniemożliwia również korzystanie z automatycznych potoków pozyskiwania obrazów, które pomogły rzucić światło na inne pytania biologiczne 34,55,56,57,58,59. Jednak gęstość próbki może zostać nieznacznie zwiększona przez doświadczonego użytkownika.
Przedstawiony tutaj protokół jest zoptymalizowany pod kątem uzyskania wysokiej gęstości etykietowania, która jest niezbędna do osiągnięcia optymalnej rozdzielczości w SMLM35. Podczas gdy poprzednie protokoły kowalencyjnie przyczepiały tkankę do szkiełka nakrywkowego przed barwieniem immunologicznym16, ten nowy protokół łączy tkankę ze szkiełkiem nakrywkowym dopiero po zabarwieniu próbek w roztworze. Modyfikacja ta umożliwia przeciwciałom używanym do znakowania immunologicznego swobodny dostęp do tkanki ze wszystkich stron, podczas gdy kowalencyjne przyłączenie tkanki do szkiełka nakrywkowego może ograniczać dotarcie przeciwciał do jąder znajdujących się najbliżej szkiełka nakrywkowego, zmniejszając w ten sposób stopień znakowania. Opisane tutaj modyfikacje łącznie poprawiają rozdzielczość z 40-50 nm (rozdzielczość FRC)16 do 30-40 nm (ten protokół).
Co ważne, podczas gdy wysoka gęstość znakowania i wysokie stężenie przeciwciał są niezbędne dla SMLM, stwierdziliśmy, że lepsze obrazy mikroskopowe STED uzyskuje się przy użyciu niższych stężeń przeciwciał (krok 3). Przy rozdzielczości dziesiątek nanometrów coraz ważniejsze staje się wielkość cząsteczek używanych do oznaczania białka będącego przedmiotem zainteresowania. W związku z tym zastosowaliśmy fragmenty F(ab')2, które są o połowę mniejsze niż przeciwciała o pełnej długości. Poprawa lokalnego kontrastu spowodowana mniejszym źródłem sygnału, a tym samym rozdzielczość uzyskana przez tę modyfikację w porównaniu z użyciem przeciwciał drugorzędowych o pełnej długości, pozwoliła na rozdzielczość dwóch C-końców SYP-5 w regionie centralnym przez TauSTED, które nie są rozpoznawane przez konwencjonalny STED przy użyciu przeciwciał o pełnej długości (16 i dane nie pokazane). Przewidujemy, że ten zoptymalizowany protokół obrazowania SC w nienaruszonych liniach zarodkowych C. eleganułatwi badanie relacji struktura-funkcja SC podczas mejozy.

Zmniejszenie liczby chromosomów o połowę podczas mejozy jest kluczem do generowania zdrowego potomstwa w organizmach rozmnażających się płciowo. Aby osiągnąć to zmniejszenie liczby chromosomów, chromosomy homologiczne muszą łączyć się w pary i segregować podczas mejozy I. Aby zapewnić dokładną segregację chromosomów homologicznych, komórki rozrodcze przechodzą rozszerzoną profazę I, podczas której chromosomy homologiczne łączą się w pary, synapsują i rekombinują, aby wygenerować fizyczne połączenia między homologami1. SC stał się centralną strukturą, która jest kluczowa w regulowaniu prawidłowej progresji przez mejotyczną prophase2.
SC to kompleks, którego ogólna struktura jest ewolucyjnie zachowana, mimo że istnieje niewielka homologia między jego składnikami białkowymi. SC został po raz pierwszy zidentyfikowany na mikrofotografiach elektronowych jako trójdzielna, przypominająca drabinę struktura składająca się z dwóch bocznych elementów lub osi, centralnego obszaru utworzonego przez poprzeczne włókna i elementu centralnego3,4. Określenie organizacji poszczególnych komponentów w kompleksie jest kluczem do pogłębienia naszego zrozumienia roli SC podczas mejotycznej profazy.
Organizm modelowy C. elegans idealnie nadaje się do badania struktury i funkcji SC, ponieważ jego linie zarodkowe zawierają dużą liczbę jąder mejotycznych z w pełni złożonymi SCs5. Badania genetyczne i biochemiczne wykazały, że osie chromosomów są utworzone przez trzy odrębne kompleksy kohezyny6,7 i cztery białka domeny HORMA o nazwach HTP-1/2/3 i HIM-37,8,9,10,11 w C. elegans. W centralnym regionie SC do tej pory zidentyfikowano sześć białek zawierających domeny zwinięte cewki12,13,14,15,16,17. Aby zniwelować odległość między dwiema osiami, SYP-1, -5 i -6 dimeryzują się w sposób head-to-head (Rysunek 1), podczas gdy trzy dodatkowe białka stabilizują swoje oddziaływanie w centralnym elemencie16,17,18,19.
Uzyskanie szczegółowego wglądu w organizację tych białek jest niezbędne do zrozumienia wielu funkcji SC podczas mejozy. Ponieważ szerokość centralnego obszaru SC wynosi tylko ~100 nm, jego podstruktura nie może być rozdzielona za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej ograniczonej dyfrakcją. Jednak wizualizacja komponentów w strukturze tej wielkości jest łatwo osiągalna za pomocą mikroskopii superrozdzielczej. Rzeczywiście, mikroskopia oświetlenia strukturalnego (SIM), mikroskopia ekspandacyjna20, mikroskopia defiscencji emisji wymuszonej (STED) class21 oraz mikroskopia lokalizacji pojedynczych cząsteczek (SMLM)22,23 okazały się niezbędnymi narzędziami do badania architektury molekularnej SC w różnych gatunkach16,24,25,26,27,28,29,30.
Aby pokonać limit rozdzielczości, mikroskopia STED polega na nałożeniu ograniczonej dyfrakcją plamki światła emisyjnego za pomocą wiązki w kształcie pączka z lasera STED, która teoretycznie zwęża funkcję rozproszenia punktów do wymiarów molekularnych31,32. Jednak rozdzielczość, która jest praktycznie osiągalna przez STED w próbkach biologicznych, pozostaje w zakresie kilkudziesięciu nanometrów w xy33.
Jeszcze wyższa rozdzielczość w próbkach biologicznych może być uzyskana za pomocą technik SMLM. SMLM wykorzystuje właściwości określonych fluoroforów do rozpoznawania obiektów na poziomie subdyfrakcyjnym poprzez rozdzielanie przestrzennie nakładających się fluoroforów w czasie. Próbka jest następnie wielokrotnie obrazowana w celu uchwycenia różnych podzbiorów fluoroforów. Położenie fluoroforów w próbce jest następnie określane przez dopasowanie funkcji rozproszenia punktowego (PSF) do uzyskanych sygnałów na wszystkich obrazach, które mogą rozdzielić struktury do 15 nm23,34.
Razem wzięte, zlokalizowane obrazy kodują pozycje wszystkich fluoroforów. Rozdzielczość SMLM zależy od gęstości znakowania i charakterystyki fluoroforu. Zgodnie z kryterium Nyquista-Shannona niemożliwe jest wiarygodne rozpoznawanie obiektów, których odległość jest mniejsza niż dwukrotność średniej odległości między etykietami. W związku z tym do obrazowania w wysokiej rozdzielczości potrzebna jest wysoka gęstość etykietowania. W przypadku SC u C. elegans wysoką gęstość znakowania można osiągnąć za pomocą znaczników epitopowych przyłączonych do określonych miejsc białek endogennych za pomocą edycji genomu. Znaczniki epitopów można następnie wybarwić z dużą gęstością przy użyciu specyficznych przeciwciał monoklonalnych o wysokim powinowactwie19,30. Jednocześnie cykl poszczególnych fluoroforów musi być na tyle krótki, aby zapewnić, że przestrzennie nakładające się fluorofory nie zostaną uchwycone w tym samym czasie35.
Ze względu na te dwa wymagania, rozdzielenie struktury dużych kompleksów makromolekularnych, takich jak SC, wymaga zobrazowania wystarczająco dużej liczby obrazów, a zatem może zająć kilka godzin. Pułapką długiego czasu obrazowania jest to, że próbki mają tendencję do dryfowania z powodu ruchu stolika lub małych prądów w buforze próbki; Nawet niewielkie ruchy rzędu 10 nm są szkodliwe przy rozdzielczości nm i muszą być korygowane. Jednak powszechnie stosowane metody korekcji dryfu nie są wystarczająco solidne, aby dokładnie nałożyć obrazy dwóch kanałów obrazowanych sekwencyjnie36. Jest to problematyczne, ponieważ pytania biologiczne często wymagają precyzyjnego wykrywania i lokalizacji wielu celów w tej samej próbce. Aby obejść te problemy, opracowano metody takie jak obrazowanie ratiometryczne. Obrazowanie ratiometryczne pozwala na jednoczesne obrazowanie wielu fluoroforów z nakładającymi się widmami wzbudzenia i emisji, z późniejszym przypisaniem każdego wykrytego sygnału do odpowiedniego fluoroforu w oparciu o stosunek intensywności w spektralnie różnych kanałach37,38.
Dodatkowo, badanie organizacji kompleksów makromolekularnych, takich jak SC, wymaga trójwymiarowych (3D) informacji. Aby osiągnąć superrozdzielczość w trzech wymiarach (3D-SMLM), w ścieżkę optyczną emitowanego światła wbudowana jest cylindryczna soczewka, która zniekształca kształt PSF fluoroforu w zależności od jego odległości od płaszczyzny ogniskowej. W związku z tym dokładne położenie fluoroforu w płaszczyźnie z można ekstrapolować, analizując kształt jego sygnału emisyjnego35,39. Połączenie tych osiągnięć w SMLM pozwala na obrazowanie 3D organizacji kompleksów makromolekularnych, w tym SC.

<table><tbody><tr><td>100x/1,5 obiektyw olejowy</td><td>Olympus</td><td>UPLAPO100XOHR</td><td>UPLAPO100XOHR</td></tr><tr><td>2-merkaptoetyloamina (MEA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30070-10G</td><td>Rozpuszczony w wodzie MilliQ do 5 M roztworu, pH &nbsp; 8,7 skorygowany HCl. Porcjowany do objętości jednorazowego użytku, zamrożony i przechowywany w temperaturze -80 & stopni C.</td></tr><tr><td>Dodatkowy laser wspomagający 640 nm</td><td>Toptica</td><td>IBEAM-SMART-640-S-HP</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 594, ester NHS</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>A37572</td><td>Rozpuszczony w DMSO do roztworu 1 mM, podany do objętości jednorazowego użytku, zamrożony i przechowywany w temperaturze -80 & stopni; C</td></tr><tr><td>AlexaFluor 647, ester NHS</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>A37573</td><td>Rozpuszczony w DMSO do 1 mM roztworu, podany do objętości jednorazowego użytku, zamrożony i przechowywany w temperaturze -80 °; C</td></tr><tr><td>anty-HA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>2-2.2.14</td><td>Mysz monoklonalna, 1:250 (SMLM), 1:1,000 (STED Microscopy)</td></tr><tr><td>anty-HTP-3</td><td>prezent od Abby F. Dernburg</td><td>MacQueen et al., 2005</td><td>Kurczak poliklonalny, 1:250 (SMLM), 1:1,000 (STED Microscopy)</td></tr><tr><td>Caenorhabditis elegans szczep&nbsp; YKM349</td><td>prezent od Yumi Kim</td><td>Hurlock et al., 2020</td><td>syp-5(kim9[syp-5::HA]) I; meIs8[pie-1p::GFP::cosa-1, unc-119(+)] II</td></tr><tr><td>CF6680, NHS ester</td><td>Biotium</td><td>92139</td><td>Rozpuszczony w DMSO do roztworu 1mM, podzielony na objętość do jednorazowego użytku, zamrożony i przechowywany w temperaturze -80 &deg; C</td></tr><tr><td>Szklana osłona okrągła 12 mm nr 1</td><td>Menzel-Gl&auml; ser; VWR</td><td>631-0713</td><td></td></tr><tr><td>Okrągłe szkło osłonowe 24 mm nr 1.5</td><td>Carl Roth</td><td>PK26.1</td><td></td></tr><tr><td>Soczewki cylindryczne</td><td>Thorlabs</td><td>LJ1516RM-A, LK1002RM-A</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do jaj (10x)</td><td></td><td>Edgar 1995</td><td>250 mM HEPES, 1.18 M NaCl, 480 mM KCl, 20 mM EDTA, 5 mM EGTA, pH 7.4</td></tr><tr><td>Etanol (bezwzględny do analizy)</td><td>Merck</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>F(ab')2 fragment anty-kurczaka IgY</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>AB_2340347</td><td>Osioł poliklonalny, 1:100 (SMLM), 1:1,000 (mikroskopia STED)</td></tr><tr><td>F(ab')2-fragmentowy anty-mysi IgG</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>AB_2340761</td><td>Osioł poliklonalny, 1:100 (SMLM), 1:1,000 (STED Microscopy)</td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe Fisherbrand T/F Grunt o grubości 0,8-1,0 mm</td><td>Fisher scientific</td><td>7107</td><td></td></tr><tr><td>Gauge Worm Pick 30 średnica 0,254 mm - Iridium 10%</td><td>Kisker</td><td>789265</td><td></td></tr><tr><td>Mieszanka oksydazy glukozowo-enzymatycznej katalazy (GlOX/Cat )</td><td>prezent od Jonasa Riesa</td><td>Hoess, Mund, Reitberger i Ries, 2018</td><td>20x, 1916 U/ml oksydazy glukozowej (Sigma G7141), 42350 U/ml katalazy (Sigma C3155), 50 mM Tris-HCl pH 8,0, 51% glicerol, woda MilliQ. Przechowywany w temperaturze -20 & st. C.</td></tr><tr><td>Baza bufora obrazowania</td><td>prezent od Jonasa Riesa</td><td>Hoessa, Munda, Reitbergera i Ries, 2018</td><td>50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 10 mM NaCl, 10% D-glukozy. Podawane na objętość jednorazowego użytku (950 &mu; L), zamrożone i przechowywane w temperaturze -80 stopni Celsjusza.</td></tr><tr><td>Invitrogen ProLong Glass</td><td>Antiblade Mountant ThermoFischer Scientific</td><td>P36982</td><td></td></tr><tr><td>Leica Stellaris 8 STED FALCON</td><td>Leica</td><td>N/A</td><td>Mikroskop wyposażony jest w najnowszej generacji laser światła białego, impulsowy laser STED 775 nm, moduł FALCON Fluorescence Lifetime IMaging, Obiektyw olejowy HC PL APO CS2 100x/1.40 i detektor Leica HyD X. System jest zdolny do modułu FLIM wzmocnionego Tau-STED, który mierzy określony czas trwania fluorescencji barwnika, a zatem jest w stanie usunąć sygnał tła w oparciu o różnice w czasie życia fluorescencji barwników i warunkach barwnika w próbce. Dodatkowo rozdzielczość jest zwiększana poprzez uwzględnienie zmienności czasów życia fluorescencji w różnych obszarach pączka zubożenia.</td></tr><tr><td>Filtr emisyjny kanału długofalowego</td><td>AHF Analysentechnik</td><td>F47-702</td><td>700/100 nm pasmo przepustowe</td></tr><tr><td>Metanol (bezwzględny do analizy)</td><td>Merck</td><td>67-56-1</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich/Merck</td><td>S5761-500G</td><td>100 mM NaHCO3, pH 8,3</td></tr><tr><td>Laser światłowodowy w bliskiej podczerwieni</td><td>Toptica</td><td>IBEAM-SMART-PT-CD</td><td>Niestandardowy projekt, 808 nm - 75mW</td></tr><tr><td>Soczewka obiektywu z mocowaniem piezoelektrycznym (PIFOC)</td> <td>Physik Instrumente</td><td>P-726.1.CD</td><td>100 &micro; m zasięg podróży</td></tr><tr><td>Orca Fusion BT sCMOS Probówki</td><td>Hamamatsu</td><td>C15440-20UP</td><td></td></tr><tr><td>PCR</td><td>Greiner Bio-One</td><td>673283</td><td>0,2 ml</td></tr><tr><td>buforu fosforanowego soli fizjologicznej (PBS 10x)</td><td></td> <td>Nie dotyczy</td><td>137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4, pH 7,4</td></tr><tr><td>Pierce 16% formaldehyd (w/v), bez metanolu</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>28906</td><td>16% formaldehyd przenosi się z oryginalnej szklanej ampułki do probówki o pojemności 1,5 ml i utrzymuje w temperaturze pokojowej.</td></tr><tr><td>Środek do czyszczenia plazmy PlasmaPrep2</td><td>GaLa Instrumente GmbH</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Bromowodorek poli-L-lizyny</td><td>Sigma-Aldrich/Merck</td><td>P2636-25MG</td><td>0,1% w/v roztwór został przygotowany w wodzie Milli-Q i przechowywany w podwielokrotnościach w temperaturze -20 stopni C.</td></tr><tr><td>Pierwotny dichroiczny (odbijający światło)</td><td>AHF Analysentechnik</td><td>F73-866S</td><td>poczwórny pasmowoprzepustowy @ 405, 488, 561, 640</td></tr><tr><td>Filtr czterowskazowy</td><td>AHF Analysentechnik</td><td>F40-072</td><td>405/488/561/640 nm</td></tr><tr><td>Fotodioda kwadrantowa (QPD)</td><td>Komponenty laserowe</td><td>SD197-23-21-041, LC301DQD-PV</td><td></td></tr><tr><td>Żyletki</td><td>Apollo Herkenrath Solinger</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Kształtownik wiązki refrakcyjnej</td><td>AdlOptica</td><td>PiShaper 6_6_VIS</td><td></td></tr><tr><td>Roche Odczynnik blokujący</td><td>Roche</td><td>11096176001</td><td>10x roztwór został przygotowany zgodnie z zaleceniami. Zamrożone porcje przechowywano w temperaturze -20 °C.</td></tr><tr><td>Ostrze skalpela (marka Feather #11, nr 3)</td><td>Heinz Herenz Medizinalbedarf GmbH</td><td>1110911</td><td></td></tr><tr><td>Pudełko do usuwania skalpela</td><td>Fisher scientific</td><td>10002-50</td><td></td></tr><tr><td>Wtórny dichroiczny (odbijający emisję)</td><td>AHF Analysentechnik</td><td>F38-785S</td><td>750 nm długoprzepustowy</td></tr><tr><td>Filtr krótkoprzepustowy</td><td>Semrock</td><td>BSP01-785R-25</td><td>&nbsp; 750 nm</td></tr><tr><td>Filtr emisyjny kanału krótkofalowego</td><td>AHF Analysentechnik</td><td>F37-677</td><td>&nbsp; Pasmo przepustowe 676/37 nm</td></tr><tr><td>Mikroskop lokalizacji pojedynczej cząsteczki</td><td>Centrum Obrazowania EMBL</td><td>Diekmann i wsp., 2020 z modyfikacjami</td><td>Mikroskop zapewnia szerokokątne oświetlenie epi za pomocą jednomodowego silnika laserowego sprzężonego ze światłowodem, dodatkowego lasera wspomagającego i kształtownika wiązki refrakcyjnej, aby zapewnić równomierne pole oświetlenia (Stehr i in., 2019). Obrazy szerokokątne są rejestrowane kamerą sCMOS&nbsp; oraz odpowiedni przekaźnikowy układ optyczny dla powiększenia systemu 61x i rozmiaru piksela 106 nm. W przypadku ratiometrycznego spektralnie nakładających się na siebie barwników dalekiej czerwieni, rozdzielacz obrazu wytwarza dwa widmowo odrębne obrazy w kamerze (dichroiczny podział: długi przepustowy 665 nm, filtr emisji kanału krótkofalowego: pasmowoprzepustowy 676/37 nm, długofalowy filtr emisyjny: pasmowoprzepustowy 700/100 nm. Dodatkowy filtr czworokątny 405/488/561/640 nm i filtr krótkoprzepustowy 750 nm są wspólne dla obu ścieżek i zapewniają dodatkowe blokowanie laserowe). Złożona soczewka cylindryczna zapewnia astygmatyzm wymagany do obrazowania 3D. Aby utrzymać stałą ostrość podczas akwizycji trwających dłużej niż 2 godziny (obejmujących 200 000 - 250 000 obrazów), Blokada ostrości uzyskuje się poprzez całkowite wewnętrzne odbicie lasera sprzężonego ze światłowodem w bliskiej podczerwieni&nbsp; z szkiełka nakrywkowego, a następnie czuła na wysokość detekcja na fotodiodzie kwadrantowej (QPD). Sygnał QPD zapewniał sterowanie mocowaniem piezoelektrycznym soczewki obiektywu w pętli zamkniętej. Aby uzyskać dostęp do tego mikroskopu, zapoznaj się z https://www.embl.org/about/info/imaging-centre lub skontaktuj się z ic-contact@embl.de</td></tr><tr><td>Jednomodowy silnik wielolaserowy sprzężony ze światłowodami</td><td>Toptica</td><td>iCHROME MLE-LFA-HP</td><td>Zapewnia szerokokątne oświetlenie epi 100 mW przy 405, 488, 561, 640 nm</td></tr><tr><td>Rozdzielanie dichroiczne</td><td>AHF Analysentechnik</td><td>F48-665SG</td><td>665 nm długie przejście</td></tr><tr><td>Kwadratowa szklanka osłonowa 22 x 22 mm nr 1</td><td>Menzel-Gl&auml; ser; VWR</td><td>630-2882</td><td></td></tr><tr><td>STAR 635P, NHS ester</td><td>Abberior</td><td>ST635P-0002-1MG</td><td>Rozpuszczony w DMSO do 1 mM roztworu, podany w porcji do objętości jednorazowego użytku, zamrożony i przechowywany w temperaturze -80 & stopni; C</td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy Stemi 305 Stand K LAB</td><td>Zeiss</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek tetraizolu</td><td>Sigma-Aldrich/Merck</td><td>T1512-2G</td> 1<td>% (w/v) roztwór został przygotowany w wodzie Milli-Q. Zamrożone porcje przechowywano w temperaturze -20 °C. Rozmrożone porcje przechowywano w temperaturze 4 ° ° C; C i używany przez kilka miesięcy.</td></tr><tr><td>TetraSpeck Microspheres</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>T7279</td><td>&nbsp; 0,1 &mikro; m, fluorescencyjny niebieski/zielony/pomarańczowy/ciemnoczerwony</td></tr><tr><td>Tris Saline Buffer (TBS 10x)</td><td></td><td>N/A</td><td>200 mM Tris-HCl, 1,5 M NaCl, pH 7,5</td></tr><tr><td>TWEEN 20</td><td>Sigma-Aldrich/Merck</td><td>P9416-50ML</td><td>Przechowywać w temperaturze pokojowej w oryginalnym opakowaniu.</td></tr><tr><td>Pickik do robaków</td><td>WormStuff Kisker</td><td>789277</td><td></td></tr><tr><td>stolik mikroskopowy XY</td><td>&nbsp; Smaract</td><td>N/A</td><td>Niestandardowa</td></tr><tr><td>konstrukcja Kolumna odsalająca Zeba Micro Spin</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>89877</td><td>&nbsp; 7K MWCO, 75 i mikro; L</td></tr></tbody></table>

mikroskopia superrozdzielcza kompleksu synaptonemalnego w obrębie linii zarodkowej caenorhabditis elegans

Super-Resolution Microscopy of the Synaptonemal Complex Within the Caenorhabditis elegans Germline

Podczas mejozy, chromosomy homologiczne muszą się rozpoznawać i przylegać do siebie, aby umożliwić ich prawidłową segregację. Jednym z kluczowych zdarzeń, które zabezpiecza interakcję chromosomów homologicznych, jest złożenie kompleksu synaptonemalnego (SC) w mejotycznej profazie I. Mimo że homologia sekwencji między składnikami białka w obrębie SC jest niewielka wśród różnych gatunków, ogólna struktura SC została wysoce zachowana podczas ewolucji. Na mikrofotografiach elektronowych SC pojawia się jako trójdzielna, przypominająca drabinę struktura złożona z bocznych elementów lub osi, poprzecznych włókien i elementu centralnego. 
Jednak precyzyjne określenie lokalizacji poszczególnych składników w kompleksie za pomocą mikroskopii elektronowej w celu określenia struktury molekularnej SC pozostaje wyzwaniem. Natomiast mikroskopia fluorescencyjna pozwala na identyfikację poszczególnych składników białkowych w obrębie kompleksu. Ponieważ jednak SC ma tylko ~100 nm szerokości, jego podstruktura nie może być rozdzielona za pomocą konwencjonalnej mikroskopii fluorescencyjnej z ograniczoną dyfrakcją. W związku z tym określenie architektury molekularnej SC wymaga technik mikroskopii świetlnej o wysokiej rozdzielczości, takich jak mikroskopia oświetlenia strukturalnego (SIM), mikroskopia wymuszonej emisji (STED) lub mikroskopia lokalizacji pojedynczych cząsteczek (SMLM). 
Aby utrzymać strukturę i interakcje poszczególnych komponentów w SC, ważne jest obserwowanie kompleksu w środowisku, które jest zbliżone do jego rodzimego środowiska w komórkach rozrodczych. W związku z tym demonstrujemy protokół immunohistochemiczny i obrazowania, który umożliwia badanie podstruktury SC w nienaruszonej, wytłaczanej tkance linii rozrodczej Caenorhabditis elegans za pomocą mikroskopii SMLM i STED. Bezpośrednie przymocowanie tkanki do szkiełka nakrywkowego zmniejsza ruch próbek podczas obrazowania i minimalizuje aberracje w próbce, aby osiągnąć wysoką rozdzielczość niezbędną do wizualizacji podbudowy SC w jej kontekście biologicznym.

Aby obrazować kompleks synaptonemalny (SC) w tkance linii zarodkowej C. elegans za pomocą SMLM, zastosowaliśmy dwukolorową ratiometryczną technikę 3D-SMLM w celu lokalizacji HTP-3, będącego komponentem osi chromosomowych, oraz końca C filamentu poprzecznego SYP-5 endogennie znakowanego tagiem hemaglutyniny (HA). Lokalizacja obu białek w obrębie SC C. elegans została wcześniej określona w innych badaniach16,30.
Aby zminimalizować rozpraszanie światła i aberracje optyczne nieodłącznie związane z grubymi próbkami biologicznymi, obrazowano najniższą sekcję z jąder meiotycznych zawierających kompleksy synaptonemalne SC (Rysunek 3, żółte linie). Dla każdego pozyskanego obrazu zaznaczono pozycję stołu piezoelektrycznego w płaszczyźnie obrazowania względem pozycji stołu piezoelektrycznego w momencie, gdy obiektyw był ustawiony w ostrości na szkiełko nakrywkowe. Pozwoliło to na obliczenie odległości piezoelektrycznej od szkiełka nakrywkowego. Prawidłowo zamontowane próbki są stabilnie przytwierdzone blisko szkiełka nakrywkowego i zachowują kształt gonady (tj. tkanka nie zostaje zmiażdżona między dwoma szkiełkami nakrywkowymi podczas etapu postfiksacji). Jakość montażu próbki można łatwo ocenić pod mikroskopem stereoskopowym, ponieważ dobrze przytwierdzone gonady nie wykazują żadnego ruchu w roztworze (krok 4.2.6). Niemniej jednak, ze względu na stochastyczny charakter procesu montażu, tkanka gonady niekoniecznie będzie rozłożona całkowicie płasko na szkiełku nakrywkowym. W związku z tym dolna płaszczyzna jąder zawierających SC może znajdować się w różnych odległościach od szkiełka nakrywkowego w obrębie tej samej gonady.
Aby zilustrować, jak rozdzielczość zmienia się w zależności od przylegania tkanki do szkiełka podstawowego, wykonano obrazy w różnych odległościach piezoelektrycznych od szkiełka. W celu oceny jakości pojedynczego obrazu obliczono krzywe korelacji pierścieniowej Fouriera (FRC)50,51, a rozdzielczość określono za pomocą wtyczki FRCResolution w oprogramowaniu SMAP48. Na Rysunku 4 przedstawiono dwa reprezentatywne jądra wyodrębnione z dwóch oddzielnych obrazów 3D-SMLM, wykonanych w różnych odległościach od szkiełka podstawowego. W komórkach SC znajdujących się blisko szkiełka podstawowego, osie chromosomów oraz koniec C-końcowy SYP-5::HA są dobrze rozdzielone we wszystkich trzech wymiarach (Rysunek 4A, 0,8 µm od szkiełka podstawowego). Aby rozdzielić dwie struktury oddzielone określoną odległością, uzyskana rozdzielczość FRC musi być zazwyczaj mniejsza niż połowa tej odległości w rozdzielczości osiowej.
Aby rozdzielić te same struktury w płaszczyźnie bocznej, konieczne jest osiągnięcie jeszcze niższych wartości rozdzielczości FRC. Rzeczywiście, w próbkach znajdujących się w bliskim sąsiedztwie szkiełka podstawowego rozdzielczość FRC wynosi 38 nm dla kanału AlexaFluor 647 oraz 34 nm dla kanału CF680, co znajduje się znacznie poniżej oczekiwanej odległości 84 nm między końcami C- SYP-516. Taka rozdzielczość pozwala zatem z łatwością rozdzielić organizację SC nie tylko w widoku czołowym, ale również bocznym (Rysunek 4B i,ii). Z kolei rozdzielczość pogarsza się w SC znajdujących się w odległości 5 µm od szkiełka podstawowego z powodu rozpraszania światła i aberracji sferycznych (Rysunek 4B). Rozdzielczości FRC w tej odległości spadają do 47 nm (AlexaFluor 647) i 41 nm (CF680), co uniemożliwia pełne rozdzielenie końców C- SYP-5. Ponieważ aberracje optyczne pogarszają rozdzielczość boczną silniej niż osiową, prążki HTP-3 i SYP-5 nie są już wyraźnie rozdzielone w przekroju widoku bocznego w próbkach znajdujących się w odległości 5 µm od szkiełka podstawowego (Rysunek 4B ii). Porównanie rozdzielczości FRC obrazów pozyskanych w różnych odległościach piezo od szkiełka podstawowego wykazało, że obrazowana tkanka nie powinna znajdować się dalej niż 2 µm od szkiełka (Rysunek 5). Wynik ten podkreśla znaczenie prawidłowego wykonania etapu postfiksacji, podczas którego tkanka musi zostać skutecznie sieciowana z powłoką z poli-L-lizyny na szkiełku podstawowym.
Aby zademonstrować rozdzielczość osiągalną za pomocą innej techniki nadrozdzielczej, obrazowano również SC w utrwalonej, nienaruszonej tkance linii zarodkowej przy użyciu mikroskopii TauSTED. Rysunek 6A przedstawia obrazy TauSTED o najwyższej i najniższej rozdzielczości osiągniętej w niniejszym badaniu, oszacowanej na podstawie profilów liniowych SC w widoku czołowym (Rysunek 6B). W obu jądrach udało się rozdzielić dwa pasma lokalizacji HTP-3 w osiach chromosomów oraz końce C-terminalne SYP-5 w regionie centralnym, co dowodzi, że rozdzielczość osiągalna w technice TauSTED przy zastosowaniu tego zoptymalizowanego protokołu wynosi poniżej 84 nm. W warunkach optymalnych (Rysunek 6A, góra) udało się rozdzielić końce C-terminalne w lekko nachylonych widokach SC, które były oddzielone od siebie zaledwie o 50 nm (Rysunek 6A, żółty prostokąt oraz 6C).
<img alt="Schemat struktury chromosomów homologicznych; widoki z przodu, z boku i w przekroju poprzecznym z filamentami poprzecznymi." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64363/64363fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Schemat organizacji kompleksu synaptonemalnego u Caenorhabditis elegans. Rysunek przedstawia uproszczoną strukturę SC u C. elegans łączącą dwa chromosomy homologiczne (szare). Struktura jest pokazana w widoku z przodu, z boku i w przekroju poprzecznym. Osie chromosomów przedstawiono jako czerwone paski, natomiast filamenty poprzeczne zaznaczono kolorem cyjanowym. Białka filamentów poprzecznych (SYP-1, 5, 6 u C. elegans) są zorientowane głową do głowy (cyjanowe grafiki kulkowo-pręcikowe) w regionie centralnym, aby pokonać odległość między dwiema osiami. Wskazano przewidywane odległości między osiami a końcami C filamentów poprzecznych. Skrót: SC = kompleks synaptonemalny. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64363/64363fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Układ do sekcji i obrazowania C. elegans; mikroskopia, przeciwciała, STED, SMLM i przygotowanie preparatu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64363/64363fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Ilustracja przygotowania próbki zastosowanego w badaniu. (A) Młode dorosłe osobniki C. elegans są sekcjonowane w obrębie głowy lub ogona (zielone, przerywane linie) i przetwarzane zgodnie z opisem w protokole. (B>) Poszczególne etapy metody są zaznaczone grafikami połączonymi szarymi strzałkami. Skróty: STED = mikroskopia z wygaszaniem emisji stymulowanej; SMLM = mikroskopia lokalizacji pojedynczych cząsteczek; PBS = roztwór soli fizjologicznej buforowanej fosforanowo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64363/64363fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wyrównanie chromosomów; obraz mikroskopii fluorescencyjnej; lokalizacja białek w procesie podziału komórki." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64363/64363fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Lokalizacja przekroju tkanki, który można obserwować za pomocą mikroskopii lokalizacji pojedynczych cząsteczek. MIP obrazu konfokalnego z dyskiem wirującym całej gonady C. elegans. Tkankę barwiono w kierunku HTP-3 oraz końca C-końcowego SYP-5 (SYP-5::HA), a połączony sygnał przedstawiono w kolorze szarym. Pojedyncze obrazy konfokalne zostały zszyte przy użyciu wtyczki Grid/Collection stitching w programie Fiji52 w celu utworzenia obrazu całej gonady. Wstawka przedstawia widok xy najniższej płaszczyzny z zawierającej SCs. Lokalizacja tej płaszczyzny jest pokazana w widokach ortogonalnych przekroju tkanki zaznaczonego prostokątem na obrazie MIP gonady (żółte linie). Paski skali = 10 µm. Skróty: MIP = maksymalna projekcja intensywności; SCs = kompleksy synaptonemalnego. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64363/64363fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Proces obrazowania mikroskopowego; schematy markerów białkowych; widoki frontalne i boczne; analiza naukowa." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64363/64363fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Mikroskopia lokalizacji pojedynczych cząsteczek HTP-3 oraz końców C-terminalnych SYP-5. (A,B) Lewo: Obrazy SMLM przedstawiające jądra w stadium pachytenu barwione na HTP-3 (czerwony) i koniec C-terminalny SYP-5 (SYP-5::HA, cyjan) (pasek skali = 1 µm). Środek: Powiększone obrazy obszarów zainteresowania wskazanych w punktach A i B z odpowiadającymi im przekrojami poprzecznymi wyświetlanymi pod każdym obrazem (i, ii; pasek skali = 100 nm). Odcinki SC na powiększonych obrazach zostały obrócone tak, aby osie chromosomów były równoległe do osi y. Prawo: Graficzne przedstawienie lokalizacji badanych białek w obrębie SC, obrazujące orientację SC w powiększonych regionach pokazanych w środkowej części ryciny. Skróty: SMLM = mikroskopia lokalizacji pojedynczych cząsteczek; SC = kompleks synaptonemalny. Surowe dane do rekonstrukcji obrazów SMLM są dostępne w bazie danych BioStudies60 (Accession ID: S-BIAD504). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64363/64363fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres FRC w funkcji częstotliwości przestrzennej, AlexaFluor647 i CF680, dane dotyczące odległości piezoelektrycznej, dopasowanie widmowe." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64363/64363fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Rozdzielczość określona metodą korelacji pierścieni Fouriera (FRC) dla obrazów z mikroskopii lokalizacji pojedynczych cząsteczek zależy od odległości obrazowanej płaszczyzny z od płaszczyzny szkiełka podstawowego. Kolorowe linie przedstawiają krzywe FRC dla obrazów pozyskanych w różnych odległościach od szkiełka podstawowego (zgodnie z paskiem kolorów). Próg 1/7 użyty do wyznaczenia rozdzielczości FRC jest zaznaczony czarną poziomą linią. Wstawki pokazują zależność rozdzielczości FRC od odległości piezoelektrycznej od szkiełka podstawowego. Wykresy zostały wykonane za pomocą autorskiego skryptu w języku R (wersja 4.1.2, Plik uzupełniający 1), w którym oryginalne krzywe zostały wygładzone za pomocą funkcji z pakietu „ggplot2”. Skróty: FRC = korelacja pierścieni Fouriera; SMLM = mikroskopia lokalizacji pojedynczych cząsteczek; SC = kompleks synaptonemalny. Dane dla krzywych FRC oraz dane SMLM są dostępne w bazie BioStudies60 (numer dostępu: S-BIAD504). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64363/64363fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej, analiza HTP-3 SYP-5:HA, wykresy rozkładu intensywności." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64363/64363fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina 6: Mikroskopia z ugaszaniem emisji stymulowanej wspomagana informacjami o czasie życia fluorescencji (TauSTED) rozróżnia dwa pasma lokalizacji dla HTP-3 oraz dla końców C-terminalnych SYP-5. (A) Dwa reprezentatywne obrazy TauSTED przedstawiają jądra w stadium pachytenu barwione na HTP-3 (czerwony) i końców C-terminalnych SYP-5 (SYP-5::HA, cyjan) z wyższą (góra) i niższą (dół) definicją strukturalną (pasek skali = 1 µm). Prostokąty wyznaczają obszary z rozdzielonymi końcami C-terminalnymi SYP-5 w widoku czołowym (biały) i lekko pochylonym (żółty) kompleksu synaptonemalnego (SC). (B,C) Rozkład sygnału HTP-3 (czerwony) i końców C-terminalnych SYP-5 (cyjan) rozdzielony metodą TauSTED. Profile liniowe obszarów zainteresowania zawierających SC w widokach czołowych (B) lub lekko pochylonych (C) przedstawiono jako linie ciągłe z intensywnością znormalizowaną do wartości maksymalnej. Profile liniowe zostały wygenerowane przy użyciu oprogramowania Fiji ImageJ. Linie przerywane w B przedstawiają uśrednione dane dla każdego białka. Gruba cyjanowa linia w C odpowiada profilowi liniowemu z najkrótszą rozdzieloną odległością między końcami C-terminalnymi SYP-5. Aby określić odległości między przeciwciałami celującymi w konkretne białka, profile liniowe (n = 9 (B), n = 7 (C)) dopasowano do funkcji podwójnego rozkładu Gaussa za pomocą skryptu R napisanego na potrzeby badania (wersja 4.1.2, Plik uzupełniający 1). Na górze każdego wykresu wskazano odpowiednio średnią odległość ± odchylenie standardowe (B) oraz zakres z wyróżnioną pogrubioną czcionką wartością minimalną (C). Skróty: STED = mikroskopia z ugaszaniem emisji stymulowanej; SC = kompleks synaptonemalny. Prezentowane obrazy i punkty danych z wykreślonych profili liniowych są dostępne w bazie danych BioStudies60 (Accession ID: S-BIAD504). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64363/64363fig06large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Tabela 1: Skład buforów i roztworów użytych w tym protokole. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64363/63463_Table%201%20(1).xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Wideo uzupełniające 1: Akwizycja obrazów w mikroskopii lokalizacji pojedynczych cząsteczek. Film przedstawiający mruganie fluoroforów z odpowiednią częstotliwością (pokazano 50 klatek, pasek skali = 5 µm, 20 ms/klatka). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64363/SupplementalVideo1.mov" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.</a>
Plik uzupełniający 1: Skrypt do analizy danych. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64363/SupplementalFile1.Rmd" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Mikroskopia superrozdzielcza może dostarczyć szczegółowych informacji na temat organizacji komponentów w kompleksie synaptonemalnym w mejozie. Tutaj demonstrujemy protokół rozwiązywania poszczególnych białek kompleksu synaptonemalnego Caenorhabditis elegans.

Mikroskopia superrozdzielcza kompleksu synaptonemalnego w obrębie linii zarodkowej Caenorhabditis elegans

During meiosis, homologous chromosomes must recognize and adhere to one another to allow for their correct segregation. One of the key events that secures ...

Kompleks synaptonemalny jest kluczowym składnikiem mejozy. Aby zbadać jego funkcję, musimy również zrozumieć jego strukturę, dla której mikroskopia superrozdzielcza okazała się niezwykle przydatna. Zoptymalizowaliśmy nasz protokół, aby stabilnie przyczepić immunobarwioną gonadę C.elegans do szkiełka nakrywkowego, co pomaga poprawić rozdzielczość do 30 nanometrów w nienaruszonych tkankach.Projektowanie eksperymentów z mikroskopią lokalizacji pojedynczych cząsteczek, późniejsza analiza, a także interpretacja danych mogą być dość trudne i najlepiej jest je ustalić wspólnie z ekspertem. Procedurę zademonstruje Ivana Cavka, doktor habilitowany w laboratorium. Akwizycja obrazów z mikroskopii lokalizacji pojedynczej cząsteczki zostanie również pokazana przez Rory'ego Powera, inżyniera optycznego z MBL Imaging Center.Zacznij od zebrania dopasowanych do wieku robaków Caenorhabditis elegans z płytek agarowych NGM. Przenieś robaki do 30-mikrolitrowej kropli EBTT na szkiełku nakrywkowym. Umyj robaki dodatkowymi 30 mikrolitrami EBTT.Usuń 30 mikrolitrów roztworu, pozostawiając 30 mikrolitrów kropli z robakami na szkiełku nakrywkowym. Użyj ostrza skalpela, aby odciąć głowy i/lub ogony robaków, aby wycisnąć gonadę. W udanej sekcji tkanka gonady zostanie w pełni wytłoczona na zewnątrz ciała robaka.Odpipetować 30 mikrolitrów roztworu utrwalającego do kropli wypreparowanych robaków. Wymieszać pipetując i pozostawić próbki do utrwalenia na jedną minutę. Zatrzymaj utrwalanie dokładnie po jednej minucie, przenosząc robaki za pomocą pipety o pojemności 20 mikrolitrów na probówkę do PCR wypełnioną TBST.Następnie wykonaj mycie, obracając wypreparowane próbki na mini wirówce stołowej. Po usunięciu supernatantu ponownie zawieś robaki w 200 mikrolitrach świeżego TBST. Po ostatnim umyciu ponownie zawieś robaki w 200 mikrolitrach PBST i umieść probówkę PCR na lodzie.Odwiruj wypreparowane próbki na mini wirówce stołowej i usuń supernatant. Dodać od 50 do 100 mikrolitrów zimnego metanolu, wymieszać pipetując i pozostawić próbki w metanolu na 30 do 60 sekund na lodzie. Przemyć próbki dwukrotnie 200 mikrolitrami PBST.Po odwirowaniu próbek i usunięciu supernatantu dodać do nich roztwór blokujący i przechowywać go w temperaturze pokojowej przez 45 do 60 minut. Rozcieńczyć pierwszorzędowe przeciwciała przeciwko roztworom roboczym w buforze blokującym. Odwiruj próbki na mini wirówce stołowej, usuwając roztwór blokujący, i dodaj od 30 do 50 mikrolitrów roztworu przeciwciała pierwotnego.Inkubować przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Pod koniec inkubacji przemyć próbki trzykrotnie w PBST. Rozcieńczyć oznaczone dwa fragmenty Fab prime do roztworów roboczych w buforze blokującym.Po trzecim płukaniu odwirować próbki, usunąć supernatant i dodać od 30 do 50 mikrolitrów roztworu przeciwciał wtórnych. Umieścić próbkę w ciemnej komorze i inkubować przez 30 minut do dwóch godzin w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie przemyć próbki trzykrotnie PBST przez pięć do 15 minut.Odwirować poplamione próbki i usunąć supernatant. Dodać 50 mikrolitrów PBST i przenieść poplamione robaki na szkiełko nakrywkowe. Odpipetować od 5,7 do 6,3 mikrolitrów roztworu po utrwaleniu na szkiełko nakrywkowe z poli-l-licyny.Odpipetować wypreparowane robaki w tej samej objętości i przenieść do kropli utrwalacza na szkiełku nakrywkowym z poli-l-lizyny. Przykryj próbkę małym szkiełkiem nakrywkowym. Usuń nadmiar płynu za pomocą małego kawałka bibuły filtracyjnej i utrwal próbkę na trzy do pięciu minut w ciemnej komorze.Zamrozić próbki, umieszczając je na aluminiowym bloku w suchym lodzie. Po co najmniej 20 minutach usuń mniejsze szkiełko nakrywkowe za pomocą maszynki do golenia. Zanurz szkiełko nakrywkowe w 50-mililitrowej stożkowej probówce zawierającej lodowaty PBS lub metanol schłodzony w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez około 10 sekund.Umieścić szkiełko nakrywkowe w studzience na sześciodołkowej płytce wypełnionej buforem PBST. Usunąć PBST z dołka, dodać świeży PBST i pozostawić próbkę na pięć minut. Po ponownym umyciu PBST należy pozostawić próbki w temperaturze czterech stopni Celsjusza do czasu wykonania obrazowania.Przed obrazowaniem oceń jakość mocowania próbki pod mikroskopem stereoskopowym. Jeśli używasz pokazanego tutaj niestandardowego uchwytu na próbkę, owiń pierścień magnetyczny parafilmem, a następnie przygotuj jeden mililitr bufora do obrazowania. Weź szkiełko nakrywkowe z płytki sześciodołkowej.Umieść go w specjalnie wykonanym uchwycie i przymocuj szkiełko nakrywkowe w uchwycie za pomocą pierścienia magnetycznego owiniętego folią parafoliową. Delikatnie odpipetować bufor obrazowania w komorze utworzonej przez pierścień magnetyczny na górze próbki i uszczelnić komorę za pomocą parafilmu. Aby zamontować próbkę, dodaj jedną kroplę olejku immersyjnego do obiektywu z czystym olejem.Nie wprowadzając powietrza do olejku immersyjnego, delikatnie umieść uchwyt na próbkę z zamontowaną próbką na stoliku mikroskopu. Korzystając z okna wtyczki EMU w MicroManager 2, przesuwaj stolik piezoelektryczny, aż sygnał z lasera blokady ostrości zostanie wykryty na fotodiodzie kwadrantowej. Uzyskaj obraz tylnej płaszczyzny ogniskowej przy niższej mocy za pomocą lasera o wzbudzeniu 640 nanometrów, aby potwierdzić brak pęcherzyków powietrza w olejku immersyjnym.Zlokalizuj tkankę gonady za pomocą oświetlenia jasnego pola. Używając oświetlenia o niskiej intensywności przy 640 nanometrach, skup się na sekcji tkanki zawierającej wiele kompleksów synaptonemalnych. Kontynuuj naświetlanie próbki przy wysokim natężeniu promieniowania z oświetleniem o długości 640 nanometrów przez około 30 sekund, aż do uzyskania odpowiedniej częstotliwości mrugania.Uchwyć 200 000 klatek z czasem naświetlania 20 milisekund za pomocą narzędzia do akwizycji wielowymiarowej w MicroManager 2. W międzyczasie skonfiguruj aktywację UV za pomocą opcji aktywacji wtyczki EMU, aby utrzymać żądaną częstotliwość. Najniższą płaszczyznę jąder mejotycznych zawierających kompleksy synaptonemalne uwidoczniono w gonadzie Caenorhabditis elegans przy użyciu barwienia HTP-3 i SYP-5.Osie chromosomów w C-końcu SYP-5 HA były dobrze rozdzielone we wszystkich trzech wymiarach w kompleksach synaptonemalnych zlokalizowanych w pobliżu szkiełka nakrywkowego. Jednak rozdzielczość pogarsza się w kompleksach synaptonemalnych znajdujących się w odległości pięciu mikrometrów od szkiełka nakrywkowego z powodu rozpraszania światła i aberracji sferycznych. Obrazy uzyskane w różnych piezoelektrycznych odległościach od szkiełka nakrywkowego ujawniły, że obrazowana tkanka nie powinna znajdować się dalej niż dwa mikrometry od szkiełka nakrywkowego.Protokół przygotowania próbki może być również stosowany w mikroskopii TauTED. Dzięki zoptymalizowanemu przygotowaniu próbki, HTP-3 w osiach chromosomów i C-końce SYP-5 w regionie centralnym zostały rozwiązane w widoku frontalnym i lekko pochylonym. Aby uzyskać najlepszą rozdzielczość, gonady muszą być ściśle połączone ze szkiełkiem nakrywkowym, aby zapewnić, że kompleksy synaptonemalne nie znajdują się dalej niż dwa mikrometry od szkiełka nakrywkowego.Używamy tego protokołu nie tylko do mikroskopii lokalizacji pojedynczych cząsteczek, ale także do mikroskopii wymuszonej deprymcji emisji. Może być również przydatny w innych technikach mikroskopii superrozdzielczej.

super-resolution-microscopy-synaptonemal-complex-within

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Niniejszy artykuł opisuje technikę wizualizacji wczesnych etapów embriogenezy u nicienia Caenorhabditis elegans.

Mikroskopia poklatkowa wczesnego embrionogenezy u Caenorhabditis elegans

Ten protokół opisuje, jak obrazować dzielące się komórki w tkance w zarodkach Caenorhabditis elegans. Podczas gdy kilka protokołów opisuje, jak obrazować podział komórek we wczesnym zarodku, ten protokół opisuje, jak obrazować podział komórek w rozwijającej się tkance podczas środkowej późnej embriogenezy.

Wizualizacja cytokinezy neuroblastów podczas embriogenezy C. elegans

Obrazowanie zachowania i aktywności neuronalnej w długich skalach czasowych bez unieruchomienia zwierzęcia jest warunkiem wstępnym do zrozumienia zachowania. Obrazowanie komór mikroprzepływowych z agarozą (AMI) może być wykorzystywane do obrazowania aktywności i zachowania neuronów na wszystkich etapach życia Caenorhabditis elegans.

Mikrokomory agarozowe do długoterminowego obrazowania wapnia Caenorhabditis elegans

Prezentujemy zautomatyzowaną metodę trójwymiarowej rekonstrukcji linii zarodkowej Caenorhabditis elegans. Nasza metoda określa liczbę i położenie każdego jądra w linii zarodkowej oraz analizuje rozmieszczenie białek linii zarodkowej i strukturę cytoszkieletu.

Analiza obliczeniowa linii zarodkowej Caenorhabditis elegans w celu zbadania rozmieszczenia jąder, białek i cytoszkieletu

Tutaj prezentujemy podejście kombinatoryczne wykorzystujące mikroskopię o wysokiej rozdzielczości, narzędzia obliczeniowe i znakowanie pojedynczych komórek w żywych zarodkach C. elegans, aby zrozumieć dynamikę pojedynczej komórki podczas rozwoju neurologicznego.

Izotropowa mikroskopia świetlna i zautomatyzowane analizy linii komórkowych w celu skatalogowania embriogenezy Caenorhabditis elegans z rozdzielczością subkomórkową

To badanie przedstawia ilościowe pomiary wielkości i lokalizacji synaptycznej, morfologii mięśni i kształtu mitochondriów u C. elegans przy użyciu swobodnie dostępnych narzędzi do przetwarzania obrazów. Takie podejście pozwala przyszłym badaniom nad C. elegans na ilościowe porównanie zakresu zmian strukturalnych tkanek i organelli w wyniku mutacji genetycznych.

Ilościowe podejścia do badania struktur komórkowych i morfologii organelli u Caenorhabditis elegans

Ta praca opisuje protokół o średniej przepustowości, który umożliwia jednoczesne obrazowanie 3D poklatkowe embriogenezy u zarodków 80-100 C. elegans w ciągu jednej nocy. Dodatkowo dołączone są narzędzia do przetwarzania i wizualizacji obrazu, które usprawniają analizę danych. Połączenie tych metod z niestandardowymi szczepami reporterowymi umożliwia szczegółowe monitorowanie embriogenezy.

Metoda obrazowania półwysokoprzepustowego i zestaw narzędzi do wizualizacji danych do analizy rozwoju embrionalnego C. elegans

Tutaj prezentujemy protokół przygotowania i montażu zarodków Caenorhabditis elegans, rejestrowania rozwoju pod mikroskopem 4D i śledzenia linii komórkowej.

Mikroskopia 4D: odkrywanie rozwoju embrionalnego Caenorhabditis elegans za pomocą mikroskopii Nomarskiego

To jest powszechnie stosowana metoda do sekcji gonad C. elegans, po której następuje pęknięcie zamrażające, która wytwarza próbki linii zarodkowej do immunofluorescencji poprzez barwienie przeciwciał, lub do prostego barwienia DAPI w celu wizualizacji DNA. Protokół ten okazał się skuteczny w przypadku studentów studiów licencjackich w laboratorium badawczym i w ramach badań licencjackich opartych na kursach.

C. elegans (C. elegans) Rozwarstwienie gonad i pęknięcie zamrażające do barwienia immunofluorescencyjnego i DAPI

Tutaj przedstawiono protokół implementacji mikroskopii ekspansywnej we wczesnych zarodkach Drosophila w celu uzyskania obrazowania w superrozdzielczości przy użyciu konwencjonalnego laserowo-skaningowego mikroskopu konfokalnego.

Wykorzystanie mikroskopii ekspansywnej do fizycznego powiększenia całych zarodków Drosophila w celu obrazowania w superrozdzielczości

Ten protokół opisuje obrazowanie poklatkowe C. elegans oparte na mikroprzepływach w całym rozwoju postembrionalnym.

Obrazowanie C. elegans w wysokiej rozdzielczości we wszystkich stadiach larwalnych

Poznaj mikroskopię superrozdzielczą kompleksu synaptonemalnego w linii zarodkowej Caenorhabditis elegans. Ta metoda umożliwia wizualizację białek z rozdzielczością 30 nanometrów w nienaruszonych tkankach.

Mikroskopia superrozdzielcza kompleksu synaptonemalnego w obrębie linii zarodkowej Caenorhabditis elegans

Przeglądaj więcej filmów