Name: Izotropowa mikroskopia świetlna i zautomatyzowane analizy linii komórkowych w celu skatalogowania embriogenezy Caenorhabditis elegans z rozdzielczością subkomórkową (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 16 s
Description: Poznaj metodę diSPIM do śledzenia linii komórkowych i analizy morfologii neuronów w żywych embrionach Caenorhabditis elegans. Protokół umożliwia obrazowanie subkomórkowe bez fototoksyczności.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Johnowi Murrayowi za zintegrowany szczep, ujIs113, do wygenerowania szczepu liniowego BV514; Brandon Harvey (NIBIB) za pomoc w testowaniu protokołu; Jonowi Danielsowi i Gary'emu Rondeau (Applied Scientific Instrumentation) za pomoc w tworzeniu Micro-Manager i instrumentu diSPIM; oraz Andrew Yorkowi i Hankowi Edenowi za ich krytyczne opinie na temat systemu diSPIM. Dziękujemy również Centrum Badawczemu dla Instytucji Mniejszościowych oraz Instituto de Neurobiología Jose del Castillo (Universidad de Puerto Rico) za udostępnienie platformy spotkań i burzy mózgów. Wiele z tych prac zostało przeprowadzonych w Morskim Laboratorium Biologicznym w Woods Hole w ramach programu Whitmana. Praca ta była wspierana przez Intramural Research Programs Narodowego Instytutu Obrazowania Biomedycznego i Bioinżynierii NIH oraz przez grant NIH nr U01-HD075602 i nr R24-OD016474. Mark W. Moyle był wspierany przez F32-NS098616, a Leighton H. Duncan był wspierany przez Dodatek do R24-OD016474.

<ol><li>Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+embryonic+cell+lineage+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Developmental Biology. 100 (1), 64-119 (1983).</li>
<li>Bao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+cell+lineage+tracing+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Automated cell lineage tracing in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (8), 2707-2712 (2006).</li>
<li>Santella, A., Du, Z., Bao, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+semi-local+neighborhood-based+framework+for+probabilistic+cell+lineage+tracing%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">A semi-local neighborhood-based framework for probabilistic cell lineage tracing.</a> BMC Bioinformatics. 15, 217(2014).</li>
<li>Santella, A., Du, Z., Nowotschin, S., Hadjantonakis, A. K., Bao, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hybrid+blob-slice+model+for+accurate+and+efficient+detection+of+fluorescence+labeled+nuclei+in+3D%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">A hybrid blob-slice model for accurate and efficient detection of fluorescence labeled nuclei in 3D.</a> BMC Bioinformatics. 11, 580(2010).</li>
<li>Boyle, T. J., Bao, Z., Murray, J. I., Araya, C. L., Waterston, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AceTree%3A+a+tool+for+visual+analysis+of+Caenorhabditis+elegans+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">AceTree: a tool for visual analysis of Caenorhabditis elegans embryogenesis.</a> BMC Bioinformatics. 7, 275(2006).</li>
<li>Katzman, B., Tang, D., Santella, A., Bao, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AceTree%3A+a+major+update+and+case+study+in+the+long+term+maintenance+of+open-source+scientific+software%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">AceTree: a major update and case study in the long term maintenance of open-source scientific software.</a> BMC Bioinformatics. 19 (1), 121(2018).</li>
<li>Murray, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+analysis+of+embryonic+gene+expression+with+cellular+resolution+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Automated analysis of embryonic gene expression with cellular resolution in C. elegans.</a> Nature Methods. 5 (8), 703-709 (2008).</li>
<li>Murray, J. I., Bao, Z., Boyle, T. J., Waterston, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lineaging+of+fluorescently-labeled+Caenorhabditis+elegans+embryos+with+StarryNite+and+AceTree%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">The lineaging of fluorescently-labeled Caenorhabditis elegans embryos with StarryNite and AceTree.</a> Nature Protocols. 1 (3), 1468-1476 (2006).</li>
<li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+isotropic+four-dimensional+imaging+with+dual-view+plane+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Spatially isotropic four-dimensional imaging with dual-view plane illumination microscopy.</a> Nature Biotechnology. 31 (11), 1032-1038 (2013).</li>
<li>Kumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+Stage-+and+Slit-Scanning+to+Improve+Contrast+and+Optical+Sectioning+in+Dual-View+Inverted+Light+Sheet+Microscopy+%28diSPIM%29%5BTitle%5D)+AND+%22The+Biological+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Using Stage- and Slit-Scanning to Improve Contrast and Optical Sectioning in Dual-View Inverted Light Sheet Microscopy (diSPIM).</a> The Biological Bulletin. 231 (1), 26-39 (2016).</li>
<li>Kumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-view+plane+illumination+microscopy+for+rapid+and+spatially+isotropic+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Dual-view plane illumination microscopy for rapid and spatially isotropic imaging.</a> Nature Protocols. 9 (11), 2555-2573 (2014).</li>
<li>Wu, Y., Christensen, R., Colon-Ramos, D., Shroff, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+optical+imaging+techniques+for+neurodevelopment%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Advanced optical imaging techniques for neurodevelopment.</a> Current Opinion in Neurobiology. 23 (6), 1090-1097 (2013).</li>
<li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inverted+selective+plane+illumination+microscopy+%28iSPIM%29+enables+coupled+cell+identity+lineaging+and+neurodevelopmental+imaging+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Inverted selective plane illumination microscopy (iSPIM) enables coupled cell identity lineaging and neurodevelopmental imaging in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (43), 17708-17713 (2011).</li>
<li>Huisken, J., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+plane+illumination+microscopy+techniques+in+developmental+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Selective plane illumination microscopy techniques in developmental biology.</a> Development. 136 (12), 1963-1975 (2009).</li>
<li>Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-sheet+fluorescence+microscopy+for+quantitative+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Light-sheet fluorescence microscopy for quantitative biology.</a> Nature Methods. 12 (1), 23-26 (2015).</li>
<li>Winter, P. W., Shroff, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Faster+fluorescence+microscopy%3A+advances+in+high+speed+biological+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Faster fluorescence microscopy: advances in high speed biological imaging.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 20, 46-53 (2014).</li>
<li>Lucy, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+iterative+technique+for+the+rectification+of+observed+distributions%5BTitle%5D)+AND+%22Astronomical+Journal%22%5BJournal%5D)">An iterative technique for the rectification of observed distributions.</a> Astronomical Journal. 76 (6), 745-754 (1974).</li>
<li>Richardson, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bayesian-Based+Iterative+Method+of+Image+Restoration%5BTitle%5D)+AND+%22JOSA%22%5BJournal%5D)">Bayesian-Based Iterative Method of Image Restoration.</a> JOSA. 62 (1), 55-59 (1972).</li>
<li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , 1-11 (2006).</li>
<li>Hart, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavior%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Behavior.</a> WormBook. , (2006).</li>
<li>Edelstein, A., Amodaj, N., Hoover, K., Vale, R., Stuurman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer+control+of+microscopes+using+microManager%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Computer control of microscopes using microManager.</a> Current Protocols in Molecular Biology. Chapter 14, Unit14 20 (2010).</li>
<li>Gualda, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SPIM-fluid%3A+open+source+light-sheet+based+platform+for+high-throughput+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">SPIM-fluid: open source light-sheet based platform for high-throughput imaging.</a> Biomedical Optics Express. 6 (11), 4447-4456 (2015).</li>
<li>Ardiel, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+Calcium+Flux+in+Freely+Moving+Nematode+Embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Visualizing Calcium Flux in Freely Moving Nematode Embryos.</a> Biophysical Journal. 112 (9), 1975-1983 (2017).</li>
<li>Walton, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Bicoid+class+homeodomain+factors+ceh-36%2FOTX+and+unc-30%2FPITX+cooperate+in+C.+elegans+embryonic+progenitor+cells+to+regulate+robust+development%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">The Bicoid class homeodomain factors ceh-36/OTX and unc-30/PITX cooperate in C. elegans embryonic progenitor cells to regulate robust development.</a> PLoS Genetics. 11 (3), e1005003(2015).</li>
<li>Altun, Z. F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAltun%2C+ZF+%22WormAtlas%22">WormAtlas</a>. , (2002).</li>
<li>Wood, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryology%3A+In+the+nematode+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Laboratory+Press%22%5BJournal%5D)">Embryology: In the nematode C. elegans.</a> Cold Spring Harbor Laboratory Press. Chapter 8, 215-241 (1988).</li>
<li>White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+the+nervous+system+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+B%3A+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 314 (1165), (1986).</li>
<li>Bao, Z., Murray, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mounting+Caenorhabditis+elegans+embryos+for+live+imaging+of+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Mounting Caenorhabditis elegans embryos for live imaging of embryogenesis.</a> Cold Spring Harb Protoc. (9), (2011).</li>
<li>Christensen, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Untwisting+the+Caenorhabditis+elegans+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Untwisting the Caenorhabditis elegans embryo.</a> eLife. 4, (2015).</li>
<li>Santella, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WormGUIDES%3A+an+interactive+single+cell+developmental+atlas+and+tool+for+collaborative+multidimensional+data+exploration%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">WormGUIDES: an interactive single cell developmental atlas and tool for collaborative multidimensional data exploration.</a> BMC Bioinformatics. 16, 189(2015).</li>
<li>Dupuy, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+first+version+of+the+Caenorhabditis+elegans+Promoterome%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">A first version of the Caenorhabditis elegans Promoterome.</a> Genome Research. 14 (10B), 2169-2175 (2004).</li>
<li>Reece-Hoyes, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insight+into+transcription+factor+gene+duplication+from+Caenorhabditis+elegans+Promoterome-driven+expression+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Insight into transcription factor gene duplication from Caenorhabditis elegans Promoterome-driven expression patterns.</a> BMC Genomics. 8 (27), (2007).</li>
<li>WormBase. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.wormbase.org">https://www.wormbase.org</a> (2019).</li>
<li>Lee, R. Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WormBase+2017%3A+molting+into+a+new+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">WormBase 2017: molting into a new stage.</a> Nucleic Acids Research. 46 (D1), D869-D874 (2018).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

C. elegans wyróżnia się jako jedyny organizm, którego końcowe pozycje i połączenia każdego dorosłego neuronu są znane27. Jednak dynamika rozwojowa prowadząca do organizacji obwodów roboczych i sieci tworzących konektom C. elegans pozostaje nieznana. Opierając się na możliwościach wynikających z postępów w mikroskopii świetlnej, możemy teraz uchwycić i przeanalizować pozycje komórek, morfogenezę i neurogenezę w całym rozwoju embrionalnym C. elegans .
Procedura, którą opisaliśmy i którą rutynowo stosujemy w laboratorium, daje izotropowe obrazy 4D znakowanych neuronów i jąder do linii komórkowej w zarodkach C. elegans . Co ważniejsze, zoptymalizowaliśmy warunki obrazowania długoterminowego za pomocą diSPIM i połączyliśmy możliwości półautomatycznego lineingu z obrazami o wysokiej rozdzielczości, aby poprawić szybkość i precyzję analizy embriogenezy C. elegans . Ten zintegrowany protokół umożliwi użytkownikom wizualizację i identyfikację komórek oraz ilościowe określenie trójwymiarowych cech, takich jak migracja neurytów i fascykulacja aksonów, poprzez początek wczesnych drgawek. Procedura ta może być łatwo zaadaptowana do każdego obiektu z systemem ASI diSPIM i zalecamy ten system specjalnie dla tego protokołu. Inne preparaty SPIM oferowane na rynku mogą różnić się od konfiguracji ASI w komorze próbki i właściwościach optycznych. Jednak dane wyeksportowane z innych platform mogą być również przesyłane przez nasz potok danych. W związku z tym możliwa jest ocena ich wartości w lineagingu, wymagającym teście jakości obrazu i stabilności instrumentu. Mimo że aktywnie wykorzystujemy diSPIM do regularnego obrazowania innych okazów (takich jak zarodki drosophila i danio pręgowanego), opisana i kompleksowa analiza pochodzenia zarodków jest obecnie nadal ograniczona do gatunków nicieni. W przypadku większych lub grubych próbek decydujemy się na zastosowanie metod skanowania etapowego, które skanują próbki przez nieruchomy arkusz świetlny. Kumar i in. wcześniej zademonstrowali to ulepszone cięcie diSPIM, aby uzyskać wysokiej jakości obrazy z grubych próbek bez dodatkowych modyfikacji diSPIM10.
Krytyczne kroki w ramach protokołu obejmują montaż zarodków C. elegans na szkiełku nakrywkowym pokrytym poli-L-lizyną, pozyskiwanie danych i przetwarzanie danych. Zbieranie i montowanie zarodków C. elegans na szklanym szkiełku nakrywkowym może być wyzwaniem dla niedoświadczonych użytkowników, ale tutaj przedstawiamy szczegółowy protokół kluczowych kroków ułatwiających naukę. Jeśli pożądane jest długoterminowe obrazowanie, najlepsze wyniki uzyskujemy pobierając czterokomórkowe lub wcześniejsze zarodki od 8-10 młodych dorosłych28. Należy pamiętać, że starsi dorośli są mniej pożądani do zbierania zarodków we wczesnym stadium, ponieważ mają tendencję do zawierania starszych zarodków w macicy i niezapłodnionych jaj. Jeśli chodzi o montowanie zarodków, problemy, takie jak zablokowanie zmontowanego aspiratora (pipety doustnej) lub zbyt duży otwór w pipecie mikrokapilarnej, mogą uniemożliwić prawidłowe zamontowanie i orientację zarodków. Aby przygotować się do optymalnego obrazowania, przeprowadzamy testy przed akwizycją na wczesnych i późnych zarodkach przed skurczem, aby sprawdzić działanie arkuszy świetlnych, kamer, obiektywów i autofokusa. Najlepsze wyniki uzyskujemy, gdy wszystkie te operacje są testowane i uzyskujemy wysokiej jakości obrazy podczas naszych testów przed akwizycją. Jest to szczególnie istotne w przypadku generowania obrazów o izotropowej rozdzielczości przestrzennej, dla których surowe obrazy uzyskane z obu widoków (obiektywów) muszą być wysokiej jakości. Po akwizycji woluminy uzyskane dla każdego widoku są przetwarzane w celu uzyskania obrazów izotropowych. Ważne jest, aby użyć odpowiedniej karty procesora graficznego (GPU) zgodnie z opisem w tym protokole (patrz poniżej). Poprawia to szybkość przetwarzania, z jaką generowane są izotropowo połączone obrazy, skracając czas analizy danych. Konieczne jest również, aby użytkownicy korzystali z najnowszej wersji CytoSHOW i korzystali z parametrów dostarczonych z naszym pakietem do pobrania do automatycznego liniowania StarryNite. Jeśli użytkownicy są zainteresowani zastosowaniem automatycznego lineingu, dla innych próbek (np. danio pręgowanego, drosophila itp.), wymagana będzie dodatkowa optymalizacja parametrów używanych w StarryNite (patrz referencje 3,4).
Chociaż nasz zintegrowany protokół dostarcza obrazów i wyników lineingu w zarodku przed drganiem, użytkownicy powinni mieć świadomość, że automatyczne lineowanie w zarodku po skurczu jest obecnie niewykonalne: pozycje jądra zmieniają się w ciągu kilku sekund w zarodku po skurczu, zbyt szybko, aby umożliwić śledzenie linii. Jednak diSPIM rzeczywiście wykazał obiecującą zdolność do wychwytywania zdarzeń neurorozwojowych i śledzenia niektórych pozycji komórek w postdrgawkowych etapach embriogenezy 23,29. Jeśli użytkownicy są zainteresowani badaniem zarodka po drganiu, diSPIM zapewnia szybkość uzyskiwania wolumetrycznych migawek i śledzenia drobnych zdarzeń neurorozwojowych, takich jak wzrost neurytów, w szybko poruszających się zarodkach.
Protokół ten będzie miał fundamentalne znaczenie dla ukończenia atlasu30 WormGUIDES komórka po komórce, ponieważ zapewni zintegrowane podejście z obrazami izotropowymi o wysokiej rozdzielczości do identyfikacji i uchwycenia morfologii 3D znakowanych neuronów w ciągu pierwszych 430 minut embriogenezy. W chwili obecnej prototypowy atlas WormGUIDES dostarcza informacji o położeniu jądrowym komórek w rozwijającym się zarodku i ma na celu uchwycenie dynamiki rozwoju podzbioru neuronów embrionalnych. Protokół ten będzie kluczem do integracji dodatkowych rozwijających się neuronów z atlasem30 WormGUIDES.
Nasz zintegrowany protokół uprości również badanie nowych profili ekspresji genów w zarodku C. elegans. U transgenicznych C. elegans wiele specyficznych dla komórek promotorów przestrzennie i czasowo kontroluje ekspresję transgenu. Podczas gdy wzorce ekspresji większości genów zostały szeroko scharakteryzowane u dorosłego zwierzęcia 31,32,33,34, prawie wszystkie nie zostały jeszcze scharakteryzowane w rozwijającym się (zwłaszcza w późnym stadium) zarodku. Promotor C. elegans był użytecznym zasobem dla społeczności robaków do stymulowania ekspresji transgenu specyficznego dla komórki, a także określania, czy funkcja genu jest autonomiczna dla komórki, czy nieautonomiczna. Uchwycenie izotropowych i dynamicznych wzorców ekspresji genów o wysokiej rozdzielczości oraz precyzyjna identyfikacja komórek wykazujących ekspresję poprzez linię będzie cenne dla wielu członków społeczności naukowej.
Embriogeneza obejmuje dwa powiązane ze sobą główne procesy: różnicowanie komórkowe i morfogenezę tkanek. Wiadomo bardzo dużo o mechanizmach i cząsteczkach, które definiują różne typy komórek podczas rozwoju C. elegans. Jednak niewiele wiadomo na temat mechanizmów ważnych dla migracji komórek, adhezji komórek i kształtu komórek w zarodku C. elegans . Mając znaną niezmienniczą linię komórkową C. elegans , nasz protokół pozwala nam łatwo dostrzec skatalogowaną mikroanatomię 3D zarodka podczas morfogenezy na nowych poziomach szczegółowości: np. fascykulacji aksonów, synaptogenezy i aktywności neuronalnej. Ardiel i wsp. wcześniej wykazali moc diSPIM do wychwytywania stanów przejściowych wapnia na poziomie pojedynczego neuronu w zarodkach C. elegans 23. Wiele innych aspektów fizjologii rozwoju dojrzało do zbadania za pomocą tych metod.
Wreszcie, protokół ten jest w dużej mierze zautomatyzowany i systematycznie skraca czas potrzebny na wygenerowanie obrazów dekonwolucji i przeprowadzenie lineingu komórek za pomocą StarryNite i Acetree. Strategie programowe użyte w tym protokole mogą być zastosowane do wielu zagadnień biologicznych odległych od bardzo konkretnych dziedzin, w których je tutaj pokazaliśmy.
Szczegółowe informacje na temat kompatybilności oprogramowania i dostępu do pobierania
Informacje na temat Micro-Manager i wtyczek do obrazowania diSPIM są dostępne na http://dispim.org/software/micro-manager i https://micro-manager.org/wiki/ASIdiSPIM_Plugin.
Potok przetwarzania danych wymaga obecnie systemu operacyjnego Windows. Dołączyliśmy pojedynczy plik archiwum, aby uprościć instalację wszystkich wymaganych programów do przetwarzania danych i plików pomocniczych. Jest on dostępny do pobrania pod adresem http://dispimlineage.wormguides.org.
CytoSHOW (http://run.cytoshow.org/) jest oparty na szeroko stosowanej platformie analizy obrazu o otwartym kodzie źródłowym, ImageJ (v1). Aby korzystać z CytoSHOW, na komputerze musi być zainstalowana i aktualna wersja oprogramowania Java, a aktualizacje programu CytoSHOW są wdrażane automatycznie za pośrednictwem programu Java Web Start. Wiele funkcji CytoSHOW opartych na ImageJ jest opisanych i zilustrowanych na https://imagej.nih.gov/ij/docs/examples/index.html. CytoSHOW został dostosowany do wyświetlania wielowymiarowych surowych danych z ASI diSPIM, a także innego oprogramowania do obrazowania, które tworzy dane wyjściowe TIFF. Zasadniczo, inne systemy obrazowania SPIM z wieloma widokami mogą być wspierane przez niewielkie modyfikacje CytoSHOW, aby umożliwić przeprowadzenie tego protokołu na różnych systemach mikroskopowych.

SpimFusion został napisany w CUDA/C++ przy użyciu Visual Studio 2013 z zestawem narzędzi CUDA w wersji 7.5. Uruchomienie SpimFusion wymaga określonego sprzętu komputerowego: karty procesora graficznego (GPU) NVIDIA z możliwościami obliczeniowymi CUDA 1.0 lub nowszymi oraz co najmniej 2 GB pamięci karty graficznej. W momencie publikacji naszego protokołu, SpimFusion jest niepublikowany (Min Guo i Hari Shroff), ale dostępny w archiwum pakietów oprogramowania, o którym mowa powyżej.

Specjalnie zbudowana wersja StarryNite oparta na wierszu poleceń wymaga zainstalowania swobodnie dostępnego środowiska uruchomieniowego kompilatora MATLAB, ale nie wymaga licencji na komercyjne oprogramowanie MATLAB. Środowisko uruchomieniowe kompilatora MATLAB jest zawarte we wspomnianym powyżej archiwum pakietów oprogramowania. Kod StarryNite używany w tym protokole jest zasadniczo niezmieniony w stosunku do kodu używanego dla obrazów konfokalnych6. Jednak kilka kwestii operacyjnych związanych z tworzeniem obrazów wejściowych do przetwarzania StarryNite i obsługą wyników StarryNite zostało tutaj rozwiązanych za pomocą metod w CytoSHOW, które umożliwiają ciągły potok przetwarzania danych dla skondensowanych izotropowych woluminów diSPIM. Zmiany te są zautomatyzowane przez kod CytoSHOW, który obsługuje te kroki przetwarzania wstępnego i końcowego. CytoSHOW edytuje również wstępnie zoptymalizowany zestaw parametrów StarryNite specyficzny dla diSPIM, aby automatycznie dostroić algorytm segmentacji do intensywności fluorescencji jąder w obrazowanych danych. Unikalne parametry używane przez StarryNite w każdym zestawie danych diSPIM są następnie zapisywane w pliku wraz z obrazem wyjściowym i danymi pochodzenia.
Niestandardowa wersja AceTree, która działa z obrazami 16-bitowymi i zachowuje kompatybilność z renderowaniem Java3D, najlepiej nadaje się do tego protokołu. Jest również zawarty we wspomnianym powyżej archiwum pakietów oprogramowania.

C. elegans wyróżnia się jako jedyny organizm, w którym każda komórka w zarodku może być obserwowana przez cały okres rozwoju neurologicznego. Mając całą linię komórkową znaną i niezmienniczą1 oraz wraz z rozwojem nowych narzędzi, które umożliwiają znakowanie i ciągłe obrazowanie pojedynczych komórek w zarodkach, biolodzy mogą teraz zacząć badać różne etapy rozwoju układu nerwowego nicieni pod każdym kątem - narodziny komórki; migracja i zróżnicowanie; tworzenie neurytów, ukierunkowany wzrost i fascykulacja; tworzenie synaps; i strojenie obwodów funkcjonalnych. Uchwycenie dynamiki wzrostu neuronów w zarodku C. elegans, poprzez połączenie stabilnie eksprymowanych reporterów i mikroskopii fluorescencyjnej, jest cenne dla społeczności naukowej.
Badania rozwojowe nad C. elegans często wykorzystują niezmienne mapy linii komórkowej i losu komórki, aby poszerzyć kontekstowe zrozumienie na poziomie pojedynczej komórki w nienaruszonym organizmie1. Automatyczna analiza liniowa - przy użyciu StarryNite2,3,4 i AceTree5,6,7,8 oprogramowanie - korzysta z obrazów jąder fluorescencyjnych o wysokim kontraście i wysokiej rozdzielczości. Aby działać optymalnie, StarryNite/AceTree zależy również od przewidywalnej, ograniczonej orientacji obrazowanych zarodków podczas rozwoju. Mikroskopia konfokalna, wykonywana na zarodkach C. elegans ściśniętych między dwoma szkiełkami nakrywkowymi, jest standardową metodą mikroskopii z automatycznym liniałem od ponad dekady, ponieważ zapewnia zarówno wysoki kontrast/wysoką rozdzielczość, jak i przewidywalną ograniczoną orientację zarodka7,8. Wcześniej opisaliśmy budowę i zastosowanie nowatorskiego, opartego na arkuszach świetlnych mikroskopu z podwójnym widokiem odwróconej selektywnej płaszczyzny oświetlenia (diSPIM) do obrazowania żywych próbek, takich jak embriogeneza C. elegans9,10,11,12,13. Ogólnie rzecz biorąc, mikroskopia arkuszowa zapewnia niską fototoksyczność, dużą szybkość i długotrwałe obrazowanie żywych próbek 3D14,15. Metoda diSPIM, w szczególności, tworzy czterowymiarowe (4D) obrazy o prawie izotropowej rozdzielczości przestrzennej około 330 nm9.
W porównaniu z mikroskopią konfokalną, diSPIM oferuje wyższy stosunek sygnału do szumu i szybkość, bardziej izotropową rozdzielczość przestrzenną i jest bardziej odpowiedni do długoterminowego obrazowania in vivo16. W związku z tym pracowaliśmy nad dostosowaniem danych diSPIM do wprowadzania danych do StarryNite/AceTree i zbadaliśmy, czy poprawiłoby to analizy lineage. Główną przeszkodą jest to, że próbki diSPIM nie mogą być łatwo ograniczone przez kompresję skorupki jaja, aby przyjąć oczekiwane orientacje dla StarryNite/ AceTree. Losowa orientacja pozycji komórek w analizowanym woluminie obniża dokładność analizy automatycznego określania linii.
Dlatego zastosowaliśmy CytoSHOW, interfejs użytkownika prowadzony przez przeglądarkę, który pozwala użytkownikom wybrać precyzyjną orientację 3D zarodków podczas wstępnego przetwarzania obrazów diSPIM, uzyskując dane obrazu, które są zarówno zoptymalizowane pod względem jakości, jak i kontekstowe do wprowadzenia do StarryNite/AceTree. Po dokonaniu selekcji zobrazowanych zarodków, CytoSHOW zarządza zautomatyzowanym procesem przetwarzania danych. Przycięte i odjęte tło obrazy zarodków są zapisywane w plikach stosu TIFF dla każdej pozycji, punktu czasowego i widoku. Następnie CytoSHOW iteracyjnie wywołuje program SpimFusion w celu wspólnej rejestracji i wspólnej dekonwolucji dwóch wstępnie przetworzonych widoków, używając algorytmu Richardson-Lucy17,18 w celu uzyskania izotropowych obrazów wolumetrycznych o wysokiej rozdzielczości. Specyficzny dla diSPIM zestaw parametrów został zoptymalizowany dla StarryNite, aby regulować jego zachowanie podczas segmentacji obrazu i śledzenia jądra w izotropowo połączonych obrazach. Połączone obrazy i wyniki pochodzenia są następnie edytowane za pomocą AceTree, co pozwala użytkownikom zidentyfikować i naprawić wszelkie błędy w automatycznym śladzie pochodzenia generowanym przez StarryNite. AceTree może również prezentować drzewo genealogiczne i modelowane w 3D renderingi śledzonych jąder w zarodku. Odkryliśmy, że szybkość i dokładność automatycznego określania linii są znacznie zwiększone przy użyciu izotropowo połączonych obrazów, w porównaniu z surowymi obrazami z dowolnej kamery SPIN. Nasz protokół, choć zoptymalizowany pod kątem opisanej tutaj aplikacji C. elegans, może być ogólnie dostosowany do automatycznego lineingowania danych diSPIM wytworzonych dla innych gatunków lub okazów. Jeśli jest to zamierzone zastosowanie protokołu, należy pamiętać, że dla nowych próbek prawdopodobnie wymagane będzie dodatkowe dostrojenie parametrów StarryNite, zgodnie z opisem3,4.
Pomyślne wdrożenie tego protokołu skutkuje obrazami o rozdzielczości izotropowej 4D i umożliwia biologom śledzenie linii komórkowych, jednocześnie identyfikując i analizując neurony w rozwijającym się zarodku C. elegans. Co więcej, dzięki połączeniu kilku algorytmów przetwarzania końcowego - z których najbardziej czasochłonnym jest akceleracja sprzętowa - możemy teraz analizować zarówno drobne szczegóły subkomórkowe, jak i linie komórkowe i losy komórkowe żywych zarodków w czasie rzeczywistym. Ten nowy protokół umożliwia precyzyjną, świadomą manipulację i obserwację zachowania komórek podczas badań dowodowych różnicowania i morfogenezy in vivo. W tym manuskrypcie przedstawiamy szczegółowe wyjaśnienie opracowanych przez nas ulepszonych protokołów do lineingu i śledzenia komórek w rozwijających się zarodkach C. elegans, aby wzmocnić badania nad embriogenezą, ekspresją genów lub rozwojem neurologicznym.

<table><tbody><tr><td>Steps 1-4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Concave Slides</td><td>ThermoFisher Scientific 1519006</td><td></td><td>Średnica 5-18 mm, głębokość 0,6-0,8 mm, 1,2-1,5 mm</td></tr><tr><td>Mikroskop preparacyjny z 10-krotnym przeprowadzką; &ndash; 50 i razy; Zakres zoomu</td><td>Motic</td><td>SMZ-171</td><td></td></tr><tr><td>E. coli (OP50)</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td>OP50</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe szklane, nr 1,5, 24 i razy; 50 mm</td><td>VWR International</td><td>48393-241</td><td></td></tr><tr><td>M9 Buffer</td><td></td><td></td><td>Stiernagle, T. Konserwacja C. elegans. WormBook. 1-11, doi:10.1895/wormbook.1.101.1, (2006).</td></tr><tr><td>Metyloceluloza &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7509-25G</td><td></td></tr><tr><td>Rurka aspiratora do pipet mikrokapilarnych</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5177</td><td></td></tr><tr><td>Pipety mikrokapilarne, średnica wewnętrzna 0,4 mm</td><td>Igła Drummond Scientific</td><td>1-000-800</td><td></td></tr><tr><td>, nr 18G x 1 i frac12; (1,2 mm x 40 mm)</td><td>BD Precision Glide</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>płytki</td><td></td><td></td> NGM <td>przygotowane zgodnie z opisem Brennera (1974)</td></tr><tr><td>O-ring do komory obrazowania</td><td>O-ringi West</td><td>M1,5X40</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta Pasteura</td><td>Corning/Sigma-Aldrich</td><td>CLS7095D5X</td><td></td></tr><tr><td>Drut platynowy, średnica 0,5 mm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>267201</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-lizyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1524</td><td></td></tr><tr><td>Prostokątna komora ze stali nierdzewnej (76,0 mm x 50,5 mm)</td><td>Oprzyrządowanie Applied Sciences (ASI)</td><td>I2450</td><td></td></tr><tr><td>Robak do</td><td></td><td></td> rzęs <td>Hart, AC Zachowanie. WormBook.&nbsp; (2006).</td></tr><tr><td>Worm Pick</td><td></td><td></td><td>Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. 1-11, doi:10.1895/wormbook.1.101.1, (2006).</td></tr><tr><td>Nazwa</strong</td><td>>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Steps 5-6</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>488 nm filtr długoprzepustowy</td><td>Semrock</td><td>LP02-488 RU-2</td><td></td></tr><tr><td>561-nm filtr wycinający</td><td>Semrock</td><td>NF03-561E-25</td><td></td></tr><tr><td>BLP02-561R-25, ilość 2</td><td>Semrock</td><td></td><td>561 nm EdgeBasic najlepszy stosunek jakości do ceny długoprzepustowy filtr krawędziowy</td></tr><tr><td>Oprogramowanie sterujące dla dolnej kamery</td><td>Jenoptik</td><td></td><td>ProgRes CapturePro</td></tr><tr><td>diSIPM film montażowy</td><td>Oprzyrządowanie do badań naukowych stosowanych (ASI)</td><td></td><td>https://youtu.be/TAgbr6IrTqw ; http://www.asiimaging.com</td></tr><tr><td>film o wyrównaniu diSPIM</td><td>Oprzyrządowanie do badań stosowanych (ASI)</td><td></td><td>https://youtu.be/qnOrg30NNuE</td></tr><tr><td></td> Komputer z <td></td><td>obrazowaniem diSPIM</td><td>Intel Intel Xeon CPU E5-2630 2,6 GHz, łącznie 12 rdzeni,&nbsp; 64&nbsp; GB pamięci, Windows 7</td></tr><tr><td>FF01-525/45-25, ilość 2</td><td>Jednozakresowy filtr pasmowoprzepustowy Semrock 525/45 nm</td><td></td> FF555-DI03-25X36, ilość 2 Semrock 555 nm edge BrightLine jednokrawędziowy dichroiczny beamsplitter Obrazowanie PC Karta graficzna NVIDIDA NVIDIA GeForce GTX 1080 Ti Kumar et al Konfiguracja diSPIM <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Konfiguracja przyrządów Applied Scientifics Instrumentations (ASI)</td><td></td><td>Konfiguracja przyrządów dla tego protokołu jest identyczna jak w Kumar et al 10,11 &nbsp; diSPIM, który wykorzystuje do obrazowania soczewki zanurzeniowe 40x 0,8 NA. (Patrz kroki 5.1 i uwaga)</td></tr><tr><td>Micro Manager</td><td>Micro-Manager</td><td></td><td>https://micro-manager.org/</td></tr><tr><td>Modyfikacje konfiguracji Kumar et al diSPIM (patrz poniżej)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stół optyczny z izolatorami, 4 stopy i czasy; 6 stóp i razy 12 cali</td><td>TMC</td><td>784-651-02DR i 14-416-34</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Company </td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Kroki 7-10</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Analysis PC</td><td></td><td></td><td>Intel Intel Core i7-8700K CPU 3,70 GHz, łącznie 6 rdzeni, 64 GB pamięci, Windows 10</td></tr><tr><td>Analysis PC Karta graficzna</td><td>NVIDIDA</td><td></td><td>NVIDIA GeForce GTX 1080 Ti</td></tr><tr><td>Instalacja instrukcje</td><td>Pakiet</td><td></td> oprogramowania <td>http://dispimlineage.wormguides.org/diSPIMlineaging_InstallationInstructions.htm</td></tr><tr><td>Pakiet oprogramowania</td><td>Pakiet</td><td></td> oprogramowania <td>http://dispimlineage.wormguides.org</td></tr></tbody></table>

izotropowa mikroskopia świetlna i zautomatyzowane analizy linii komórkowych w celu skatalogowania embriogenezy caenorhabditis elegans z rozdzielczością subkomórkową

Isotropic Light-Sheet Microscopy and Automated Cell Lineage Analyses to Catalogue Caenorhabditis elegans Embryogenesis with Subcellular Resolution

Caenorhabditis elegans (C. elegans) wyróżnia się jako jedyny organizm, w którym można zaobserwować in vivo wyzwanie związane ze zrozumieniem komórkowego pochodzenia całego układu nerwowego, z rozdzielczością pojedynczej komórki. W tym miejscu przedstawiamy zintegrowany protokół badania rozwoju neurologicznego w zarodkach C. elegans. Nasz protokół łączy obrazowanie, lineage i neuroanatomiczne śledzenie pojedynczych komórek w rozwijających się zarodkach. Udało nam się uzyskać długotrwałe, czterowymiarowe (4D) obrazowanie żywych zarodków C. elegans z niemal izotropową rozdzielczością przestrzenną dzięki zastosowaniu mikroskopii diSPIM (Dual-view Inverted Selective Plane Illumination Microscopy). Jądra i struktury neuronalne w zarodkach nicieni są obrazowane i izotropowo łączone w celu uzyskania obrazów z rozdzielczością ~330 nm we wszystkich trzech wymiarach. Te zestawy danych 4D o wysokiej rozdzielczości minuta po minucie są następnie analizowane w celu skorelowania ostatecznych tożsamości linii komórkowych z ekspresją genów i dynamiką morfologiczną na poziomie szczegółowości pojedynczej komórki i subkomórki. Nasz protokół jest skonstruowany tak, aby umożliwić modułową realizację każdego z opisanych kroków i usprawnić badania nad embriogenezą, ekspresją genów lub rozwojem neurologicznym.

W pierwszej kolejności zweryfikowano żywotność embrionów obrazowanych przy użyciu parametrów protokołu dla akwizycji diSPIM (sekcje 1-6). Dziesięć embrionów obrazowano jednocześnie w temperaturze 20 °C, przy szybkości jedna objętość/embrion/minutę, od stadium 2 komórek do stadium 2-fold (7,5 godziny, 451 objętości/embrion). Do monitorowania podziałów komórkowych w trakcie embriogenezy wykorzystano szczep BV514, który powszechnie ekspresuje konstrukty reporterowe mCherry::Histone zintegrowanej macierzy transgenu ujIs1324. Rysunek 6 przedstawia oś czasu pierwszej połowy rozwoju embrionalnego dla jednego z obrazowanych embrionów. Każdy obraz przedstawia rzutowanie maksymalnej intensywności z jednego widoku (wykonane zgodnie z krokami 7-8) obrazowanego embrionu. Stwierdzono, że zoptymalizowane protokoły nie wywołały wykrywalnej fototoksyczności u embrionów, co oceniono na podstawie czasu podziałów komórkowych (nie pokazano), czasu wyklucia oraz terminów osiągnięcia kamieni milowych rozwoju (Rysunek 6 oraz referencje1,25,26).
Następnie zastosowaliśmy protokół do analizy dynamiki wzrostu pojedynczych neuronów w rozwijających się zarodkach. Wykonano obrazowanie DCR7692 (olaex465), transgenicznego szczepu nicieni wykazującego ekspresję GFP pod promotorem neuropeptydu flp-19 w podzbiorze niezidentyfikowanych komórek (DACR2819, Pflp-19 (3.6kb)::Syn21::GFP::CAAX::p10 3’UTR)). Postępując zgodnie z krokami opisanego tutaj protokołu, ustaliliśmy, że niezidentyfikowane komórki odpowiadają neuronom ruchowym RMDDL i RMDDR, komórce kanału wydalniczego oraz dwóm komórkom mięśniowym (Rycina 7). Następnie zbadaliśmy i ilościowo określiliśmy dynamikę wzrostu neuronów RMDDL i RMDDR. Zaobserwowaliśmy, że neurony RMDDL i RMDDR mają kształt skośny już w 360. minucie po zapłodnieniu, przy czym dłuższa oś komórki wyznacza późniejszą oś wzrostu neurytów (Rycina 7 oraz Film S1). Korzystając z wtyczki „simple neurite tracing” w programie FIJI i stosując ją do rekonstrukcji 3D izotropowo scalonych wolumenów, ilościowo określiliśmy stereotypowy wzrost neurytów RMDDL i RMDDR w sześciu zarodkach. Stwierdzono, że dynamika wzrostu neurytów RMDDL i RMDDR (zwanych dalej RMDDs) była stereotypowa we wszystkich zarodkach. Od 385. do 410. minuty po zapłodnieniu neuryty RMDDs wydłużyły się o 6,0±0,5µm (średnia ± SEM; n = 12 neurytów) przednio względem ciał komórkowych (Rycina 7B,C,I). Od 415. do 45. minuty po zapłodnieniu oba neuryty wydłużają się grzbietowo do i wokół domniemanego pierścienia nerwowego (gwiazdka na Rycynie 7D). Średnio każdy neuryt RMDD wydłużył się o 1,0 ± 0,6 µm (średnia ± SEM; n = 12 neurytów) od ciała komórkowego, zanim synchronicznie spotkał się z odpowiednikiem po przeciwnej stronie w wierzchołku pierścienia (Rycina 7I). Co istotne, nasze reprezentatywne wyniki wykazują, że dzięki zastosowaniu zintegrowanego protokołu jesteśmy w stanie badać, porównywać i ilościowo określać cechy rozwoju neuronalnego pojedynczych, identyfikowalnych komórek (Rycina 7 oraz Rycina 8).
<img alt="Układ mikroskopowy z poli-L-lizyną, schemat pokrywki z powłoką, zestaw do obrazowania, komora, ustnik." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59533/59533fig1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rycina 1: Układ montażowy próbki w diSPIM. (A) Przygotowanie szkiełka nakrywkowe z poli-L-lizyną. Na wstawce, 10 µL do pokrycia szkiełka podstawowego przez 5 minut. Poli-L-lizyna umożliwia silne przyleganie skorupki jaja embrionalnego do szkiełka podstawowego wewnątrz prostokąta.B) Schemat stalowej komory obrazowania oraz zmontowanej komory. Na wstawce reprezentatywne embriony są zorientowane tak, aby oś przednio-tylna była prostopadła do długiej osi szkiełka podstawowego. (CZłożona rurka aspiratora z pipetą mikrokapilarną.D) Stalowa komora obrazowania zamontowana w uchwycie na próbkę pod obiektywami 40x systemu diSPIM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59533/59533fig1large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Konfiguracja oprogramowania do akwizycji obrazu z mikroskopu, ustawianie intensywności laserów 48 nm i 561 nm oraz parametrów danych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59533/59533fig2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rycina 2: Konfiguracja obrazowania diSPIM długoterminowego w programie Micro-Manager. (A) Zalecane parametry mocy lasera w systemie diSPIM (czerwony prostokąt), zoptymalizowane pod kątem przedłużonego obrazowania przy jednoczesnym ograniczeniu fototoksyczności (ocenianej na podstawie wyższego wskaźnika wyklucia C. elegans zarodki). Ustaw laser 561 nm na 79 µW (0,25) oraz laser 48 nm do 179 µW (0,5). Należy pamiętać, że dokładna kalibracja ustawień oprogramowania w stosunku do mocy lasera różni się w zależności od instalacji diSPIM. Zaleca się, aby użytkownicy zmierzyli i skalibrowali moc lasera w celu uzyskania 79 µW (561 nm) i 179 µW moc lasera (48 nm). (B) parametry diSPIM dla zapisu danych (zielony prostokąt), ustawienia objętości (niebieski kwadrat) oraz ustawienia przekroju (pomarańczowy kwadrat). (Cparametry autofokusa diSPIM dla długoterminowego obrazowania C. elegans embriogeneza (patrz kroki 6.1-6.6). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59533/59533fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>
<img alt="Proces dekonwolucji w diSPIM; schemat przedstawiający widoki przednio-tylne; mikroskopia; analiza danych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59533/59533fig3.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rycina 3: Konfiguracja wizualizacji obrazu i przetwarzania danych z wykorzystaniem CytoSHOW. (A) Surowe obrazy diSPIM otwarte w programie CytoSHOW. CytoSHOW umożliwia otwieranie obrazów zarejestrowanych przez obie ścieżki kamer (SPIM A i B). Te surowe obrazy są otwierane w oknach wielowymiarowych zwanych monitor diSPIMW monitor diSPIMgenerowany jest tzw. „wzór krawata motylnego” (bowtie pattern), aby wyznaczyć przednią, tylną, grzbietową i brzuszną krawędź zarodka (patrz krok 9.1). Selekcje w kształcie krawata motylnego określają orientację zarodka na potrzeby dekonwolucji oraz śledzenia linii komórkowych przy pomocy oprogramowania StarryNite.B) Zoptymalizowane parametry wykorzystane do generowania obrazów izotropowych. W Dekonwolucja w czasie akwizycji okno, ustaw parametry określone w krokach 9.5.1-9.5.8. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59533/59533fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Układ mikroskopii SPIM z dwiema kamerami. Schemat: rotacja próbki, detekcja fluorescencji, dekonwolucja." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59533/59533fig4.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Konfiguracja kamery diSPIM. (A) Fotografia rozmieszczenia i orientacji kamer diSPIM. (B) Przedstawienie obrotów o +90 stopni obrazowania SPIM A w celu dopasowania do zebranych obrazów SPIM B. (CObjętości wejściowe względem indeksu orientacji +1 na podstawie konfiguracji kamer naszego systemu diSPIM (patrz krok 9.5.2). Przed rejestracją obracamy obrazy z systemu SPIM A o +90 stopni wokół osi Y, aby dopasować je do obrazów z systemu SPIM B. Paski skali = 10 µmObrazy stanowią reprezentatywne rzuty maksymalnej intensywności w jednym widoku oraz obrazy po dekonwolucji zarodka powiększonego 1,5-krotnie z oznakowanymi jądrami (561 nm, kolor czerwony) i neuronami (48 nm, kolor zielony). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59533/59533fig4large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>
<img alt="Śledzenie linii komórkowych z ABa, ABp, EMS, P2 na schemacie; wizualizacja rozwoju embrionalnego." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59533/59533fig5.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 5"> 
Rysunek 5: Kuratela i edycja C. elegans linia embrionalna w AceTree. (A) Do edycji śladów linii komórkowych z programu StarryNite wykorzystujemy narzędzie AceTree (patrz referencje5,6,8; w pakiecie do pobrania znajdują się również manuskrypty). AceTree wyświetli C. elegans systematyczne nazwy dla każdego jądra (zielony prostokąt) po zakończeniu kroków 10.1-10.2. To okno (A) dostarcza informacji (czarny prostokąt) o każdej komórce w śledzeniu linii (ABa, zaznaczona na niebiesko), co pomaga użytkownikom podczas śledzenia i edytowania linii rozwojowych. Zaleca się, aby użytkownicy weryfikowali i porównywali komórki linii oraz ich pozycje z C. elegans linia komórek zarodkowych opisana wcześniej przez Sulstona i współpracowników1 Ponadto, jeśli użytkownicy są zainteresowani zlokalizowaniem konkretnych komórek w dekonwolwowanych seriach danych (patrz poniżej, B) wprowadzić do C. elegans nazwa systematyczna w pasku wyszukiwania (pomarańczowy prostokąt). (BSeria danych z dekonwolucji użytkownika otwiera się również automatycznie po zakończeniu kroków 10.1–10.2. Przedstawiono tutaj obraz izotropowo scalony zarodka w stadium czterech komórek z jądrami znakowanymi na czerwono. Podczas śledzenia jąder użytkownicy powinni zmieniać intensywność obrazu (czerwony kwadrat) oraz nawigować w czasie i wzdłuż osi z, korzystając z klawiszy strzałek na klawiaturze (czas – lewo/prawo, z – góra/dół).C) rysunek schematyczny 3D punktu czasowego w (B) z określonymi funkcjami (fioletowy prostokąt), które umożliwiają rotacyjną wizualizację 3D. Przegląd programu AceTree oraz jego funkcjonalności 3D znajduje się w literaturze5,6,8. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59533/59533fig5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego schematu.</a>
<img alt="Harmonogram rozwoju zarodka C. elegans, stadia od zapłodnienia do dwukrotnego zwiększenia rozmiaru, obrazy mikroskopowe." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59533/59533fig6.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rycina 6: Dynamika rozwoju w czasie dla C. elegans zarodki w systemie diSPIM. Górny panel, obrazy diSPIM przedstawiające pierwszą połowę rozwoju embrionalnego jednego z obrazowanych embrionów (szczep BV514 ujIs113)24). Zarodki obrazowano w sposób ciągły w odstępach minutowych przez 7,5 godziny (przy 20 °C). Dwa pierwsze obrazy w górnym panelu przedstawiają embriony w stadium 4- i 8-komórkowym z jądrami (kolor czerwony) oraz położeniem ciał polarnych (gęste czerwone sfery, oznaczone niebieskimi gwiazdkami). Każdy obraz stanowi maksymalną projekcję intensywności z jednego widoku obrazowanego embrionu. Paski skali = 10 µmOś czasu (poziomy pasek) przedstawia minuty po zapłodnieniu (m.p.f.) w rozwoju C. elegans embriony. Potwierdziliśmy, że parametry naszego protokołu akwizycji obrazu diSPIM nie wywołały wykrywalnej fototoksyczności w obrazowanych embrionach, co oceniono na podstawie przeżywalności, czasu podziałów komórkowych, czasu wyklucia oraz czasu osiągania kluczowych etapów rozwoju (patrz literatura)1,25,26). Zauważono, że czas osiągania kamieni milowych rozwoju był powtarzalny w obrębie zarodków przy zastosowanych parametrach obrazowania (SEM ± 8,174 minuty dla 6,4-godzinnych sesji obrazowania; n = 10). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59533/59533fig6large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wzrost neurytów w embrionach; mikroskopia fluorescencyjna, obrazy time-lapse, analiza wykresów wzrostu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59533/59533fig7_v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 7"> 
Rysunek 7. Identyfikacja komórkowa i charakterystyka pojedynczych komórek w zakresie dynamiki wzrostu neurytów w fazie rozwoju C. elegans embriony. Obrazowanie dwukolorowe szczepu otrzymanego w wyniku krzyżowania BV514 ujIs11324 (do śledzenia linii komórkowych) oraz DCR7692 (olaex465), transgeniczny szczep nicieni wykazujący ekspresję GFP pod promotorem neuropeptydu flp-19 promotor w podzbiorze niezidentyfikowanych komórek. (A-HPostępując zgodnie z krokami opisanego tutaj protokołu, ustaliliśmy, że niezidentyfikowane komórki odpowiadają neuronom ruchowym RMDDL i RMDDR (żółte strzałki), komórce kanału wydalniczego (niebieskie strzałki) oraz dwóm komórkom mięśniowym (białe strzałki).I) Ilościowe określenie dynamiki wzrostu neuronów RMDDL i RMDDR przy użyciu wtyczki „simple neurite tracing” w programie FIJI i zastosowanie tej metody do rekonstrukcji 3D wolumenów z fuzją izotropową. Zauważmy, że zarówno RMDDL, jak i RMDDR wykazują stereotypową dynamikę wzrostu, przy czym oba rozrastają się synchronicznie do całkowitej długości 1,0±0.6µm (średnia ± SEM; n = 12 neurytów) i łączących się w grzbietowym wierzchołku pierścienia nerwowego (patrz również Film S1). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59533/59533fig7large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>
<img alt="Schemat mikroskopii fluorescencyjnej struktury komórkowej z obrotami o 90 stopni w celu analizy przestrzennej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59533/59533fig8.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 8"> 
Rycina 8: Analiza izotropowych obrazów diSPIM morfologii neuronów w C. elegans zarodki. Izotropowa wizualizacja neuronów AVHL i AVHR (żółte strzałki). Przy użyciu diSPIM można rejestrować morfologię neuronów, uzyskując obrazy czterowymiarowe (4D) o izotropowej rozdzielczości przestrzennej wynoszącej około 30 nm. diSPIM umożliwia użytkownikom wirtualną rotację wolumenów obrazu o identycznej rozdzielczości we wszystkich kierunkach. Obrazy w A-D stanowią rzuty maksymalnej intensywności tego samego izotropowo scalonego wolumenu obrazów diSPIM, uzyskane z różnych kątów obrotu wokół osi podłużnej zarodka. Paski skali = 5 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59533/59533fig8large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Film uzupełniający S1: C. elegans embrion rozwijający się od 280 do 434 minuty po zapłodnieniu. Izotropowy film szczepu DCR7692 (olaex465) wykazujących ekspresję ujIs13 wszechobecnie, przy czym DACR2819 rzadko znakuje neuryty RMDD (Rycina 7A-D, żółte strzałki). DACR2819 znakuje również dwie komórki mięśniowe (Rysunek 7A-D, białe strzałki) i komórki kanału wydalniczego (Rysunek 7A-D, niebieska strzałka) podczas rozwoju zarodkowego (Rysunek 7A-D). Paski skali = 10 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59533/Movie_S1.mov">Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Tutaj prezentujemy podejście kombinatoryczne wykorzystujące mikroskopię o wysokiej rozdzielczości, narzędzia obliczeniowe i znakowanie pojedynczych komórek w żywych zarodkach C. elegans, aby zrozumieć dynamikę pojedynczej komórki podczas rozwoju neurologicznego.

Izotropowa mikroskopia świetlna i zautomatyzowane analizy linii komórkowych w celu skatalogowania embriogenezy Caenorhabditis elegans z rozdzielczością subkomórkową

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous ...

Protokół ten umożliwia skuteczne śledzenie linii komórkowych i tożsamości w żywych zarodkach, jednocześnie analizując szczegółowe morfologie komórek, takie jak aksony i dendryty, w rozwijających się neuronach C. elegans. W porównaniu z mikroskopią konfokalną, mikroskopia z odwróconym selektywnym oświetleniem płaszczyznowym z podwójnym widokiem lub diSPIM oferuje wyższy stosunek sygnału do szumu, większą izotropową rozdzielczość przestrzenną i lepiej nadaje się do długoterminowego obrazowania in vivo. Zacznij od dodania 500 mikrolitrów 1% roztworu metylocelulozy do wgłębienia wklęsłego szkiełka mikroskopowego.Za pomocą platynowego drucianego szpikulca przenieś dorosłe osobniki z płytki pożywki dla nicieni do roztworu metylocelulozy M9. Użyj zaostrzonych końcówek igieł podskórnych o rozmiarze 18, aby pokroić każde zwierzę poprzecznie w środkowej części ciała do co najmniej jednego do czterech zarodków komórkowych. Trzymając delikatnie ustnik aspiratora między zębami, napełnij pipetę mikrokapilarną 10 do 15 mikrolitrami buforu M9 i delikatnie odessaj kilka zarodków z szkiełka do naczynia włosowatego.Dozować zarodki do środkowego prostokąta szkiełka nakrywkowego stalowej komory obrazowania wypełnionej świeżym buforem M9. Delikatnie ustaw zarodki pionowo tak, aby długa oś każdego zarodka była prostopadła do długiej osi szkiełka nakrywkowego. Następnie umieść stalową komorę obrazowania w uchwycie próbki na stoliku diSPIM.Aby przygotować zarodki do obrazowania, otwórz mikro menedżer i ustaw intensywność lasera na 179 mikrowatów (równoważnik 0,5%) dla 488 nanometrów i 79 mikrowatów (równoważnik 0,25%) dla 561 nanometrów. Kalibracja między regulacją oprogramowania a rzeczywistą mocą wyjściową lasera musi być wykonana z wyprzedzeniem, aby ustawić zakres dla określonych mikrowatów. W menu wtyczek wybierz sterowanie urządzeniem i stosowane obrazowanie naukowe diSPIM, aby otworzyć okno mikroskopii z podwójnym widokiem odwróconej selektywnej płaszczyzny obrazowania stosowanego.Na karcie akwizycji upewnij się, że parametry są ustawione zgodnie ze wskazaniami. Na karcie autofokus ustaw parametry zgodnie ze wskazaniami. Należy pamiętać, że kanał autofokusa powinien określać kanał fluorescencji jądrowej dla planowanych eksperymentów z linią.Zaznacz pola belki i arkusza dla ścieżki A lub B i kliknij na żywo, aby rozpocząć pobieranie obrazu. Otworzy się okno podglądu na żywo. Następnie narysuj ramkę wokół interesującego Cię zarodka, aby wybrać obszar analizy autofokusa zarodka i kliknij rozpocznij akwizycję, aby rozpocząć długoterminowe wielowymiarowe przechwytywanie obrazu.W celu przeglądania obrazu, przetwarzania i analizy pochodzenia komórek, po pobraniu i rozpakowaniu pakietu oprogramowania, kliknij dwukrotnie plik CytoSHOW_app. jnlp, aby rozpocząć uruchamianie CytoSHOW. W menu pliku wybierz new i diSPIM monitor micro manager, aby zlokalizować folder głównego zestawu danych, w którym zostały zapisane nieprzetworzone obrazy mikromenedżera.Wybierz dowolny folder z punktami czasowymi i kliknij przycisk Otwórz. Wielowymiarowe okna nawigacji zostaną otwarte automatycznie zarówno dla SPIM A, jak i SPIM B. Korzystając z narzędzia do zaznaczania wielokątów, kliknij tuż za przednią, tylną, grzbietową i brzuszną krawędzią interesującego zarodka, aby wygenerować wzór muszki nad zarodkiem zarówno w widokach SPIM A, jak i SPIM B, a następnie kliknij diSPIM. Wyrównaj zielony i czerwony kanał dla każdego ramienia SPIM i ponownie kliknij diSPIM.Przesunięcia zostaną uruchomione we wszystkich pozostałych oknach pozycji. Następnie kliknij diSPIM i fuse, aby otworzyć okno dialogowe deconvolved fuse diSPIM raw data volumes i ustawić parametry zgodnie ze wskazaniami. Po ustawieniu wszystkich parametrów kliknij tak i określ katalog wyjściowy, w którym chcesz zapisać przetworzone pliki przed kliknięciem OK.In oknie podglądu, przesuń pasek przewijania t do punktu czasowego drugiego okna i przesuwaj suwak z, aż zostanie pokazany widok bezpośrednio wzdłuż długiej osi zarodka.Przesuń pasek przewijania w kształcie litery t z powrotem do pierwszego punktu czasowego w oknie podglądu i użyj narzędzia do zaznaczania linii, aby narysować linię od najbardziej okrągłego jądra brzusznego przez płaszczyznę płytek metafazy komórki AB. Kliknij przycisk podglądu diSPIM, aby zapisać drobne korekty orientacji podglądu obrazowanego woluminu. Ustawia paski przewijania t w oknach monitora diSPIM na początkowy i końcowy punkt czasowy pełnego zakresu obrazów do przetworzenia.Następnie kliknij przycisk OK. Aby uzyskać wydajną i dokładną analizę linii komórkowych, kluczowe znaczenie ma osiągnięcie precyzyjnej orientacji ADL ilości danych przed przetworzeniem Starry Night. Aby otworzyć serię śledzenia pochodzenia Gwiaździstej nocy w AceTree, otwórz dostarczony dostosowany plik AceTree i wybierz otwórz plik konfiguracyjny, aby zlokalizować wcześniej wskazany katalog wyjściowy. Otwórz podfolder bezpiecznika dla interesującego nas zarodka i wybierz edytowany plik.Następnie kliknij przycisk Otwórz i kontynuuj wizualizację pochodzenia i edycję zgodnie z wcześniejszym opisem. Zoptymalizowane protokoły nie wywołują żadnej wykrywalnej fototoksyczności dla zarodków, ocenianej na podstawie czasu wyklucia i czasu związanego z kamieniami milowymi rozwoju. Korzystając z tego protokołu, jak pokazano, ustalono, że niezidentyfikowane komórki w tym transgenicznym zielonym białku fluorescencyjnym eksprymującym szczep nicieni odpowiadają neuronom ruchowym, komórce kanału wydalniczego i dwóm komórkom mięśniowym.Zidentyfikowane neurony miały ukośny kształt już 360 minut po zapłodnieniu, przy czym dłuższa oś komórkowa reprezentowała kolejną oś wzrostu neurytów. Od 385 do 410 minut po zapłodnieniu neuryty RMDD rozciągały się około sześciu mikrometrów przed ciałami komórek. Od 415 do 445 minut po zapłodnieniu oba neuryty rozciągały się grzbietowo do i wokół przypuszczalnego pierścienia nerwowego.Średnio każdy neuryt RMDD rozciągał się na około 11 mikrometrów od ciała komórki, zanim synchronicznie spotkał się ze swoim przeciwległym odpowiednikiem na szczycie pierścienia. Podsumowując, dane te pokazują, że cechy rozwojowe neuronów dla pojedynczych możliwych do zidentyfikowania komórek mogą być badane, porównywane i określane ilościowo za pomocą tego zintegrowanego protokołu. Ważne jest, aby pamiętać o ustawieniu zarodków w pionie, tak aby długa oś każdego zarodka była prostopadła do długiej osi szkiełka nakrywkowego.Korzystając z tego protokołu, zaczęliśmy badać rodzący się embrionalny układ nerwowy pod każdym kątem. Na przykład podczas narodzin, migracji i różnicowania komórek, tworzenia neurytów, wzrostu i fascykulacji.

isotropic-light-sheet-microscopy-automated-cell-lineage-analyses-to

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Zarodek C. elegans jest potężnym systemem do badania biologii komórki i rozwoju. Przedstawiamy protokół obrazowania na żywo zarodków C. elegans z wykorzystaniem optyki DIC lub fluorescencji, przy użyciu powszechnie dostępnych mikroskopów epifluorescencyjnych oraz oprogramowania otwartoźródłowego.

Obrazowanie zarodków C. elegans przy użyciu mikroskopu epifluorescencyjnego i oprogramowania otwartoźródłowego

Niniejszy artykuł opisuje technikę wizualizacji wczesnych etapów embriogenezy u nicienia Caenorhabditis elegans.

Mikroskopia poklatkowa wczesnego embrionogenezy u Caenorhabditis elegans

Ten protokół opisuje, jak obrazować dzielące się komórki w tkance w zarodkach Caenorhabditis elegans. Podczas gdy kilka protokołów opisuje, jak obrazować podział komórek we wczesnym zarodku, ten protokół opisuje, jak obrazować podział komórek w rozwijającej się tkance podczas środkowej późnej embriogenezy.

Wizualizacja cytokinezy neuroblastów podczas embriogenezy C. elegans

Ten protokół opisuje konfigurację mikroskopu z arkuszem świetlnym i jego implementację do obrazowania in vivo zarodków C. elegans.

Konfiguracja prostego mikroskopu z arkuszami świetlnymi do obrazowania in toto rozwoju C. elegans

Tutaj pokazano, jak śledzić i określać ilościowo procesy rozwojowe u C. elegans. Przedstawione metody oparte są na narzędziach open-source, które można łatwo wdrożyć. Pokazano, jak rekonstruować modele 3D w kształcie komórki, jak ręcznie śledzić struktury subkomórkowe i jak analizować korowy przepływ skurczowy.

Śledzenie i ilościowe określanie procesów rozwojowych u C. elegans przy użyciu narzędzi open source

Obrazowanie morfogenezy zarodków owadów za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej opartej na arkuszach świetlnych stało się najnowocześniejszym rozwiązaniem. Protokół ten nakreśla i porównuje trzy techniki montażu odpowiednie dla zarodków Tribolium castaneum, wprowadza dwie nowatorskie, wykonane na zamówienie linie transgeniczne, dobrze nadające się do obrazowania na żywo, omawia podstawowe kontrole jakości i wskazuje obecne ograniczenia eksperymentalne.

Mikroskopia fluorescencyjna oparta na arkuszach świetlnych żywych lub utrwalonych i barwionych zarodków Tribolium castaneum

Przezroczyste jelito C. elegans może służyć jako "komora tkankowa in vivo" do badania biogenezy błony wierzchołkowej i światła na poziomie pojedynczej komórki i subkomórkowej podczas tubulingenezy wielokomórkowej. Protokół ten opisuje, w jaki sposób połączyć standardowe znakowanie, genetykę utraty funkcji/RNAi i podejścia mikroskopowe w celu przeanalizowania tych procesów na poziomie molekularnym.

Jelito C. elegans jako model morfogenezy światła międzykomórkowego i biogenezy błony spolaryzowanej in vivo na poziomie pojedynczej komórki: znakowanie przez barwienie przeciwciałami, analiza utraty funkcji RNAi i obrazowanie

To badanie przedstawia ilościowe pomiary wielkości i lokalizacji synaptycznej, morfologii mięśni i kształtu mitochondriów u C. elegans przy użyciu swobodnie dostępnych narzędzi do przetwarzania obrazów. Takie podejście pozwala przyszłym badaniom nad C. elegans na ilościowe porównanie zakresu zmian strukturalnych tkanek i organelli w wyniku mutacji genetycznych.

Ilościowe podejścia do badania struktur komórkowych i morfologii organelli u Caenorhabditis elegans

Ta praca opisuje protokół o średniej przepustowości, który umożliwia jednoczesne obrazowanie 3D poklatkowe embriogenezy u zarodków 80-100 C. elegans w ciągu jednej nocy. Dodatkowo dołączone są narzędzia do przetwarzania i wizualizacji obrazu, które usprawniają analizę danych. Połączenie tych metod z niestandardowymi szczepami reporterowymi umożliwia szczegółowe monitorowanie embriogenezy.

Metoda obrazowania półwysokoprzepustowego i zestaw narzędzi do wizualizacji danych do analizy rozwoju embrionalnego C. elegans

Tutaj prezentujemy protokół przygotowania i montażu zarodków Caenorhabditis elegans, rejestrowania rozwoju pod mikroskopem 4D i śledzenia linii komórkowej.

Mikroskopia 4D: odkrywanie rozwoju embrionalnego Caenorhabditis elegans za pomocą mikroskopii Nomarskiego

Ten protokół opisuje obrazowanie poklatkowe C. elegans oparte na mikroprzepływach w całym rozwoju postembrionalnym.

Obrazowanie C. elegans w wysokiej rozdzielczości we wszystkich stadiach larwalnych

Poznaj metodę diSPIM do śledzenia linii komórkowych i analizy morfologii neuronów w żywych embrionach Caenorhabditis elegans. Protokół umożliwia obrazowanie subkomórkowe bez fototoksyczności.

Izotropowa mikroskopia świetlna i zautomatyzowane analizy linii komórkowych w celu skatalogowania embriogenezy Caenorhabditis elegans z rozdzielczością subkomórkową (Wideo) | JoVE Journal

Izotropowa mikroskopia świetlna i zautomatyzowane analizy linii komórkowych w celu skatalogowania embriogenezy Caenorhabditis elegans z rozdzielczością subkomórkową

Przeglądaj więcej filmów