Izotropowa mikroskopia świetlna i zautomatyzowane analizy linii komórkowych w celu skatalogowania embriogenezy Caenorhabditis elegans z rozdzielczością subkomórkową

Tutaj prezentujemy podejście kombinatoryczne wykorzystujące mikroskopię o wysokiej rozdzielczości, narzędzia obliczeniowe i znakowanie pojedynczych komórek w żywych zarodkach C. elegans, aby zrozumieć dynamikę pojedynczej komórki podczas rozwoju neurologicznego.

Protokół ten umożliwia skuteczne śledzenie linii komórkowych i tożsamości w żywych zarodkach, jednocześnie analizując szczegółowe morfologie komórek, takie jak aksony i dendryty, w rozwijających się neuronach C. elegans. W porównaniu z mikroskopią konfokalną, mikroskopia z odwróconym selektywnym oświetleniem płaszczyznowym z podwójnym widokiem lub diSPIM oferuje wyższy stosunek sygnału do szumu, większą izotropową rozdzielczość przestrzenną i lepiej nadaje się do długoterminowego obrazowania in vivo. Zacznij od dodania 500 mikrolitrów 1% roztworu metylocelulozy do wgłębienia wklęsłego szkiełka mikroskopowego.

Za pomocą platynowego drucianego szpikulca przenieś dorosłe osobniki z płytki pożywki dla nicieni do roztworu metylocelulozy M9. Użyj zaostrzonych końcówek igieł podskórnych o rozmiarze 18, aby pokroić każde zwierzę poprzecznie w środkowej części ciała do co najmniej jednego do czterech zarodków komórkowych. Trzymając delikatnie ustnik aspiratora między zębami, napełnij pipetę mikrokapilarną 10 do 15 mikrolitrami buforu M9 i delikatnie odessaj kilka zarodków z szkiełka do naczynia włosowatego.

Dozować zarodki do środkowego prostokąta szkiełka nakrywkowego stalowej komory obrazowania wypełnionej świeżym buforem M9. Delikatnie ustaw zarodki pionowo tak, aby długa oś każdego zarodka była prostopadła do długiej osi szkiełka nakrywkowego. Następnie umieść stalową komorę obrazowania w uchwycie próbki na stoliku diSPIM.

Aby przygotować zarodki do obrazowania, otwórz mikro menedżer i ustaw intensywność lasera na 179 mikrowatów (równoważnik 0,5%) dla 488 nanometrów i 79 mikrowatów (równoważnik 0,25%) dla 561 nanometrów. Kalibracja między regulacją oprogramowania a rzeczywistą mocą wyjściową lasera musi być wykonana z wyprzedzeniem, aby ustawić zakres dla określonych mikrowatów. W menu wtyczek wybierz sterowanie urządzeniem i stosowane obrazowanie naukowe diSPIM, aby otworzyć okno mikroskopii z podwójnym widokiem odwróconej selektywnej płaszczyzny obrazowania stosowanego.

Na karcie akwizycji upewnij się, że parametry są ustawione zgodnie ze wskazaniami. Na karcie autofokus ustaw parametry zgodnie ze wskazaniami. Należy pamiętać, że kanał autofokusa powinien określać kanał fluorescencji jądrowej dla planowanych eksperymentów z linią.

Zaznacz pola belki i arkusza dla ścieżki A lub B i kliknij na żywo, aby rozpocząć pobieranie obrazu. Otworzy się okno podglądu na żywo. Następnie narysuj ramkę wokół interesującego Cię zarodka, aby wybrać obszar analizy autofokusa zarodka i kliknij rozpocznij akwizycję, aby rozpocząć długoterminowe wielowymiarowe przechwytywanie obrazu.

W celu przeglądania obrazu, przetwarzania i analizy pochodzenia komórek, po pobraniu i rozpakowaniu pakietu oprogramowania, kliknij dwukrotnie plik CytoSHOW_app. jnlp, aby rozpocząć uruchamianie CytoSHOW. W menu pliku wybierz new i diSPIM monitor micro manager, aby zlokalizować folder głównego zestawu danych, w którym zostały zapisane nieprzetworzone obrazy mikromenedżera.

Wybierz dowolny folder z punktami czasowymi i kliknij przycisk Otwórz. Wielowymiarowe okna nawigacji zostaną otwarte automatycznie zarówno dla SPIM A, jak i SPIM B. Korzystając z narzędzia do zaznaczania wielokątów, kliknij tuż za przednią, tylną, grzbietową i brzuszną krawędzią interesującego zarodka, aby wygenerować wzór muszki nad zarodkiem zarówno w widokach SPIM A, jak i SPIM B, a następnie kliknij diSPIM. Wyrównaj zielony i czerwony kanał dla każdego ramienia SPIM i ponownie kliknij diSPIM.

Przesunięcia zostaną uruchomione we wszystkich pozostałych oknach pozycji. Następnie kliknij diSPIM i fuse, aby otworzyć okno dialogowe deconvolved fuse diSPIM raw data volumes i ustawić parametry zgodnie ze wskazaniami. Po ustawieniu wszystkich parametrów kliknij tak i określ katalog wyjściowy, w którym chcesz zapisać przetworzone pliki przed kliknięciem OK.In oknie podglądu, przesuń pasek przewijania t do punktu czasowego drugiego okna i przesuwaj suwak z, aż zostanie pokazany widok bezpośrednio wzdłuż długiej osi zarodka.

Przesuń pasek przewijania w kształcie litery t z powrotem do pierwszego punktu czasowego w oknie podglądu i użyj narzędzia do zaznaczania linii, aby narysować linię od najbardziej okrągłego jądra brzusznego przez płaszczyznę płytek metafazy komórki AB. Kliknij przycisk podglądu diSPIM, aby zapisać drobne korekty orientacji podglądu obrazowanego woluminu. Ustawia paski przewijania t w oknach monitora diSPIM na początkowy i końcowy punkt czasowy pełnego zakresu obrazów do przetworzenia.

Następnie kliknij przycisk OK. Aby uzyskać wydajną i dokładną analizę linii komórkowych, kluczowe znaczenie ma osiągnięcie precyzyjnej orientacji ADL ilości danych przed przetworzeniem Starry Night. Aby otworzyć serię śledzenia pochodzenia Gwiaździstej nocy w AceTree, otwórz dostarczony dostosowany plik AceTree i wybierz otwórz plik konfiguracyjny, aby zlokalizować wcześniej wskazany katalog wyjściowy. Otwórz podfolder bezpiecznika dla interesującego nas zarodka i wybierz edytowany plik.

Następnie kliknij przycisk Otwórz i kontynuuj wizualizację pochodzenia i edycję zgodnie z wcześniejszym opisem. Zoptymalizowane protokoły nie wywołują żadnej wykrywalnej fototoksyczności dla zarodków, ocenianej na podstawie czasu wyklucia i czasu związanego z kamieniami milowymi rozwoju. Korzystając z tego protokołu, jak pokazano, ustalono, że niezidentyfikowane komórki w tym transgenicznym zielonym białku fluorescencyjnym eksprymującym szczep nicieni odpowiadają neuronom ruchowym, komórce kanału wydalniczego i dwóm komórkom mięśniowym.

Zidentyfikowane neurony miały ukośny kształt już 360 minut po zapłodnieniu, przy czym dłuższa oś komórkowa reprezentowała kolejną oś wzrostu neurytów. Od 385 do 410 minut po zapłodnieniu neuryty RMDD rozciągały się około sześciu mikrometrów przed ciałami komórek. Od 415 do 445 minut po zapłodnieniu oba neuryty rozciągały się grzbietowo do i wokół przypuszczalnego pierścienia nerwowego.

Średnio każdy neuryt RMDD rozciągał się na około 11 mikrometrów od ciała komórki, zanim synchronicznie spotkał się ze swoim przeciwległym odpowiednikiem na szczycie pierścienia. Podsumowując, dane te pokazują, że cechy rozwojowe neuronów dla pojedynczych możliwych do zidentyfikowania komórek mogą być badane, porównywane i określane ilościowo za pomocą tego zintegrowanego protokołu. Ważne jest, aby pamiętać o ustawieniu zarodków w pionie, tak aby długa oś każdego zarodka była prostopadła do długiej osi szkiełka nakrywkowego.

Korzystając z tego protokołu, zaczęliśmy badać rodzący się embrionalny układ nerwowy pod każdym kątem. Na przykład podczas narodzin, migracji i różnicowania komórek, tworzenia neurytów, wzrostu i fascykulacji.