Name: Wykorzystanie mikroskopii ekspansywnej do fizycznego powiększenia całych zarodków Drosophila w celu obrazowania w superrozdzielczości (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-28T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: Poznaj mikroskopię ekspansywną do obrazowania w superrozdzielczości całych zarodków Drosophila. Ta metoda pozwala ominąć granicę dyfrakcji bez specjalistycznego sprzętu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować dr Jennifer Zallen za dostarczenie świnki morskiej przeciwciała pierwotnego anty-Par-3. Prace te były wspierane przez hojne fundusze (1R15GM143729-01 i 1P20GM139768-01 5743) z National Institute of General Medical Science (NIGMS), jednego z członków National Institutes of Health (NIH), a także Arkansas Biosciences Institute (ABI), który zapewnił częściowe fundusze na zakup naszego mikroskopu konfokalnego.

<ol><li>Klar, T. A., Jakobs, S., Dyba, M., Egner, A., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+microscopy+with+diffraction+resolution+barrier+broken+by+stimulated+emission%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Fluorescence microscopy with diffraction resolution barrier broken by stimulated emission.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (15), 8206-8210 (2000).</li>
<li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+%28STORM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nature Methods. 3 (10), 793-796 (2006).</li>
<li>Betzig, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li>
<li>Wassie, A. T., Zhao, Y., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+microscopy%3A+principles+and+uses+in+biological+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Expansion microscopy: principles and uses in biological research.</a> Nature Methods. 16 (1), 33-41 (2019).</li>
<li>Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging.+Expansion+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical imaging. Expansion microscopy.</a> Science. 347 (6221), 543-548 (2015).</li>
<li>Chen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+imaging+of+RNA+with+expansion+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Nanoscale imaging of RNA with expansion microscopy.</a> Nature Methods. 13 (8), 679-684 (2016).</li>
<li>Tillberg, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-retention+expansion+microscopy+of+cells+and+tissues+labeled+using+standard+fluorescent+proteins+and+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Protein-retention expansion microscopy of cells and tissues labeled using standard fluorescent proteins and antibodies.</a> Nature Biotechnology. 34 (9), 987-992 (2016).</li>
<li>Chang, J. -B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iterative+expansion+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Iterative expansion microscopy.</a> Nature Methods. 14 (6), 593-599 (2017).</li>
<li>Cahoon, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superresolution+expansion+microscopy+reveals+the+three-dimensional+organization+of+the+Drosophila+synaptonemal+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Superresolution expansion microscopy reveals the three-dimensional organization of the Drosophila synaptonemal complex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (33), 6857-6866 (2017).</li>
<li>Mosca, T. J., Luginbuhl, D. J., Wang, I. E., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+LRP4+promotes+synapse+number+and+function+of+excitatory+CNS+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Presynaptic LRP4 promotes synapse number and function of excitatory CNS neurons.</a> eLife. 6, e27347(2017).</li>
<li>Jiang, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superresolution+imaging+of+Drosophila+tissues+using+expansion+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Superresolution imaging of Drosophila tissues using expansion microscopy.</a> Molecular Biology of the Cell. 29 (12), 1413-1421 (2018).</li>
<li>Yu, C. -C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+microscopy+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Expansion microscopy of C. elegans.</a> eLife. 9, e46249(2020).</li>
<li>Freifeld, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+microscopy+of+zebrafish+for+neuroscience+and+developmental+biology+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Expansion microscopy of zebrafish for neuroscience and developmental biology studies.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (50), E10799-E10808 (2017).</li>
<li>Tanaka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+transitions+in+ionic+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+Letters%22%5BJournal%5D)">Phase transitions in ionic gels.</a> Physical Review Letters. 45 (20), 1636-1639 (1980).</li>
<li>Hausen, P., Dreyer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+polyacrylamide+as+an+embedding+medium+for+immunohistochemical+studies+of+embryonic+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Stain+Technology%22%5BJournal%5D)">The use of polyacrylamide as an embedding medium for immunohistochemical studies of embryonic tissues.</a> Stain Technology. 56 (5), 287-293 (1981).</li>
<li>Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCampos-Ortega%2C+JA+%22The+Embryonic+Development+of+Drosophila+melanogaster%22">The Embryonic Development of Drosophila melanogaster</a>. , Springer Berlin Heidelberg. Berlin, Germany. (2013).</li>
<li>Chozinski, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+microscopy+with+conventional+antibodies+and+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Expansion microscopy with conventional antibodies and fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 13 (6), 485-488 (2016).</li>
<li>Miller, D. F. B., Holtzman, S. L., Kaufman, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Customized+microinjection+glass+capillary+needles+for+P-element+transformations+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Customized microinjection glass capillary needles for P-element transformations in Drosophila melanogaster.</a> BioTechniques. 33 (2), 366-367 (2002).</li>
<li>Rothwell, W. F., Sullivan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+embryo+dechorionation%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protocols%22%5BJournal%5D)">Drosophila embryo dechorionation.</a> CSH Protocols. 2007, (2007).</li>
<li>Cold Spring Harbor Protocols. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Drosophila+apple+juice-agar+plates%22">Drosophila apple juice-agar plates</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2011).</li>
<li>de Matos Simões, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rho-kinase+directs+bazooka%2FPar-3+planar+polarity+during+drosophila+axis+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Rho-kinase directs bazooka/Par-3 planar polarity during drosophila axis elongation.</a> Developmental Cell. 19 (3), 377-388 (2010).</li>
<li>Gambarotto, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+cellular+ultrastructures+using+expansion+microscopy+%28U-ExM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging cellular ultrastructures using expansion microscopy (U-ExM).</a> Nature Methods. 16 (1), 71-74 (2019).</li>
<li>Paddock, S. W., Fellers, T. J., Davidson, M. W. Specimen Preparation and Imaging. Nikon MicroscopyU. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.microscopyu.com/techniques/confocal/specimen-preparation-and-imaging">http://www.microscopyu.com/techniques/confocal/specimen-preparation-and-imaging</a> (2022).</li>
<li>Paré, A. C., Zallen, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular%2C+molecular%2C+and+biophysical+control+of+epithelial+cell+intercalation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Cellular, molecular, and biophysical control of epithelial cell intercalation.</a> Current Topics in Developmental Biology. 136, 167-193 (2020).</li>
<li>Royou, A., Field, C., Sisson, J. C., Sullivan, W., Karess, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reassessing+the+role+and+dynamics+of+nonmuscle+myosin+II+during+furrow+formation+in+early+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Reassessing the role and dynamics of nonmuscle myosin II during furrow formation in early Drosophila embryos.</a> Molecular Biology of the Cell. 15 (2), 838-850 (2004).</li>
<li>Chowdhary, S., Tomer, D., Dubal, D., Sambre, D., Rikhy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+mitochondrial+organization+and+function+in+the+Drosophila+blastoderm+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Analysis of mitochondrial organization and function in the Drosophila blastoderm embryo.</a> Scientific Reports. 7 (1), 5502(2017).</li>
<li>Chowdhary, S., Madan, S., Tomer, D., Mavrakis, M., Rikhy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+morphology+and+activity+regulate+furrow+ingression+and+contractile+ring+dynamics+in+Drosophila+cellularization%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial morphology and activity regulate furrow ingression and contractile ring dynamics in Drosophila cellularization.</a> Molecular Biology of the Cell. 31 (21), 2331-2347 (2020).</li>
<li>Stelzer, E. H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+sheet+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Methods+Primers%22%5BJournal%5D)">Light sheet fluorescence microscopy.</a> Nature Reviews Methods Primers. 1, 73(2021).</li>
<li>Ku, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+and+scalable+super-resolution+imaging+of+three-dimensional+protein+localization+in+size-adjustable+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Multiplexed and scalable super-resolution imaging of three-dimensional protein localization in size-adjustable tissues.</a> Nature Biotechnology. 34 (9), 973-981 (2016).</li>
<li>Wen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Universal+labeling+strategy+for+nucleic+acids+in+expansion+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">A Universal labeling strategy for nucleic acids in expansion microscopy.</a> Journal of the American Chemical Society. 143 (34), 13782-13789 (2021).</li>
<li>M'Saad, O., Bewersdorf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+microscopy+of+proteins+in+their+ultrastructural+context%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Light microscopy of proteins in their ultrastructural context.</a> Nature Communications. 11 (1), 3850(2020).</li>
<li>Sarkar, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+revealing%3A+Decrowding+proteins+to+unmask+invisible+brain+nanostructures%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Expansion revealing: Decrowding proteins to unmask invisible brain nanostructures.</a> bioRxiv. , (2020).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Ręczna dewitynizacja Większość protokołów utrwalania zarodków Drosophila polega na usunięciu błony witeliny poprzez potrząsanie utrwalonymi zarodkami w emulsji metanolu i heptanu, co powoduje pękanie błon w wyniku pęknięcia osmotycznego26. Podczas gdy dewitellinizacja na bazie metanolu (popping metanolu) jest skuteczna i odpowiednia do wielu zastosowań, ręczna dewitellinizacja (peeling ręczny) ma kilka istotnych zalet. Po pierwsze, ręczne obieranie pozwala na wybór precyzyjnie zainscenizowanych zarodków do dewitelinizacji i zebrania, co znacznie zwiększa prawdopodobieństwo uzyskania rozszerzonych zarodków w użytecznej orientacji pod koniec eksperymentu. To wzbogacenie ma kluczowe znaczenie przy badaniu specyficznych aspektów szybkich procesów rozwojowych (np. inwagacji mezodermy lub zbieżnego rozciągania), dla których odpowiednio zaawansowane zarodki mogą stanowić zaledwie kilka procent wszystkich zarodków. nawet w ściśle określonym czasie oknie odbioru. Oczywiście, w przypadku wielu zastosowań, bardziej tradycyjne masowe pobieranie zarodków metanolem z okienka pobierania w określonym czasie będzie wystarczające, a ręczne obieranie może nie być warte dodatkowego wysiłku. Po drugie, na wiązanie niektórych pierwszorzędowych przeciwciał i barwników negatywnie wpływa wcześniejsza ekspozycja próbki na metanol. Z tego powodu ręczne obieranie może spowodować znaczny wzrost jakości sygnału immunofluorescencji w porównaniu z próbkami z metanolem, co czyni go przydatną ogólną techniką dla biologów rozwojowych Drosophila .
Mikroskopia konfokalna o wysokiej rozdzielczości w rozszerzonych zarodkach Drosophila Podczas gdy wykonywanie mikroskopii konfokalnej o wysokiej rozdzielczości na próbkach ekspandowanych jest koncepcyjnie takie samo jak w przypadku próbek nieekspandowanych, ExM wprowadza pewne przeszkody techniczne. Warto zauważyć, że orientacja zarodka, która jest losowa, staje się jeszcze ważniejsza wraz ze wzrostem wielkości próbki, ponieważ obiektywy o dużym powiększeniu i wysokim NA są w stanie skupić światło tylko z obszarów próbki, które znajdują się bardzo blisko szkiełka nakrywkowego27. Dlatego zwykle możliwe jest skupienie się tylko na komórkach na powierzchni zarodka lub w jego pobliżu, które znalazły się w sąsiedztwie szkiełka nakrywkowego w momencie tworzenia żelu. Najlepszym sposobem, aby upewnić się, że na końcu znajdują się próbki o prawidłowej orientacji, jest rozpoczęcie protokołu ExM od ściśle zaplanowanej kolekcji utrwalonych zarodków (np. za pomocą ręcznego obierania) i wysiewu wielu zarodków w każdym dołku (>10). Aby uwidocznić komórki głęboko we wnętrzu zarodka, może być konieczne użycie bardziej specjalistycznych zestawów obrazowania, takich jak mikroskopia świetlna28. Ponadto stwierdzamy, że jakość obrazu można poprawić, otwierając otwór konfokalny do rozmiaru większego niż jedna przewiewna jednostka. Oczywiście zwiększenie rozmiaru otworka będzie się wiązało ze zmniejszeniem maksymalnej rozdzielczości, ale w praktyce nawet niewielkie zwiększenie rozmiaru otworka może znacznie zwiększyć intensywność sygnału (dane nie pokazane). Przyszłe badania powinny systematycznie koncentrować się na wielkości otworków i efektywnej rozdzielczości w próbkach ExM.
Wariacje na temat podstawowego ExM Opisany tutaj protokół jest stosunkowo prostym przykładem ExM, który powinien działać w wielu zastosowaniach i być łatwy do wdrożenia w większości laboratoriów biologii rozwojowej. Istnieje jednak wiele odmian podstawowej koncepcji ExM 4,5,7, które można wykorzystać do zwiększenia intensywności sygnału, osiągnięcia jeszcze dalszych stopni ekspansji i wykrywania cząsteczek kwasów nukleinowych, a także białek. W tym protokole zarodki są inkubowane z przeciwciałami przed żelowaniem i ekspansją. Alternatywnie, próbki można poddać działaniu przeciwciał po ich rozprężeniu 6,30, co może zwiększyć intensywność sygnału ze względu na zwiększoną dostępność epitopów i zmniejszoną utratę związanych przeciwciał podczas etapów ekspansji. Ponadto specyficzne cząsteczki sieciujące mogą być używane do przyłączania cząsteczek RNA do hydrożelu, aby umożliwić wykrycie RNA w ekspandowanych żelach przy użyciu metody hybrydyzacji reakcji łańcuchowej30. Wreszcie, próbki mogą być poddawane wielu rundom ekspansji, jak w iteracyjnej mikroskopii ekspansji (iExM)31, pan-ExM32 i ujawniającej ekspansję (ExR)31, aby osiągnąć jeszcze wyższe stopnie zwiększonej rozdzielczości.

W biologii komórkowej i rozwojowej obserwacje są kluczowym dowodem, a zdolność do dokładnego określania wzorców lokalizacji białek jest fundamentalna dla wielu rodzajów eksperymentów. Konfokalna mikroskopia skaningowa jest standardowym narzędziem do obrazowania fluorescencyjnie znakowanych białek w trzech wymiarach wewnątrz nienaruszonych próbek. Konwencjonalne mikroskopy konfokalne nie są w stanie rozróżnić (rozdzielić) sąsiadujących sygnałów fluorescencyjnych oddzielonych od siebie o mniej niż połowę długości fali emitowanego przez nie światła1. Innymi słowy, dwa punktowe źródła światła muszą być oddalone od siebie o co najmniej 200-300 nm w kierunku lateralnym (500-700 nm w kierunku osiowym), aby można było rozdzielić je jako dwa odrębne sygnały. Bariera techniczna ta jest znana jako limit dyfrakcyjny i stanowi fundamentalną przeszkodę w badaniu złożonych struktur subkomórkowych (np. sieci aktomiozynowego cytoszkieletu lub sieci mitochondrialnych) o cechach przestrzennych poniżej limitu dyfrakcyjnego. Dlatego techniki zwiększające rozdzielczość konwencjonalnych mikroskopów konfokalnych budzą powszechne zainteresowanie społeczności biologicznej.
Aby obejść limit dyfrakcyjny, opracowano szereg różnych technologii mikroskopii super-rozdzielczej, które pozwalają na uzyskanie rozdzielczości rzędu kilkunastu nanometrów lub mniej1,2,3, odsłaniając świat złożoności biologicznej, który wcześniej był dostępny jedynie via mikroskopia elektronowa. Pomimo oczywistych zalet tych metod opartych na sprzęcie, mikroskopy super-rozdzielcze często wymagają specyficznego znakowania próbek i długiego czasu akwizycji, co ogranicza ich elastyczność, lub mogą być po prostu zbyt drogie dla niektórych laboratoriów. Alternatywą dla super-rozdzielczości opartej na mikroskopie jest mikroskopia ekspansyjna (ExM), która nie jest typem mikroskopii per se, lecz raczej metodą zwiększania objętości próbki przy zachowaniu względnej organizacji przestrzennej jej składników molekularnych4. Izotropowo rozszerzone próbki można następnie obserwować przy efektywnie zwiększonej rozdzielczości, korzystając z tradycyjnego konfokalnego mikroskopu fluorescencyjnego. ExM została po raz pierwszy opisana przez grupę Boydena w 2015 roku5, a podstawowa technika została od tego czasu zaadaptowana do zastosowania w wielu różnych eksperymentach6,7,8. ExM została również zaadaptowana do zastosowania w całych embrionach, w szczególności u Drosophila9,10,11, C. elegans12 oraz zebrafish13, co czyni ją potężnym narzędziem dla biologów rozwojowych.
ExM opiera się na dwóch różnych rodzajach chemii hydrożeli: 1) pęczniejących hydrożelach polielektrolitowych, które znacznie zwiększają swoją objętość po namoczeniu w wodzie14, oraz 2) hydrożelach poliakrylamidowych, które charakteryzują się niezwykle małym odstępem między polimerami, co umożliwia izotropowe rozszerzanie próbki15. Choć opublikowano wiele protokołów ExM, zazwyczaj obejmują one następujące etapy: fiksację próbki, znakowanie, aktywację, żelowanie, trawienie i rozszerzanie4. Warunki fiksacji i strategie znakowania fluorescencyjnego różnią się oczywiście w zależności od potrzeb eksperymentu i systemu; w niektórych protokołach znakowanie odbywa się po rozszerzeniu. Cząsteczki docelowe w próbce muszą zostać przygotowane (aktywowane) do wiązania z hydrożelem, co można osiągnąć przy użyciu różnych metod chemicznych4. Podczas etapów żelowania próbka jest nasycana monomerami przyszłego hydrożelu (akrylanem sodu, akrylamidem i sieciującym bisakrylamidem), a następnie hydrożel jest tworzony w procesie polimeryzacji rodnikowej katalizowanej przez inicjator, taki jak nadsiarczan amonu (APS), oraz akcelerator, taki jak tetrametylendiamina (TEMED)4. Po żelowaniu próbka jest trawiona enzymatycznie, aby ujednolicić opór próbki przeciw pęcznieniu i zapewnić izotropowe rozszerzanie hydrożelu4. Na koniec strawiony hydrożel umieszcza się w wodzie, co powoduje jego rozszerzenie do około czterokrotności pierwotnego rozmiaru liniowego4.
<img alt="Schemat przetwarzania embrionów; fiksacja, znakowanie, przyleganie do szkiełka nakrywki, obrazowanie; immunofluorescencja." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64662/64662fig01v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Przegląd mikroskopii ekspansyjnej w embrionach Drosophila. ExM to wieloetapowy protokół, którego wykonanie zajmuje co najmniej 4 dni. Zbieranie embrionów, fiksacja i dewitellinizacja trwają 1 dzień lub więcej, w zależności od tego, czy łączone są embriony z wielu partii. Znakowanie immunofluorescencyjne trwa 1 lub 2 dni, w zależności od tego, czy embriony są inkubowane przez noc z przeciwciałami pierwszorzędowymi. Aktywację embrionów, żelowanie, trawienie i ekspansję można przeprowadzić w ciągu jednego dnia. Żele można zamontować i obrazować natychmiast po ekspansji, choć ze względów praktycznych często korzystnie jest rozpocząć obrazowanie następnego dnia. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64662/64662fig01largev2.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Niniejszy protokół opisuje sposób przeprowadzania ExM na całych zarodkach Drosophila we wczesnych i średnich stadiach rozwoju16 w celu wizualizacji subkomórkowych wzorców lokalizacji białek w superrozdzielczości (Rycina 1). Metoda ta wykorzystuje chemię estru N-hydroksysukcynimidy kwasu metakrylowego (MA-NHS) do aktywacji i kotwiczenia cząsteczek białek w hydrożelu17; stanowi ona modyfikację wcześniej opisanego protokołu ExM przeznaczonego dla tkanek i zarodków Drosophila w późniejszych stadiach rozwoju11. W tym protokole zastosowano studzienki z polidimetylosiloksanu (PDMS) do formowania hydrożeli oraz ułatwienia wymiany roztworów podczas aktywacji i żelowania. Alternatywna metoda niewymagająca tworzenia studzienek PDMS polega na zanurzaniu zarodków przytwierdzonych do szkiełek nakrywkowych w kroplach roztworu monomeru umieszczonych na kawałku laboratoryjnej folii uszczelniającej22. Ponadto protokół ten opisuje metodę ręcznego usuwania nieprzepuszczalnej błony witelinowej otaczającej zarodki Drosophila, co jest warunkiem niezbędnym do przeprowadzenia barwienia immunofluorescencyjnego. Co istotne, ta metoda ręcznego oddzielania zarodków może być wykorzystana do selekcji wyłącznie prawidłowo rozwiniętych zarodków Drosophila przed znakowaniem próbek, co znacznie zwiększa prawdopodobieństwo uzyskania powiększonych próbek o właściwym stadium rozwoju i orientacji, a tym samym znacznie usprawnia późniejszą analizę danych.

<table><tbody><tr><td>akryloamid</td><td>Milipore Sigma</td><td>1490-100ML</td><td></td></tr><tr><td>nadsiarczan amonu</td><td>VWR</td><td>BDH9214-500G</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało poliklonalne królika anty-GFP</td><td>Torrey Pines BioLabs</td><td>TP-401</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało poliklonalne IgG kozy przeciwko śwince morskiej, Alexa Fluor 568</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11075</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało poliklonalne przeciw królikowi IgG kozie, Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11008</td><td></td></tr><tr><td>bisakryloamid</td><td>Research Products International</td><td>A11275</td><td></td></tr><tr><td>albumina surowicy bydlęcej (30% roztwór)</td><td>Millipore Sigma</td><td>A7284</td><td></td></tr><tr><td>probówki stożkowe, 50 ml</td><td>fisherscientific&nbsp;</td><td>21008-940</td><td></td></tr><tr><td>szkło nakrywkowe, kwadratowe 22 mm</td><td>VWR</td><td>48366-227</td><td></td></tr><tr><td>szkło nakrywkowe, prostokątne 40 mm x 24 mm</td><td>VWR</td><td>48393-230</td><td></td></tr><tr><td>szklane kapilary do ciągnięcia igieł</td> World <td>Precision Instruments</td><td>TW100F-4</td><td></td></tr><tr><td>szklane igły do mikroiniekcji (wstępnie naciągnięte)</td><td>World Precision Instruments</td><td>TIP10LT</td><td></td></tr><tr><td>guanidyna HCl</td><td>VWR</td><td>101970-606</td><td></td></tr><tr><td>heptan</td><td>VWR</td><td>EM-HX0078-1</td><td></td></tr><tr><td>lateksowe żarówki do pipet</td><td>VWR</td><td>82024-554</td><td></td></tr><tr><td>metanol</td><td>VWR</td><td>BDH1135-4LP</td><td></td></tr><tr><td>kwas melaksylowy N-hydroksysukcynimidyl ester</td><td>VWR</td><td>730300-1G</td><td></td></tr><tr><td>, 1,5 ml</td><td>VWR</td><td>20170-038</td><td></td></tr><tr><td>Płytka wielodołkowa, 6-dołkowa</td><td>Genesee</td><td>25-100</td><td></td></tr><tr><td>paraformaldehyd (16%, klasa EM, bez metanolu)</td><td>Mikroskopia elektronowa 509804487</td><td>(Fisher)</td><td></td></tr><tr><td>Pigazat Pasteura (2 ml, krótka końcówka)</td><td>Zestaw VWR</td><td>14673-010</td><td></td></tr><tr><td>PDMS (zestaw Sylgard 184, baza i utwardzacz)</td><td>VWR</td><td>102092-312</td><td></td></tr><tr><td>Płytki Petriego</td><td>Genesee</td><td>32-107</td><td></td></tr> sól <tr><td>fizjologiczna buforowana fosforanami (10 x roztwór)</td><td>VWR</td><td>97063-660</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór poli-L-lizyny (0,1% roztwór)</td><td>VWR</td><td>P8920-1ooML</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaza K</td> Fiolki scyntylacyjne <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>E00491</td><td></td></tr><tr><td>(30 ml)</td><td>VWR</td><td>66022-128</td><td></td></tr><tr><td>Akrylan sodu</td><td>VWR</td><td>101181-226</td><td></td></tr><tr><td>Azydek sodu ( proszek)</td> <td>Millipore Sigma</td><td>71289</td><td>wytwarza 1% w/v zapasu roboczego; ostra TRUCIZNA w tym stężeniu!</td></tr><tr><td>Streptawidyna, Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S32354</td><td></td></tr><tr><td>TAE (50x)</td><td>Taśma VWR</td><td>97063-692</td><td></td></tr><tr><td>(dwustronna, szerokość 1 cala)</td><td>Szkocka&nbsp; 3M</td><td>665 Szkocka dwustronna 1inch/1296 inches Pudełkowa</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PI17919</td><td></td></tr><tr><td>TEMPO</td><td>VWR</td><td>EM8.14681.0005</td><td>utleniacz katalityczny</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>VWR</td><td>97063-872</td><td>wyjątkowo lepki po oczyszczeniu; zrobić 10% zapas roboczy z wodą</td></tr><tr><td>Zeiss LSM 900</td><td>Zeiss Laserowy</td><td></td><td>mikroskop skaningowy używany bez AiryScan</td></tr></tbody></table>

wykorzystanie mikroskopii ekspansywnej do fizycznego powiększenia całych zarodków drosophila w celu obrazowania w superrozdzielczości

Using Expansion Microscopy to Physically Enlarge Whole-Mount Drosophila Embryos for Super-Resolution Imaging

Tytanem pracy biologii rozwojowej jest mikroskop konfokalny, który pozwala badaczom określić trójwymiarową lokalizację oznaczonych molekuł w złożonych próbkach biologicznych. Podczas gdy tradycyjne mikroskopy konfokalne pozwalają na rozpoznanie dwóch sąsiadujących ze sobą punktów fluorescencyjnych oddalonych od siebie o kilkaset nanometrów, obserwacja najdrobniejszych szczegółów biologii subkomórkowej wymaga zdolności do rozdzielania sygnałów rzędu dziesiątek nanometrów. Opracowano wiele sprzętowych metod mikroskopii superrozdzielczej, aby umożliwić naukowcom ominięcie takich ograniczeń rozdzielczości, chociaż metody te wymagają specjalistycznych mikroskopów, które nie są dostępne dla wszystkich badaczy. Alternatywną metodą zwiększania zdolności rozdzielczej jest izotropowe powiększenie samej próbki w procesie znanym jako mikroskopia ekspansywna (ExM), który został po raz pierwszy opisany przez grupę Boydena w 2015 roku. ExM nie jest rodzajem mikroskopii per se, ale raczej metodą pęcznienia próbki przy zachowaniu względnej organizacji przestrzennej jej cząsteczek składowych. Rozszerzoną próbkę można następnie obserwować w efektywnie zwiększonej rozdzielczości za pomocą tradycyjnego mikroskopu konfokalnego. W tym miejscu opisujemy protokół implementacji ExM w zarodkach Drosophila z całą górą, który służy do badania lokalizacji Par-3, miozyny II i mitochondriów w powierzchniowych komórkach nabłonka. Protokół ten zapewnia około czterokrotny wzrost wielkości próbki, co pozwala na wykrycie szczegółów subkomórkowych, które nie są widoczne za pomocą konwencjonalnej mikroskopii konfokalnej. Jako dowód zasady, przeciwciało anty-GFP jest używane do rozróżniania odrębnych pul miozyny-GFP między sąsiednimi korami komórkowymi, a znakowana fluorescencyjnie streptawidyna jest używana do wykrywania endogennych biotynylowanych cząsteczek w celu ujawnienia drobnych szczegółów architektury sieci mitochondrialnej. Protokół ten wykorzystuje powszechne przeciwciała i odczynniki do znakowania fluorescencyjnego i powinien być kompatybilny z wieloma istniejącymi protokołami immunofluorescencji.

Aby scharakteryzować ogólną skuteczność ExM w całych embrionach Drosophila, zmierzono długość embrionów wzdłuż osi głowa-ogon w niepowiększonych embrionach kontrolnych oraz w embrionach powiększonych (Rysunek 3A-C). Niepowiększone embriony kontrolne poddano tym samym warunkom fiksacji i etapom znakowania immunofluorescencyjnego co embriony powiększone, z wyjątkiem tego, że przed obrazowaniem zamontowano je w zestalonym medium montażowym. Pojedyncze niepowiększone embriony zajmowały około połowy pola widzenia przy użyciu obiektywu 10x (Rysunek 3A). W przeciwieństwie do nich, powiększone embriony zajmowały około dwóch pełnych pól widzenia przy użyciu tego samego obiektywu 10x (Rysunek 3B). Aby ocenić, jak stopień powiększenia różnił się zarówno w obrębie jednego eksperymentu, jak i między eksperymentami, ten sam protokół ExM wykonano w trzech oddzielnych próbach, a długość embrionów mierzono w trzech różnych żelach w ramach każdego pojedynczego eksperymentu. Średnia długość z głową do ogona niepowiększonych embrionów kontrolnych wynosiła 398.8 µm (odchylenie standardowe [SD] = 22.93 µm; n = 74; Rysunek 3C). Dla eksperymentu 1, eksperymentu 2 i eksperymentu 3 średnie długości embrionów wynosiły odpowiednio 1,596 µm (SD = 159.9 µm; n = 57), 1,868 µm (SD = 150.5 µm; n = 51) oraz 1,954 µm (SD = 120.3 µm; n = 44), co odpowiada odpowiednio 4.0-krotnemu, 4.7-krotnemu i 4.9-krotnemu czynnikowi powiększenia (Rysunek 3C). Zmienność wewnątrzeksperymentalna między żelami była znacznie mniej zauważalna niż zmienność międzyeksperymentalna, która wynosiła około 20% (Rysunek 3C). Aby ocenić wpływ ExM na morfologię komórek i embrionów, użyto przeciwciała przeciwko komponentowi połączeń przylegających Par-3 (Bazooka)21 do znakowania apikalnych błon komórkowych, a następnie obrazowano rozwijające się segmenty gębowe embrionów Drosophila w stadium 11 — stadium o złożonej strukturze segmentowej (Rysunek 3D-F). W próbce kontrolnej komórki w segmencie szczękowym miały średnią szerokość 4.76 µm (SD = 1.053 µm, n = 25; Rysunek 3D,F). W próbkach powiększonych obrazowanych przy użyciu tego samego obiektywu 40x i czynnika powiększenia (1x), komórki w segmencie szczękowym miały średnią szerokość 19.10 µm (SD = 3.966 µm, n = 18; Rysunek 3E,F), co stanowi 4.0-krotne powiększenie. Zatem, zgodnie z wcześniejszymi doniesieniami11, udało nam się powiększyć całe embriony Drosophila około czterokrotnie w wymiarach liniowych przy użyciu ExM bez rozdarcia próbek czy wyraźnych zniekształceń morfologii komórkowej lub tkankowej.
<img alt="Rozwój zarodka: mikroskopia, pomiary; schematy, mikrografie (10x, 40x) i wykres analizy." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64662/64662fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Czterokrotna ekspansja zarodków Drosophila. (A) Nieeksponowane i (B) eksponowane zarodki Drosophila obrazowane za pomocą obiektywu 10x (0,3 NA) przy powiększeniu 1x. Poszczególne pola widzenia (FOV) zaznaczono liniami przerywanymi. Zarodki wykazywały ekspresję wersji łańcucha lekkiego miozyny z tagiem GFP i zostały zabarwione przeciwciałem anty-GFP. (C) Ilościowe oznaczenie długości zarodka (wzdłuż osi głowa-ogon) w trzech hydrożelach na eksperyment oraz z trzech oddzielnych eksperymentów ExM w porównaniu z nieeksponowanymi kontrolami. (D,E) Segmenty szczękowe z (D) nieeksponowanych i (E) eksponowanych zarodków Drosophila w stadium 11, obrazowane za pomocą obiektywu 40x (1,3 NA) przy powiększeniu 1x. Kontury komórek (złącza przylegające) wykryto za pomocą przeciwciała anty-Par-3/Bazooka (kolor biały). (F) Ilościowe oznaczenie szerokości komórek (długa oś) z równoważnych grup komórek z (D) i (E). Wykresy pudełkowe w (C) i (F) przedstawiają zakresy 25., 50. i 75. percentyla; wąsy wskazują wartości minimalne i maksymalne; symbole „+” oznaczają średnią. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64662/64662fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
Aby wykazać, że ExM może być wykorzystywany do rozdzielania szczegółów subkomórkowych poniżej typowego limitu dyfrakcyjnego, obrazowano cytoszkielet akto-miozynowy w kontrolnych embrionach nierozszerzonych oraz w embrionach rozszerzonych poddawanych konwergentnemu wydłużaniu (stadium 7). Zdarzenia przebudowy tkanek podczas gastrulacji i konwergentnego wydłużania są w dużej mierze kontrolowane przez zmiany w lokalizacji białka motorycznego miozyny II24. Jednak w gęsto upakowanym nabłonku kolumnowym wczesnej ektodermy Drosophila trudno jest zaobserwować wiele drobnych szczegółów wzorca lokalizacji miozyny II, nawet przy obrazowaniu z powiększeniem 158x (obiektyw 63x z 2,5-krotnym zoomem optycznym) — co stanowi typową maksymalną rozdzielczość mikroskopu konfokalnego z laserowym skanowaniem. Na przykład, ponieważ miozyna II jest białkiem kortykalnym (znajdującym się bezpośrednio pod błoną plazmatyczną), pulle miozyny II25 zlokalizowane po obu stronach kontaktów międzykomórkowych nie były rozdzielone w embrionach w stadium 7 i jawiły się jako pojedyncza linia w miejscu styku sąsiadujących komórek (Rysunek 4A). W przeciwieństwie do tego, w rozszerzonych embrionach w stadium 7 można było zaobserwować równoległe linie miozyny II w złączach międzykomórkowych, reprezentujące pulle białek kortykalnych w sąsiednich komórkach (Rysunek 4B). Odległość między równoległymi liniami miozyny II w próbkach rozszerzonych wynosiła 892,7 nm (SD = 0,171 nm, n = 12); po podzieleniu przez cztery daje to przewidywaną odległość ~220 nm między liniami miozyny w sąsiednich komórkach w embrionach nierozszerzonych, co rzeczywiście znajduje się tuż poniżej limitu dyfrakcyjnego dla sygnału wykrywanego za pomocą Alexa 488 (szczytowa emisja ~520 nm/2 = 260 nm).
Dodatkowo zbadaliśmy, czy ExM może zostać wykorzystane do obrazowania architektury sieci mitochondrialnej w gęsto upakowanych komórkach gastrulujących embrionów Drosophila (stadium 6). Funkcja mitochondriów jest ściśle powiązana ze strukturą sieci (tj. organellami połączonymi w przeciwieństwie do pofragmentowanych), jednak szczegóły organizacji sieci mitochondrialnej są trudne do wizualizacji przy użyciu konwencjonalnej mikroskopii konfokalnej w typach komórek, które nie są płaskie i/lub cienkie. Mitochondria są naturalnie bogate w cząsteczki biotynilowane, w związku z czym można je znakować we wczesnym embrionie Drosophila za pomocą streptawidyny znakowanej fluorescencyjnie26. W niepowiększonych embrionach w stadium 6 znakowanych streptawidyną-Alexa 488 sygnał pojawiał się w postaci punktów cytoplazmatycznych, które często nakładały się na siebie i były trudne do rozdzielenia (Rycina 4C). W przeciwieństwie do nich, w powiększonych embrionach w stadium 6 widocznych było znacznie więcej drobnych szczegółów sieci mitochondrialnej, a punkty były łatwiejsze do rozdzielenia (Rycina 4D)26, 27. Wyniki te wskazują, że ExM może być stosowane do badania organizacji sieci mitochondrialnej w typach komórek, które tradycyjnie nie nadają się do analizy mitochondriów.
<img alt="Lokalizacja miozyny II i Par-3 w komórkach; obrazy z mikroskopu fluorescencyjnego przy powiększeniu 158x." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64662/64662fig4v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Szczegóły cytoszkieletu akto-miozynowego i mitochondriów ujawnione za pomocą mikroskopii ekspansyjnej. (A,B) Lokalizacja miozyny II w komórkach neuroektodermy (pasma zarodkowego) obrazowana obiektywem 63x (1.4 NA) przy powiększeniu 2,5x w stadium 7 w zarodkach (A) nieekspandowanych i (B) ekspandowanych. Miozynę II wykryto w zarodkach wykazujących ekspresję transgenicznej wersji łańcucha lekkiego regulacyjnego miozyny II z tagiem GFP (sqh-GFP), przy użyciu przeciwciała anty-GFP (czerwony). W zarodku ekspandowanym można rozróżnić wyraźne pule korowej miozyny zlokalizowane w sąsiadujących komórkach (białe strzałki). (C,D) Sieci mitochondrialne w komórkach neuroektodermy obrazowane obiektywem 63× (1.4 NA) przy powiększeniu 2,5x w stadium 6 w zarodkach nieekspandowanych (C) i ekspandowanych (D). Mitochondria wykryto za pomocą streptawidyny-Alexa 488 (zielony), a obrysy komórek za pomocą przeciwciała anty-Par-3/Bazooka (magenta). Eksperymenty przeprowadzono przy użyciu konfokalnego mikroskopu skaningowego. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64662/64662fig4v2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
Tabela 1: Przepisy na roztwory. Skład roztworów wykorzystanych w tym protokole w kolejności ich występowania. Wszystkie roztwory zapasowe są w formie ciekłej, chyba że zaznaczono inaczej. Odczynniki chemiczne resuspenderowano lub rozcieńczano w autoklawowanej wodzie filtrowanej, chyba że zaznaczono inaczej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64662/JOVE_Parveen%202023_Revision_Recipes.zip" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>

Tutaj przedstawiono protokół implementacji mikroskopii ekspansywnej we wczesnych zarodkach Drosophila w celu uzyskania obrazowania w superrozdzielczości przy użyciu konwencjonalnego laserowo-skaningowego mikroskopu konfokalnego.

Wykorzystanie mikroskopii ekspansywnej do fizycznego powiększenia całych zarodków Drosophila w celu obrazowania w superrozdzielczości

The workhorse of developmental biology is the confocal microscope, which allows researchers to determine the three-dimensional localization of tagged ...

Protokół ten może być wdrożony w większości laboratoriów biologii rozwoju przełyku, umożliwiając badaczom, którzy nie mają dostępu do mikroskopów o super rozdzielczości, tworzenie obrazów w super rozdzielczości. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona naukowcom ominąć granicę dyfrakcji konwencjonalnej mikroskopii konfokalnej bez konieczności stosowania mikroskopu o wysokiej rozdzielczości poprzez rozszerzanie samej próbki. Protokół ten będzie korzystny dla osób badających, w jaki sposób lokalizacja białek wpływa na morfologię lub funkcję komórek w nienaruszonych zarodkach, szczególnie gdy białka te są zorganizowane w złożone struktury lub sieci subkomórkowe.Najczęstszym problemem, z jakim spotykają się ludzie, jest utrata zarodków w trakcie trwania protokołu. Zaleca się nałożenie wielu warstw poli-L-lizyny, aby mocno przylegać do zarodków. Po zarodkach weź sześciocentymetrową plastikową podstawę szalki Petriego wypełnioną w połowie 3% agarem.Naciąć prostokąt o wymiarach pięć na trzy centymetry w agarze za pomocą żyletki lub skalpela. Usuń płytę agarową za pomocą małej szpatułki laboratoryjnej. Następnie odwróć podstawę szalki Petriego, połóż ją na ławce i umieść płytę agarową na wierzchu odwróconej płytki.Zdejmij pokrywkę z szalki Petriego i upewnij się, że jest sucha. Za pomocą rękawiczek przymocuj kawałek taśmy dwustronnej do wewnętrznej strony pokrywy. Wyjąć fiolki zawierające powlekane i utrwalone zarodki z wytrząsarki i umieścić je pionowo na stole warsztatowym.Pozwól, aby faza organiczna i wodna się rozdzieliły. Prawidłowo utrwalone zarodki powinny pozostać na styku. Całkowicie usuń dolną fazę wodną za pomocą pipety Pasteura i pipety P200.Użyj szklanej pipety Pasteura wyposażonej w lateksową bańkę, aby przenieść utrwalone zarodki na płytę agarową w wielu małych partiach, tak aby nie przylegały do wnętrza pipety. Gdy zarodki znajdą się na płycie agarowej, użyj pipetera P200, aby usunąć pozostały heptan w pobliżu zarodków. Teraz upuść dwustronną pokrywkę taśmy na płytę agarową z wysokości dwóch centymetrów, aby przykleić zarodki do taśmy.Delikatnie zdejmij pokrywkę z płyty agarowej, połóż ją do góry nogami na ławce i dodaj tyle PBS Tween, aby przykryć zarodki w pokrywce. Aby pobrać pożądane zarodki, użyj stereoskopowego mikroskopu preparacyjnego o 100-krotnym powiększeniu z pośrednim oświetleniem. Nakłuj błonę witelinową w pobliżu przedniego lub tylnego końca zarodka cienką szklaną igłą, aby ją opróżnić i uwolnić ciśnienie.Użyj cienkich kleszczyków lub metalowej sondy, aby delikatnie wypchnąć zarodek przez otwór z błoną witelinową nadal przyklejoną do dwustronnej taśmy. Pozostaw niepożądane zarodki na taśmie. Okresowo używaj szklanej pipety Pasteura, aby zebrać unoszący się w powietrzu zarodek dewitellinizowany i przenieść go do 1,5-mililitrowej probówki do mikrofugi.Przygotuj roztwór PDMS w stożkowej probówce o pojemności 50 mililitrów i utwórz zrównoważoną probówkę, dodając odpowiednią ilość wody do drugiej 50-mililitrowej rurki stożkowej. Odwirować roztwór PDMS o sile 500G przez trzy minuty w temperaturze 15 stopni Celsjusza. Następnie wlej go do 10-centymetrowej szalki Petriego na głębokość jednego milimetra.Pozostaw roztwór PDMS do zestalenia się przez noc w temperaturze 55 stopni Celsjusza. Po zestaleniu się płyty PDMS naciąć kwadratowe obszary nieco mniejsze niż szkiełko nakrywkowe o wymiarach 22 na 22 milimetry za pomocą skalpela. Wewnątrz każdego kwadratu naciąć i usunąć kwadratową studzienkę o szerokości ośmiu milimetrów.przenieść każdy kwadratowy PDMS dobrze na szkiełko nakrywkowe o wymiarach 22 na 22 milimetry i mocno go przykleić. Aby przykleić zarodki do szkiełek nakrywkowych, nałóż wystarczającą ilość 0,1% poli-L-lizyny, aby pokryć powierzchnię szkiełka nakrywkowego wewnątrz każdej studzienki i umieść je w inkubatorze o temperaturze 55 stopni Celsjusza do wyschnięcia. Krótko opłucz zarodki i PBS, aby usunąć detergent Tween.Następnie przenieś więcej niż 10 zarodków do każdej studzienki pokrytej poli-L-lizyną. Pozwól zarodkom osiąść na dnie studzienek. Usuń nadmiar płynu z przylegających zarodków za pomocą pipety Pasteura i natychmiast przejdź do następnego kroku.Podczas gdy zarodki znajdują się w roztworze monomeru, przygotuj roztwór żelujący, aby przykryć studzienki PDMS. Rozcieńczyć utleniacz katalityczny świeżo z proszku. Połącz 3 920 mikrolitrów roztworu monomeru z 60 mikrolitrami 10% TEMED i 20 mikrolitrami 1%TEMPO.Podziel roztwór żelujący na 125 mikrolitrów podwielokrotności na wiele probówek PCR. Usunąć roztwór monomeru ze studzienek PDMS za pomocą odkurzacza lub pipetera, uważając, aby nie zakłócić pracy zarodków. Dodaj pięć mikrolitrów APS do jednej z probówek PCR zawierających roztwór żelujący, aby zainicjować polimeryzację.Szybko rozprowadź roztwór żelujący polimeryzujący między trzema dołkami. Powtarzaj to, aż wszystkie dołki i zarodki zostaną pokryte. Pozostaw próbki na żelowanie przez 1,5 do 2,5 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Grubsze hydrożele będą potrzebowały więcej czasu, aby zakończyć polimeryzację i zestalenie. Często mieszaj hydrożele, aby monitorować polimeryzację. Po zestaleniu hydrożele nie będą się poruszać.Po żelowaniu oderwij studzienki PDMS od szkiełka nakrywkowego, nie naruszając hydrożeli. Przenieś hydrożele pojedynczo do studzienek płytki sześciodołkowej. Hydrożele mogą nieznacznie rozszerzać się podczas trawienia.Całkowicie przykryj żele buforem wytrawiającym. 30 mililitrów buforu wytrawiającego wystarcza do pokrycia ich w sześciodołkowej płytce i inkubacji przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po strawieniu przenieś hydrożele na sześciocentymetrową szalkę Petriego i napełnij ją wodą dejonizowaną, aby się rozszerzyła.W tym momencie hydrożele mogą oderwać się od szkiełek nakrywkowych i rozszerzyć się czterokrotnie w wymiarze liniowym. Za pomocą pipety Pasteura usuń jak najwięcej wody z szalki Petriego, aby zminimalizować ruch żeli podczas obchodzenia się z nimi. Manewruj ekspandowanymi żelami z zarodkami na dolnej powierzchni na dużym szkiełku nakrywkowym w celu obrazowania.Zamontuj każde szkiełko nakrywkowe z żelem na obiektywie odwróconego skaningowego mikroskopu konfokalnego. Po zlokalizowaniu odpowiednio ustawionych i zorientowanych próbek przełączono się na obiektyw zanurzony w oleju lub wodzie o dużym powiększeniu, aby obrazować w wysokiej rozdzielczości. Pomiar długości zarodka wzdłuż osi od głowy do ogona pod obiektywem 10x wykazał, że nierozszerzone zarodki obejmowały około połowy pola widzenia, podczas gdy rozszerzone zarodki obejmowały około dwóch pełnych pól widzenia.Średnia długość od głowy do ogona nierozszerzonych zarodków kontrolnych wynosiła 398,8 mikrometrów. W przypadku eksperymentów pierwszego, drugiego i trzeciego średnia długość zarodka wynosiła odpowiednio 4,0-krotność, 4,7-krotność i 4,9-krotność. W próbie kontrolnej komórki w segmencie szczęki miały średnią szerokość 4,76 mikrometra.W rozszerzonych próbkach komórki w segmencie szczęki miały średnią szerokość 19,10 mikrometrów, co oznacza 4,0-krotne rozszerzenie. Cytoszkielet aktomiozyny zobrazowano w nierozszerzonej kontroli w porównaniu z rozszerzonymi zarodkami, ulegającymi zbieżnemu wydłużeniu. Wyglądały jak pojedyncza linia, w której spotykały się sąsiednie komórki.Natomiast w rozszerzonych zarodkach w stadium siódmym można było zaobserwować równoległe linie miozyny drugiej na połączeniach komórkowych, reprezentujące pule białek korowych w sąsiednich komórkach. W nierozszerzonych zarodkach w stadium szóstym mitochondria oznaczone streptawidyną wyglądały jak heterogeniczna cytoplazmatyczna mgła bez żadnych wyraźnych szczegółów subkomórkowych. Jednak w rozszerzonych zarodkach liczne punkty były rozpoznawalne w cytoplazmie, prawdopodobnie reprezentując rozdrobnione mitochondria lub części sieci mitochondrialnej.Jedną z ważnych rzeczy, o których należy pamiętać podczas próby tej procedury, jest ochrona zarodków przed nadmierną ekspozycją na światło po wtórnej inkubacji przeciwciał.

using-expansion-microscopy-to-physically-enlarge-whole-mount

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Drosophila hemocyty rozprzestrzeniają się po całym rozwijającym się embrionie. Niniejszy protokół demonstruje sposób montowania i obrazowania tych migracji z wykorzystaniem embrionów z hemocytami znakowanymi fluorescencyjnie.

Obrazowanie na żywo migracji hemocytów embrionalnych Drosophila melanogaster

W niniejszym opracowaniu przedstawiamy protokół montowania barwionych zarodków Drosophila w pozycji pionowej, co umożliwia obrazowanie przekrojów poprzecznych z wykorzystaniem mikroskopii konfokalnej.

Obrazowanie w układzie pionowym embrionów Drosophila

Ten artykuł demonstruje użycie szybkiego skaningowego mikroskopu konfokalnego do obrazowania zachowania komórek bezpośrednio przez poczwarkę. Pozostawiając nienaruszoną obudowę poczwarki, metoda ta umożliwia obserwację i pomiar dynamicznych procesów komórkowych na etapie rozwoju Drosophila, który jest trudny do bezpośredniego zbadania.

Obrazowanie przez poczwarkę Drosophila melanogaster

Przedstawiono protokół, który pozwala na wizualizację nienaruszonego Drosophila melanogaster na dowolnym etapie rozwoju za pomocą tomografii mikrokomputerowej.

Obrazowanie całego zwierzęcia Drosophila melanogaster za pomocą tomografii mikrokomputerowej

Prezentowany tutaj jest protokół do obrazowania żywych komórek w nienaruszonej tkance w superrozdzielczości. Ustandaryzowaliśmy warunki obrazowania bardzo wrażliwej populacji dorosłych komórek macierzystych w ich natywnym środowisku tkankowym. Technika ta polega na zrównoważeniu rozdzielczości czasowej i przestrzennej, aby umożliwić bezpośrednią obserwację zjawisk biologicznych w żywej tkance.

Obrazowanie żywych komórek w superrozdzielczości struktur subkomórkowych

Prezentowany tutaj jest protokół mikroiniekcji i jednoczesnego obrazowania wielu zarodków Drosophila podczas rozwoju embrionalnego za pomocą obrazowania o wysokiej zawartości na płytce.

Przygotowanie zarodków Drosophila i mikroiniekcja do mikroskopii żywych komórek wykonana przy użyciu automatycznego analizatora o wysokiej zawartości

Błona podstawna jest niezbędna do morfogenezy tkanek i narządów podczas rozwoju. Aby lepiej zrozumieć mechanizmy prowadzące do prawidłowego umiejscowienia tej struktury, w przedstawionym protokole opisano metody wizualizacji i charakterystyki wewnątrzkomórkowego transportu i wydzielania białek błony podstawnej w komórkach nabłonka za pomocą mikroskopii konfokalnej i superrozdzielczej.

Obrazowanie konfokalne i superrozdzielcze spolaryzowanego transportu wewnątrzkomórkowego i wydzielania białek błony podstawnej podczas oogenezy Drosophila

Mikroskopia superrozdzielcza może dostarczyć szczegółowych informacji na temat organizacji komponentów w kompleksie synaptonemalnym w mejozie. Tutaj demonstrujemy protokół rozwiązywania poszczególnych białek kompleksu synaptonemalnego Caenorhabditis elegans.

Mikroskopia superrozdzielcza kompleksu synaptonemalnego w obrębie linii zarodkowej Caenorhabditis elegans

To badanie pokazuje szczegółowy protokół do przeprowadzenia mikroskopii ekspansji ultrastruktury w trzech etapach cyklu życia in vitro Trypanosoma cruzi, patogenu odpowiedzialnego za chorobę Chagasa. Uwzględniamy zoptymalizowaną technikę białek cytoszkieletu i znakowania pan-proteomu.

Mikroskopia ekspansji ultrastrukturalnej w trzech etapach cyklu życia Trypanosoma cruzi in vitro

Tutaj proponujemy prosty protokół łączący metaboliczną inżynierię oligosacharydów, chemię kliknięć i mikroskopię ekspansji, który umożliwia bioobrazowanie wewnątrzkomórkowych sjalowanych N-glikoprotein z lepszą rozdzielczością przy użyciu rutynowego sprzętu mikroskopowego.

Wizualizacja sialilacji wewnątrzkomórkowej za pomocą chemii kliknięć i mikroskopii ekspansyjnej

Przedstawiamy tutaj szczegółowy protokół łączący metody kriofiksacji i mikroskopii ekspansyjnej (Cryo-ExM), umożliwiający obrazowanie w wysokiej rozdzielczości z zachowaniem strukturalnym dostosowanym do różnych próbek biologicznych. Próbki biologiczne są zamrażane, osadzane w polimerze puchniącym, denaturowane, rozszerzane i znakowane immunosystemowo, co umożliwia obrazowanie o nadrozdzielczości za pomocą standardowych mikroskopów świetlnych.

Mikroskopia ekspansyjna: Obrazowanie fluorescencyjne o wysokiej rozdzielczości za pomocą konwencjonalnego mikroskopu

Poznaj mikroskopię ekspansywną do obrazowania w superrozdzielczości całych zarodków Drosophila. Ta metoda pozwala ominąć granicę dyfrakcji bez specjalistycznego sprzętu.

Wykorzystanie mikroskopii ekspansywnej do fizycznego powiększenia całych zarodków Drosophila w celu obrazowania w superrozdzielczości (Wideo) | JoVE Journal

Wykorzystanie mikroskopii ekspansywnej do fizycznego powiększenia całych zarodków Drosophila w celu obrazowania w superrozdzielczości

Przeglądaj więcej filmów