Wykorzystanie mikroskopii ekspansywnej do fizycznego powiększenia całych zarodków Drosophila w celu obrazowania w superrozdzielczości

Protokół ten może być wdrożony w większości laboratoriów biologii rozwoju przełyku, umożliwiając badaczom, którzy nie mają dostępu do mikroskopów o super rozdzielczości, tworzenie obrazów w super rozdzielczości. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona naukowcom ominąć granicę dyfrakcji konwencjonalnej mikroskopii konfokalnej bez konieczności stosowania mikroskopu o wysokiej rozdzielczości poprzez rozszerzanie samej próbki. Protokół ten będzie korzystny dla osób badających, w jaki sposób lokalizacja białek wpływa na morfologię lub funkcję komórek w nienaruszonych zarodkach, szczególnie gdy białka te są zorganizowane w złożone struktury lub sieci subkomórkowe.

Najczęstszym problemem, z jakim spotykają się ludzie, jest utrata zarodków w trakcie trwania protokołu. Zaleca się nałożenie wielu warstw poli-L-lizyny, aby mocno przylegać do zarodków. Po zarodkach weź sześciocentymetrową plastikową podstawę szalki Petriego wypełnioną w połowie 3% agarem.

Naciąć prostokąt o wymiarach pięć na trzy centymetry w agarze za pomocą żyletki lub skalpela. Usuń płytę agarową za pomocą małej szpatułki laboratoryjnej. Następnie odwróć podstawę szalki Petriego, połóż ją na ławce i umieść płytę agarową na wierzchu odwróconej płytki

Zdejmij pokrywkę z szalki Petriego i upewnij się, że jest sucha. Za pomocą rękawiczek przymocuj kawałek taśmy dwustronnej do wewnętrznej strony pokrywy. Wyjąć fiolki zawierające powlekane i utrwalone zarodki z wytrząsarki i umieścić je pionowo na stole warsztatowym.

Pozwól, aby faza organiczna i wodna się rozdzieliły. Prawidłowo utrwalone zarodki powinny pozostać na styku. Całkowicie usuń dolną fazę wodną za pomocą pipety Pasteura i pipety P200.

Użyj szklanej pipety Pasteura wyposażonej w lateksową bańkę, aby przenieść utrwalone zarodki na płytę agarową w wielu małych partiach, tak aby nie przylegały do wnętrza pipety. Gdy zarodki znajdą się na płycie agarowej, użyj pipetera P200, aby usunąć pozostały heptan w pobliżu zarodków. Teraz upuść dwustronną pokrywkę taśmy na płytę agarową z wysokości dwóch centymetrów, aby przykleić zarodki do taśmy.

Delikatnie zdejmij pokrywkę z płyty agarowej, połóż ją do góry nogami na ławce i dodaj tyle PBS Tween, aby przykryć zarodki w pokrywce. Aby pobrać pożądane zarodki, użyj stereoskopowego mikroskopu preparacyjnego o 100-krotnym powiększeniu z pośrednim oświetleniem. Nakłuj błonę witelinową w pobliżu przedniego lub tylnego końca zarodka cienką szklaną igłą, aby ją opróżnić i uwolnić ciśnienie.

Użyj cienkich kleszczyków lub metalowej sondy, aby delikatnie wypchnąć zarodek przez otwór z błoną witelinową nadal przyklejoną do dwustronnej taśmy. Pozostaw niepożądane zarodki na taśmie. Okresowo używaj szklanej pipety Pasteura, aby zebrać unoszący się w powietrzu zarodek dewitellinizowany i przenieść go do 1,5-mililitrowej probówki do mikrofugi.

Przygotuj roztwór PDMS w stożkowej probówce o pojemności 50 mililitrów i utwórz zrównoważoną probówkę, dodając odpowiednią ilość wody do drugiej 50-mililitrowej rurki stożkowej. Odwirować roztwór PDMS o sile 500G przez trzy minuty w temperaturze 15 stopni Celsjusza. Następnie wlej go do 10-centymetrowej szalki Petriego na głębokość jednego milimetra.

Pozostaw roztwór PDMS do zestalenia się przez noc w temperaturze 55 stopni Celsjusza. Po zestaleniu się płyty PDMS naciąć kwadratowe obszary nieco mniejsze niż szkiełko nakrywkowe o wymiarach 22 na 22 milimetry za pomocą skalpela. Wewnątrz każdego kwadratu naciąć i usunąć kwadratową studzienkę o szerokości ośmiu milimetrów.

przenieść każdy kwadratowy PDMS dobrze na szkiełko nakrywkowe o wymiarach 22 na 22 milimetry i mocno go przykleić. Aby przykleić zarodki do szkiełek nakrywkowych, nałóż wystarczającą ilość 0,1% poli-L-lizyny, aby pokryć powierzchnię szkiełka nakrywkowego wewnątrz każdej studzienki i umieść je w inkubatorze o temperaturze 55 stopni Celsjusza do wyschnięcia. Krótko opłucz zarodki i PBS, aby usunąć detergent Tween.

Następnie przenieś więcej niż 10 zarodków do każdej studzienki pokrytej poli-L-lizyną. Pozwól zarodkom osiąść na dnie studzienek. Usuń nadmiar płynu z przylegających zarodków za pomocą pipety Pasteura i natychmiast przejdź do następnego kroku.

Podczas gdy zarodki znajdują się w roztworze monomeru, przygotuj roztwór żelujący, aby przykryć studzienki PDMS. Rozcieńczyć utleniacz katalityczny świeżo z proszku. Połącz 3 920 mikrolitrów roztworu monomeru z 60 mikrolitrami 10% TEMED i 20 mikrolitrami 1%TEMPO.

Podziel roztwór żelujący na 125 mikrolitrów podwielokrotności na wiele probówek PCR. Usunąć roztwór monomeru ze studzienek PDMS za pomocą odkurzacza lub pipetera, uważając, aby nie zakłócić pracy zarodków. Dodaj pięć mikrolitrów APS do jednej z probówek PCR zawierających roztwór żelujący, aby zainicjować polimeryzację.

Szybko rozprowadź roztwór żelujący polimeryzujący między trzema dołkami. Powtarzaj to, aż wszystkie dołki i zarodki zostaną pokryte. Pozostaw próbki na żelowanie przez 1,5 do 2,5 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Grubsze hydrożele będą potrzebowały więcej czasu, aby zakończyć polimeryzację i zestalenie. Często mieszaj hydrożele, aby monitorować polimeryzację. Po zestaleniu hydrożele nie będą się poruszać.

Po żelowaniu oderwij studzienki PDMS od szkiełka nakrywkowego, nie naruszając hydrożeli. Przenieś hydrożele pojedynczo do studzienek płytki sześciodołkowej. Hydrożele mogą nieznacznie rozszerzać się podczas trawienia.

Całkowicie przykryj żele buforem wytrawiającym. 30 mililitrów buforu wytrawiającego wystarcza do pokrycia ich w sześciodołkowej płytce i inkubacji przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po strawieniu przenieś hydrożele na sześciocentymetrową szalkę Petriego i napełnij ją wodą dejonizowaną, aby się rozszerzyła.

W tym momencie hydrożele mogą oderwać się od szkiełek nakrywkowych i rozszerzyć się czterokrotnie w wymiarze liniowym. Za pomocą pipety Pasteura usuń jak najwięcej wody z szalki Petriego, aby zminimalizować ruch żeli podczas obchodzenia się z nimi. Manewruj ekspandowanymi żelami z zarodkami na dolnej powierzchni na dużym szkiełku nakrywkowym w celu obrazowania.

Zamontuj każde szkiełko nakrywkowe z żelem na obiektywie odwróconego skaningowego mikroskopu konfokalnego. Po zlokalizowaniu odpowiednio ustawionych i zorientowanych próbek przełączono się na obiektyw zanurzony w oleju lub wodzie o dużym powiększeniu, aby obrazować w wysokiej rozdzielczości. Pomiar długości zarodka wzdłuż osi od głowy do ogona pod obiektywem 10x wykazał, że nierozszerzone zarodki obejmowały około połowy pola widzenia, podczas gdy rozszerzone zarodki obejmowały około dwóch pełnych pól widzenia.

Średnia długość od głowy do ogona nierozszerzonych zarodków kontrolnych wynosiła 398,8 mikrometrów. W przypadku eksperymentów pierwszego, drugiego i trzeciego średnia długość zarodka wynosiła odpowiednio 4,0-krotność, 4,7-krotność i 4,9-krotność. W próbie kontrolnej komórki w segmencie szczęki miały średnią szerokość 4,76 mikrometra.

W rozszerzonych próbkach komórki w segmencie szczęki miały średnią szerokość 19,10 mikrometrów, co oznacza 4,0-krotne rozszerzenie. Cytoszkielet aktomiozyny zobrazowano w nierozszerzonej kontroli w porównaniu z rozszerzonymi zarodkami, ulegającymi zbieżnemu wydłużeniu. Wyglądały jak pojedyncza linia, w której spotykały się sąsiednie komórki.

Natomiast w rozszerzonych zarodkach w stadium siódmym można było zaobserwować równoległe linie miozyny drugiej na połączeniach komórkowych, reprezentujące pule białek korowych w sąsiednich komórkach. W nierozszerzonych zarodkach w stadium szóstym mitochondria oznaczone streptawidyną wyglądały jak heterogeniczna cytoplazmatyczna mgła bez żadnych wyraźnych szczegółów subkomórkowych. Jednak w rozszerzonych zarodkach liczne punkty były rozpoznawalne w cytoplazmie, prawdopodobnie reprezentując rozdrobnione mitochondria lub części sieci mitochondrialnej.

Jedną z ważnych rzeczy, o których należy pamiętać podczas próby tej procedury, jest ochrona zarodków przed nadmierną ekspozycją na światło po wtórnej inkubacji przeciwciał.