Name: Skuteczny protokół oczyszczania do badania rozwoju nasion pomidora (Solanum lycopersicum L.) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-07T14:15:00.000+00:00
Duration: 6 min 26 s
Description: Poznaj protokół oczyszczania nasion pomidora Solanum lycopersicum do obserwacji embriogenezy. Metoda z użyciem podchlorynu sodu umożliwia wizualizację struktur zarodkowych we wczesnych, środkowych i późnych stadiach rozwoju.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy są wdzięczni dr Jie Le i dr Xiufen Song za ich pomocne sugestie dotyczące mikroskopii kontrastowej z interferencją różnicową i konwencjonalnej metody oczyszczania. Badania te zostały sfinansowane przez Chińską Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych (31870299) oraz Stowarzyszenie Promocji Innowacji Młodzieży Chińskiej Akademii Nauk. Rysunek 2 został utworzony za pomocą BioRender.com.

1. Przygotowanie roztworów
<ol>
	<li>Przygotuj utrwalacz FAA, dodając 2,5 ml 37% formaldehydu, 2,5 ml lodowatego kwasu octowego i 45 ml 70% etanolu w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml. Sproszkować i przechowywać w temperaturze 4 °C. Świeżo przygotować utrwalacz FAA tuż przed użyciem. 
	UWAGA: 37% formaldehyd jest i potencjalnie rakotwórczy w przypadku narażenia lub wdychania. Utrwalacz musi być wykonywany w dygestoriach przy użyciu odpowiedniego wyposażenia ochrony osobistej.</li>
	<li>Przygotuj roztwór klarujący, dodając 5 ml 100% glicerolu, 40 g hydratu chloralu i 10 ml wody destylowanej w szklanej butelce o pojemności 100 ml owiniętej folią aluminiową. Rozpuścić za pomocą mieszadła magnetycznego przez noc w temperaturze pokojowej. Przygotowany roztwór można przechowywać w temperaturze 4 °C do 6 miesięcy. 
	UWAGA: Hydrat chloralu jest rakotwórczy i ma ostry zapach. Eksperyment należy przeprowadzić w dygestorium i nosić odpowiednie środki ochrony osobistej. Hydrat chloralu łatwo rozpływa się w powietrzu i nie powinien być przechowywany w dużych ilościach. Roztwór czyszczący może rozkładać się pod wpływem światła i należy go trzymać z dala od światła.</li>
	<li>Przygotuj roztwór dezynfekujący, dodając 10 ml 6% podchlorynu sodu, 40 ml wody destylowanej i 50 μl Tween-20 w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml. Wiruj i przechowuj w temperaturze pokojowej. Świeżo przygotuj roztwór dezynfekujący tuż przed użyciem. 
	UWAGA: Efektywna zawartość chloru w podchlorynie sodu, który był umieszczony przez długi czas, może się zmniejszyć, a zawartość 6% podchlorynu sodu można zwiększyć w zależności od rzeczywistej sytuacji. </li>
</ol>
2. Zbiór nasion
<ol>
	<li>Wysiewać nasiona pomidora (S. lycopersicum L. cv. Micro-Tom, patrz tabela materiałów) w kwadratowych miskach o wymiarach 8 cm × 8 cm × 8 cm wypełnionych mieszanką gleby i podłoża (v/v) w proporcji 1:1 (patrz tabela materiałów) i rosnąć w pomieszczeniu do wzrostu z okresami światła/ciemności 16/8 godzin w temperaturze 24 ± 2 °C (dzień) i 18 ± 2 °C (noc), 60%-70% wilgotności względnej i natężenie światła 4,000 luksów. Około 6 tygodni później rośliny weszły w fazę kwitnienia.</li>
	<li>Oznacz datę kwitnienia niezależnych kwiatów w miejscu kwitnienia (kąt rozwarcia płatków wynosi 90°) i zapisz dzień po kwitnieniu (DAF).</li>
	<li>Zbierz owoce z 3 do 23 sadzonek pomidora DAF i natychmiast połóż je na lodzie. Owoce (nasiona lub zarodki) należy podzielić od 3 do 23 DAF na wczesne (3-10 DAF), średnie (11-16 DAF) i późne (17-23 DAF) owoce (nasiona lub zarodki). 
	UWAGA: Nie zbieraj zbyt wielu owoców na raz i upewnij się, że nasiona z każdego owocu zostaną usunięte w ciągu 1 godziny w celu dalszej obróbki.</li>
	<li>W przypadku wczesnych owoców należy rozbić owoc i położyć go na szkiełku, a następnie ostrożnie zebrać świeże nasiona za pomocą precyzyjnych kleszczy pod mikroskopem stereoskopowym (patrz Tabela materiałów) przy powiększeniu od 1x do 4x. W przypadku średnich i późnych owoców rozbij owoce i bezpośrednio zbierz świeże nasiona za pomocą precyzyjnych kleszczy.</li>
</ol>
3. Oczyszczanie nasion za pomocą hydratów chloralu
UWAGA: Konwencjonalne35 i zoptymalizowane protokoły zostały porównane w tym badaniu pod kątem ich skuteczności usuwania nasion.
<ol>
	<li>Rozliczenie przy użyciu konwencjonalnego protokołu
	<ol>
		<li>Świeże nasiona (otrzymane w kroku 2.4) umieścić natychmiast w probówce wirówkowej o pojemności 2 ml zawierającej 1,5 ml utrwalacza FAA i inkubować na wytrząsarce orbitalnej (5 obr./min, patrz tabela materiałów) przez 4 godziny w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Odwodnić te nasiona w serii etanolu 70%, 95% i 100% etanolu (v/v) przez 1 godzinę każde na wytrząsarce orbitalnej (5 obr./min).</li>
		<li>Umieść nasiona w 3-5 kroplach roztworu klarującego (~100 μL) na szkiełku podstawowym i delikatnie przykryj próbkę szkiełkiem nakrywkowym. Zastąp szkiełko pojedynczym wklęsłym szkiełkiem (patrz Tabela materiałów) dla środkowych i późnych nasion.</li>
		<li>Szkiełka te lub pojedyncze szkiełka wklęsłe należy przechowywać w temperaturze pokojowej przez 30 minut (3 DAF), 2 godziny (6 DAF), 1 dzień (9 DAF), 3 dni (12 DAF) lub 7 dni (14 do 22 DAF) w zależności od etapów rozwoju materiału siewnego (im młodsze materiały, tym większa prędkość oczyszczania).</li>
		<li>Obserwuj próbki za pomocą mikroskopu z różnicowym kontrastem interferencyjnym (DIC) wyposażonego w kamerę cyfrową (patrz tabela materiałów) przy powiększeniu 10x, 20x i 40x. Dostosuj i zoptymalizuj jasność światła przechodzącego, suwak DIC i aperturę kondensora w czasie rzeczywistym dla każdej próbki i rejestruj obrazy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozliczanie przy użyciu zoptymalizowanego protokołu
	<ol>
		<li>Umieść świeże nasiona (uzyskane w kroku 2.4) bezpośrednio w probówce wirówkowej o pojemności 2 ml zawierającej 1,5 ml roztworu dezynfekującego (krok 1.3). 
		UWAGA: Liczba nasion zebranych w probówce wirówkowej o pojemności 2 ml różni się w zależności od etapu rozwoju nasion. Szczegółowe informacje przedstawiono w tabeli 1.</li>
		<li>Próbki należy inkubować na wytrząsarce orbitalnej (30 obr./min) w temperaturze pokojowej przez 3 do 50 minut, aż najbardziej wewnętrzny zarys okrywy nasiennej będzie wyraźnie widoczny. Wyrzuć roztwór dezynfekujący. 
		UWAGA: Wymagany czas inkubacji zależy od etapu rozwoju nasion (im późniejsze nasiona, tym dłuższy będzie czas inkubacji). Szczegółowe informacje przedstawiono w tabeli 1.</li>
		<li>W przypadku średnich i późnych nasion przenieś nasiona na szkiełko i usuń śluz z nasion za pomocą kleszczy i igły preparacyjnej pod mikroskopem stereoskopowym pod powiększeniem od 1x do 4x. Przenieś nasiona z powrotem do oryginalnej probówki wirówkowej za pomocą kleszczy. 
		UWAGA: Ten krok nie jest konieczny w przypadku wczesnych nasion.</li>
		<li>Umyj nasiona 5x w 1,5 ml wody dejonizowanej, za każdym razem 10 s. Wyrzuć wodę dejonizowaną.</li>
		<li>Dodać roztwór klarujący o stężeniu 2 × objętości nasion, a następnie poddać działaniu próżni przez 0 do 50 minut (tabela 1) za pomocą pompy próżniowej (patrz tabela materiałów). Przerywaną obróbkę próżniową przeprowadza się z każdym zabiegiem próżniowym przez 10 minut w odstępach 10 minut.</li>
		<li>Zastąp świeżym roztworem czyszczącym o stężeniu 2 × objętości nasion. Probówkę wirówkową o pojemności 2 ml zawierającą nasiona należy przechowywać w temperaturze pokojowej i chronić przed światłem przez 30 minut do 7 dni, aby ułatwić ich oczyszczenie (Tabela 1). Podczas inkubacji, w przypadku późnych zarodków, należy codziennie zastępować roztwór klarujący świeżym roztworem i poddawać nasiona obróbce próżniowej przez 10 minut.</li>
		<li>Przygotuj oczyszczone nasiona na szkiełkach podstawowych lub jednowklęsłych szkiełkach i obserwuj za pomocą mikroskopu DIC wyposażonego w kamerę cyfrową przy powiększeniu 10x, 20x i 40x. Dostosuj i zoptymalizuj jasność światła przechodzącego, suwak DIC i aperturę kondensora w czasie rzeczywistym dla każdej próbki i rejestruj obrazy.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>FAOSTAT. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.fao.org/faostat/en/#data/QCL">https://www.fao.org/faostat/en/#data/QCL</a> (2022).</li>
<li>Olmstead, R. G., Bohs, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+summary+of+molecular+systematic+research+in+Solanaceae%3A+1982-2006%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Horticulturae%22%5BJournal%5D)">A summary of molecular systematic research in Solanaceae: 1982-2006.</a> Acta Horticulturae. 745, 255-268 (2007).</li>
<li>Consortium, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tomato+genome+sequence+provides+insights+into+fleshy+fruit+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The tomato genome sequence provides insights into fleshy fruit evolution.</a> Nature. 485 (7400), 635-641 (2012).</li>
<li>Ebert, A. W., Chou, Y. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tomato+collection+maintained+by+AVRDC+-+The+World+Vegetable+Center%3A+composition%2C+germplasm+dissemination+and+use+in+breeding%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Horticulturae%22%5BJournal%5D)">The tomato collection maintained by AVRDC - The World Vegetable Center: composition, germplasm dissemination and use in breeding.</a> Acta Horticulturae. 1101, 169-176 (2015).</li>
<li>Hilhorst, H., Groot, S., Bino, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tomato+seed+as+a+model+system+to+study+seed+development+and+germination%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Botanica+Neerlandica%22%5BJournal%5D)">The tomato seed as a model system to study seed development and germination.</a> Acta Botanica Neerlandica. 47, 169-183 (1998).</li>
<li>Chaban, I. A., Gulevich, A. A., Kononenko, N. V., Khaliluev, M. R., Baranova, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+and+structural+details+of+tomato+seed+coat+formation%3A+A+different+functional+role+of+the+inner+and+outer+epidermises+in+unitegmic+ovule%5BTitle%5D)+AND+%22Plants-Basel%22%5BJournal%5D)">Morphological and structural details of tomato seed coat formation: A different functional role of the inner and outer epidermises in unitegmic ovule.</a> Plants-Basel. 11 (9), 1101(2022).</li>
<li>Iwahori, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+temperature+injuries+in+tomato.+V.+Fertilization+and+development+of+embryo+with+special+reference+to+the+abnormalities+caused+by+high+temperature%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+The+Japanese+Society+for+Horticultural+Science%22%5BJournal%5D)">High temperature injuries in tomato. V. Fertilization and development of embryo with special reference to the abnormalities caused by high temperature.</a> Journal of The Japanese Society for Horticultural Science. 35 (4), 379-386 (1966).</li>
<li>Xiao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+tomato+reproductive+developmental+landmarks+and+expression+profiles%2C+and+the+effect+of+SUN.+on+fruit+shape%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Integration of tomato reproductive developmental landmarks and expression profiles, and the effect of SUN. on fruit shape.</a> BMC Plant Biology. 9 (1), 49(2009).</li>
<li>Karssen, C. M., Haigh, A. M., Toorn, P., Weges, R. Physiological mechanisms involved in seed priming. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKarssen%2C+CM+%22Recent+advances+in+the+development+and+germination+of+seeds.+NATO+ASI+Series%22">Recent advances in the development and germination of seeds. NATO ASI Series</a>. Taylorson, R. B. 187, Springer. Boston, MA. (1989).</li>
<li>Nonogaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seed+dormancy+and+germination-emerging+mechanisms+and+new+hypotheses%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Seed dormancy and germination-emerging mechanisms and new hypotheses.</a> Frontiers in Plant Science. 5, 233(2014).</li>
<li>Doll, N. M., Ingram, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryo-endosperm+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Embryo-endosperm interactions.</a> Annual Review of Plant Biology. 73, 293-321 (2022).</li>
<li>Serrani, J. C., Fos, M., Atarés, A., García-Martínez, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+gibberellin+and+auxin+on+parthenocarpic+fruit+growth+induction+in+the+cv+micro-tom+of+tomato%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Plant+Growth+Regulation%22%5BJournal%5D)">Effect of gibberellin and auxin on parthenocarpic fruit growth induction in the cv micro-tom of tomato.</a> Journal of Plant Growth Regulation. 26 (3), 211-221 (2007).</li>
<li>Yang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+regulatory+gene+induces+trichome+formation+and+embryo+lethality+in+tomato%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">A regulatory gene induces trichome formation and embryo lethality in tomato.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108 (29), 11836-11841 (2011).</li>
<li>Goetz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+cis-12-oxo-phytodienoic+acid+in+tomato+embryo+development%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Role of cis-12-oxo-phytodienoic acid in tomato embryo development.</a> Plant Physiology. 158 (4), 1715-1727 (2012).</li>
<li>Ko, H. Y., Ho, L. H., Neuhaus, H. E., Guo, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transporter+SlSWEET15+unloads+sucrose+from+phloem+and+seed+coat+for+fruit+and+seed+development+in+tomato%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Transporter SlSWEET15 unloads sucrose from phloem and seed coat for fruit and seed development in tomato.</a> Plant Physiology. 187 (4), 2230-2245 (2021).</li>
<li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clarifying+tissue+clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Clarifying tissue clearing.</a> Cell. 162 (2), 246-257 (2015).</li>
<li>Kurihara, D., Mizuta, Y., Sato, Y., Higashiyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ClearSee%3A+A+rapid+optical+clearing+reagent+for+whole-plant+fluorescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">ClearSee: A rapid optical clearing reagent for whole-plant fluorescence imaging.</a> Development. 142 (23), 4168-4179 (2015).</li>
<li>Vieites-Prado, A., Renier, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+clearing+and+3D+imaging+in+developmental+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Tissue clearing and 3D imaging in developmental biology.</a> Development. 148 (18), (2021).</li>
<li>Kwiatkowska, M., Kadłuczka, D., Wędzony, M., Dedicova, B., Grzebelus, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Refinement+of+a+clearing+protocol+to+study+crassinucellate+ovules+of+the+sugar+beet+%28Beta+vulgaris+L.%2C+Amaranthaceae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">Refinement of a clearing protocol to study crassinucellate ovules of the sugar beet (Beta vulgaris L., Amaranthaceae).</a> Plant Methods. 15, 71(2019).</li>
<li>Ponitka, A., Ślusarkiewicz-Jarzina, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleared-ovule+technique+used+for+rapid+access+to+early+embryo+development+in+Secale+cereale+%C3%97+Zea+mays+crosses%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biologica+Cracoviensia.+Series+Botanica%22%5BJournal%5D)">Cleared-ovule technique used for rapid access to early embryo development in Secale cereale × Zea mays crosses.</a> Acta Biologica Cracoviensia. Series Botanica. 46, 133-137 (2014).</li>
<li>Ceccato, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+control+of+PIN1+is+required+for+female+gametophyte+development+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Maternal control of PIN1 is required for female gametophyte development in Arabidopsis.</a> PLoS One. 8 (6), 66148(2013).</li>
<li>Wilkinson, L. G., Tucker, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimised+clearing+protocol+for+the+quantitative+assessment+of+sub-epidermal+ovule+tissues+within+whole+cereal+pistils%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">An optimised clearing protocol for the quantitative assessment of sub-epidermal ovule tissues within whole cereal pistils.</a> Plant Methods. 13, 67(2017).</li>
<li>Hedhly, A., Vogler, H., Eichenberger, C., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-mount+clearing+and+staining+of+Arabidopsis+flower+organs+and+Siliques%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Whole-mount clearing and staining of Arabidopsis flower organs and Siliques.</a> Journal of Visualized Experiments. (134), e56441(2018).</li>
<li>Creff, A., Brocard, L., Ingram, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mechanically+sensitive+cell+layer+regulates+the+physical+properties+of+the+Arabidopsis+seed+coat%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A mechanically sensitive cell layer regulates the physical properties of the Arabidopsis seed coat.</a> Nature Communications. 6, 6382(2015).</li>
<li>Yang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+B3+domain-containing+transcription+factor+ZmABI19+coordinates+expression+of+key+factors+required+for+maize+seed+development+and+grain+filling%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">The B3 domain-containing transcription factor ZmABI19 coordinates expression of key factors required for maize seed development and grain filling.</a> Plant Cell. 33 (1), 104-128 (2021).</li>
<li>Anderson, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hoyer%27s+solution+as+a+rapid+permanent+mounting+medium+for+bryophytes%5BTitle%5D)+AND+%22Bryologist%22%5BJournal%5D)">Hoyer's solution as a rapid permanent mounting medium for bryophytes.</a> Bryologist. 57 (3), 242-244 (1954).</li>
<li>Herr, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+clearing-squash+technique+for+the+study+of+ovule+development+in+angiosperms%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Botany%22%5BJournal%5D)">A new clearing-squash technique for the study of ovule development in angiosperms.</a> American Journal of Botany. 58 (8), 785-790 (1971).</li>
<li>Yadegari, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+differentiation+and+morphogenesis+are+uncoupled+in+Arabidopsis+raspberry+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Cell differentiation and morphogenesis are uncoupled in Arabidopsis raspberry embryos.</a> The Plant Cell. 6 (12), 1713-1729 (1995).</li>
<li>Grini, P. E., Jurgens, G., Hulskamp, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryo+and+endosperm+development+is+disrupted+in+the+female+gametophytic+capulet+mutants+of+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Embryo and endosperm development is disrupted in the female gametophytic capulet mutants of Arabidopsis.</a> Genetics. 162 (4), 1911-1925 (2002).</li>
<li>Kataoka, K., Uemachi, A., Yazawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fruit+growth+and+pseudoembryo+development+affected+by+uniconazole%2C+an+inhibitor+of+gibberellin+biosynthesis%2C+in+pat-2+and+auxin-Induced+parthenocarpic+tomato+fruits%5BTitle%5D)+AND+%22Scientia+Horticulturae%22%5BJournal%5D)">Fruit growth and pseudoembryo development affected by uniconazole, an inhibitor of gibberellin biosynthesis, in pat-2 and auxin-Induced parthenocarpic tomato fruits.</a> Scientia Horticulturae. 98 (1), 9-16 (2003).</li>
<li>de Jong, M., Wolters-Arts, M., Feron, R., Mariani, C., Vriezen, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Solanum+lycopersicum+auxin+response+factor+7+%28SlARF7%29+regulates+auxin+signaling+during+tomato+fruit+set+and+development%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">The Solanum lycopersicum auxin response factor 7 (SlARF7) regulates auxin signaling during tomato fruit set and development.</a> Plant Journal. 57 (1), 160-170 (2009).</li>
<li>Roth, M., Florez-Rueda, A. M., Paris, M., Stadler, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wild+tomato+endosperm+transcriptomes+reveal+common+roles+of+genomic+imprinting+in+both+nuclear+and+cellular+endosperm%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Wild tomato endosperm transcriptomes reveal common roles of genomic imprinting in both nuclear and cellular endosperm.</a> Plant Journal. 95 (6), 1084-1101 (2018).</li>
<li>Orsi, C. H., Tanksley, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+variation+in+an+ABC+transporter+gene+associated+with+seed+size+evolution+in+tomato+species%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Natural variation in an ABC transporter gene associated with seed size evolution in tomato species.</a> PLoS Genetics. 5 (1), 1000347(2009).</li>
<li>Herridge, R. P., Day, R. C., Baldwin, S., Macknight, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+analysis+of+seed+size+in+Arabidopsis+for+mutant+and+QTL+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid analysis of seed size in Arabidopsis for mutant and QTL discovery.</a> Plant Methods. 7 (1), 3(2011).</li>
<li>Xu, T. T., Ren, S. C., Song, X. F., Liu, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CLE19+expressed+in+the+embryo+regulates+both+cotyledon+establishment+and+endosperm+development+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">CLE19 expressed in the embryo regulates both cotyledon establishment and endosperm development in Arabidopsis.</a> Journal of Experimental Botany. 66 (17), 5217-5227 (2015).</li>
<li>Ghadiri Alamdari, N., Salmasi, S., Almasi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tomato+seed+mucilage+as+a+new+source+of+biodegradable+film-forming+material%3A+effect+of+glycerol+and+cellulose+nanofibers+on+the+characteristics+of+resultant+films%5BTitle%5D)+AND+%22Food+and+Bioprocess+Technology%22%5BJournal%5D)">Tomato seed mucilage as a new source of biodegradable film-forming material: effect of glycerol and cellulose nanofibers on the characteristics of resultant films.</a> Food and Bioprocess Technology. 14 (12), 2380-2400 (2021).</li>
<li>Gardner, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+of+botanical+clearing+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Stain+Technology%22%5BJournal%5D)">An overview of botanical clearing technique.</a> Stain Technology. 50 (2), 99-105 (1975).</li>
<li>Beresniewicz, M. M., Taylor, A. G., Goffinet, M. C., Terhune, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+location+of+a+semipermeable+layer+in+seed+coats+of+leek+and+onion+%28Liliaceae%29%2C+tomato+and+pepper+%28Solanaceae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Seed+Science+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Characterization and location of a semipermeable layer in seed coats of leek and onion (Liliaceae), tomato and pepper (Solanaceae).</a> Seed Science and Technology. 23 (1), 123-134 (1995).</li>
<li>Stebbins, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bleaching+and+clearing+method+for+plant+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A bleaching and clearing method for plant tissues.</a> Science. 87 (2245), 21-22 (1938).</li>
<li>Debenham, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+technique+for+the+microscopic+examination+of+the+xylem+of+whole+plants+or+plant+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Botany%22%5BJournal%5D)">A modified technique for the microscopic examination of the xylem of whole plants or plant organs.</a> Annals of Botany. 3 (2), 369-373 (1939).</li>
<li>Morley, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+clearing+of+plant+leaves+by+NaOH+in+association+with+oxygen%5BTitle%5D)+AND+%22Stain+Technology%22%5BJournal%5D)">Accelerated clearing of plant leaves by NaOH in association with oxygen.</a> Stain Technology. 43 (6), 315-319 (1968).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

W porównaniu z cięciem mechanicznym, technologia oczyszczania jest bardziej korzystna w przypadku obrazowania trójwymiarowego, ponieważ zachowuje integralność tkanek roślinnych lub organów16. Konwencjonalne protokoły oczyszczania są często ograniczone do małych próbek ze względu na łatwiejszą penetrację roztworów chemicznych. Nasiona pomidora są problematyczną próbką do oczyszczania tkanek, ponieważ są około 70 razy większe niż nasiona Arabidopsis i mają więcej barier przepuszczalności. O...

Pomidor (S. lycopersicum L.) jest jedną z najważniejszych upraw warzywnych na świecie, z plonem 186,8 miliona ton mięsistych owoców z 5,1 miliona hektarów w 2020 roku1. Należy do licznej rodziny psiankowatych (Solanaceae), obejmującej około 2716 gatunków2, w tym wiele komercyjnie istotnych upraw, takich jak bakłażan, papryka, ziemniak i tytoń. Uprawny pomidor jest gatunkiem diploidalnym (2n = 2x = 24) o rozmiarze genomu wynoszącym około 900 Mb3. Przez długi czas podejmowano ogromne wysiłki w celu udomowienia i hodowli pomidora, selekcjonując pożądane cechy z dzikich gatunków Solanum spp. W Tomato Genetics Resource Center wymieniono ponad 5000 akcesji pomidora, a w zasobach genoplazmy na całym świecie przechowywanych jest ponad 80 000 próbek pomidorów4. Roślina pomidora w warunkach szklarniowych jest wieloletnia i rozmnaża się przez nasiona. Dojrzałe nasiono pomidora składa się z trzech głównych części: w pełni wykształconego embrionu, pozostałości endospermy typu komórkowego oraz twardej łupiny nasiona5,6 (Rycina 1A). Po podwójnym zapłodnieniu rozwój endospermy typu komórkowego poprzedza rozwój zygot. Około 5-6 dni po kwitnieniu (DAF) po raz pierwszy obserwuje się dwukomórkowy proembrion, gdy endosperma składa się z sześciu do ośmiu jąder7. U Solanum pimpinellifolium embrion osiąga swój ostateczny rozmiar po 20 DAF, a nasiona stają się zdolne do kiełkowania po 32 DAF8. W miarę rozwoju embrionu endosperma jest stopniowo wchłaniana i w nasionu pozostaje jedynie niewielka jej ilość. Pozostała endosperma składa się z endospermy mikropylnej otaczającej wierzchołek radikuli oraz endospermy bocznej w pozostałej części nasiona9,10. Zewnętrzna łupina nasiona rozwija się z pogrubionej i zdrewniałej zewnętrznej epidermy łupiny nasiennej, która wraz z martwymi warstwami pozostałości łupiny tworzy twardą powłokę chroniącą embrion i endospermę5.
<img alt="Schemat przekroju zarodka; struktura nasiona z merystemem wierzchołkowym, liścieniami, korzeniem zakrębkowym i endospermą." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64445/64445fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Schematyczna reprezentacja dojrzałego nasiona Solanum lycopersicum oraz Arabidopsis thaliana. (A) Anatomia podłużna dojrzałego nasiona pomidora. (B) Anatomia podłużna dojrzałego nasiona Arabidopsis. Dojrzałe nasiono pomidora jest około 70 razy większe od nasiona Arabidopsis. Paski skali = (A) 400 µm, (B) 100 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64445/64445fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Produkcja wysokiej jakości nasion pomidora zależy od koordynacji między embrionem, endospermem a macierzystymi komponentami nasion11. Analiza kluczowych genów i sieci w rozwoju nasion wymaga dokładnego i pełnego rejestrowania fenotypowego nasion mutantów. Konwencjonalne techniki zatapiania i krojenia, takie jak przekroje półcienkie i przekroje parafinowe, są szeroko stosowane w przypadku nasion pomidora w celu obserwacji lokalnych i drobniejszych struktur embrionu12,13,14,15. Jednak analiza rozwoju nasion na podstawie cienkich przekrojów jest zazwyczaj żmudna i pozbawiona rozdzielczości przestrzennej w osi z. W porównaniu z nimi, klarowanie tkanek jest szybką i wydajną metodą pozwalającą precyzyjnie określić etap rozwoju wad embrionu, które najczęściej występują16. Metoda klarowania zmniejsza nieprzezroczystość tkanki wewnętrznej poprzez ujednolicenie współczynnika załamania światła za pomocą jednego lub większej liczby czynników biochemicznych16. Klarowanie całych tkanek umożliwia obserwację struktury tkanki roślinnej bez niszczenia jej integralności, a połączenie technologii klarowania z obrazowaniem trójwymiarowym stało się idealnym rozwiązaniem do pozyskiwania informacji o morfologii i stanie rozwojowym organu roślinnego17,18. Na przestrzeni lat techniki klarowania nasion były stosowane u różnych gatunków roślin, w tym Arabidopsis thaliana, Hordeum vulgare oraz Beta vulgaris19,20,21,22,23. Wśród nich technologia klarowania całych zalążków okazała się wydajnym podejściem do badania rozwoju nasion Arabidopsis, ze względu na ich mały rozmiar, 4-5 warstwy komórek łupiny nasiennej oraz endosperm typu jądrowego24,25. Dzięki ciągłemu aktualizowaniu różnych mieszanin klarujących, takich jak wprowadzenie roztworu Hoyera26, struktury wewnętrzne zalążka jęczmienia były obrazowane z wysokim stopniem przejrzystości, mimo że jego endosperm stanowi główną masę nasion. Embriogenezę buraka cukrowego można obserwować poprzez klarowanie połączone z traktowaniem próżniowym i zmiękczaniem kwasem solnym19. Niemniej jednak, w przeciwieństwie do wspomnianych wyżej gatunków, nie zgłoszono obserwacji embriologicznych nasion pomidora z wykorzystaniem protokołów klarowania. Uniemożliwia to szczegółowe badanie rozwoju embrionalnego i nasiennego pomidorów.
Hydrat chloralu jest powszechnie stosowany jako roztwór przejaśniający, który umożliwia obrazowanie zanurzonych tkanek i komórek w różnych płaszczyznach optycznych, zachowując przy tym w znacznym stopniu komórki lub komponenty tkankowe27,28,29. Protokół przejaśniania oparty na hydracie chloralu był z sukcesem stosowany do przejaśniania całych nasion w celu obserwacji zarodka i endospermy Arabidopsis21,28. Jednakże roztwór ten nie jest efektywny w przejaśnianiu nasion pomidora, które są bardziej nieprzepuszczalne niż nasiona Arabidopsis. Bariery fizyczne obejmują: (1) okrywę nasion pomidora, która posiada prawie 20 warstw komórek w 3 do 15 DAF30,31, (2) endospermę pomidora typu komórkowego, a nie jądrowego32, (3) nasiona pomidora, które są około 70 razy większe33,34 oraz (4) produkcję dużych ilości śluzu łupiny nasion, który blokuje penetrację odczynników przejaśniających i utrudnia wizualizację komórek zarodka.
Niniejszy raport przedstawia zoptymalizowaną metodę przejaśniania opartą na wodnym roztworze chloralu, przeznaczoną do przejaśniania całych nasion pomidora na różnych etapach rozwoju, co umożliwia głębokie obrazowanie procesu rozwoju zarodka (Rysunek 2).

<table><tbody><tr><td>1 000 i mikro; Pipeta L</td><td>GILSON</td><td>FA10006M</td><td></td></tr><tr><td>1 000 &mikro; L końcówki do pipet</td><td>Corning</td><td>T-1000-B</td><td></td></tr> 2 <tr><td>ml probówka wirówkowa</td><td>Axygen</td><td>MCT-200-C</td><td></td></tr><tr><td>37% formaldehyd</td><td>DAMAO</td><td>685-2013</td><td></td></tr><tr><td>5 000 &mikro; L pipeta</td><td>Eppendorf</td><td>3120000275</td><td></td></tr><tr><td>5 000 &mikro; L końcówki do pipet</td><td>biosharp</td><td>BS-5000-TL</td><td></td></tr><tr><td>50 ml probówka wirówkowa</td><td>Corning</td><td>430829</td><td></td></tr><tr><td>Absolutny etanol</td><td>BOYUAN</td><td>678-2002</td><td></td></tr><tr><td>Szklanka do butelek</td><td>Fisher</td><td>FB800-100</td><td></td></tr><tr><td>Hydrat chloralu</td><td>Meryer</td><td>M13315-100G</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko nakrywkowe</td><td>Mikroskop Leica</td><td>384200</td><td></td></tr><tr><td>DIC</td><td>Zeiss</td><td>Axio Imager A1</td><td>Powiększenie 10x, 20x i 40x</td></tr><tr><td>Środek dezynfekujący</td><td>QIKELONGAN</td><td>17-9185</td><td></td></tr><tr><td>Igła preparcyjna</td><td>Bioroyee</td><td>17-9140</td><td></td></tr><tr><td>Gleba</td><td>odżywcza do kwiatów Kleszcze FANGJIE</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>HAIOU</td><td>4-94</td><td></td></tr><tr><td>Lodowaty kwas octowy</td><td>BOYUAN</td><td>676-2007</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Solarbio</td><td>G8190</td><td></td></tr><tr><td>Mieszadło magnetyczne</td><td>IKA</td><td>RET basic</td><td></td></tr><tr><td>Micro-Tom</td><td>Tomato Genetics Resource Center</td><td>LA3911</td><td></td></tr><tr><td>Wytrząsarka orbitalna</td><td>QILINBEIER</td><td>QB-206</td><td></td></tr><tr><td>Podłoże siewne</td><td>PINDSTRUP</td><td>LV713/018-LV252</td><td>Przesiewanie: 0-10 mm</td></tr><tr><td>Pojedynczy wklęsły suwak</td><td>HUABODEYI</td><td></td><td></td>HBDY1895</tr><tr><td>Slajd</td><td>Leica</td><td>3800381</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td>Leica</td><td>S8 APO</td><td>Powiększenie od 1x do 4x</td></tr><tr><td>Folia aluminiowa</td><td>ZAOWUFANG</td><td>613</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Pompa próżniowa</td><td>SHIDING</td><td>SHB-III</td><td></td></tr><tr><td>Miernik wirów</td><td>Silogex</td><td>MX-S</td><td></td></tr></tbody></table>

skuteczny protokół oczyszczania do badania rozwoju nasion pomidora (solanum lycopersicum l.)

An Efficient Clearing Protocol for the Study of Seed Development in Tomato (Solanum lycopersicum L.)

Pomidor (Solanum lycopersicum L.) jest jedną z głównych upraw dochodowych na świecie. Nasiona pomidora są ważnym modelem do badania genetyki i biologii rozwoju podczas rozmnażania roślin. Wizualizacja drobniejszej struktury embrionalnej w nasionach pomidora jest często utrudniona przez śluz okrywy nasiennej, wielokomórkową powłokę warstwową i grubościenne bielmo, które należy rozwiązać przez pracochłonne osadzanie i sekcje. Prostszą alternatywą jest zastosowanie technik oczyszczania tkanek, które sprawiają, że nasiona stają się prawie przezroczyste za pomocą środków chemicznych. Chociaż konwencjonalne procedury oczyszczania pozwalają na głęboki wgląd w mniejsze nasiona z cieńszą okrywą nasienną, usuwanie nasion pomidorów nadal stanowi wyzwanie techniczne, zwłaszcza w późnych stadiach rozwojowych.
Prezentowany tutaj jest szybki i oszczędzający pracę protokół oczyszczania, który pozwala obserwować rozwój nasion pomidora od 3 do 23 dni po kwitnieniu, kiedy morfologia embrionalna jest prawie kompletna. Metoda ta łączy roztwór czyszczący na bazie wodzianu chloralu, szeroko stosowany u rzodkiewnika lekarskiego, z innymi modyfikacjami, w tym pominięciem utrwalania formaliny-acetoalkoholu (FAA), dodaniem podchlorynu sodu do nasion, usunięciem zmiękczonego śluzu okrywy nasiennej oraz myciem i obróbką próżniową. Metoda ta może być stosowana do skutecznego oczyszczania nasion pomidorów na różnych etapach rozwoju i jest przydatna w pełnym monitorowaniu procesu rozwojowego zmutowanych nasion z dobrą rozdzielczością przestrzenną. Ten protokół oczyszczania może być również stosowany do głębokiego obrazowania innych ważnych komercyjnie gatunków z rodziny Solanaceae.

Kiedy nasiona pomidora poddano przejrzystości metodą konwencjonalną, stosowaną w przypadku Arabidopsis, gęste komórki endospermy uniemożliwiały wizualizację wczesnych embrionów pomidora w 3. i 6. dniu po zapyleniu (DAF) (Rycina 3A,B). Wraz ze wzrostem całkowitej objętości embrionu, embrion w stadium globularnym był ledwie rozróżnialny w 9. dniu DAF (Rycina 3C). Jednak w miarę dalszego wzrostu wielkości nasiona jego przepuszczalność mala...

Nasiona pomidora są ważnym modelem do badania genetyki i biologii rozwoju podczas rozmnażania roślin. Protokół ten jest przydatny do oczyszczania nasion pomidorów na różnych etapach rozwoju w celu obserwacji drobniejszej struktury embrionalnej.

Skuteczny protokół oczyszczania do badania rozwoju nasion pomidora (Solanum lycopersicum L.)

Tomato (Solanum lycopersicum L.) is one of the major cash crops worldwide. The tomato seed is an important model for studying genetics and developmental ...

Ta metoda może pomóc w szybkim i bezproblemowym znalezieniu nieprawidłowych okresów rozwoju zarodków pomidorów. Główną zaletą tego protokołu jest zaprawianie nasion pomidora podchlorynem sodu, który stanowi podstawę do obserwacji zarodków pomidorów. Rozpocznij od chemicznego przygotowania i zbioru owoców Solanum lycopersicum od trzech do 23 dni po kwitnieniu lub DAF.Natychmiast połóż owoce na lodzie i podziel je na wczesne, średnie i późne, w zależności od dni po kwitnieniu. Połam wczesne owoce, połóż je na szkiełku i ostrożnie zbierz świeże nasiona precyzyjnymi kleszczami pod powiększeniem od 1x do 4x mikroskopu stereoskopowego. W przypadku średnich i późnych owoców rozbij owoce i bezpośrednio zbierz świeże nasiona za pomocą precyzyjnych kleszczy.W metodzie konwencjonalnej świeżo zebrane nasiona należy natychmiast przenieść do dwumililitrowej probówki wirówkowej zawierającej 1,5 mililitra utrwalacza FAA i umieścić probówkę na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 5 obr./min na cztery godziny w temperaturze pokojowej. Następnie odwodnić nasiona w 70%95% i 100% etanolu przez jedną godzinę na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 5 obr./min. Po zakończeniu umieść nasiona w trzech do pięciu kroplach roztworu klarującego znajdującego się na szkiełku i delikatnie przykryj je szkiełkiem nakrywkowym.Użyj pojedynczego wklęsłego szkiełka do średnich i późnych nasion. W zależności od etapów rozwoju nasion inkubuj je w temperaturze pokojowej w celu oczyszczenia. Po inkubacji obserwuj próbki za pomocą mikroskopu różnicowego kontrastu interferencyjnego lub mikroskopu DIC wyposażonego w kamerę cyfrową przy powiększeniu 10x, 20x i 40x.Dostosuj i zoptymalizuj jasność światła przechodzącego, suwak DIC i aperturę kondensora w czasie rzeczywistym dla każdej próbki i rejestruj obrazy. Przenieś świeże nasiona zebrane z połamanych owoców do dwumililitrowej probówki wirówkowej zawierającej 1,5 mililitra roztworu dezynfekującego. Próbki należy inkubować na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 30 obr./min przez trzy do 50 minut w temperaturze pokojowej.Gdy najbardziej wewnętrzny kontur okrywy nasiennej jest wyraźnie widoczny, wyrzuć roztwór dezynfekujący. W przypadku średnich i późnych nasion przenieś nasiona na szkiełko. Użyj kleszczy i igły preparującej, aby usunąć śluz nasienny pod powiększeniem od 1x do 4x mikroskopu stereoskopowego.Przenieś nasiona z powrotem do oryginalnej probówki wirówkowej za pomocą kleszczy. Umyj je pięć razy w 1,5 mililitra wody dejonizowanej przez 10 sekund każdy i wylej wodę dejonizowaną. Następnie dodaj podwójną objętość roztworu klarującego do nasion.W zależności od etapu wysiewu, poddać przerywaną obróbkę próżniową przez zero do 50 minut, z 10-minutowymi przerwami po każdej obróbce próżniowej wynoszącymi 10 minut. Po obróbce próżniowej wymień roztwór czyszczący. Aby ułatwić usuwanie nasion, umieść probówkę wirówkową chronioną przed światłem na 30 minut do siedmiu dni w temperaturze pokojowej.W przypadku późnych zarodków należy codziennie zastępować roztwór świeżym roztworem klarującym, a następnie poddawać nasiona obróbce próżniowej przez 10 minut. Umieść oczyszczone nasiona na szkiełku podstawowym lub pojedynczym wklęsłym szkiełku. Korzystając z mikroskopu DIC wyposażonego w kamerę cyfrową, dostosuj i zoptymalizuj jasność światła przechodzącego, suwak DIC i aperturę kondensora w czasie rzeczywistym dla każdej próbki i uchwyć obraz.W konwencjonalnej metodzie usuwania nasion S. lycopersicum gęste komórki bielma blokowały wizualizację wczesnych zarodków przy 3 i 6 DAF. Zmniejszona przepuszczalność podczas wzrostu nasion skutkowała rozmytymi obrazami po 9 DAF. Śluz nasienny i okrywa nasienna stopniowo stawały się gęstsze, co zapobiegało przenikaniu środków czyszczących począwszy od 13 DAF.Zarys zarodka wewnątrz 14 do 19 nasion DAF był bardzo niewyraźny, pomimo wydłużonego czasu leczenia do siedmiu dni. Struktura wewnętrzna w 22 nasionach DAF była całkowicie niewidoczna. Pozbawiony śluz okrywy nasiennej wytwarzany przez komórki naskórka okrywy nasiennej był widoczny od 13 DAF.Zaprawienie podchlorynem sodu umożliwiło wyraźną identyfikację wewnętrznej okrywy nasiennej i oderwanie większości przylegającego śluzu bez uszkodzenia nasion. W zoptymalizowanym protokole oczyszczania nasiona wykazały zadowalającą przezroczystość we wszystkich badanych stadiach rozwojowych. Zaobserwowano wyraźne warstwy komórkowe okrywy nasiennej przy 3 DAF, rozróżnialne komórki bielma przy 5 DAF, zarodek w kształcie pałeczki przy 7 DAF, stadium kuliste przy 9 DAF i stadium serca przy 11 DAF.W zoptymalizowanym protokole stopień zwijania się liścieni i merystemu wierzchołkowego pędów był bardzo łatwy do uchwycenia na różnych etapach rozwoju embrionalnego. Sterylizacja usuwa śluz z nasion i pigment okrywy nasiennej, co poprawia penetrację i wizualizację nasion. Obróbka próżniowa może przyspieszyć penetrację roztworu czyszczącego.

an-efficient-clearing-protocol-for-study-seed-development-tomato

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Analizator Pomidorów (Tomato Analyzer, TA) w sposób powtarzalny i dokładny określa cechy dwuwymiarowych kształtów oraz koloru. Opisano procedurę krok po kroku w celu uzyskania wysokiej jakości zdigitalizowanych obrazów owoców pomidora, analizy morfologiczne i kolorystyczne tych obrazów oraz kilka zastosowań z wykorzystaniem danych generowanych przez to oprogramowanie.

Tomato Analyzer: Przydatna aplikacja programistyczna do gromadzenia dokładnych i szczegółowych danych morfologicznych oraz kolorymetrycznych z obiektów dwuwymiarowych

Metoda Ice-Cap pozwala na hodowlę roślin w płytkach 96-dołkowych oraz niedestrukcyjne pobieranie tkanki korzenia z każdej siewki. DNA wyekstrahowane z tej tkanki korzenia może być wykorzystane w reakcjach genotypowania. Stwierdziliśmy, że metoda Ice-Cap sprawdza się w przypadku siewek Arabidopsis thaliana, pomidora oraz ryżu.

Ice-Cap: Metoda hodowli roślin Arabidopsis oraz pomidora w płytkach 96-dołkowych do genotypowania wysokoprzepustowego

Opisano dwie odrębne metody przesiewania roślin pod kątem infekcji nicielami okrągłymi (nematodami) tworzącymi narośla korzeniowe. Opisane podejścia obejmują wysokoprzepustowe badania z użyciem nematod w sposób niedestrukcyjny, co ułatwia wykorzystanie tych roślin w programach hodowlanych.

Przesiewy wysokoprzepustowe i niskoprzepustowe z wykorzystaniem nicieni korzeniowych Meloidogyne spp.

Źródło: Hassan, J. A., et al. Wysokoprzepustowa identyfikacja oporności na Pseudomonas syringae pv. Pomidor w pomidorze za pomocą testu powodziowego sadzonek. J. Vis. Exp. (2020).Ten film przedstawia metodę badań przesiewowych pod kątem oporności bakteryjnej w różnych odmianach pomidorów przy użyciu dziesięciodniowych sadzonek zaszczepionych zawiesiną bakteryjną. Wyjaśnia, w jaki sposób bakterie atakują aparaty szparkowe, dostarczają białka efektorowe w celu stłumienia odporności roślin oraz...

Test zalewania sadzonek w celu badania przesiewowego odporności bakteryjnej pomidorów

Tutaj prezentujemy wszechstronną metodę transformacji korzenia pomidora, a następnie inokulacji Ralstonia solanacearum, aby przeprowadzić prostą analizę genetyczną do badania bakteryjnej choroby więdnięcia.

Transformacja korzenia pomidora, a następnie inokulacja Ralstonia solanacearum w celu prostej analizy genetycznej bakteryjnej choroby więdnięcia

Test zalewania sadzonek ułatwia szybkie badanie odmian dzikich pomidorów pod kątem odporności na bakterię Pseudomonas syringae. Ten test, stosowany w połączeniu z testem wzrostu bakterii siewek, może pomóc w dalszym charakteryzowaniu podstawowej odporności na bakterię i może być wykorzystany do mapowania populacji w celu określenia genetycznych podstaw odporności.

Wysokoprzepustowa identyfikacja oporności na Pseudomonas syringae pv. Pomidor w pomidorze za pomocą testu powodziowego sadzonek

Tutaj prezentujemy prostą metodę bezpośredniej obserwacji i automatycznego pomiaru reakcji aparatów szparkowych na inwazję bakterii u Arabidopsis thaliana. Metoda ta wykorzystuje przenośne urządzenie do obrazowania aparatów szparkowych wraz z potokiem analizy obrazu przeznaczonym do obrazów liści zarejestrowanych przez urządzenie.

Bezpośrednia obserwacja i automatyczny pomiar reakcji aparatów szparkowych na Pseudomonas syringae pv. pomidor DC3000 w rzodkiewniku pospolitym (Arabidopsis thaliana)

Hodowle embrionalnych komórek siatkówki kurcząt stanowią cenne narzędzia do badania biologii fotoreceptorów. Opracowaliśmy skuteczną technikę transferu genów opartą na elektroporacji plazmidowej siatkówki ex ovo przed hodowlą. Technika ta znacznie zwiększa wydajność transfekcji w porównaniu z obecnie dostępnymi protokołami, dzięki czemu manipulacja genetyczna jest możliwa dla tego systemu.

Efektywny transfer genów w siatkówkach piskląt w badaniach pierwotnych hodowli komórkowych: podejście do elektroporacji ex-ovo

W tym badaniu opisujemy prostą metodę przeprowadzania analizy Evans Blue Dye (EBD) na larwach danio pręgowanego.  Technika ta jest potężnym narzędziem do charakteryzowania integralności mięśni szkieletowych i wyznaczania modeli dystrofii mięśniowej danio pręgowanego, a także jest cenną metodą opracowywania nowych metod terapeutycznych.

Analiza integralności mięśni szkieletowych larw danio pręgowanego za pomocą niebieskiego barwnika Evansa

Tutaj opisujemy rozwój i zastosowanie testu skurczu żelu do oceny funkcji skurczu w komórkach mezenchymalnych, które przeszły przejście nabłonkowo-mezenchymalne.

Opracowanie testu in vitro do oceny funkcji skurczowej komórek mezenchymalnych, które przeszły przejście nabłonkowo-mezenchymalne

Poznaj protokół oczyszczania nasion pomidora Solanum lycopersicum do obserwacji embriogenezy. Metoda z użyciem podchlorynu sodu umożliwia wizualizację struktur zarodkowych we wczesnych, środkowych i późnych stadiach rozwoju.

Skuteczny protokół oczyszczania do badania rozwoju nasion pomidora (Solanum lycopersicum L.)

Przeglądaj więcej filmów