Skuteczny protokół oczyszczania do badania rozwoju nasion pomidora (Solanum lycopersicum L.)

Ta metoda może pomóc w szybkim i bezproblemowym znalezieniu nieprawidłowych okresów rozwoju zarodków pomidorów. Główną zaletą tego protokołu jest zaprawianie nasion pomidora podchlorynem sodu, który stanowi podstawę do obserwacji zarodków pomidorów. Rozpocznij od chemicznego przygotowania i zbioru owoców Solanum lycopersicum od trzech do 23 dni po kwitnieniu lub DAF.

Natychmiast połóż owoce na lodzie i podziel je na wczesne, średnie i późne, w zależności od dni po kwitnieniu. Połam wczesne owoce, połóż je na szkiełku i ostrożnie zbierz świeże nasiona precyzyjnymi kleszczami pod powiększeniem od 1x do 4x mikroskopu stereoskopowego. W przypadku średnich i późnych owoców rozbij owoce i bezpośrednio zbierz świeże nasiona za pomocą precyzyjnych kleszczy.

W metodzie konwencjonalnej świeżo zebrane nasiona należy natychmiast przenieść do dwumililitrowej probówki wirówkowej zawierającej 1,5 mililitra utrwalacza FAA i umieścić probówkę na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 5 obr./min na cztery godziny w temperaturze pokojowej. Następnie odwodnić nasiona w 70%95% i 100% etanolu przez jedną godzinę na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 5 obr./min. Po zakończeniu umieść nasiona w trzech do pięciu kroplach roztworu klarującego znajdującego się na szkiełku i delikatnie przykryj je szkiełkiem nakrywkowym.

Użyj pojedynczego wklęsłego szkiełka do średnich i późnych nasion. W zależności od etapów rozwoju nasion inkubuj je w temperaturze pokojowej w celu oczyszczenia. Po inkubacji obserwuj próbki za pomocą mikroskopu różnicowego kontrastu interferencyjnego lub mikroskopu DIC wyposażonego w kamerę cyfrową przy powiększeniu 10x, 20x i 40x.

Dostosuj i zoptymalizuj jasność światła przechodzącego, suwak DIC i aperturę kondensora w czasie rzeczywistym dla każdej próbki i rejestruj obrazy. Przenieś świeże nasiona zebrane z połamanych owoców do dwumililitrowej probówki wirówkowej zawierającej 1,5 mililitra roztworu dezynfekującego. Próbki należy inkubować na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 30 obr./min przez trzy do 50 minut w temperaturze pokojowej.

Gdy najbardziej wewnętrzny kontur okrywy nasiennej jest wyraźnie widoczny, wyrzuć roztwór dezynfekujący. W przypadku średnich i późnych nasion przenieś nasiona na szkiełko. Użyj kleszczy i igły preparującej, aby usunąć śluz nasienny pod powiększeniem od 1x do 4x mikroskopu stereoskopowego.

Przenieś nasiona z powrotem do oryginalnej probówki wirówkowej za pomocą kleszczy. Umyj je pięć razy w 1,5 mililitra wody dejonizowanej przez 10 sekund każdy i wylej wodę dejonizowaną. Następnie dodaj podwójną objętość roztworu klarującego do nasion.

W zależności od etapu wysiewu, poddać przerywaną obróbkę próżniową przez zero do 50 minut, z 10-minutowymi przerwami po każdej obróbce próżniowej wynoszącymi 10 minut. Po obróbce próżniowej wymień roztwór czyszczący. Aby ułatwić usuwanie nasion, umieść probówkę wirówkową chronioną przed światłem na 30 minut do siedmiu dni w temperaturze pokojowej.

W przypadku późnych zarodków należy codziennie zastępować roztwór świeżym roztworem klarującym, a następnie poddawać nasiona obróbce próżniowej przez 10 minut. Umieść oczyszczone nasiona na szkiełku podstawowym lub pojedynczym wklęsłym szkiełku. Korzystając z mikroskopu DIC wyposażonego w kamerę cyfrową, dostosuj i zoptymalizuj jasność światła przechodzącego, suwak DIC i aperturę kondensora w czasie rzeczywistym dla każdej próbki i uchwyć obraz.

W konwencjonalnej metodzie usuwania nasion S. lycopersicum gęste komórki bielma blokowały wizualizację wczesnych zarodków przy 3 i 6 DAF. Zmniejszona przepuszczalność podczas wzrostu nasion skutkowała rozmytymi obrazami po 9 DAF. Śluz nasienny i okrywa nasienna stopniowo stawały się gęstsze, co zapobiegało przenikaniu środków czyszczących począwszy od 13 DAF.

Zarys zarodka wewnątrz 14 do 19 nasion DAF był bardzo niewyraźny, pomimo wydłużonego czasu leczenia do siedmiu dni. Struktura wewnętrzna w 22 nasionach DAF była całkowicie niewidoczna. Pozbawiony śluz okrywy nasiennej wytwarzany przez komórki naskórka okrywy nasiennej był widoczny od 13 DAF.

Zaprawienie podchlorynem sodu umożliwiło wyraźną identyfikację wewnętrznej okrywy nasiennej i oderwanie większości przylegającego śluzu bez uszkodzenia nasion. W zoptymalizowanym protokole oczyszczania nasiona wykazały zadowalającą przezroczystość we wszystkich badanych stadiach rozwojowych. Zaobserwowano wyraźne warstwy komórkowe okrywy nasiennej przy 3 DAF, rozróżnialne komórki bielma przy 5 DAF, zarodek w kształcie pałeczki przy 7 DAF, stadium kuliste przy 9 DAF i stadium serca przy 11 DAF.

W zoptymalizowanym protokole stopień zwijania się liścieni i merystemu wierzchołkowego pędów był bardzo łatwy do uchwycenia na różnych etapach rozwoju embrionalnego. Sterylizacja usuwa śluz z nasion i pigment okrywy nasiennej, co poprawia penetrację i wizualizację nasion. Obróbka próżniowa może przyspieszyć penetrację roztworu czyszczącego.