Skuteczny protokół oczyszczania do badania rozwoju nasion pomidora (Solanum lycopersicum L.)
September 7th, 2022
Nasiona pomidora są ważnym modelem do badania genetyki i biologii rozwoju podczas rozmnażania roślin. Protokół ten jest przydatny do oczyszczania nasion pomidorów na różnych etapach rozwoju w celu obserwacji drobniejszej struktury embrionalnej.
Ta metoda może pomóc w szybkim i bezproblemowym znalezieniu nieprawidłowych okresów rozwoju zarodków pomidorów. Główną zaletą tego protokołu jest zaprawianie nasion pomidora podchlorynem sodu, który stanowi podstawę do obserwacji zarodków pomidorów. Rozpocznij od chemicznego przygotowania i zbioru owoców Solanum lycopersicum od trzech do 23 dni po kwitnieniu lub DAF.
Natychmiast połóż owoce na lodzie i podziel je na wczesne, średnie i późne, w zależności od dni po kwitnieniu. Połam wczesne owoce, połóż je na szkiełku i ostrożnie zbierz świeże nasiona precyzyjnymi kleszczami pod powiększeniem od 1x do 4x mikroskopu stereoskopowego. W przypadku średnich i późnych owoców rozbij owoce i bezpośrednio zbierz świeże nasiona za pomocą precyzyjnych kleszczy.
W metodzie konwencjonalnej świeżo zebrane nasiona należy natychmiast przenieść do dwumililitrowej probówki wirówkowej zawierającej 1,5 mililitra utrwalacza FAA i umieścić probówkę na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 5 obr./min na cztery godziny w temperaturze pokojowej. Następnie odwodnić nasiona w 70%95% i 100% etanolu przez jedną godzinę na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 5 obr./min. Po zakończeniu umieść nasiona w trzech do pięciu kroplach roztworu klarującego znajdującego się na szkiełku i delikatnie przykryj je szkiełkiem nakrywkowym.
Użyj pojedynczego wklęsłego szkiełka do średnich i późnych nasion. W zależności od etapów rozwoju nasion inkubuj je w temperaturze pokojowej w celu oczyszczenia. Po inkubacji obserwuj próbki za pomocą mikroskopu różnicowego kontrastu interferencyjnego lub mikroskopu DIC wyposażonego w kamerę cyfrową przy powiększeniu 10x, 20x i 40x.
Dostosuj i zoptymalizuj jasność światła przechodzącego, suwak DIC i aperturę kondensora w czasie rzeczywistym dla każdej próbki i rejestruj obrazy. Przenieś świeże nasiona zebrane z połamanych owoców do dwumililitrowej probówki wirówkowej zawierającej 1,5 mililitra roztworu dezynfekującego. Próbki należy inkubować na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 30 obr./min przez trzy do 50 minut w temperaturze pokojowej.
Gdy najbardziej wewnętrzny kontur okrywy nasiennej jest wyraźnie widoczny, wyrzuć roztwór dezynfekujący. W przypadku średnich i późnych nasion przenieś nasiona na szkiełko. Użyj kleszczy i igły preparującej, aby usunąć śluz nasienny pod powiększeniem od 1x do 4x mikroskopu stereoskopowego.
Przenieś nasiona z powrotem do oryginalnej probówki wirówkowej za pomocą kleszczy. Umyj je pięć razy w 1,5 mililitra wody dejonizowanej przez 10 sekund każdy i wylej wodę dejonizowaną. Następnie dodaj podwójną objętość roztworu klarującego do nasion.
W zależności od etapu wysiewu, poddać przerywaną obróbkę próżniową przez zero do 50 minut, z 10-minutowymi przerwami po każdej obróbce próżniowej wynoszącymi 10 minut. Po obróbce próżniowej wymień roztwór czyszczący. Aby ułatwić usuwanie nasion, umieść probówkę wirówkową chronioną przed światłem na 30 minut do siedmiu dni w temperaturze pokojowej.
W przypadku późnych zarodków należy codziennie zastępować roztwór świeżym roztworem klarującym, a następnie poddawać nasiona obróbce próżniowej przez 10 minut. Umieść oczyszczone nasiona na szkiełku podstawowym lub pojedynczym wklęsłym szkiełku. Korzystając z mikroskopu DIC wyposażonego w kamerę cyfrową, dostosuj i zoptymalizuj jasność światła przechodzącego, suwak DIC i aperturę kondensora w czasie rzeczywistym dla każdej próbki i uchwyć obraz.
W konwencjonalnej metodzie usuwania nasion S. lycopersicum gęste komórki bielma blokowały wizualizację wczesnych zarodków przy 3 i 6 DAF. Zmniejszona przepuszczalność podczas wzrostu nasion skutkowała rozmytymi obrazami po 9 DAF. Śluz nasienny i okrywa nasienna stopniowo stawały się gęstsze, co zapobiegało przenikaniu środków czyszczących począwszy od 13 DAF.
Zarys zarodka wewnątrz 14 do 19 nasion DAF był bardzo niewyraźny, pomimo wydłużonego czasu leczenia do siedmiu dni. Struktura wewnętrzna w 22 nasionach DAF była całkowicie niewidoczna. Pozbawiony śluz okrywy nasiennej wytwarzany przez komórki naskórka okrywy nasiennej był widoczny od 13 DAF.
Zaprawienie podchlorynem sodu umożliwiło wyraźną identyfikację wewnętrznej okrywy nasiennej i oderwanie większości przylegającego śluzu bez uszkodzenia nasion. W zoptymalizowanym protokole oczyszczania nasiona wykazały zadowalającą przezroczystość we wszystkich badanych stadiach rozwojowych. Zaobserwowano wyraźne warstwy komórkowe okrywy nasiennej przy 3 DAF, rozróżnialne komórki bielma przy 5 DAF, zarodek w kształcie pałeczki przy 7 DAF, stadium kuliste przy 9 DAF i stadium serca przy 11 DAF.
W zoptymalizowanym protokole stopień zwijania się liścieni i merystemu wierzchołkowego pędów był bardzo łatwy do uchwycenia na różnych etapach rozwoju embrionalnego. Sterylizacja usuwa śluz z nasion i pigment okrywy nasiennej, co poprawia penetrację i wizualizację nasion. Obróbka próżniowa może przyspieszyć penetrację roztworu czyszczącego.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Nasienie pomidora służy jako kluczowy model do badania genetyki i biologii rozwoju w reprodukcji roślin. Ten protokół ułatwia oczyszczanie nasion pomidora na różnych etapach rozwoju, aby zbadać skomplikowaną strukturę zarodkową.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Genetyka
- Biologia rozwoju
- Reprodukcja roślin
Tło
- Nasienia pomidora są niezbędne do badania rozwoju zarodka roślin.
- Zrozumienie etapów rozwoju zarodka pomidora może ujawniać genetyczne informacje.
- Techniki oczyszczania poprawiają wizualizacje struktur zarodkowych.
- Leczenie hipochlorytem sodu jest kluczowe dla obserwacji zarodka.
Cel badania
- Aby zapewnić protokół oczyszczania nasion pomidora.
- Aby ułatwić obserwację zarodka pomidora na różnych etapach rozwoju.
- Aby pomóc badaczom w identyfikacji nienormalnych okresów rozwoju zarodka.
Stosowane metody
- Zbieranie owoców Solanum lycopersicum 3 do 23 dni po kwitnieniu.
- Dzielenie owoców na wczesne, średnie i późne kategorie w oparciu o dni po kwitnieniu.
- Używanie precyzyjnych kleszczy do zbierania świeżych nasion pod mikroskopem stereoskopowym.
- Leczenie nasion hipochlorytem sodu dla lepszej obserwacji.
Główne wyniki
- Protokół pozwala na jasną wizualizacje zarodka pomidora.
- Badacze mogą sprawnie identyfikować nienormalności rozwojowe.
- Różne etapy rozwoju zarodka można wyraźnie obserwować.
- Metoda jest prosta i skuteczna dla badań zarodkowych.
Wnioski
- Ten protokół jest cennym narzędziem dla badań nad biologią rozwoju roślin.
- Zwiększa rozumienie embriogenezy nasion pomidora.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tej metodzie, aby zbadać różnice genetyczne.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Efficient visualization of tomato seed embryogenesis addresses a key bottleneck in plant developmental biology and trait discovery. This clearing protocol enables high-resolution, quantitative assessment of seed development stages, supporting hypothesis-driven research and genetic screening in crop improvement pipelines. Enhanced imaging continuity across developmental windows strengthens predictive confidence for translational plant R&D and trait validation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables precise morphological assessment of embryonic stages for genetic target validation.
- Facilitates identification of developmental abnormalities in mutant lines for pathway interrogation.
- Supports biological de-risking by clarifying developmental checkpoints in seed formation.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized protocol for preparing cleared seeds suitable for quantitative imaging assays.
- Improves reproducibility and scalability in phenotypic screening of seed traits.
- Enables reliable comparison of developmental phenotypes across genotypes and treatments.
Translational & Preclinical Research
- Aligns developmental imaging outputs with translational trait selection in crop R&D.
- Supports continuity from genetic discovery to pre-breeding validation in Solanaceae species.
- Reduces risk of late-stage trait failure by enabling early detection of developmental defects.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates into the discovery-to-validation continuum for plant trait R&D, from early genetic hypothesis testing through phenotypic screening and translational trait advancement.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling direct visualization of embryonic structures.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible cleared seeds for quantitative imaging and phenotype comparison.
- Analytics: Provides high-resolution morphological readouts for statistical analysis of developmental progression.
- Translational Research: Facilitates trait alignment and risk-adjusted advancement in crop improvement programs.
- Enterprise Reuse: Offers a broadly applicable clearing workflow for Solanaceae and related species in plant R&D portfolios.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in trait selection and target validation by resolving developmental ambiguity.
- Operational Value: Streamlines sample preparation, enhances reproducibility, and reduces labor intensity.
- Strategic Value: Enables more informed go/no-go decisions and capital-efficient trait advancement.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of genetic lines and developmental traits.
Implementation Considerations
- Requires expertise in plant developmental biology and microscopy.
- Needs access to DIC microscopy and vacuum treatment infrastructure.
- Demands cross-team standardization for protocol adoption and data comparability.
- Adaptable to other Solanaceae species with protocol optimization.
- Clearing efficiency may vary with seed coat thickness and developmental stage.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:30
Seed Collection
1:10
Chloral Hydrate-Based Clearing of Seeds Using a Conventional Protocol
2:21
Chloral Hydrate-Based Clearing of Seeds Using the Optimized Protocol
4:11
Results: Clearing Tomato (Solanum lycopersicum) Seeds at Different Developmental Stages to Observe the Finer Embryonic Structure
5:56
Conclusion
