Name: Strategia walidacji roli bramkowania plazmodowego za pośrednictwem kalozy w odpowiedzi tropikalnej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 18 s
Description: Poznaj metodę badania genów regulujących przepuszczalność plazmodesm i gradienty auksyny podczas odpowiedzi tropikalnych u Arabidopsis thaliana. Technika umożliwia identyfikację genów kontrolujących sygnalizację międzykomórkową.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Te badania były wspierane przez Narodową Fundację Badawczą Korei (NRF-2015R1A2A1A10053576) oraz przez grant z Next-Generation BioGreen 21 Program (SSAC, grant PJ01137901), Rural Development Administration, Republika Korei. RK, WS, ABB i DK były wspierane przez program Brain Korea 21 Plus (BK21+).

<ol><li>Went, F. W., Thimann, K. V., et al. Phytohormones. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWent%2C+FW+%22Experimental+biology+monographs%22">Experimental biology monographs</a>. Bard, P., et al. , The Macmillan Company. New York. 204(1937).</li>
<li>Bennett, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+AUX1+gene%3A+a+permease-like+regulator+of+root+gravitropism%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis AUX1 gene: a permease-like regulator of root gravitropism.</a> Science. 273 (5277), 948-950 (1996).</li>
<li>Christensen, S. K., Dagenais, N., Chory, J., Weigel, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+auxin+response+by+the+protein+kinase+PINOID%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Regulation of auxin response by the protein kinase PINOID.</a> Cell. 100 (4), 469-478 (2000).</li>
<li>Jurgens, G., Geldner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+high+road+and+the+low+road%3A+trafficking+choices+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The high road and the low road: trafficking choices in plants.</a> Cell. 130 (6), 977-979 (2007).</li>
<li>Michniewicz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antagonistic+regulation+of+PIN+phosphorylation+by+PP2A+and+PINOID+directs+auxin+flux%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Antagonistic regulation of PIN phosphorylation by PP2A and PINOID directs auxin flux.</a> Cell. 130 (6), 1044-1056 (2007).</li>
<li>Noh, B., Bandyopadhyay, A., Peer, W. A., Spalding, E. P., Murphy, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+gravi-+and+phototropism+in+plant+mdr+mutants+mislocalizing+the+auxin+efflux+protein+PIN1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Enhanced gravi- and phototropism in plant mdr mutants mislocalizing the auxin efflux protein PIN1.</a> Nature. 423 (6943), 999-1002 (2003).</li>
<li>Weijers, D., Friml, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Snap+Shot%3A+auxin+signaling+and+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Snap Shot: auxin signaling and transport.</a> Cell. 136 (6), 1172-1172 (2009).</li>
<li>Wisniewska, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polar+PIN+localization+directs+auxin+flow+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Polar PIN localization directs auxin flow in plants.</a> Science. 312 (5775), 883(2006).</li>
<li>Murphy, A. S., Hoogner, K. R., Peer, W. A., Taiz, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification%2C+purification%2C+and+molecular+cloning+of+N-1-naphthylphthalmic+acid-binding+plasma+membrane-associated+aminopeptidases+from+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Identification, purification, and molecular cloning of N-1-naphthylphthalmic acid-binding plasma membrane-associated aminopeptidases from Arabidopsis.</a> Plant Physiol. 128 (3), 935-950 (2002).</li>
<li>Kleine-Vehn, J., Friml, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polar+targeting+and+endocytic+recycling+in+auxin-dependent+plant+development%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Cell+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Polar targeting and endocytic recycling in auxin-dependent plant development.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 24, 447-473 (2008).</li>
<li>Yang, Y., Hammes, U. Z., Taylor, C. G., Schachtman, D. P., Nielsen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-affinity+auxin+transport+by+the+AUX1+influx+carrier+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">High-affinity auxin transport by the AUX1 influx carrier protein.</a> Curr. Biol. 16 (11), 1123-1127 (2006).</li>
<li>Geisler, M., Murphy, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ABC+of+auxin+transport%3A+the+role+of+p-glycoproteins+in+plant+development%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">The ABC of auxin transport: the role of p-glycoproteins in plant development.</a> FEBS Lett. 580 (4), 1094-1102 (2006).</li>
<li>Band, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Root+gravitropism+is+regulated+by+a+transient+lateral+auxin+gradient+controlled+by+a+tipping+point+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.USA%22%5BJournal%5D)">Root gravitropism is regulated by a transient lateral auxin gradient controlled by a tipping point mechanism.</a> Proc. Natl. Acad. Sci.USA. 109 (12), 4668-4673 (2012).</li>
<li>Vanneste, S., Friml, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Auxin%3A+a+trigger+for+change+in+plant+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Auxin: a trigger for change in plant development.</a> Cell. 136 (6), 1005-1016 (2009).</li>
<li>Han, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Auxin-callose-mediated+plasmodesmal+gating+is+essential+for+tropic+auxin+gradient+formation+and+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Auxin-callose-mediated plasmodesmal gating is essential for tropic auxin gradient formation and signaling.</a> Dev. Cell. 28 (2), 132-146 (2014).</li>
<li>Kumar, R., Kumar, D., Hyun, T. K., Kim, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Players+at+plasmodesmal+nano-channels%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Players at plasmodesmal nano-channels.</a> J. Plant Biol. 58, 75-86 (2015).</li>
<li>Chen, X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Arabidopsis+callose+synthase+gene+GSL8+is+required+for+cytokinesis+and+cell+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">The Arabidopsis callose synthase gene GSL8 is required for cytokinesis and cell patterning.</a> Plant Physiol. 150, 105-113 (2009).</li>
</ol>

Autorzy nie ujawnili żadnych informacji.

W tym manuskrypcie szczegółowo opisano strategię badania przesiewowego zmutowanych/nadmiernych linii ekspresji, które są wadliwe w odpowiedziach fototropowych i grawitropowych z powodu zmienionej kalozy PD, a tym samym PD SEL. Synteza i degradacja kalozy PD odbywa się głównie przez syntazy kalozy i β-1,3-glukanazy, ale regulacja tych enzymów jest kontrolowana przez wiele czynników poprzedzających. Aby wyszukać takie czynniki początkowe lub kandydatów, którzy są bezpośrednio zaangażowani w regulację PD, opracowaliśmy tę m...

Rośliny, jako osiadłe organizmy żywe, rozwinęły wysoce wyrafinowaną sieć sygnalizacji międzykomórkowej, aby reagować na różne bodźce środowiskowe. Reakcje tropikalne są jednym ze zjawisk, za pomocą których rośliny reagują na bodźce środowiskowe. Rośliny wykazują dwie główne reakcje tropikalne, fototropizm i grawitropizm. Rośliny fotosyntetyczne zginają się w kierunku źródła światła za pomocą fototropizmu, aby zebrać maksymalną energię. Podobnie grawitropizm sprawia, że rośliny rosną w kierunku środka ciężkości. Podstawowym mechanizmem prowadzącym do takich reakcji tropikalnych jest asymetryczne tworzenie gradientu fitohormonu auksyny1. Akt lokalnego tworzenia gradientu auksyny jest dobrze scharakteryzowany; Geny, które są zaangażowane w ten mechanizm, stanowią mapę drogową dla działania hormonów2-8. Specyficzne położenie nośników wypływu auksyny, takich jak PIN-FORMED (PIN) i glikoproteiny P, wykonuje ruch auksyny z cytoplazmy do ściany komórkowej komórek dawcy9,10. Ponadto, dzięki aktywnej aktywności symportowej H+/IAA nośników napływu auksyny, takich jak białka z rodziny AUX1 / LAX, auksyna jest ostatecznie dostarczana do sąsiednich komórek odbiorczych2,11,12. Ten kierunkowy ruch auksyny jest znany jako polarny transport auksyny (PAT). PAT prowadzi do zróżnicowanej dystrybucji auksyny na różnych etapach rozwoju i w odpowiedzi na różne bodźce środowiskowe13,14. Co więcej, zakłócenie lokalizacji lub ekspresji któregokolwiek z tych nośników napływu lub wypływu auksyny prowadzi do poważnych zmian w PAT, co powoduje zakłócenie gradientu auksyny, prowadząc do wad rozwojowych. Ostatnio Han i wsp. stwierdzono, że regulacja plazmodesmalna jest również niezbędna do utrzymania gradientu auksyny15. Do tej pory zidentyfikowano ponad 30 białek plazmodesmalnych16. Wśród tych białek AtGSL8 został opisany jako kluczowy enzym do syntezy kalozy w plazmodesmacie (PD), a zatem odgrywa istotną rolę w utrzymaniu limitu wykluczenia wielkości PD (SEL). Stłumiona ekspresja AtGSL8 spowodowała zniekształcony wzór gradientu auksyny prowadzący do braku odpowiedzi tropikalnej, w przeciwieństwie do siewek typu dzikiego15.
W tym manuskrypcie przedstawiono metody badania nowych genów kandydujących, które są zaangażowane w regulację PD. AtGSL8 został wykorzystany jako białko modelowe do przetestowania tych metod, ponieważ jest kluczowym enzymem przyczyniającym się do biosyntezy kalozy PD. Ze względu na śmiertelność mutantów nokautujących gsl8 17, zastosowano linie RNAi indukowane deksametazonem (dex) zgodnie z wcześniej opublikowanym raportem15. Przedstawiona tutaj strategia może być dostosowana do badań przesiewowych genów, które są zaangażowane w odpowiedź hipokotylowo-tropową kontrolowaną przez PD SEL.

<table><tbody><tr><td>HPTS (sól trisodowa kwasu 8-hydroksypireno-1,3,6-trisulfonowego)</td><td>Sigma</td><td>H1529-1G</td><td>Barwnik fluorescencyjny jako znacznik symplazmatyczny</td></tr><tr><td>LE Agaroza</td><td>Dongin-Genomic</td><td>GEL001-500G</td><td>Używany do bloku agarozy HPTS</td></tr><tr><td>Kuchenka mikrofalowa</td><td>LG-Goldstar</td><td></td><td>Maszyna do gotowania żelu agarozowego</td></tr><tr><td>100 ml szklana kolba stożkowa</td><td>Dong Kwang</td><td>A0205</td><td>Służy do gotowania agarozy HPTS żelowa</td></tr><tr><td>szalka Petriego (35 mm x 10 mm)</td><td>SPL nauki przyrodnicze</td><td>SPL10035</td><td>Służy do wytwarzania bloków agarozowych HPTS i mycia próbek roślin&nbsp;</td></tr><tr><td>Szkiełka podstawowe i szkiełka mikroskopowe (24 mm x 50 mm)</td><td>Szkło laboratoryjne Marienfeld</td><td>101222</td><td>Służy do bloków agarozowych HPTS i przygotowywania próbek mikroskopowych</td></tr><tr><td>Płytki pośrednie MS 125 mm x 125 mm x 20 mm</td><td>SPL nauki przyrodnicze</td><td>SPL11125</td><td>Płytki do produkcji podłoża agarowego MS</td></tr><tr><td>Nożyczki</td><td>Niemcy Stal nierdzewna</td><td>HSB 942-11</td><td>Służy do wycinania obszaru hakowego próbek roślinnych</td></tr><tr><td>Murashige i Skoog (MS) mieszanina soli bazowej</td><td>Duchefa</td><td>P10453.01</td><td>MS pożywka zawierająca witaminy.</td></tr><tr><td>(N-morfolino) kwas etanosulfonowy (MES) monohydrat</td><td>Bioshop</td><td>3G30212</td><td>Do produkcji pożywek MS.</td></tr><tr><td>Agar</td><td>roślinny Duchefa</td><td>P1001.1000</td><td>Do zestalania pożywki MS.</td></tr><tr><td>Autoklaw</td><td>ALP</td><td>CL-40L</td><td></td></tr><tr><td>Shaker</td><td>Wise Mix</td><td>SHO-1D</td><td>Do spokojnego zmywania buforu barwiącego anilinę i barwnika HPTS.</td></tr><tr><td>1 ml Niebieskie końcówki</td><td>Sorenson</td><td>10040</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta 1 ml</td><td>BioPette</td><td>L-1101-2</td><td></td></tr><tr><td>Taśma chirurgiczna</td><td>MIcropore</td><td>1530-0</td><td>Do uszczelniania płytki MS</td></tr><tr><td>Błękit anilinowy (błękit metylowy)</td><td>Sigma</td><td>M5528-25G</td><td>Służy do przygotowania buforu do barwienia błękitu anilinowego.</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Bioshop</td><td>GLN001</td><td>Służy do przygotowania buforu do barwienia błękitu anilinowego.</td></tr><tr><td>DDG</td><td>Sigma</td><td>D8375-1G</td><td>Służy do hamowania syntaz kalozy.</td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny</td><td>Olympus</td><td>FV1000MPE SIM</td><td>Aby sprawdzić barwienie błękitem anilinowym i wynik obciążenia barwnikiem HPTS.</td></tr><tr><td>Mieszadło&nbsp;</td><td>I lab&nbsp;</td><td>K400</td><td>Do mieszania roztworu mediów.</td></tr><tr><td>Folia aluminiowa</td><td>SW folia</td><td></td> do gotowania <td>Do owijania talerzy w ciemnym stanie.</td></tr><tr><td>Podchloryn sodu</td><td>Samjin Przemysł</td><td></td><td>Do nasion sterylizowanych powierzchniowo</td></tr></tbody></table>

strategia walidacji roli bramkowania plazmodowego za pośrednictwem kalozy w odpowiedzi tropikalnej

A Strategy to Validate the Role of Callose-mediated Plasmodesmal Gating in the Tropic Response

Roślinny hormon auksyna odgrywa ważną rolę w wielu procesach wzrostu i rozwoju, w tym w tropikalnych reakcjach na światło i grawitację. Ustalenie gradientu auksyny jest kluczowym zdarzeniem prowadzącym do fototropizmu i grawitropizmu. Wcześniej wykazano, że polarny transport auksyny (PAT) ustanawia gradient auksyny w różnych domenach komórkowych roślin. Jednak Han i in. wykazali niedawno, że dla prawidłowego tworzenia gradientu auksyny, plazmodesmalna łączność symplazmatyczna za pośrednictwem modzeli między sąsiednimi komórkami jest również czynnikiem krytycznym. W tym manuskrypcie omówiono strategię wyjaśnienia roli poszczególnych genów, które mogą wpływać na fototropizm i grawitropizm poprzez zmianę łączności symplazmatycznej poprzez modulację syntezy plazmodalnej kalozy. Pierwszym krokiem jest badanie przesiewowe nieprawidłowych reakcji tropikalnych z 3-dniowych etiolowanych siewek mutantów lub linii nadekspresji genu wraz z typem dzikim. To wstępne badanie przesiewowe może prowadzić do identyfikacji szeregu genów funkcjonujących w PAT lub kontrolujących łączność symplazmatyczną. Drugie badanie przesiewowe polega na sortowaniu kandydatów, którzy wykazują zmienione reakcje tropiczne poprzez wpływ na łączność symplazmatyczną. Aby zająć się takimi kandydatami, zbadano ruch znacznika symplazmatycznego i osadzanie się plazmodesmalnej kalozy. Strategia ta byłaby przydatna do zbadania nowych genów kandydujących, które mogą bezpośrednio lub pośrednio regulować łączność symplazmatyczną podczas reakcji tropikalnych i innych procesów rozwojowych.

W obecnym układzie wykorzystano linie AtGSL8 z indukowalnym przez dekzametazon (dex) RNAi [dalej dsGSL8 (+dex/-dex)], ponieważ homozygotyczne mutanty z insercją T-DNA w genie gsl8 są letalne na etapie siewki18. Trzydniowe etiolowane siewki dsGSL8 oraz siewki typu dzikiego z ±dex poddano działaniu bodźców fototropicznych i gravitropicznych. Stwierdzono, że siewki dsGSL8 (+dex) wykazują defekty w fototropizmie i gravitropizmie15</...

Ten artykuł opisuje metody badania przesiewowego genów kontrolujących przepuszczalność plazmodalną, a tym samym gradient auksyny podczas odpowiedzi tropikalnej. Obejmuje to pomiar stopnia odpowiedzi tropikalnej u hipokotylu Arabidopsis thaliana i sprawdzenie przepuszczalności plazmodalnej przez obciążenie kwasem 8-hydroksypireno-1,3,6-trisulfonowym (HPTS) i wreszcie ocenę poziomu kalozy.

Strategia walidacji roli bramkowania plazmodowego za pośrednictwem kalozy w odpowiedzi tropikalnej

The plant hormone auxin plays an important role in many growth and developmental processes, including tropic responses to light and gravity. The ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przesiewanie genów zaangażowanych w regulację przepuszczalności plazmodezmatów za pośrednictwem kallozy podczas odpowiedzi tropicznej. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu biologii rozwojowej roślin, takie jak to, które nieznane geny kontrolują sygnalizację międzykomórkową poprzez plazmodezmaty podczas odpowiedzi tropicznej. Główną zaletą tej techniki jest jej prostota, skuteczność oraz powtarzalność.Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności, ponieważ manipulowanie etiolowanymi podsadkami Arabidopsis w sposób zapobiegający ich uszkodzeniu podczas całego procesu jest wymagające. Pomysł na tę metodę pojawił się u nas podczas ustalania roli GSL8, syntazy glukozy, w regulacji bramkowania plasmodesmat. Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ procedury opisane w ścieżce dźwiękowej nie wyjaśniają krytycznych etapów, które są trudne do wykonania ze względu na konieczność zastosowania specjalnej konfiguracji i sposobu obchodzenia się z materiałem.Przygotuj pożywkę Murashige i Skoog, czyli pożywkę MS, na jeden dzień przed eksperymentem. Poddaj ją autoklawowaniu, a następnie wypełnij kwadratowe płytki o wymiarach 125 mm, wlewając 50 ml pożywki na każdą płytkę. Następnego dnia nanieś nasiona, które zostały wysterylizowane 1,1% podchlorynem sodu, na półwysuszone płytki.Używając końcówki do mikropipety o średnicy 1 mm, nanieś na nasiona po 200 µL wody. Ułóż nasiona w pięciu rzędach w odstępach 1,8 cm, zachowując minimalny odstęp 0,1 cm między nasionami w rzędach. Pozostaw wodę do częściowego odparowania przed przykryciem i zabezpieczeniem płytek taśmą chirurgiczną.Następnie owiń płytki folią i umieść je w pudełku. Inkubuj pudełko w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez trzy dni. Po trzech dniach traktowania zimnem przenieś pudełko z nasionami do temperatury 22 stopni Celsjusza na trzy dni.Po kolejnych trzech dniach, w ciemni, należy sprawdzić status kiełkowania nasion w świetle zielonym. Zazwyczaj trzydniowe etiolowane siewki Col-0 osiągają długość do 1,6 centymetrów. W świetle zielonym należy przeanalizować zmienioną odpowiedź fototropową i grawitropową.Używając wysterylizowanego pęsety, należy wybrać siewki o podobnej wielkości z prostym, pionowym wzrostem. Delikatnie unieś siewki za najniższą część podkotylonu, nie dotykając pozostałych części rośliny. Następnie ostrożnie przenieś wybrane siewki na świeżą płytkę z agarem MS.Na nowej płytce ustaw zakrzywienia siewek w ten sam sposób. Wybierz co najmniej 20 siewek dla każdego tła genetycznego do każdego rzędu i przygotuj duplikat każdej płytki. Każda płytka zawiera dwa genotypy w dwóch rzędach.Aby sprawdzić reakcję fototropową, umieść płytki w czarnym pudełku w taki sposób, aby siewki były zorientowane pionowo. Pozostaw jedną stronę pudełka otwartą od strony krawędzi płytek. Następnie inkubuj pudełko w komorze wzrostu roślin przy jednostronnym białym świetle.Aby sprawdzić odpowiedź grawitropową, owiń płytki folią i umieść je w czarnym pudełku w taki sposób, aby siewki znajdowały się w pozycji poziomej. W kilku punktach czasowych, zazwyczaj zaczynając od 90 minut i kończąc na 12 godzinach, wykonaj zdjęcia płytek w warunkach słabego oświetlenia. Użyj skanera ustawionego na zbieranie obrazów JPEG w rozdzielczości 600 DPI.Aby zmierzyć kąt wygięcia siewek, należy wczytać ich obrazy do oprogramowania ImageJ. Użyj narzędzia powiększania, aby przybliżyć obraz, a następnie przewiń do siewki przeznaczonej do analizy. Następnie użyj narzędzia do pomiaru kątów, aby zmierzyć kąt, pod którym siewka jest wygięta.Aby to zrobić, kliknij dwukrotnie lewym przyciskiem myszy w punkcie A, wyznaczającym pierwotny kierunek wzrostu podkotylowca, a następnie przeciągnij kursor do punktu B, będącego punktem rozpoczęcia wygięcia. Następnie użyj lewego przycisku myszy, aby narysować pierwszą linię. Teraz przeciągnij kursor z punktu B do punktu C, będącego końcem wygięcia, i użyj lewego przycisku myszy, aby narysować drugą linię, tworząc kąt A. Rzeczywisty kąt wygięcia to kąt B, który jest równy 180 stopniom minus kąt A. Teraz zmierz i zapisz wartość kąta A, naciskając klawisz M na klawiaturze. Plik z wynikami otworzy się w osobnym oknie.Powtórz poprzedni krok w celu pomiaru pozostałych siewek, a następnie oblicz średni kąt dla dwóch różnych tuteł, korzystając z pliku arkusza z zestawem danych. Przygotowanie bloków agarozy HPTS niezbędnych do tego testu zostało opisane w protokole tekstowym. Rozpocznij od przygotowania próbek roślin.W tym przykładzie analizowane są mutanty o zmienionym limicie wykluczania wielkości w plazmodesmatach. Najpierw należy przygotować platformę do analizy. Umieść szkiełko podstawowe mikroskopowe na nowej płytce z pożywką MS.Następnie z płytek MS z trzydniowymi etiolowanymi siewkami, używając ostrych nożyczek chirurgicznych, należy ostrożnie wyciąć siewki u nasady zakrzywienia i przenieść je na szkiełko nakrywkowe. Przenieś co najmniej pięć siewek dla każdego tła genetycznego. Ułóż siewki tak, aby na szkiełku nakrywkowym pozostało tylko 0,5 centymetra podkotylu od miejsca wycięcia, a reszta podkotylu dotykała pożywki.Następnie umieść blok agarozowy z HPTS na wierzchu odciętych siewek w taki sposób, aby miejsce cięcia stykało się z blokiem HPTS. Upewnij się, że kontakt został nawiązany. Pozostaw blok na hipokotylach na pięć minut.Następnie przenieś podsiewki do 10 milimetrowej szalki Petri zawierającej wodę dwukrotnie destylowaną i płucz je przy jednoczesnym wstrząsaniu przez 15 minut. Następnie przenieś wypłukane siewki na szkiełko. Umieść każdy mutant obok kontroli, aby umożliwić bezpośrednie porównanie.Przykryj podlistwia 100 do 150 µL wody dwukrotnie destylowanej i nałóż szkiełko przykrywowe. Następnie przeanalizuj preparat za pomocą mikroskopii konfokalnej zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Do tego badania należy użyć świeżo przygotowanego barwnika, który ma mniej niż dwa dni i był przechowywany w ciemności.Aby zahamować syntezę kallozy de novo, do barwnika należy dodać 1,5 milimola 2-Deoksy-D-glukozy. Analizę należy rozpocząć od wybrania trzydniowych etiolowanych siewek do barwienia kallozy, z reakcją tropową lub bez niej. Odciąć siewki w obrębie obszaru haczyka, używając cienkich nożyczek chirurgicznych.Następnie, za pomocą końcówki wykałaczki, przenieś siewki do małej szalki Petri zawierającej dwa mililitry buforu barwiącego. Inkubuj siewki w buforze barwiącym w ciemności przez dwie godziny przy ciągłym wstrząsaniu z prędkością 30 RPM. Po barwieniu przemyj siewki wodą dwukrotnie destylowaną przez dwie minuty, aby usunąć nadmiar buforu barwiącego.Po przemyciu należy wybrać co najmniej pięć siewek każdego tła do analizy konfokalnej. Natężenie sygnału kallozy należy zmierzyć za pomocą oprogramowania ImageJ. W oprogramowaniu do obrazowania należy otworzyć plik z mikroskopii konfokalnej zapisany wcześniej w formacie JPEG.Następnie, korzystając z prostokątnego narzędzia zaznaczania, przeciągnij kursor nad obrazem i wybierz obszar do zbadania. Następnie zmierz i zapisz wartości liczbowe intensywności sygnału, naciskając klawisz M. Plik z wynikami otworzy się w osobnym oknie. W pliku z wynikami termin „Mean” wskazuje intensywność sygnału wybranego obszaru, a nie średnią z kilku obszarów.Analizuj sygnał w ten sposób dla każdej siewki, jedna po drugiej. Powtórz powyższy krok w celu pomiaru pozostałych siewek i oblicz średni kąt dla dwóch różnych teł, korzystając z pliku arkusza danych. Z zastosowaniem opisanych protokołów przeanalizowano linie RNAi AtGSL8 indukowane deksametazonem.Siewki DsGSL8 wykazywały wyraźne defekty fototropizmu i gravitropizmu. Nie ulegały one zginaniu pod wpływem żadnej z tych sił. Zmiany w transporcie symplastycznym wykazały, że przemieszczanie się barwnika HPTSA było znacznie bardziej rozległe w liniach dsGSL8 RNAi knockdowns niż w grupach kontrolnych.Kaloza jest jednym z kluczowych regulatorów granicy wykluczania wielkości w plazmodejsmatach, a AtGSL8 jest znaną syntazą kalozy plazmodejsmatów. W związku z tym przeprowadzono barwienie kalozy błękitem anilinowym. W grupie kontrolnej kaloza nagromadziła się po sześciu godzinach, co zaznaczono żółtymi strzałkami.Jednak po sześciu godzinach mutanty wykazywały stale niski poziom kalozy w plazmodesmatach. Brak syntezy kalozy był mierzalny już trzy godziny po wystąpieniu fototropizmu. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, jak przeprowadzić szybki screening genów w wariancie kontrolującym bramkowanie plazmodesmat w odpowiedzi na reakcję tropyczną poprzez modulację wyłącznie kalozy.Po opanowaniu tej techniki, procedurę można przeprowadzić w około sześć godzin po trzech dniach kiełkowania siewek Arabidopsis. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, aby nie uszkodzić siewek podczas ich przenoszenia. Ważne jest również zapewnienie prawidłowego kontaktu agaru z hipokotylem podczas badania obciążenia.Po tym rozwoju technika ta utorowała drogę biologii rozwoju do badania genów, w tym nowych genów, które odgrywają rolę w kontrolowaniu przewodnictwa symplastycznego podczas tropizmów

a-strategy-to-validate-role-callose-mediated-plasmodesmal-gating

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Kwantyfikacja wzrostu patogenów jest potężnym narzędziem do charakteryzowania różnych odpowiedzi immunologicznych Arabidopsis thaliana (dalej: Arabidopsis). Opisana tutaj metoda przedstawia zoptymalizowany test infiltracji strzykawki w celu ilościowego określenia Pseudomonas syringae pv. Maculicola powiedział: Wzrost ES4326 w dorosłych liściach Arabidopsis.

Test infiltracji bakteryjnych liści w celu dokładnej charakterystyki reakcji obronnych roślin przy użyciu patosystemu Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae

Na poziomie subkomórkowym, zdarzenia sygnalizacyjne są dynamicznie modulowane przez sygnały rozwojowe i środowiskowe. W tym miejscu opisujemy protokół, który wykorzystuje system przejściowej ekspresji tytoniu do monitorowania dynamicznej interakcji białko-białko i ujawniania przestrzennej organizacji transdukcji sygnału w komórkach roślinnych.

Obrazowanie przestrzennej reorganizacji szlaku sygnałowego MAPK przy użyciu systemu przejściowej ekspresji tytoniu

Połączenia międzykomórkowe roślin, plazmodesmaty (Pd), odgrywają kluczową rolę w fizjologii roślin i interakcjach między roślinami a wirusami. Kluczowe znaczenie dla transportu Pd mają sygnały sortujące, które kierują białka do Pd. Jednak nasza wiedza na temat tych sekwencji jest wciąż w powijakach. Opisujemy strategię identyfikacji sygnałów lokalizacji Pd w białkach docelowych Pd.

Identyfikacja sekwencji lokalizacji plazmodesmalnej w białkach w Planta

Celem tego protokołu jest pokazanie, jak indukować skupione aparaty szparkowe w liścieniach siewek Arabidopsis thaliana poprzez zanurzenie roztworu pożywki zawierającej cukier oraz jak obserwować struktury wewnątrzkomórkowe, takie jak chloroplasty i mikrotubule w zgrupowanych komórkach ochronnych za pomocą konfokalnej mikroskopii laserowej.

System indukcyjny do grupowania aparatów szparkowych za pomocą zanurzenia w roztworze cukru w siewkach rzodkiewnika pospolitego (Arabidopsis thaliana)

Zewnątrzkomórkowa systemowa sygnalizacja wapniowa wywołana glutaminianem jest kluczowa dla indukcji reakcji obronnych roślin na mechaniczne zranienia i ataki roślinożerców u roślin. W artykule opisano metodę wizualizacji przestrzennej i czasowej dynamiki obu tych czynników przy użyciu roślin Arabidopsis thaliana wykazujących ekspresję wrażliwych na wapń i glutaminian biosensorów fluorescencyjnych.

Szerokokątne obrazowanie w czasie rzeczywistym lokalnych i układowych sygnałów rany u rzodkiewnika

Obecny protokół opisuje zoptymalizowaną metodę obserwacji histologicznej galasów indukowanych przez Plasmodiophora brassicae. Skrawki wibratomu hipokotyli są oczyszczane przed obrazowaniem fluorescencyjnym w celu zbadania udziału czynników transkrypcyjnych i fitohormonów podczas progresji choroby. Protokół ten przezwycięża ograniczenia związane z zatapianiem żywicy, umożliwiając wizualizację białek fluorescencyjnych w plantach.

Połączenie mikroskopii oczyszczającej i fluorescencyjnej w celu wizualizacji zmian w ekspresji genów i reakcjach fizjologicznych na Plasmodiophora brassicae

Kilka powszechnie stosowanych metod jest tutaj wprowadzanych do badania zdarzeń transportu błonowego kinazy receptora błony komórkowej. Manuskrypt ten opisuje szczegółowe protokoły, w tym przygotowanie materiału roślinnego, leczenie farmakologiczne i konfokalną.

Oparte na obrazie metody badania zdarzeń transportu błonowego w komórkach linii szparkowej

Tutaj prezentujemy prostą metodę bezpośredniej obserwacji i automatycznego pomiaru reakcji aparatów szparkowych na inwazję bakterii u Arabidopsis thaliana. Metoda ta wykorzystuje przenośne urządzenie do obrazowania aparatów szparkowych wraz z potokiem analizy obrazu przeznaczonym do obrazów liści zarejestrowanych przez urządzenie.

Bezpośrednia obserwacja i automatyczny pomiar reakcji aparatów szparkowych na Pseudomonas syringae pv. pomidor DC3000 w rzodkiewniku pospolitym (Arabidopsis thaliana)

Ten protokół opisuje wybór optymalnych markerów plazmodesmalnych do analiz opartych na mikroskopii konfokalnej białek ukierunkowanych na plazmodesmat podczas interakcji wirus-plazmodesmata lub transportu plazmodesmalnego.

Mikroskopia konfokalna Analiza sortowania białek do plazmodesmatów u Nicotiana benthamiana

Protokół ten opisuje podejście o wysokiej przepustowości do oceny wycieku jonów roślinnych, aktywności peroksydazy oraz produkcji kalloz w tej samej próbce.

Ocena odpowiedzi liści na metabolity drugorzędne mikroorganizmów przy użyciu formatu o wysokiej przepustowości

Poznaj metodę badania genów regulujących przepuszczalność plazmodesm i gradienty auksyny podczas odpowiedzi tropikalnych u Arabidopsis thaliana. Technika umożliwia identyfikację genów kontrolujących sygnalizację międzykomórkową.

Strategia walidacji roli bramkowania plazmodowego za pośrednictwem kalozy w odpowiedzi tropikalnej

Przeglądaj więcej filmów