Strategia walidacji roli bramkowania plazmodowego za pośrednictwem kalozy w odpowiedzi tropikalnej

Ogólnym celem tej procedury jest badanie przesiewowe genów zaangażowanych w bramkowanie plazmodesmalne za pośrednictwem modzeli podczas odpowiedzi tropikalnej. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii rozwoju roślin, takie jak to, które nieznane geny kontrolują sygnalizację międzykomórkową przez plazmodesmaty podczas odpowiedzi tropikalnej. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest prosta, działa też i się powtarza.

Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w tej metodzie, będą miały trudności, ponieważ obchodzenie się z hipokotylami etiolowanymi Arabidopsis bez żadnych uszkodzeń podczas całego procesu jest trudne. Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, gdy ustaliliśmy regułę GSL8, syntazy glukozy w bramkowaniu plazmodesmalnym. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ procedury wymienione w nagraniu nie wyjaśniły krytycznych kroków, które są trudne do wykonania, ponieważ wymagają specjalnej konfiguracji i obsługi.

Przygotuj Murashige i Skoog, czyli pożywkę ze stwardnienia rozsianego, na dzień przed eksperymentem. Autoklaw i napełnij 125-milimetrowe kwadratowe płytki 50 mililitrami pożywki na płytkę. Następnego dnia na półsuszonych płytkach umieść nasiona, które zostały wysterylizowane 1,1% podchlorynem sodu.

Z 1-milimetrowej końcówki mikropipety nasiej nasiona na 200 mikrolitrów wody. Ułóż nasiona w pięciu rzędach w odległości 1,8 centymetra od siebie, przy czym nasiona są oddalone od siebie o co najmniej 0,1 centymetra w rzędach. Pozwól, aby trochę wody odparowało, zanim przykryjesz i uszczelnisz płytki taśmą chirurgiczną.

Następnie zawiń talerze w folię i umieść je w pudełku. Inkubuj pudełko w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez trzy dni. Po trzech dniach zimnej kuracji przenieś pudełko z nasionami do 22 stopni Celsjusza na trzy dni.

Po kolejnych trzech dniach w ciemnym pomieszczeniu sprawdź stan kiełkowania nasion w zielonym świetle. Zwykle trzydniowe sadzonki etiolowane Col-0 dorastają do 1,6 centymetra długości. W zielonym świetle przeanalizuj zmienioną odpowiedź fototropową i grawitropową.

Za pomocą wysterylizowanego kilofa wybierz sadzonki o podobnej wielkości i prostym, pionowym wzroście. Delikatnie podnieś sadzonki z najniższej części ich hipokotylu, nie dotykając żadnych innych części. Następnie ostrożnie przenieś wybrane sadzonki na świeżą płytkę agarową MS.

Na nowej płycie ustaw haczyki sadzonek w ten sam sposób. Wybierz co najmniej 20 sadzonek z każdego tła genetycznego, aby utworzyć każdy rząd i zrób duplikat każdej płytki. Każda płytka zawiera dwa genotypy w dwóch rzędach.

Aby sprawdzić odpowiedź fototropową, umieść płytki w czarnym pudełku tak, aby sadzonki były zorientowane pionowo. Pozostaw jedną stronę pudełka otwartą do krawędzi talerzy. Następnie inkubuj pudełko w komorze wzrostu roślin z jednostronnym białym światłem.

Aby sprawdzić odpowiedź grawitropową, owiń płytki folią i włóż do czarnego pudełka tak, aby sadzonki były poziome. W kilku punktach czasowych, zwykle zaczynających się od 90 minut i wydłużających do 12 godzin, zobrazuj płyty w warunkach słabego oświetlenia. Użyj zestawu skanera, aby zebrać obrazy JPEG o rozdzielczości 600 DPI.

Aby zmierzyć kąt gięcia sadzonek, załaduj ich obrazy do oprogramowania ImageJ. Użyj narzędzia powiększającego, aby powiększyć i przewinąć do sadzonki, aby przeanalizować. Następnie użyj narzędzia kątowego, aby zmierzyć kąt, pod jakim sadzonka jest wygięta.

Aby to zrobić, kliknij dwukrotnie lewym przyciskiem myszy na oryginalny punkt A kierunku wzrostu hipokotylu i przeciągnij mysz do punktu inicjacji zginania B. Następnie kliknij lewym przyciskiem myszy, aby narysować pierwszą linię. Teraz przeciągnij myszą z punktu B do końca gięcia, punktu C, i kliknij lewym przyciskiem myszy, aby narysować drugą linię, tworząc kąt, A. Prawdziwy kąt gięcia to kąt B, który jest równy 180 stopniom minus kąt A.Teraz zmierz i zapisz kąt A, naciskając M na klawiaturze. Plik wynikowy otworzy się osobno.

Powtórz poprzedni krok, aby zmierzyć resztę sadzonek i zmierz średni kąt dwóch różnych teł za pomocą pliku arkusza kalkulacyjnego zestawu danych. Przygotowanie bloków agarozy HPTS potrzebnych do tego testu jest omówione w protokole tekstowym. Zacznij od przygotowania próbek roślin.

W tym przykładzie analizowane są mutanty ze zmienionym limitem wykluczenia wielkości plazmodesmatów. Po pierwsze, stwórz platformę dla testu. Umieść szkiełko podstawowe mikroskopu na nowej płytce średniej ze stwardnienia rozsianego.

Następnie z płytek MS z trzydniowymi etiolowanymi siewkami użyj ostrych nożyczek chirurgicznych, aby ostrożnie wyciąć sadzonki z podstawy haczyka i przenieść je na szkło nakrywkowe. Przenieś co najmniej pięć sadzonek na tło genetyczne. Ustaw sadzonki tak, aby na szkiełku okładkowym pozostało tylko 0,5 centymetra hipokotylu od miejsca wycięcia, a reszta hipokotylu dotykała podłoża.

Następnie umieść blok agarozy HPTS na wyciętych sadzonkach, tak aby wycięty obszar stykał się z blokiem HPTS. Upewnij się, że kontakt został nawiązany. Pozostaw blok na hipokotylach przez pięć minut.

Następnie przenieś hipokotyle na 10-milimetrową szalkę Petriego zawierającą podwójnie destylowaną wodę i myj je wstrząsając przez 15 minut. Następnie przenieś umyte sadzonki na szkiełko. Umieść każdego mutanta obok kontrolki, aby dokonać bezpośrednich porównań.

Przykryj hipokotyle 100 do 150 mikrolitrami podwójnie destylowanej wody i nałóż szkiełko nakrywkowe. Teraz przeanalizuj szkiełko za pomocą mikroskopii konfokalnej, jak opisano w protokole tekstowym. Do tego testu użyj świeżo przygotowanego barwnika, który ma mniej niż dwa dni i jest przechowywany w ciemności.

Aby zahamować syntezę kalozy de novo, dodaj 1,5 milimola 2-Deoksy-D-glukozy do barwnika. Rozpocznij ten test od wybrania trzydniowych etiolowanych siewek do barwienia kalozy, z reakcją tropikalną lub bez. Wytnij sadzonki z obszaru haczyka za pomocą cienkich nożyczek chirurgicznych.

Następnie za pomocą końcówki wykałaczki przenieś sadzonki na małą szalkę Petriego zawierającą dwa mililitry buforu barwiącego. Inkubować sadzonki w buforze barwiącym w ciemności przez dwie godziny, ciągle wstrząsając przy 30 obr./min. Po zabarwieniu umyj sadzonki podwójnie destylowaną wodą przez dwie minuty, aby usunąć nadmiar buforu barwiącego.

Po umyciu wybierz co najmniej pięć sadzonek z każdego tła do analizy konfokalnej. Zmierz intensywność sygnału kalozy za pomocą oprogramowania ImageJ. Otwórz plik mikroskopii konfokalnej już zapisany w formacie JPEG w oprogramowaniu do obrazowania.

Następnie, za pomocą narzędzia do zaznaczania prostokątnego, przeciągnij kursor nad obrazem i wybierz obszar do zbadania. Następnie zmierz i zapisz wartości liczbowe natężenia sygnału, naciskając M. Plik wynikowy otworzy się osobno. W pliku wynikowym termin Średnia" wskazuje intensywność sygnału wybranego obszaru, a nie średnią kilku obszarów.

Jeden po drugim analizuj sygnał w ten sposób dla każdej sadzonki. Powtórz powyższy krok, aby zmierzyć resztę sadzonek i zmierz średni kąt dwóch różnych teł za pomocą pliku arkusza kalkulacyjnego zestawu danych. Korzystając z opisanych protokołów, przeanalizowano indukowane deksametazonem linie RNAi AtGSL8.

Siewki DsGSL8 były wyraźnie wadliwe pod względem fototropizmu i grawitropizmu. Nie wykazywały one ugięcia pod wpływem żadnej z sił. Zmiany w ruchu symplazmatycznym wykazały, że ruch barwnika HPTSA był znacznie bardziej rozległy w knockdownach dsGSL8 RNAi niż w obu kontrolach.

Kaloza jest jednym z kluczowych regulatorów limitu wykluczenia wielkości plazmodesmatów, a AtGSL8 jest znaną syntazą kalozy plazmodesmatów. Przeprowadzono więc barwienie błękitem kalozy anilinowej. W grupie kontrolnej kaloza nagromadziła się po sześciu godzinach, co oznaczono żółtymi strzałkami.

Jednak po sześciu godzinach mutanty miały utrzymujący się niski poziom kalozy plazmodesmatów. Ten brak syntezy kalozy był mierzalnie mniejszy już po trzech godzinach od fototropizmu. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przeprowadzić szybkie badania przesiewowe genów w wariancie kontrolującym bramkowanie plazmodesmalne z powodu odpowiedzi tropikalnej poprzez modulację czysto modzelowatego.

Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu około sześciu godzin po trzech dniach kiełkowania sadzonek rzodkiewnika. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, aby nie uszkodzić sadzonek podczas ich przenoszenia. Ważne jest również, aby zapewnić prawidłowy kontakt między agarem a hipokotylem podczas testu ładowania.

Po tym rozwoju technika ta utorowała biologii rozwojowej drogę do badania genów, nowych genów, które odgrywają rolę w kontrolowaniu przewodnictwa symplazmatycznego podczas tropiku