Frakcjonowanie subkomórkowe w celu wyizolowania składników synaptycznych z mózgu myszy

Synapsy są podstawowymi jednostkami obliczeniowymi mózgu. Przedstawiona metoda jest prostym i cennym narzędziem do badania synaps i ich procesów molekularnych, a także do zrozumienia, w jaki sposób mogą one być zmieniane w różnych zaburzeniach mózgu. Technika ta polega na frakcjonowaniu struktur synaptosomów odizolowanych od mózgu.

Dzięki temu badacz może uchwycić efekty, które mogą być podzielone na segmenty w synapsie. Poziomy dystrybucji i aktywność określonych białek mogą być również analizowane z rozdzielczością subsynaptyczną. Procedura ta zajmuje indywidualnemu badaczowi około 11 godzin, jeśli wszystko pójdzie gładko.

Osoba, która nigdy nie wykonywała tej techniki, może mieć trudności z długością tej procedury, ponieważ naturalnie zajmie to trochę więcej czasu komuś, kto nie jest zaznajomiony z krokami. Ze względu na długość tego eksperymentalnego dnia, zdecydowanie zalecamy wykonanie sekcji z partnerem, który może pomóc w szybkim pobraniu tkanek, aby upewnić się, że żadne próbki nie zostaną umieszczone na lodzie dłużej niż jest to konieczne. Zalecamy również przygotowanie i materiałów stołowych na dzień przed przeprowadzeniem tego eksperymentu, aby wszystko było w zasięgu ręki w razie potrzeby.

Jest to szczególnie prawdziwe w przypadku tubek zbiorczych. Do końca tej procedury zostanie pobranych wiele podwielokrotności łącznie 11 frakcji subkomórkowych. Tak więc wyraźne oznakowanie tych rurek z wyprzedzeniem znacznie ułatwi Ci dzień.

Na początek włóż cienkie nożyczki pod skórę w miejscu nacięcia głowy na głębokość okołoczaszkową i wykonaj środkowe nacięcie strzałkowe aż do szwu donosowego, aby cofnąć skórę głowy od czaszki. Pracując od obszaru potylicznego w kierunku każdego aspektu skroniowego, przytnij powięź i mięsień, aby odsłonić zewnętrzną powierzchnię czaszki poza każdy zewnętrzny przewód akustyczny. Zabezpiecz skórę głowy i rostralny aspekt czaszki ręką niedominującą, a drugą ręką włóż cienkie nożyczki dwa milimetry w ogonową stronę otworu wielkiego, z którego wychodzi rdzeń kręgowy.

Wykonaj nacięcie w linii środkowej, aż nożyczki dotrą do wewnętrznej powierzchni kości śródciemieniowej. Zmień kąt nożyczek tak, aby ostrza biegły równolegle do grzbietowej powierzchni czaszki. Kontynuuj przesuwanie nacięcia środkowego strzałkowo przez kość ciemieniową i czołową, używając szwów strzałkowych i międzyczołowych jako przewodnika i zakończ nacięcie tuż za szwem międzynosowym.

Następnie wykonaj trzymilimetrowe prostopadłe nacięcie do kości nosowej, rostralne do szwu międzynosowego, umieszczając nożyczki prostopadle do czaszki, tak aby każde ostrze znajdowało się na szwie przedszczękowym nosa i wykonując jedno równe cięcie. Zabezpieczając aspekt rostralny, użyj jednej strony pary teksturowanych kleszczy, aby delikatnie podnieść czaszkę z mózgu, a następnie podnieś ją na boki i brzusznie. W razie potrzeby powtórz wzdłuż linii środkowej, a następnie dla drugiej półkuli, aż cała powierzchnia mózgu zostanie odsłonięta.

Za pomocą zakrzywionych kleszczy lub cienkiej szpatułki delikatnie podnieś rostralną stronę mózgu. Przetnij nerwy wzrokowe i czaszkowe, aby zakończyć wycięcie z czaszki. Homogenizuj mózgi za pomocą homogenizatora ze szklanym puchem umieszczonego na łaźni lodowej w 12 przejściach w górę w dół przy 500 obr./min.

Zatrzymaj się na chwilę przy każdym pociągnięciu w dół, aby zapewnić dokładną homogenizację tkanki. Przenieść cały homogenat mózgu do 14-mililitrowej probówki wirówkowej z okrągłym dnem o dużej prędkości i wirować ją w temperaturze 800 G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby uzyskać supernatant zwany S1. Przenieść S1 do nowej probówki wirówkowej, wyrzucić osad. Weź dwie pięciomikrolitrowe podwielokrotności S1 do testu kwasu bicinchoninowego i dwie 100-mikrolitrowe podwielokrotności S1 do western blot.

Wirować S1 w temperaturze 9 000 G przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby uzyskać synaptyczny supernatant somalny lub S2 i surowy osad synaptosomu lub P2. Weź dwie 10-mikrolitrowe podwielokrotności S2 do testu kwasu bicinchoninowego i dwie 500-mikrolitrowe podwielokrotności S2 do western blot. Odrzucić supernatant po otrzymaniu podwielokrotności. po odwirowaniu w temperaturze 9 000 G przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, uzyskać supernatant S2'i przemyty synaptosom, P2'Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić P2'w trzech mililitrach buforu A. Unikać ponownego zawieszenia ciemnoczerwonej części na dnie osadu, który zawiera głównie mitochondria.

Weź dwie 20-mikrolitrowe podwielokrotności P2'do testu kwasu bicinchoninowego i dwie 100-mikrolitrowe podwielokrotności P2' do western blot. Do hipotonicznej lizy przemytego synaptosmu dodać dziewięć objętości schłodzonego buforu B w celu ponownego zawieszenia P2' i homogenizować synaptosom w homogenizatorze ze szkła. Przenieś próbki do stożkowych probówek wirówkowych o pojemności 50 mililitrów i obracaj je na rewolwerze probówkowym w chłodni o temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 15 minut.

Odwirować zlizany P2'w temperaturze 25 000 G przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza w celu uzyskania supernatantu do lizy lub LS1 i osadu do lizy zawierającego błony synaptosomalne lub LP1. Weź dwie podwielokrotności LS1 o pojemności 50 mikrolitrów do testu kwasu bicynkowego i dwie podwielokrotności LS1 o pojemności 400 mikrolitrów do testu Western Blot. Przenieś LS1 do zakorkowanej probówki wirówkowej w celu ultra odwirowania.

Odwirować LS1 w wirniku ultrawirówki o stałym kącie pod kątem 100 000 G przez 60 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby uzyskać supernatant cytozolu synaptycznego lub LS2 i osad pęcherzyków synaptycznych lub LP2. Zawiesić LP2 w 500 mikrolitrach buforu A i za pomocą igły o rozmiarze 23 i jednomililitrowej strzykawki przezroczystej LP dwa z delikatnym rozcieraniem. Weź dwie 10 mikrolitrowych podwielokrotności LP2 do testu kwasu bicinchoninowego i dwie 250 mikrolitrowe podwielokrotności LP2 do western blot.

Przenieś około 30 mililitrów LS2 do odśrodkowych jednostek filtrujących z odcięciem 10 milidaltonów i zagęść LS2 do około 0,5 mililitra, wirując z prędkością 5 000 G przez maksymalnie godzinę w czterech stopniach Celsjusza. Weź dwie 10 mikrolitrowych porcji skoncentrowanego LS2 do testu bicynkowego i dwie 250 mikrolitrowe podwielokrotności skoncentrowanego LS2 do western blot. Ponownie zawiesić LP1 w jednym mililitrze buforu B i wziąć dwie 10-mikrolitrowe podwielokrotności LP1 do testu kwasu bicinchoninowego i dwie 50-mikrolitrowe podwielokrotności LP1 do western blot.

Dostosuj pozostały LP1 do końcowej objętości 7,5 mililitra i końcowego stężenia sacharozy 1,1 mola z buforem B i buforem C. Następnie przenieś 7,5 mililitra zawieszonego LP1 do 14-mililitrowej ultra probówki wirówkowej. Ostrożnie nałożyć na LP1 3,75 mililitra buforu D i zaznaczyć górną część roztworu pisakiem. Następnie nałożyć około 1,25 mililitra buforu A. I podobnie oznaczyć górną część roztworu pisakiem.

Zrównoważyć probówki do ultra wirowania wagowo, a nie objętościowo, z kroplowym dodaniem buforu A z dokładnością do 10 miligramów. Wirować w temperaturze 48 000 G przez 2,5 godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza w wahadłowym wirniku ultrawirówki kubełkowej i uzyskać obrazy nienaruszonych gradientów, aby udokumentować odrębność każdego granicy faz sacharozy i sukces frakcjonowania. Ostrożnie usuń powierzchowną warstwę 320-milimolowej sacharozy i odzyskaj frakcję mielinową na granicy faz sacharozy 320 milimolowej, 855 milimolowej w objętości 800 mikrolitrów.

Odpipetować od ścianki probówki w sposób okrężny, aby upewnić się, że zebrano całą frakcję. Następnie odzyskaj frakcję SPM na granicy faz sacharozy o średnicy 855 milimolów i 1,1 milimola w objętości 1000 mikrolitrów. Ostrożnie odessać pozostałą sacharozę i odzyskać osad mitochondrialny poprzez ponowne zawieszenie w 200 mikrolitrach buforu B. Rozcieńczyć frakcję SPM dwiema objętościami buforu B, a następnie odwirować w wirniku o stałym kącie w 3,5 mililitrowej probówce wirówkowej.

Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad SPM w buforze A do uzyskania końcowej objętości 250 mikrolitrów. Weź dwie, pięć mikrolitrów podwielokrotności SPM do testu kwasu bicinchoninowego i podziel pozostały SPM na pół na western blot. Obrazy synaptosomu z mikroskopii elektronowej pokazano na tym rysunku.

Pokazano tutaj synaptosom zawierający pęcherzyki synaptyczne, zarówno przed, jak i postsynaptyczne komponenty oraz pęcherzyki synaptyczne w mitochondrium. Przeprowadzono analizę immunoblot frakcji subkomórkowych w celu oceny markerów czystości frakcji. W porównaniu z początkowym homogenatem całego mózgu, analiza wykazała wzbogacenie n-kadheryny we frakcji błony plazmatycznej synapy, alfa synukleiny we frakcji synaptycznego cytozolu, synaptofizyny we frakcji pęcherzyków synaptycznych i podstawowego białka mieliny we frakcji mieliny.

Po ustaleniu czystości frakcji, ilościowe immunoblotting może być wykorzystany do określenia lokalizacji białek będących przedmiotem zainteresowania lub zbadania różnic w dystrybucji białek między genotypami lub leczeniem. Próbując wykonać tę procedurę, upewnij się, że używasz szklanych naczyń bez detergentów, aby można było zebrać nienaruszony synaptosom. Należy również zachować ostrożność podczas przygotowywania gradientów sacharozy, aby uzyskać wyraźne interfejsy.

Pozwoli to z powodzeniem wyizolować frakcję błony plazmatycznej synaptycznej. Aby poprawić jakość frakcji synaptycznych, można przeprowadzić różne analizy strukturalne i funkcjonalne, takie jak mikroskopia elektronowa, immunoblotting, proteomika i inne metody molekularne. Można również przeprowadzić uwalnianie neuroprzekaźników lub testy enzymatyczne, aby wspomóc żywotność metaboliczną synaptosomu.

Izolacja struktur synaptosomów była techniką zmiany paradygmatu w analizie funkcji i składu synaps. Ponieważ obserwujemy wczesną dysfunkcję synaps w neurodegeneracji, dokładna analiza zmian molekularnych na poziomie synaps pomoże nam zbadać mechanizmy molekularne tych zaburzeń.