Name: Frakcjonowanie subkomórkowe w celu wyizolowania składników synaptycznych z mózgu myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 14 s
Description: Poznaj metodę frakcjonowania subkomórkowego w celu wyizolowania składników synaptycznych z mózgu myszy. Ta technika umożliwia badanie lokalizacji i aktywności białek na poziomie kompartmentowym oraz analizę procesów synaptycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować P. Colosi za przygotowanie obrazu EM. Prace te były wspierane przez National Institutes of Health (R01 NS064963, SSC; R01 NS110354, SSC; R01 NS083846, SSC; R21 NS094971, SSC; T32 NS007224, SMT; T32 NS041228, SMT), Departament Obrony Stanów Zjednoczonych (W81XWH-17-1-0564, SSC; W81XWH-19-1-0264, VDJ), Aligning Science across Parkinson's (ASAP) Collaborative Research Network (SSC) oraz Michael J. Fox Foundation Target Advancement Program (MJFF-020160, SSC & VDJ). Ilustracje graficzne tworzyliśmy z wykorzystaniem BioRender.com.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W swoich przełomowych badaniach Whittaker i współpracownicy wykorzystali cztery kryteria morfologiczne do identyfikacji synaptosomów: (1) struktury mają uszczelnioną błonę plazmatyczną; (2) struktury zawierają SV przypominające te w zakończeniach nerwowych i żylaki in situ pod względem wielkości i liczby; (3) struktury posiadają jedno lub więcej małych mitochondriów; oraz (4) błona presynaptyczna jest często przylegająca do komponentu postsynaptycznego 11,12,13. Chociaż pierwsze dwa kryteria generalnie mają zastosowanie do każdej metody izolacji, w najnowszych protokołach opisanych w tym artykule nie wszystkie powstałe synaptosomy będą miały mitochondria i przyłączone zakończenia postsynaptyczne. Około 60% synaptosomów będzie miało mitochondria, a szacuje się, że tylko do 15% ma przyłączone zakończenia postsynaptyczne37. Jeśli składniki postsynaptyczne są szczególnie interesujące, wiadomo, że zastosowanie izotonicznego buforu homogenizacyjnego podobnego do Krebsa i filtracji ciśnieniowej w celu wzbogacenia daje wysokie stężenia synaptosomów z zakończeniami postsynaptycznymi (zwanymi również synaptoneurosomami)22,38.
Metoda składania w ofierze zwierzęcia może wpływać na jakość synaptosomów i podfrakcji synaptycznych. Dorosłe zwierzęta uśmiercone metodą eutanazji, która nie wymaga znieczulenia, uzyskają najlepszą jakość frakcji. Co więcej, mózgi powinny być świeżo wypreparowane, nie zamrożone i homogenizowane przy użyciu stosunku bufora homogenizacyjnego 1:10 (waga/objętość) dla najbardziej żywotnych frakcji synaptycznych22. Mózg ma niejednorodną populację synaps, które można różnicować ze względu na rodzaj przenoszonych przez nie neuroprzekaźników. Na tworzenie synaptosomów na ogół nie ma wpływu typ synapsy ani zawartość neuroprzekaźników13. Wyjątkiem są omszałe włókna w móżdżku, o których wiadomo, że są zaburzone w optymalnych warunkach do pozyskiwania synaptosomów z reszty mózgu39,40. Dlatego zaleca się usunięcie móżdżku przed homogenizacją mózgu, jeśli wykluczenie tego regionu nie wpływa na cel eksperymentalny. Jeśli jesteś zainteresowany izolacją synaptosomów o określonym charakterze neuroprzekaźnika, obszary mózgu, które są wzbogacone o neurony zawierające interesujący nas neuroprzekaźnik, mogą być najpierw wyizolowane. Podejście to będzie jednak nakładać ograniczenia na końcowy plon frakcji, w zależności od wielkości regionu zainteresowania (w związku z tym wiek zwierząt jest również brany pod uwagę). Istnieją immunochemiczne metody izolacji synaptosomów specyficznych dla neuroprzekaźników, ale żywotność i wydajność będą znacznie zagrożone22. Jeśli ocena żywotności metabolicznej synaptosomów jest ważna, można zastosować pomiar uwalniania neuroprzekaźników41,42 lub niektóre testy enzymatyczne43.
Typowe zanieczyszczenia w preparatach synaptosomów obejmują mikrosomy, wolne mitochondria, SV oraz błony neuronalne i glejowe. Zanieczyszczenie można zmniejszyć, zwiększając liczbę płukań przy frakcjach P1 i P222 i unikając ponownego zawieszania czerwonego osadu mitochondrialnego w kolejnych etapach. W eksperymentach, w których żywotność metaboliczna i czas mają kluczowe znaczenie, pomocne będzie zmniejszenie liczby prań i zastosowanie gradientów Ficoll lub Percoll zamiast gradientów sacharozy 44,45,46. Metody te również znacznie zmniejszają zanieczyszczenie. Oryginalny protokół Whittakera zaowocował wysokiej jakości SV. Dalsza optymalizacja dokonana przez Nagya i wsp.23, zawarta w tej metodzie, pozwala uzyskać SV o niezwykłej jednorodności i czystości bez znacznego uszczerbku dla plonu36. Jeśli interesujące są określone podtypy SV, takie jak SV glutaminergiczne (zawierające VGLUT-1) lub GABA-ergiczne (zawierające VGAT-1), można przeprowadzić immunoizolację przy użyciu swoistych przeciwciał47,48. Dostępne są również alternatywne metody izolowania CCV od synaptosomów, które ze względu na różną gęstość mogą nie występować na tym samym interfejsie, co SV otrzymane tą metodą 20,49,50.
Ogólnie rzecz biorąc, obecny protokół izolacji składników synaptycznych można dodatkowo zoptymalizować w celu uzyskania frakcji o zwiększonej jednorodności i żywotności w oparciu o jakość i ilość źródłowej tkanki mózgowej oraz cele eksperymentalne. Aby uzyskać więcej informacji na temat rozwiązywania problemów, należy zapoznać się z rozdziałami książek Dunkleya i Robinsona22 oraz Ganzella i wsp.36.

Synapsy są podstawowymi jednostkami obliczeniowymi mózgu, za pomocą których neurony komunikują się i wykonują różnorodne i niezwykle złożone funkcje. Synapsy mają zatem fundamentalne znaczenie dla zdrowia mózgu1; Dysfunkcja synaps jest uważana za źródło lub wynik wielu zaburzeń<klasa SUP="xref">2. Synapsy składają się z zakończeń pre- i postsynaptycznych, przedłużeń dwóch różnych neuronów, które są ściśle przylegające i oddzielone szczeliną synaptyczną przeciętą przez cząsteczki adhezyjne synaptyczne. Informacja przepływa z przedziału pre- i postsynaptycznego w postaci przekaźników chemicznych zwanych neuroprzekaźnikami1. Procesy molekularne związane z neuroprzekaźnictwem są aktywnymi obszarami badań3,4,5. Zrozumienie procesów patogennych w obrębie zakończeń synaptycznych i odpowiedzi synaps na patologię w innych podprzedziałach neuronalnych jest kluczowym krokiem w leczeniu zaburzeń mózgu1,2. Kilka postępów metodologicznych, zastosowanych głównie do modeli mysich, posunęło naprzód to dążenie6. Izolacja frakcji synaptycznych za pomocą wirowania różnicowego jest jedną z takich metod zmieniających paradygmat, która umożliwiła szczegółową ocenę procesów synaptycznych w zdrowiu i chorobie.
Mózg dorosłego człowieka składa się z 80-90 miliardów neuronów7,8. Wśród gatunków mysich mózg szczura zawiera około ~200 milionów neuronów, podczas gdy myszy mają ~70 milionów9,10. Każdy neuron tworzy tysiące specyficznych połączeń synaptycznych z siecią wysoce spolaryzowanych neuronów zmieszanych z komórkami glejowymi i gęstym unaczynieniem. W tak złożonej i niejednorodnej tkance kiedyś nie do pomyślenia było izolowanie i badanie synaps jako niezależnego systemu. W latach sześćdziesiątych XX wieku Victor Whittaker, Catherine Hebb i inni umożliwili to, izolując nienaruszone zakończenia synaptyczne za pomocą subkomórkowego frakcjonowania11,12,13,14. Próbując wyizolować pęcherzyki synaptyczne (SV), homogenizowali mózgi za pomocą siły ścinającej ciecz w izoosmotycznej (0,32 M) sacharozy, a następnie ultrawirowania. Uzyskali ściśnięte, otoczone błoną plazmatyczną, nienaruszone zakończenia nerwowe lub żylaki, które nazwali cząstkami zakończeń nerwowych (NEPs)11,13. Ponieważ strukturalne i funkcjonalne cechy synapsy zostały zachowane w tych strukturach, NEP-y zostały później nazwane "synaptosomami" w celu zgodności z innymi organellami subkomórkowymi13,15. Warto zauważyć, że praca Eduardo de Robertisa i współpracowników, którzy ukuli termin "pęcherzyk synaptyczny", pokrywała się z pracami Whittakera i współpracowników i przyczyniła się do walidacji izolacji i charakterystyki "synaptosomu"16,17,18.
Synaptosomy to fizjologicznie aktywne struktury, które zawierają wszystkie właściwości komórkowe i molekularne niezbędne do przechowywania, uwalniania i wychwytu zwrotnego neuroprzekaźników13,18. Zachowanie kluczowych cech synaptycznych in vitro i brak składników niesynaptycznych również przyczynia się do użyteczności tej metody izolacji. Synaptosomy w ogromnym stopniu przyczyniły się do zrozumienia chemicznych i fizjologicznych właściwości neuroprzekaźnictwa, a obecnie są wykorzystywane do badania synaptycznych procesów molekularnych i ich zmian w chorobie19,20,21,22,23. Synaptosomy są również początkowym materiałem źródłowym do izolowania składników synaptycznych, takich jak SV, pęcherzyki pokryte klatryną (CCV), cytozol synaptyczny, błona plazmatyczna synaptyczna, mitochondria synaptyczne, cząsteczki adhezji synaptycznej i inne składniki będące przedmiotem zainteresowania, które mogą ułatwić zrozumienie molekularnych mechanizmów funkcji synaptycznej18,19,20,24,25,26,27,28. Te subsynaptyczne składniki można uzyskać przez osmotyczną lizę synaptosomów i ultrawirowanie w gradiencie gęstości sacharozy15,29. Chociaż oryginalna metoda frakcjonowania subkomórkowego opracowana przez grupę badawczą Whittakera jest znana z tego, że jest skuteczna w izolowaniu wysokiej jakości synaptosomów i SVs13,30, ostatnie optymalizacje zwiększają czystość frakcji subkomórkowych22,23,31,32. Ten artykuł zawiera bardzo szczegółową i przystępną wersję klasycznego protokołu subkomórkowego frakcjonowania mysiej tkanki mózgowej w celu wyizolowania synaptosomów, SV i innych składników subsynaptycznych.

<table><tbody><tr><td>1 ml TB Strzykawka</td><td>BD</td><td>309649</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml Eppendorf Tubes</td><td>USA Scientific</td><td>1415-2500</td><td></td></tr><tr><td>14 mL, otwarta cienkościenna ultraprzezroczysta rurka</td><td>Beckman Coulter</td><td>344060</td><td>Kompatybilna z</td></tr><tr><td>igłą podskórną SW 40 Ti 23 Gauge Precision Glide</td><td>BD</td><td>305145</td><td></td></tr><tr><td>26,3 mL, butelka z poliwęglanu z zespołem nakrętki</td><td>Beckman Coulter</td><td>355618</td><td>Kompatybilna z</td></tr><tr><td>grubościenną rurką polipropylenową Ti70 3,5 mL z otwartym</td> wierzchem <td>Beckman Coulter</td><td>349623</td><td>Kompatybilna z TLA-100.3</td></tr><tr><td>50 ml Falcon Tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>Filtr odśrodkowy Amicon Ultra-15&nbsp;</td><td>Millipore Sigma UFC901024</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aprotinin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6279</td><td>1 mg / ml w diH2O</td></tr><tr><td>Wirówka Avanti J-26 XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>B22984</td><td>< 26 000 obr./min</td></tr><tr><td>Stołowa kolba Dewara HDPE</td><td>Thermo Scientific</td><td>5028U19</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J Myszy</td><td>Wirówka Jackson Labs</td><td>000664</td><td></td></tr><tr><td>5810R</td><td>Eppendorf</td><td>EP022628168</td><td>< 14 000 obr./min</td></tr><tr><td>kompletne, mini, wolne od EDTA tabletki koktajlowe z inhibitorem proteazy</td><td>Roche</td><td>11873580001</td><td>Dodaj 1 tabletkę na 50 ml roztworu</td></tr><tr><td>Zakrzywione kleszcze</td><td>Narzędzia do nauki</td><td>precyzyjnej 11273-20</td><td></td></tr><tr><td>Cienkie nożyczki chirurgiczne</td><td>Fine Science Tools</td><td>8r</td><td></td></tr><tr><td>System homogenizacji tkanek Glas-Col</td><td>Cole-Parmer</td><td>UX-04369-15</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze Graefe</td><td>Fine Science Tools</td><td>11650-10</td><td></td></tr><tr><td>Szybkoobrotowe probówki wirówkowe z okrągłym dnem z poliwęglanu</td><td>ThermoFisher</td><td>3117-0500</td><td>Kompatybilny z izofluoranem JA20</td></tr><tr><td></td><td>Henry Schein Zdrowie zwierząt</td><td>NDC 11695-6776-2</td><td></td></tr><tr><td>JA-20 Rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>334831</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptin</td><td>American Bio</td><td>AB01108</td><td>1 mg / ml w diH2O</td></tr><tr><td>Kwas N-[2-hydroksyetylo]piperazyno-N'-[2-etanosulfonowy] (HEPES)</td><td>American Bio</td><td>AB00892</td><td></td></tr><tr><td>Optima L-80 XP Ultrawirówka</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>< 100 000 obr./min</td></tr><tr><td>Ultrawirówka Optima TLX</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>< 120 000 obr./min</td></tr><tr><td>Pepstatyna A</td><td>Thermo Scientific</td><td>78436</td><td>1 mg / ml w</td></tr><tr><td>DMSO Fluorek fenylometylosulfonylu (PMSF)</td><td>American Bio</td><td>AB01620</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Zestaw do oznaczania białek BCA</td><td>Thermo Scientific</td><td>23335</td><td>Do oznaczania stężenia białka</td></tr><tr><td>Końcówki</td><td></td><td></td><td></td>do pipet</tr><tr><td>Pipety</td><td></td><td></td><td></td> serologiczne</tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki chirurgiczne</td><td>Fine Science Tools</td><td>14002-12</td><td></td></tr><tr><td>SW 40 Ti Rotor z łyżką wahadłową</td><td>Beckman Coulter</td><td>331301</td><td></td></tr><tr><td>teflonowy tłuczek i moździerz Młynek do tkanek</td><td>Thomas Scientific</td><td>3431D94</td><td></td></tr><tr><td>Ti70 Rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>337922</td><td></td></tr><tr><td>TLA-100.3 Rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>349490</td><td></td></tr><tr><td>Rewolwer rurowy</td><td>Dot Scientific</td><td>DTR-02VS</td><td></td></tr></tbody></table>

frakcjonowanie subkomórkowe w celu wyizolowania składników synaptycznych z mózgu myszy

Subcellular Fractionation for the Isolation of Synaptic Components from the Murine Brain

Zakończenia synaptyczne są głównymi miejscami komunikacji neuronalnej. Dysfunkcja synaps jest cechą charakterystyczną wielu zaburzeń neuropsychiatrycznych i neurologicznych. Charakterystyka podprzedziałów synaptycznych za pomocą izolacji biochemicznej jest zatem potężną metodą wyjaśniania molekularnych podstaw procesów synaptycznych, zarówno w zdrowiu, jak i chorobie. Protokół ten opisuje izolację zakończeń synaptycznych i podprzedziałów synaptycznych z mózgów myszy poprzez frakcjonowanie subkomórkowe. Po pierwsze, uszczelnione struktury końcówek synaptycznych, znane jako synaptosomy, są izolowane po homogenizacji tkanki mózgowej. Synaptosomy to neuronalne przedziały pre- i postsynaptyczne z ściśniętymi i uszczelnionymi błonami. Struktury te zachowują metabolicznie aktywny stan i są cenne dla badania struktury i funkcji synapty. Synaptosomy są następnie poddawane hipotonicznej lizie i ultrawirowaniu w celu uzyskania podkompartmentów synaptycznych wzbogaconych o pęcherzyki synaptyczne, cytozol synaptyczny i błonę plazmatyczną synaptyczną. Czystość frakcji potwierdza mikroskopia elektronowa i analiza wzbogacenia biochemicznego białek specyficznych dla przedziałów subsynaptycznych. Przedstawiona metoda jest prostym i cennym narzędziem do badania cech strukturalnych i funkcjonalnych synapsy oraz etiologii molekularnej różnych zaburzeń mózgu.

Przedstawiona metoda pozwala na uzyskanie 11 frakcji subkomórkowych mózgu, które mogą zostać poddane dalszemu oczyszczaniu i różnym formom analizy końcowej35,36. Złotym standardem w ocenie jakości synaptosomów, pęcherzyków synaptycznych (SVs)23 oraz innych komponentów jest mikroskopia elektronowa (EM) (Rysunek 7). W celu oceny markerów czystości frakcji można również przeprowadzić ilościowy immunoblotting białek obecnych w konkretnych frakcjach subkomórkowych (Rysunek 8). Przykładowo, analiza immunoblottingowa frakcji wykazuje wzbogacenie N-kadheryny (CDH2, nazwa UniProt) we frakcji błony plazmatycznej synaps (SPM), α-synukleiny (SYUA) w cytosolu synaptycznym (LS2), synaptofizyny (SYPH) we frakcji pęcherzyków synaptycznych (LP2) oraz podstawowego białka mieliny (MBP) we frakcji mieliny (MF) w porównaniu z poziomami białek w początkowym homogenacie całego mózgu (Total) (Rysunek 8). Po ustaleniu czystości frakcji (na przykład zauważając brak CDH2 we frakcji LS2 lub wielokrotny wzrost poziomu SYPH we frakcji LP2), ilościowy immunoblotting może zostać wykorzystany do określenia lokalizacji białek zainteresowania lub zbadania różnic w rozkładzie białek pomiędzy genotypami lub wariantami traktowania. Zrozumienie lokalizacji subkomórkowej białek synaptycznych może umożliwić opisanie wcześniej nieznanych funkcji białek. Ponadto metoda ta może pomóc w wyjaśnieniu defektów transportu lub dysfunkcji synaptycznych w stanach chorobowych, zwłaszcza w połączeniu z testami funkcjonalnymi. Przykładowo, nasz zespół wykorzystał tę metodę do zidentyfikowania puli enzymatycznie aktywnej palmitoilowej białkowej tioesterazy 1, która jest wzbogacona w cytosolu synaptycznym19.
<img alt="Struktura komórkowa na obrazach z mikroskopu elektronowego; wizualizacja organelli; analiza biologiczna." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64574/64574fig07.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 7"> 
Rysunek 7: Mikroskopia elektronowa (EM) synaptosomów. (A) Reprezentatywny obraz EM synaptosomu zawierającego pęcherzyki synaptyczne (strzałka). (B) Reprezentatywny obraz EM synaptosomu z elementami przedsynaptycznymi (strzałka) i postsynaptycznymi (podwójna strzałka). (C) Reprezentatywny obraz EM synaptosomu zawierającego pęcherzyki synaptyczne i mitochondrium (strzałka) (paski skali = 100 nm). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64574/64574fig07large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Western blot i wykres słupkowy analizujący wzbogacenie markerów białkowych w frakcjach komórkowych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64574/64574fig08.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 8"> 
Rycina 8: Analiza immunoblotting frakcji subkomórkowych. (A) Markery czystości frakcji subkomórkowych (oznaczone zgodnie z nomenklaturą UniProt) są odpowiednio zlokalizowane w porównaniu z homogenatem całego mózgu (total): N-kadheryna (CDH2) we frakcji błony plazmatycznej synaps (SPM), synaptofizyna 1 (SYPH) i synaptojanina 1 (SYNJ1) we frakcji wzbogaconej w pęcherzyki synaptyczne (LP2), α-synukleina (SYUA) w cytosolu synaptycznym (LS2) oraz białko zasadowe mieliny (MBP) we frakcji mieliny (MF). (B) Ilościowa analiza immunoblottingu wykazuje wzbogacenie (zmiana krotności względem total) markerów czystości frakcji. Dane przedstawiono jako średnia ± odchylenie standardowe w skali log10. Linia przerywana wskazuje 1,5-krotną zmianę (y = 0,176) (n = 3 powtórzone eksperymenty z 8 myszami typu dzikiego; wiek = 2 miesiące; n = 4-5 blotów dla SYPH, SYUA, MBP, z n = 3 wartościami naniesionymi na wykres, opublikowanymi wcześniej przez Gorenberga i wsp.19; n = 5 dla SYNJ1; n = 1 dla CDH2). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64574/64574fig08large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>

Ten protokół przedstawia solidną, szczegółową metodę uzyskiwania wysoce czystych synaptosomów, pęcherzyków synaptycznych i innych frakcji synaptycznych z mózgu myszy. Metoda ta umożliwia ocenę procesów synaptycznych, w tym analizę biochemiczną lokalizacji i funkcji białek z rozdzielczością kompartmentową.

Frakcjonowanie subkomórkowe w celu wyizolowania składników synaptycznych z mózgu myszy

Synaptic terminals are the primary sites of neuronal communication. Synaptic dysfunction is a hallmark of many neuropsychiatric and neurological ...

Synapsy są podstawowymi jednostkami obliczeniowymi mózgu. Przedstawiona metoda jest prostym i cennym narzędziem do badania synaps i ich procesów molekularnych, a także do zrozumienia, w jaki sposób mogą one być zmieniane w różnych zaburzeniach mózgu. Technika ta polega na frakcjonowaniu struktur synaptosomów odizolowanych od mózgu.Dzięki temu badacz może uchwycić efekty, które mogą być podzielone na segmenty w synapsie. Poziomy dystrybucji i aktywność określonych białek mogą być również analizowane z rozdzielczością subsynaptyczną. Procedura ta zajmuje indywidualnemu badaczowi około 11 godzin, jeśli wszystko pójdzie gładko.Osoba, która nigdy nie wykonywała tej techniki, może mieć trudności z długością tej procedury, ponieważ naturalnie zajmie to trochę więcej czasu komuś, kto nie jest zaznajomiony z krokami. Ze względu na długość tego eksperymentalnego dnia, zdecydowanie zalecamy wykonanie sekcji z partnerem, który może pomóc w szybkim pobraniu tkanek, aby upewnić się, że żadne próbki nie zostaną umieszczone na lodzie dłużej niż jest to konieczne. Zalecamy również przygotowanie i materiałów stołowych na dzień przed przeprowadzeniem tego eksperymentu, aby wszystko było w zasięgu ręki w razie potrzeby.Jest to szczególnie prawdziwe w przypadku tubek zbiorczych. Do końca tej procedury zostanie pobranych wiele podwielokrotności łącznie 11 frakcji subkomórkowych. Tak więc wyraźne oznakowanie tych rurek z wyprzedzeniem znacznie ułatwi Ci dzień.Na początek włóż cienkie nożyczki pod skórę w miejscu nacięcia głowy na głębokość okołoczaszkową i wykonaj środkowe nacięcie strzałkowe aż do szwu donosowego, aby cofnąć skórę głowy od czaszki. Pracując od obszaru potylicznego w kierunku każdego aspektu skroniowego, przytnij powięź i mięsień, aby odsłonić zewnętrzną powierzchnię czaszki poza każdy zewnętrzny przewód akustyczny. Zabezpiecz skórę głowy i rostralny aspekt czaszki ręką niedominującą, a drugą ręką włóż cienkie nożyczki dwa milimetry w ogonową stronę otworu wielkiego, z którego wychodzi rdzeń kręgowy.Wykonaj nacięcie w linii środkowej, aż nożyczki dotrą do wewnętrznej powierzchni kości śródciemieniowej. Zmień kąt nożyczek tak, aby ostrza biegły równolegle do grzbietowej powierzchni czaszki. Kontynuuj przesuwanie nacięcia środkowego strzałkowo przez kość ciemieniową i czołową, używając szwów strzałkowych i międzyczołowych jako przewodnika i zakończ nacięcie tuż za szwem międzynosowym.Następnie wykonaj trzymilimetrowe prostopadłe nacięcie do kości nosowej, rostralne do szwu międzynosowego, umieszczając nożyczki prostopadle do czaszki, tak aby każde ostrze znajdowało się na szwie przedszczękowym nosa i wykonując jedno równe cięcie. Zabezpieczając aspekt rostralny, użyj jednej strony pary teksturowanych kleszczy, aby delikatnie podnieść czaszkę z mózgu, a następnie podnieś ją na boki i brzusznie. W razie potrzeby powtórz wzdłuż linii środkowej, a następnie dla drugiej półkuli, aż cała powierzchnia mózgu zostanie odsłonięta.Za pomocą zakrzywionych kleszczy lub cienkiej szpatułki delikatnie podnieś rostralną stronę mózgu. Przetnij nerwy wzrokowe i czaszkowe, aby zakończyć wycięcie z czaszki. Homogenizuj mózgi za pomocą homogenizatora ze szklanym puchem umieszczonego na łaźni lodowej w 12 przejściach w górę w dół przy 500 obr./min.Zatrzymaj się na chwilę przy każdym pociągnięciu w dół, aby zapewnić dokładną homogenizację tkanki. Przenieść cały homogenat mózgu do 14-mililitrowej probówki wirówkowej z okrągłym dnem o dużej prędkości i wirować ją w temperaturze 800 G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby uzyskać supernatant zwany S1. Przenieść S1 do nowej probówki wirówkowej, wyrzucić osad. Weź dwie pięciomikrolitrowe podwielokrotności S1 do testu kwasu bicinchoninowego i dwie 100-mikrolitrowe podwielokrotności S1 do western blot.Wirować S1 w temperaturze 9 000 G przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby uzyskać synaptyczny supernatant somalny lub S2 i surowy osad synaptosomu lub P2. Weź dwie 10-mikrolitrowe podwielokrotności S2 do testu kwasu bicinchoninowego i dwie 500-mikrolitrowe podwielokrotności S2 do western blot. Odrzucić supernatant po otrzymaniu podwielokrotności. po odwirowaniu w temperaturze 9 000 G przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, uzyskać supernatant S2'i przemyty synaptosom, P2'Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić P2'w trzech mililitrach buforu A. Unikać ponownego zawieszenia ciemnoczerwonej części na dnie osadu, który zawiera głównie mitochondria.Weź dwie 20-mikrolitrowe podwielokrotności P2'do testu kwasu bicinchoninowego i dwie 100-mikrolitrowe podwielokrotności P2' do western blot. Do hipotonicznej lizy przemytego synaptosmu dodać dziewięć objętości schłodzonego buforu B w celu ponownego zawieszenia P2' i homogenizować synaptosom w homogenizatorze ze szkła. Przenieś próbki do stożkowych probówek wirówkowych o pojemności 50 mililitrów i obracaj je na rewolwerze probówkowym w chłodni o temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 15 minut.Odwirować zlizany P2'w temperaturze 25 000 G przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza w celu uzyskania supernatantu do lizy lub LS1 i osadu do lizy zawierającego błony synaptosomalne lub LP1. Weź dwie podwielokrotności LS1 o pojemności 50 mikrolitrów do testu kwasu bicynkowego i dwie podwielokrotności LS1 o pojemności 400 mikrolitrów do testu Western Blot. Przenieś LS1 do zakorkowanej probówki wirówkowej w celu ultra odwirowania.Odwirować LS1 w wirniku ultrawirówki o stałym kącie pod kątem 100 000 G przez 60 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby uzyskać supernatant cytozolu synaptycznego lub LS2 i osad pęcherzyków synaptycznych lub LP2. Zawiesić LP2 w 500 mikrolitrach buforu A i za pomocą igły o rozmiarze 23 i jednomililitrowej strzykawki przezroczystej LP dwa z delikatnym rozcieraniem. Weź dwie 10 mikrolitrowych podwielokrotności LP2 do testu kwasu bicinchoninowego i dwie 250 mikrolitrowe podwielokrotności LP2 do western blot.Przenieś około 30 mililitrów LS2 do odśrodkowych jednostek filtrujących z odcięciem 10 milidaltonów i zagęść LS2 do około 0,5 mililitra, wirując z prędkością 5 000 G przez maksymalnie godzinę w czterech stopniach Celsjusza. Weź dwie 10 mikrolitrowych porcji skoncentrowanego LS2 do testu bicynkowego i dwie 250 mikrolitrowe podwielokrotności skoncentrowanego LS2 do western blot. Ponownie zawiesić LP1 w jednym mililitrze buforu B i wziąć dwie 10-mikrolitrowe podwielokrotności LP1 do testu kwasu bicinchoninowego i dwie 50-mikrolitrowe podwielokrotności LP1 do western blot.Dostosuj pozostały LP1 do końcowej objętości 7,5 mililitra i końcowego stężenia sacharozy 1,1 mola z buforem B i buforem C. Następnie przenieś 7,5 mililitra zawieszonego LP1 do 14-mililitrowej ultra probówki wirówkowej. Ostrożnie nałożyć na LP1 3,75 mililitra buforu D i zaznaczyć górną część roztworu pisakiem. Następnie nałożyć około 1,25 mililitra buforu A. I podobnie oznaczyć górną część roztworu pisakiem.Zrównoważyć probówki do ultra wirowania wagowo, a nie objętościowo, z kroplowym dodaniem buforu A z dokładnością do 10 miligramów. Wirować w temperaturze 48 000 G przez 2,5 godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza w wahadłowym wirniku ultrawirówki kubełkowej i uzyskać obrazy nienaruszonych gradientów, aby udokumentować odrębność każdego granicy faz sacharozy i sukces frakcjonowania. Ostrożnie usuń powierzchowną warstwę 320-milimolowej sacharozy i odzyskaj frakcję mielinową na granicy faz sacharozy 320 milimolowej, 855 milimolowej w objętości 800 mikrolitrów.Odpipetować od ścianki probówki w sposób okrężny, aby upewnić się, że zebrano całą frakcję. Następnie odzyskaj frakcję SPM na granicy faz sacharozy o średnicy 855 milimolów i 1,1 milimola w objętości 1000 mikrolitrów. Ostrożnie odessać pozostałą sacharozę i odzyskać osad mitochondrialny poprzez ponowne zawieszenie w 200 mikrolitrach buforu B. Rozcieńczyć frakcję SPM dwiema objętościami buforu B, a następnie odwirować w wirniku o stałym kącie w 3,5 mililitrowej probówce wirówkowej.Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad SPM w buforze A do uzyskania końcowej objętości 250 mikrolitrów. Weź dwie, pięć mikrolitrów podwielokrotności SPM do testu kwasu bicinchoninowego i podziel pozostały SPM na pół na western blot. Obrazy synaptosomu z mikroskopii elektronowej pokazano na tym rysunku.Pokazano tutaj synaptosom zawierający pęcherzyki synaptyczne, zarówno przed, jak i postsynaptyczne komponenty oraz pęcherzyki synaptyczne w mitochondrium. Przeprowadzono analizę immunoblot frakcji subkomórkowych w celu oceny markerów czystości frakcji. W porównaniu z początkowym homogenatem całego mózgu, analiza wykazała wzbogacenie n-kadheryny we frakcji błony plazmatycznej synapy, alfa synukleiny we frakcji synaptycznego cytozolu, synaptofizyny we frakcji pęcherzyków synaptycznych i podstawowego białka mieliny we frakcji mieliny.Po ustaleniu czystości frakcji, ilościowe immunoblotting może być wykorzystany do określenia lokalizacji białek będących przedmiotem zainteresowania lub zbadania różnic w dystrybucji białek między genotypami lub leczeniem. Próbując wykonać tę procedurę, upewnij się, że używasz szklanych naczyń bez detergentów, aby można było zebrać nienaruszony synaptosom. Należy również zachować ostrożność podczas przygotowywania gradientów sacharozy, aby uzyskać wyraźne interfejsy.Pozwoli to z powodzeniem wyizolować frakcję błony plazmatycznej synaptycznej. Aby poprawić jakość frakcji synaptycznych, można przeprowadzić różne analizy strukturalne i funkcjonalne, takie jak mikroskopia elektronowa, immunoblotting, proteomika i inne metody molekularne. Można również przeprowadzić uwalnianie neuroprzekaźników lub testy enzymatyczne, aby wspomóc żywotność metaboliczną synaptosomu.Izolacja struktur synaptosomów była techniką zmiany paradygmatu w analizie funkcji i składu synaps. Ponieważ obserwujemy wczesną dysfunkcję synaps w neurodegeneracji, dokładna analiza zmian molekularnych na poziomie synaps pomoże nam zbadać mechanizmy molekularne tych zaburzeń.

subcellular-fractionation-for-isolation-synaptic-components-from

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Opisano metodę przygotowania translacyjnie aktywnych, nienaruszonych synaptoneurosomów (SNs) z kory mózgu myszy. Metoda ta wykorzystuje nieciągły gradient gęstości Percoll-sukroza, co umożliwia szybkie przygotowanie aktywnych SNs.

Przygotowanie synaptoneurosomów z kory mózgu myszy z wykorzystaniem nieciągłego gradientu gęstości Percoll-sukroza

W tym filmie przeprowadzamy izolację komórek jednojądrzastych z mózgu myszy za pomocą wirowania gradientu gęstości. Wyizolowaną zawiesinę komórek jednojądrzastych można wykorzystać do dalszej analizy.

Izolacja komórek jednojądrzastych z mózgu myszy: technika wirowania w gradimencie gęstości do izolowania komórek jednojądrzastych rezydujących w mózgu

Ten film demonstruje metodę izolowania fluorescencyjnie znakowanych neuronów z mózgu myszy.

Izolowanie fluorescencyjnie znakowanych neuronów z mysiego mózgu

Ten artykuł szczegółowo opisuje wzbogacanie białek związanych z błoną plazmatyki synaptycznej przez ultrawirowanie na nieciągłym gradiencie sacharozy. Opisano również późniejsze przygotowanie białek o gęstości postsynaptycznej. Preparaty białkowe nadają się do western blotting lub analizy 2D DIGE.

Otrzymywanie błony plazmatycznej synaps i białek o gęstości postsynaptycznej przy użyciu nieciągłego gradientu sacharozy

Identyfikacja molekuł i szlaków kontrolujących plastyczność synaptyczną i pamięć jest nadal głównym wyzwaniem w neurobiologii. W tym miejscu opisano przepływ pracy dotyczący względnej kwantyfikacji białek synaptycznych rzekomo zaangażowanych w molekularną reorganizację synaps podczas uczenia się i konsolidacji pamięci w paradygmacie uczenia się słuchowego.

Ilościowe profilowanie proteomu synaptycznego w wysokiej rozdzielczości regionów mózgu myszy po uczeniu się dyskryminacji słuchowej

Tutaj prezentujemy protokół frakcjonowania błony mózgowej, który stanowi solidną procedurę izolowania białek należących do różnych przedziałów synaptycznych.

Frakcjonowanie błony mózgowej: podejście ex vivo do oceny lokalizacji białek subsynaptycznych

Napad elektrowstrząsowy (ECS) to eksperymentalny model terapii elektrowstrząsowej w ciężkiej depresji. ECS globalnie stymuluje aktywność hipokampa, prowadząc do synaptogenezy i plastyczności synaptycznej. W tym miejscu opisujemy metody indukcji ECS u szczurów i subkomórkowego frakcjonowania ich hipokampów w celu zbadania zmian w białkach synaptycznych wywołanych napadami.

Napady elektrowstrząsowe u szczurów i frakcjonowanie ich hipokampów w celu zbadania wywołanych napadami zmian w białkach o gęstości postsynaptycznej

Tutaj opisujemy ilościowe podejście do określania rozkładu białka synaptycznego względem białka markerowego za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego, mikroskopii konfokalnej i analizy komputerowej.

Kwantyfikacja niejednorodnego rozmieszczenia białka synaptycznego w mózgu myszy za pomocą immunofluorescencji

Dostarczamy protokół izolacji mikrogleju z różnych wypreparowanych obszarów półkuli mózgu dorosłej myszy, a następnie półautomatyczne przygotowanie biblioteki do głębokiego sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki transkryptomów pełnej długości. Metoda ta pomoże wyjaśnić funkcjonalną heterogeniczność mikrogleju w zdrowiu i chorobie.

Izolacja specyficznego dla regionu mikrogleju z jednej dorosłej półkuli mózgu myszy w celu głębokiego sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki

Ten protokół dysocjacji komórek nerwowych jest przeznaczony dla próbek z małą ilością materiału wyjściowego i daje wysoce żywotną zawiesinę pojedynczej komórki do dalszej analizy, z opcjonalnymi etapami utrwalania i barwienia.

Połączona mechaniczna i enzymatyczna dysocjacja tkanki hipokampa mózgu myszy

Ta praca opisuje protokół do kwantyfikacji globalnych modyfikacji histonów za pomocą wewnątrzjądrowej cytometrii przepływowej w izolowanym mikrogleju mózgu. Praca zawiera również protokół izolacji mikrogleju, który został wykorzystany do zebrania danych.

Kwantyfikacja globalnych modyfikacji potranslacyjnych histonów za pomocą wewnątrzjądrowej cytometrii przepływowej w izolowanym mikrogleju mózgu myszy

Poznaj metodę frakcjonowania subkomórkowego w celu wyizolowania składników synaptycznych z mózgu myszy. Ta technika umożliwia badanie lokalizacji i aktywności białek na poziomie kompartmentowym oraz analizę procesów synaptycznych.

Frakcjonowanie subkomórkowe w celu wyizolowania składników synaptycznych z mózgu myszy

Przeglądaj więcej filmów