Otrzymywanie synaptoneurosomów z kory myszy przy użyciu nieciągłego gradientu gęstości perkolu i sacharozy
17 września 2011
Opisano metodę przygotowania translacyjnie aktywnych, nienaruszonych synaptoneurosomów (SN) z kory mózgowej myszy. W metodzie wykorzystuje się nieciągły gradient gęstości perkolu i sacharozy, co pozwala na szybkie otrzymanie aktywnych SN.
Ogólnym celem tej procedury jest przygotowanie translacyjnie aktywnej synapy do stref neurologicznych z kory mózgowej myszy, przy użyciu nieciągłego gradientu gęstości sacharozy peralnej. Osiąga się to poprzez najpierw zebranie i homogenizację kory myszy, a następnie odwirowanie homogenatu. Następnie nanieść homogenat wirówki lub sup natant do praportu na gradienty co sacharozy.
Ostatnim krokiem jest odwirowanie i zebranie frakcji synaptosomu. Ostatecznie analiza western blot i eksperymenty z inkorporacją metioniny S 35 pokazują, że frakcja synaptosomów jest wzbogacona synaptycznie i aktywna translacyjnie. Główne zalety tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak wirowanie i filtracja, nasze pierwsze uszkodzenia mechaniczne są unikane dzięki zastosowaniu gradientów gęstości, a druga na wywołanie ma niską toksyczność dla komórek w ich składnikach.
Ogólnie rzecz biorąc, osoby nowe w tej metodzie będą zmagać się z tym protokołem, ponieważ czas odgrywa kluczową rolę. Po zebraniu korty procedura powinna zostać szybko zakończona. Aby rozpocząć procedurę, należy przygotować warstwy gradientu 3, 10, 15 i 23%, dodając odpowiednie ilości SIP zgodnie z opisem w dołączonym manuskrypcie do bufora GM i dobrze wymieszać.
Wlać warstwy gradientu, pipetując po dwa mililitry z każdego z 23, 15, 10 i 3% izosmotycznych roztworów perolu do probówek wirówkowych Beckman z nakrętkami. Używając pipety P 1000, powierzchnia styku między warstwami powinna być wyraźnie widoczna, bez mieszania warstw. Przechowuj nachylenia czterech stopni Celsjusza przez co najmniej 20 minut przed użyciem.
Przed rozpoczęciem tej procedury należy przygotować inne niezbędne rozwiązania zgodnie z opisem w dołączonym manuskrypcie. Poddaj mysz eutanazji w wieku od P 13 do P 21 i przygotuj ją do sekcji, spryskując tył szyi i głowę 70% etanolem. Następnie użyj ostrych nożyczek, aby przeciąć rdzeń kręgowy u podstawy czaszki.
Następnie usuń skórę z górnej części czaszki. Przetnij czaszkę bocznie między kością ciemieniową a kością międzyciemieniową lub między mózgowiem a obszarami kory. Następnie przetnij czaszkę od podstawy do nosa wzdłuż szwu strzałkowego.
Na tym etapie ostrożnie usuń miękką kość ciemieniową, pociągając każdą półkulę na bok. Następnie włóż szpatułkę do mózgu nad móżdżkiem, aby zgarnąć korę. Umieść go w lodowatym buforze GMO i powtórz procedury ponownie, aby zebrać więcej kory.
Teraz opłucz korę w lodowatym buforze GMO. Następnie przenieś dwie korowe wody do homogenizatora ze szklanym puchem zawierającego pięć mililitrów zimnego buforu GMO. Delikatnie homogenizuj korę za pomocą pięciu do 10 uderzeń tłuczka A, luźnego tłuczka, a następnie od pięciu do 10 uderzeń tłuczka B, tłuczka typu tłuczek.
Liczba uderzeń różni się w zależności od indywidualnego homogenizatora. Przenieś homogenat do stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów. Odwiruj go 1000 razy.
Grawitacja przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza w wirówce Allegra six KR w celu osadzania szczątków komórkowych i jąder. Ułóż dwa mililitry supinatu dla każdego gradientu per lub sacharozy z jednym gradientem dla każdej całej kory i zakryj rurki. Następnie odwiruj je w wirniku o stałym kącie nachylenia 32, 500 razy większym niż grawitacja przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza w wirówce Beckman J 2 21.
Używając odpowiednich adapterów po zakończeniu, gradient powinien usunąć mocną pipetę pasmową SN i wyrzucić roztwór powyżej pasma SN. Używając szklanej pipety do makaronu, pipetuje się pasmo SN na granicy faz od 15 do 23%, jeden gradient zwykle daje około 0,9 do 1,1 mililitra sns. Następnie przenieś go do stożkowej rurki i przechowuj na lodzie.
Następnie dostosuj stężenie soli w SNS, dodając jedną dziesiątą objętość 10-krotnego buforu stymulacyjnego. Opcjonalnie dodać 1000 razy chlorek wapnia, aby uzyskać końcowe stężenie 12 anomolowców. Następnie dodaj jeden milimolowy zapas TTX, aby uzyskać końcowe stężenie jednego mikromola, aby stłumić wzbudzenie nieswoiste.
Następnym krokiem jest użycie SNS w odpowiedniej aplikacji podrzędnej, takiej jak badania translacji białek. W przypadku innych zastosowań lizat SN można oczyścić lub zagęścić za pomocą zestawu do przygotowywania próbek stron Pierce SDS. Stężenie białka w SNS można określić za pomocą zestawu do oznaczania białek mikro BCA.
Oto przykład sześciu pasm lub ułamków. Kiedy kora myszy została zhomogenizowana i oddzielona na nieciągłych gradientach sacharozy perolu, wzbogacony SNS zawarto w paśmie piątym na granicy faz od 23 do 15%, pasmo to usunięto i zbadano za pomocą mikroskopii elektronowej. Przykład nienaruszonych pęcherzyków synaptycznych i zachowania elementów presynaptycznych i postsynaptycznych pokazano tutaj w western blot.
Wykazano, że wzrost markerów synaptycznych i spadek zanieczyszczeń w paśmie SN z nieciągłego gradientu na sacharozę potwierdza, że wzrost inkorporacji metioniny S 35 po dodaniu glutaminianu jest spowodowany syntezą białek de novo. Dodano 40 mikromolowych znieczuleń Mycyna inhibitor syntezy białek. Rysunek ten pokazuje wyraźny spadek inkorporacji metioniny S 35 w obecności anso mycyny z glutaminianem lub bez niego w porównaniu z poziomami podstawowymi.
W ten sposób nieciągłe gradienty sacharozy peralnej szybko wytwarzają wysoce aktywny i stosunkowo czysty SNS, który można wykorzystać do badania translacji białek. Rysunek ten pokazuje, że pasmo piąte z nieciągłego gradientu sacharozy na rdzeń zawiera najwyższe poziomy syntezy białek de novo. Wykazano, że SNS przygotowany przez przepuszczenie homogenizowanej kory przez szereg filtrów o zmniejszającej się wielkości porów, a następnie odwirowanie nad nieciągłym gradientem sacharozy na rdzeń dla porównania, zawiera więcej uszkodzonych błon i mniej całych SNS niż SNS przygotowanych metodą nieciągłego gradientu sacharozy Perol Wykazano, że SNS przygotowany przy użyciu metody nieciągłego gradientu sacharozy peral zawiera większą aktywność syntezy białek de novo niż SNS przygotowany przy użyciu metody filtracji.
Wykazano, że SNS przygotowane od młodszych myszy mają większą aktywność translacyjną niż starsze myszy. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobry pomysł na to, jak wyizolować translacyjnie aktywne synaptyczne strefy neuro poprzez homogenizację kory myszy, odwirowanie homogenatu w kołyszącym się wirniku kubełkowym, odwirowanie supernatantu nad gradientem sacharozy na wywołanie w wirniku o stałym kącie, a następnie zebranie powstałego pasma stref nerwu synaptycznego.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten artykuł opisuje metodę przygotowywania translacyjnie aktywnych synaptoneurosomu (SN) z kory mózgu myszy za pomocą niespójnego gradientu gęstości Percoll-sacharyzy. Technika ta pozwala na szybkie przygotowanie, minimalizując jednocześnie uszkodzenia mechaniczne i toksyczność.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Neuronauki
- Biologia komórki
- Biochemia
Tło
- Synaptoneurosomy są niezbędne do badania funkcji synaptycznych.
- Tradycyjne metody mogą powodować mechaniczne uszkodzenia próbek.
- Gradienty gęstości mogą zmniejszać toksyczność dla komórek.
- Rozumienie aktywności translacyjnej w synapsach jest kluczowe dla badań neuronaukowych.
Cel badania
- Opracowanie niezawodnej metody izolacji aktywnych synaptoneurosomu.
- Poprawa jakości preparatów synaptosomów do badań.
- Ułatwienie dalszych badań nad funkcjami i mechanizmami synaptycznymi.
Zastosowane metody
- Homogenizacja kory mózgu myszy.
- Centryfugacja homogenatu w celu oddzielenia składników.
- Zastosowanie nadstanika do gradientów Percoll-sacharyzy.
- Ostateczna centryfugacja w celu zebrania frakcji synaptosomów.
Główne wyniki
- Analiza Western blot potwierdziła synaptyczne wzbogacenie frakcji.
- Eksperymenty z inkorporacją S35 metioniny wykazały aktywność translacyjną.
- Metoda efektywnie zmniejsza uszkodzenia mechaniczne w porównaniu z tradycyjnymi technikami.
- Niska toksyczność Percoll zwiększa żywotność komórek w preparatach.
Wnioski
- Opisana metoda jest skuteczna w przygotowywaniu aktywnych synaptoneurosomu.
- Zapewnia niezawodne narzędzie do badania mechanizmów synaptycznych.
- Przyszły badania mogą opierać się na tej technice dla różnych zastosowań.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Synaptoneurosome isolation enables mechanistic de-risking of synaptic targets by preserving native pre- and postsynaptic protein complexes. This method supports target validation in neuroscience drug discovery by providing translationally active preparations that reflect physiological neurotransmitter handling. The Percoll-sucrose gradient approach reduces artifacts from mechanical damage and cytotoxicity, improving data reliability for lead identification campaigns.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by maintaining synaptic vesicle uptake, storage, and release machinery.
- Operational Value: Enables functional target validation through assessment of neurotransmitter dynamics in resealed terminals.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by quantifying de novo protein synthesis via S35 methionine incorporation as a translational activity readout.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream assays measuring synaptic protein translation or drug effects on vesicle cycling.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible SN yields (0.9–1.1 mL per cortex) with minimal batch variability due to controlled gradient layering.
- Assay Readiness: Provides scalability for compound screening platforms requiring intact synaptic terminals with preserved pre- and postsynaptic markers.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Maintains disease-relevant synaptic protein complexes from discovery through preclinical validation of CNS-targeted modulators.
- Mechanistic De-risking: Confirms on-target mechanism by correlating glutamate-stimulated S35 methionine incorporation with synaptic vesicle cycling.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables go/no-go decisions based on translational activity levels, which are higher in juvenile (P13–P21) mouse cortices and reduced by protein synthesis inhibitors like anisomycin.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead identification, where synaptic functional assays inform compound prioritization before preclinical efficacy studies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by isolating synaptically enriched fractions validated via western blot for synaptic markers and reduced impurity profiles.
- Screening: Delivers assay-ready SNs with quantitative outputs such as S35 methionine incorporation rates, enabling comparison of compound effects on protein synthesis.
- Analytics: Generates translational activity measurements that help teams compare synaptic functional states across conditions or genetic models.
- Translational Research: Connects to preclinical work by preserving synaptic vesicle cycling machinery relevant to biomarker alignment in neurodegenerative or neuropsychiatric indications.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable cortical SN preparation platform applicable across multiple projects studying synaptic protein translation or drug-induced modulation of vesicle dynamics.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in synaptic target engagement through preserved neurotransmitter uptake, storage, and release capabilities.
- Operational Value: Standardization via isotonic Percoll-sucrose gradients that avoid cytotoxic media and reduce centrifugation steps, enhancing reproducibility.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions by quantifying translational activity as a functional synaptic readout, reducing late-stage biological risk in CNS programs.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of compounds based on dose-dependent effects on SN protein synthesis, supporting capital efficiency in target validation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue dissection, homogenization technique, and density gradient preparation to avoid cortical damage and ensure sharp layer interfaces.
- Dependent on centrifugation infrastructure (swinging bucket and fixed angle rotors) and temperature control (4°C) throughout processing to maintain SN integrity.
- Necessitates cross-team standardization of homogenization stroke counts and gradient layer volumes to minimize inter-user variability in SN yield and activity.
- Adaptation considerations include adjusting P13–P21 mouse age for developmental synaptic profiles and optimizing TTX concentration (1 µM) to suppress non-specific neuronal excitation in downstream assays.
- Practical limitations include the need for rapid processing post-dissection to prevent activity loss and the requirement for validation via S35 methionine incorporation or western blot to confirm synaptic enrichment.
