Name: Otrzymywanie synaptoneurosomów z kory myszy przy użyciu nieciągłego gradientu gęstości perkolu i sacharozy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Poznaj metodę izolacji aktywnych translacyjnie synaptoneurosomów z kory mózgu myszy przy użyciu nieciągłego gradientu gęstości Percoll-sacharoza. Technika minimalizuje uszkodzenia mechaniczne i toksyczność.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Pragniemy podziękować B. K. August z Electron Microscope Facility na University of Wisconsin-Madison za wykonanie mikroskopii elektronowej. Praca ta była finansowana z grantów NIH R01-DA026067 oraz P30-HD03352 (przyznanych J.S.M.).

1. Przygotowania1-4
<ol>
 <li>Przygotować 500 mL buforu do medium gradientowego (GM), mieszając 50 mL zawiesiny sacharozy 2.5 M, 2,5 mL roztworu stokowego Tris-HCl 1 M o pH 7,5 oraz 0,1 mL roztworu stokowego EDTA 0,5 m o pH 8,0, uzupełniając objętość wodą milli-Q. Roztwór poddać sterylizacji przez filtrowanie, podzielić na alikwoty i przechowywać w zamrażarce.</li>
 <li>Przygotować 1000-krotny roztwór stokowy tetrodotoksyny (TTX), sporządzając roztwór 1 mM w wodzie milli-Q H2O. Alikwoty TTX można przechowywać w temperaturze -20°C.</li>
 <li>Przygotować 10-krotny bufor stymulujący, sporządzając w wodzie milli-Q roztwór zawierający 100 mM Tris (pH 7,5), 5 mM Na2HPO4, 4 mM KH2PO4, 40 mM NaHCO3 oraz 800 mM NaCl. Roztwór stokowy można przechowywać w temperaturze 4°C.</li>
 <li>Wychłodzić wirówki do 4°C.</li>
 <li>Przygotować roztwór stokowy izosmotycznego Percollu (SIP), dodając 9 objętości Percollu (18 mL) do 1 objętości sacharozy 2.5 M (2 mL) w wodzie milli-Q, a następnie dokładnie wymieszać.</li>
 <li>Przygotować warstwy gradientu 3%, 10%, 15% i 23%, dodając odpowiednie ilości SIP do buforu GM i mieszając każdą z nich:</li>
</ol>
<img alt="Tabela gradientu z objętościami buforu GM i SIP do analizy danych eksperymentu chromatograficznego." src="/files/ftp_upload/3196/3196table0.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Tabela 0">
<ol start="7">
 <li>Nalej warstwy gradientu, pipetując po 2 ml izoosmotycznych roztworów Percoll o stężeniach 23, 15, 10 i 3% do probówek z nakrętkami do wirówki Beckman, używając pipety P1000 Gilson Pipetman. Granica między warstwami powinna być wyraźnie widoczna, bez mieszania się roztworów. Przechowuj gradienty w temperaturze 4°C przez co najmniej 20 min przed użyciem. Gradienty można przechowywać do 24 godzin, choć zaleca się ich użycie w tym samym dniu. [Osoby z mniejszym doświadczeniem laboratoryjnym mogą ćwiczyć przygotowywanie gradientów, dodając niebieski barwnik do izoosmotycznych roztworów Percoll w celu wizualizacji granic między warstwami.]</li>
</ol>
2. Disekccja myszy 1
<ol>
 <li>Należy upewnić się, że wszystkie procedury związane z hodowlą i uśmiercaniem myszy są wykonywane zgodnie z wytycznymi NIH oraz uczelni. Uśmiercić młode myszy (wiek P13 do P21) poprzez uduszenie dwutlenkiem węgla lub metodą zatwierdzoną w protokole dotyczącym zwierząt.</li>
 <li>Przymocować mysz do deski sekcyjnej i spryskać kark oraz głowę etanolem. Za pomocą ostrych nożyczek przeciąć rdzeń kręgowy u podstawy czaszki, usunąć skórę z górnej części czaszki, przeciąć czaszkę bocznie pomiędzy kością ciemieniową a kością międzyciemieniową lub pomiędzy obszarami mózgowia i kory. Następnie przeciąć czaszkę od podstawy do nosa (wzdłuż szwu strzałkowego), ostrożnie usunąć miękką kość ciemieniową, odsuwając każdą półkulę na bok, i usunąć korę za pomocą szpatułki. Wprowadzić szpatułkę do mózgu powyżej móżdżku, a następnie wybrać korę i umieścić ją w lodowatym buforze GM. Bezzwłocznie przejść do etapu homogenizacji. Nie pozostawiać kory w lodowatym buforze przez zbyt długi czas, ponieważ może to negatywnie wpłynąć na tworzenie się SN.</li>
</ol>
3. Przygotowanie homogenatu i nadnadczyn 1-4
<ol>
 <li>Opłukać korę w lodowatym buforze GM i przenieść dwie części kory do szklanego homogenizatora Dounce zawierającego 5 mL zimnego buforu GM.</li>
 <li>Delikatnie zhomogenizować korę, wykonując 5-10 ruchów luźnym tłuczkiem (tłuczyk „A”), a następnie 5-10 ruchów ciasnym tłuczkiem (tłuczyk „B”). Ruchy powinny być szybkie, ale na tyle powolne, aby nie powodować powstawania pęcherzyków powietrza. Zdjęcie homogenatu po homogenizacji znajduje się w Schemacie 1. Liczba ruchów może się różnić w zależności od konkretnego homogenizatora i dołączonych tłuczyków. Po zakończeniu gradienty powinny wykazać wyraźny prążek SN; w przeciwnym razie należy dostosować liczbę ruchów.</li>
 <li>Przenieść homogenat do probówki stożkowej 15 mL i wirować przy 1000xg przez 10 min w temperaturze 4°C w rotorze z koszyczkami wahadłowymi (wirówka Allegra 6KR), aby odwirować resztki komórkowe i jądra. Zdjęcie odwirowanego homogenatu znajduje się w Schemacie 1.</li>
 <li>Nanieść 2 mL supernatantu na każdy gradient Percoll-cukru, zakręcić probówki i wirować przy 32 500xg przez 5 min w temperaturze 4°C w rotorze kątowym (wirówka Beckman J2-21, rotor JA-17), używając odpowiednich adapterów (patrz Tabela odczynników i sprzętu).</li>
 <li>Odessać i usunąć roztwór znajdujący się powyżej prążka SN za pomocą szklanej pipety Pasteura. Odessać prążek SN z interfejsu 15/23%, przenieść do probówki stożkowej i przechowywać w lodzie. Każdy gradient lub jedna część kory pozwoli uzyskać 0,9-1,1 mL SN.</li>
 <li>Dostosować stężenie soli w SN, dodając jedną dziesiątą objętości 10x buforu stymulującego, dodać 1000x CaCl2 do stężenia końcowego 12 nM oraz dodać roztwór stokowy 1 mM TTX do stężenia końcowego 1 μM w celu zahamowania niespecyficznego pobudzenia. (Dodanie CaCl2 jest opcjonalne, jeśli mogłoby ono zakłócić dalsze zastosowania SN).</li>
 <li>Oznaczyć stężenie białka w SN przy użyciu zestawu Micro BCA Protein Assay Kit. (Analiza białek metodą Bradforda nie jest zalecana ze względu na interferencję z Percollem).</li>
 <li>SN można wykorzystać bezpośrednio i szybko do badań nad translacją białek. W przypadku innych zastosowań lizat SN można oczyścić lub zagęścić przy użyciu zestawu Pierce SDS-PAGE Sample Prep Kit.</li>
</ol>
4. Reprezentatywne wyniki:
Po homogenizacji kory mózgu myszy i rozdzieleniu jej na nieciągłych gradientach Percoll-sacharozy (Schemat 1), zaobserwowano 6 prążków lub frakcji (Rysunek 1). Wcześniej wykazano dla kory mózgowej szczura3,5, że składnikami prążków o wysokiej masie cząsteczkowej były fragmenty błon i mielina, a materiał w osadzie zawierał mitochondria lub organelle (Tabela 1). Interfejs 23%/15% (Prążek 5) zawierał wzbogacone SNs.
Prążek na interfejsie 23%/15%, zawierający nienaruszone SN, został usunięty i poddany badaniu za pomocą mikroskopii elektronowej (EM) zgodnie z wcześniej opisaną procedurą.2,6 EM wykazała obecność nienaruszonych pęcherzyków synaptycznych oraz zachowanie elementów presynaptycznych i postsynaptycznych (Rysunek 2). Izolacja przedziałów presynaptycznych i postsynaptycznych jest istotna dla badania sygnalizacji oraz syntezy białek, która zachodzi w obu tych przedziałach.7-13 Gradient Percoll-cukier pełni rolę wstępnego oczyszczania, dlatego w frakcji SN zaobserwowano niewielkie zanieczyszczenia komórkowe, jądrowe i organellowe, jednak ogólna separacja była dobra.
Analiza metodą Western blot wykazała, że frakcje Percoll zawierały oczekiwane markery białkowe, przy jednoczesnym wzroście czystości synaptycznej w prążku SN (Rysunek 3, Tabela 2). Markery synaptyczne i neuronalne zostały zachowane w wzbogaconym prążku SN (prążek 5), natomiast liczebność innych markerów uległa znacznemu zmniejszeniu. W szczególności obecność GFAP, markera astrocytów i komórek nowotworowych pochodzenia glejowego, oraz Lamin-B1, markera jądrowego, była pomijalna, podczas gdy markery strukturalne i synaptyczne zostały zachowane lub nasilone. Ponadto odnotowano obecność markerów organelli, takich jak mitochondria i aparat Golgiego, które odgrywają rolę w syntezie białek.
Typowe wydajności dla frakcji SN wynosiły 250-500 ng białka na μL, co określono za pomocą testu białkowego BCA. Aktywność SNs określono na podstawie ilości syntezy białek de novo, monitorowanej poprzez wbudowywanie [35S]-Met (Rycina 4).2 Bazowa aktywność translacyjna wzrosła 1,56-krotnie po stymulacji SNs za pomocą 50 μM glutaminianu/10 μM glicyny (Glu) lub 5,12-krotnie po aktywacji inhibitorem Pin1, juglonem. Znane jest, że inhibicja Pin1 prowadzi do zwiększenia syntezy białek.2 Aby potwierdzić, że wzrost wbudowywania [35S]-Met wynikał z syntezy białek de novo, dodano 40 μM anisomycyny, inhibitora syntezy białek, co spowodowało wyraźny spadek wbudowywania zarówno w obecności, jak i w przypadku braku Glu w porównaniu z poziomami bazowymi. Ponadto po dodaniu 2% Triton-X 100, który zaburza integralność SNs, translacja bazowa spadła o 75%.2 Dodatkowo, podczas badania frakcji (B4-B6), które wykazały największe wzbogacenie w markery synaptyczne, SNs lub frakcja 5 wykazały największą aktywność syntezy białek de novo (Rycina 5). Zatem nieciągłe gradienty Percoll-sukroza pozwalają na szybkie uzyskanie wysoce aktywnej i wzbogaconej frakcji SN, która może być wykorzystana do badania translacji białek.
Procedura z wykorzystaniem nieciągłego gradientu Percoll-cukier jest korzystniejsza od innych metod, ponieważ surowsze warunki powodują uszkodzenia mechaniczne. W porównaniu z metodą filtracyjną, w której oczyszczony homogenat kory przepuszczany jest przez serię filtrów o malejącej wielkości oczek,3,14-15 metoda z użyciem Percollu pozwala uzyskać więcej SN o większej aktywności. Jak pokazano na Rysunku 6, gdy aliquot SN przygotowanych metodą filtracyjną przepuszczono przez gradient Percoll-cukier, na granicy 15/23% stwierdzono znacznie mniej SN oraz większą ilość uszkodzonych membran. Podczas pomiaru syntezy białek de novo za pomocą wbudowywania S35-met, SN przygotowane metodą filtracyjną wykazały znacznie niższą aktywność (Rysunek 7). Aby zmaksymalizować aktywność translacyjną, wykorzystujemy myszy w wieku od P14 do P18. SN można przygotować z dorosłych myszy, jednak zaobserwowaliśmy znacząco zwiększoną aktywność translacyjną w przypadku SN przygotowanych z młodych myszy (Rysunek 8).
<img alt="Rozkład komponentów komórkowych, tabela przedstawiająca frakcje z błonami, mielinę, synaptosomy, organelle." src="/files/ftp_upload/3196/3196table1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Tabela 1"> 
Tabela 1. Składniki frakcji z przerwanych gradientów Percoll po homogenizacji kory mózgu myszy.3,5
<img alt="Wykres rozkładu markerów białkowych; wyniki laboratoryjne wykazujące obecność białek w różnych prążkach." src="/files/ftp_upload/3196/3196table2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Tabela 2"> 
Tabela 2. Podsumowanie analizy Western blot składników prążków z nieciągłego gradientu Percoll-sacharoza. Względne stężenia białek dla każdej z frakcji prążków wyizolowanych przy użyciu nieciągłego gradientu Percoll-sacharoza określono metodą Western blot. Brak białka (-), 0≥0,2 (+), 0,2≥0,8 (++), lub &gt;0,8 (+++) razy więcej białka niż w supernatancie (S, odwirowany homogenat kory), reprezentatywnie dla n=3.
<img alt="Schemat wycinania kory mózgu i wirowania; przedstawia homogenizację, gradienty Percoll, pasmo SN." src="/files/ftp_upload/3196/3196scheme1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Scheme 1"> 
Schemat 1: Schemat przygotowania SN z wykorzystaniem nieciągłego gradientu gęstości Percoll-sukroza. Korę mózgu myszy wycięto, poddano homogenizacji, a następnie wirowano z niską prędkością w celu usunięcia niehomogenizowanej tkanki, komórek oraz całych organelli, takich jak jądra i błony. Gradient nieciągły powinien posiadać wyraźnie zdefiniowane warstwy. Wstawka na zdjęciu pokazuje przykład warstw, które zostały zafarbowane na niebiesko wyłącznie w celach ilustracyjnych, aby umożliwić wizualizację tych warstw. Nadfiltr nakłada się na nieciągły gradient Percoll-sukroza i wiruje z umiarkowaną prędkością. Następnie z gradientu odzyskuje się pasmo SN, które jest gotowe do użycia.
<img alt="Schemat wirowania w gradiencie gęstości; rozdział białek, procentowe stężenia gradientu, identyfikacja pasm." src="/files/ftp_upload/3196/3196fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Frakcjonowanie homogenatu w nieciągłym gradiencie Percoll-sukroza. Kora mózgu myszy została zhomogenizowana i rozdzielona w nieciągłym gradiencie Percoll-sukroza, co doprowadziło do powstania 6 pasm lub frakcji. Oczyszczone, aktywne SNs (*) znajdowały się w paśmie 5.
<img alt="Obraz z mikroskopii elektronowej; analiza ultrastruktury komórki, organelle zaznaczone strzałkami." src="/files/ftp_upload/3196/3196fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Preparaty SN dają heterogenną mieszaninę synaps (SN), które zachowują elementy przedsynaptyczne i postsynaptyczne. Wykonano mikrofotografię elektronową preparatu SN otrzymanego z myszy C57BL/6 (wiek P13 do P21) zgodnie z wcześniejszym opisem, która pokazuje synapsy z zachowanymi elementami przedsynaptycznymi i postsynaptycznymi.2,6 Czerwone strzałki wskazują gęstości postsynaptyczne. Pasek skali wynosi 1 μm.
<img alt="Schemat Western blot; analiza ekspresji białek β-Actin, GFAP, GP73 w frakcjach 1-6, S." src="/files/ftp_upload/3196/3196fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Analizy Western blot preparatów SN wykazały, że markery synaptyczne i neuronalne zostały zachowane w oczyszczonych SN (frakcja 5), natomiast zawartość innych markerów była znacząco zredukowana. Immunobloty nadnadkładu (S, odwirowany homogenat kory) oraz frakcji 1-6 nieciągłego gradientu Percoll-sacharozy poddano analizie pod kątem obecności β-Actin (strukturalna, kontrola załadunku), GFAP (astrocytarny), GP73 (aparatu Golgiego), HSC70 (cytoplazmatyczny i jądrowy), Lamin-B1 (jądrowy), Prohibitin (mitochondrialny), PSD95 (gęstość postsynaptyczna), SNAP25 (synaptyczny), Synaptophysin (synaptyczny) oraz β3-Tubulin (specyficzny dla neuronów). Frakcje wizualizowano za pomocą obrazownika fosforowego Storm 860, wyniki reprezentatywne dla n=3.
 
<img alt="Elektroforeza białek SDS-PAGE i wykres słupkowy wbudowywania S35-Met w celu analizy działania leków." src="/files/ftp_upload/3196/3196fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4. SN są aktywne i wykazują syntezę białek de novo poprzez wbudowywanie [35S]-Met. SN poddano wstępnej równowadze w temperaturze 37°C przez 10 min. Następnie SN pozostały nieleczone lub zostały poddane wstępnej inkubacji przez 15 min z 40 μM anisomycyną lub 1 μM juglonem w 37°C, po czym dodano [35S]-Met, 20 μl Express Pro Label Mix S35 Easy Tag, z dodatkiem lub bez dodatku Glu w 37°C przez 30 min. Próbki przygotowano przy użyciu Pierce SDS-PAGE Sample Prep Kit, rozdzielono na 15% żelu poliakrylamidowym, wysuszono i poddano kwantyfikacji za pomocą fosforymageru Molecular Dynamics Storm 860; wyniki reprezentatywne dla n=3, ±SEM.
<img alt="Wykres elektroforezy białek i wbudowywania S35-Met; prążki żelu, porównanie na wykresie słupkowym, kontekst Glu." src="/files/ftp_upload/3196/3196fig5.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5. Prążek 5 z nieciągłego gradientu Percoll-sacharoza zawierał najwyższe poziomy syntezy białek de novo. Prążki 4, 5 i 6 oraz nadsącz (S, odwirowany homogenat kory) poddano wstępnej inkubacji w temperaturze 37°C przez 10 min. Następnie dodano [35S]-Met (Express Pro Label Mix S35 Easy Tag), z dodatkiem lub bez dodatku Glu, i inkubowano w 37°C przez 30 min. Próbki przygotowano przy użyciu Pierce SDS-PAGE Sample Prep Kit, rozdzielono na 15% żelu poliakrylamidowym, wysuszono i skwantyfikowano za pomocą fosforimageru Molecular Dynamics Storm 860; wyniki reprezentatywne dla n=3, ±SEM.
<img alt="Proces oczyszczania białek w probówkach do ultrawirowania; rozdział osadu i nadsączu." src="/files/ftp_upload/3196/3196fig6.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6. SN przygotowane metodą filtracji zawierają więcej uszkodzonych błon i mniej całych SN niż SN przygotowane metodą nieciągłego gradientu Percoll-sacharozy. SN przygotowano poprzez przepuszczenie homogenizatu kory przez serię filtrów o zmniejszającej się wielkości porów, zgodnie z wcześniejszym opisem.3,14-15 Alikwot SN przygotowanych metodą filtracji odwirowano nad nieciągłym gradientem Percoll-sacharozy i porównano z równoważną ilością materiału otrzymanego metodą nieciągłego gradientu Percoll-sacharozy.
<img alt="Żel SDS-PAGE i wykres słupkowy przedstawiające analizę białek; wyniki filtracji w porównaniu z metodą Percoll w eksperymencie." src="/files/ftp_upload/3196/3196fig7.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 7"> 
Rycina 7. SN-y przygotowane metodą filtracyjną wykazują mniejszą aktywność syntezy białek de novo niż SN-y przygotowane metodą nieciągłego gradientu Percoll-sacharoza. SN-y przygotowano poprzez przepuszczanie homogenizatu kory przez serię filtrów o malejącej wielkości porów zgodnie z opisem z poprzednich prac,3,14-15 oraz metodą nieciągłego gradientu Percoll-sacharoza. SN-y z obu preparatów poddano wstępnej ekwilibracji w temperaturze 37°C przez 10 min. Następnie dodano [35S]-Met (Express Pro Label Mix S35 Easy Tag), z dodatkiem lub bez dodatku Glu, w temperaturze 37°C przez 30 min. Próbki przygotowano przy użyciu Pierce SDS-PAGE Sample Prep Kit, rozdzielono na żelu poliakrylamidowym 15%, wysuszono i skwantyfikowano za pomocą fosforymageru Molecular Dynamics Storm 860, wyniki reprezentatywne dla n=3, ±SEM.
<img alt="Elektroforeza w żelu poliakrylamidowym i wykres słupkowy; analiza syntezy białek, wbudowywanie S35-Met." src="/files/ftp_upload/3196/3196fig8.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 8"> 
Rycina 8. Synaptosomy (SNs) z młodszych myszy (P14) wykazują większą aktywność translacyjną niż synaptosomy z myszy starszych (P85). SNs przygotowano z myszy w różnym wieku przy użyciu metody nieciągłego gradientu Percoll-sacharoza, inkubowano w temperaturze 37°C przez 10 min w celu równowagi, poddano działaniu Glu lub nie w obecności [35S]-Met (Express Pro Label Mix S35 Easy Tag) przez 30 min, zamrożono błyskawicznie, a następnie oczyszczono za pomocą Pierce SDS-PAGE Sample Prep Kit. Następnie SNs rozdzielono w 12% żelu SDS-poliakrylamidowym, osuszono i obrazowano na fosforimagerze Molecular Dynamics Storm 860; wyniki reprezentatywne dla n=3, ±SEM. SNs z myszy P14 były co najmniej 3-krotnie bardziej aktywne niż SNs z myszy P85.

<ol><li>Westmark, C. J., Malter, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FMRP+mediates+mGluR5-dependent+translation+of+amyloid+precursor+protein%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">FMRP mediates mGluR5-dependent translation of amyloid precursor protein.</a> PLoS Biol. 5, e52-e52 (2007).</li>
<li>Westmark, P. R., Westmark, C. J., Wang, S., Levenson, J., O'Riordan, K. J., Burger, C., Malter, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pin1+and+PKMzeta+sequentially+control+dendritic+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Signal%22%5BJournal%5D)">Pin1 and PKMzeta sequentially control dendritic protein synthesis.</a> Sci Signal. 3, ra18-ra18 (2010).</li>
<li>Dunkley, P. R., Heath, J. W., Harrison, S. M., Jarvie, P. E., Glenfield, P. J., Rostas, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+Percoll+gradient+procedure+for+isolation+of+synaptosomes+directly+from+an+S1+fraction%3A+Homogeneity+and+morphology+of+subcellular+fractions%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">A rapid Percoll gradient procedure for isolation of synaptosomes directly from an S1 fraction: Homogeneity and morphology of subcellular fractions.</a> Brain Res. 441, 59-71 (1988).</li>
<li>Dunkley, P. R., Jarvie, P. E., Robinson, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+Percoll+gradient+procedure+for+preparation+of+synaptosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">A rapid Percoll gradient procedure for preparation of synaptosomes.</a> Nat. Protoc. 3, 1718-1728 (2008).</li>
<li>Hollingsworth, E. B., McNeal, E. T., Burton, J. L., Williams, R. J., Daly, J. W., Creveling, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+characterization+of+a+filtered+synaptoneurosome+preparation+from+guinea+pig+cerebral+cortex%3A+cyclic+adenosine+3%27%3A5%27-monophosphate-generating+systems%2C+receptors%2C+and+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Biochemical characterization of a filtered synaptoneurosome preparation from guinea pig cerebral cortex: cyclic adenosine 3':5'-monophosphate-generating systems, receptors, and enzymes.</a> J. Neurosci. 5, 2240-2253 (1985).</li>
<li>Yi, H., Leunissen, J., Shi, G., Gutekunst, C., Hersch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+procedure+for+pre-embedding+double+immunogold-silver+labeling+at+the+ultrastructural+level%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">A novel procedure for pre-embedding double immunogold-silver labeling at the ultrastructural level.</a> J. Histochem. Cytochem. 49, 279-284 (2001).</li>
<li>Akins, M. R., Berk-Rauch, H. E., Fallon, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+translation%3A+stepping+out+of+the+postsynaptic+shadow%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">Presynaptic translation: stepping out of the postsynaptic shadow.</a> Front. Neural Circuits. 3, (2009).</li>
<li>Jin, I., Kandel, E. R., Hawkins, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whereas+short-term+facilitation+is+presynaptic%2C+intermediate-term+facilitation+involves+both+presynaptic+and+postsynaptic+protein+kinases+and+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Learn.+Mem%22%5BJournal%5D)">Whereas short-term facilitation is presynaptic, intermediate-term facilitation involves both presynaptic and postsynaptic protein kinases and protein synthesis.</a> Learn. Mem. 18, 96-102 (2011).</li>
<li>Lyles, V., Zhao, Y., Martin, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synapse+formation+and+mRNA+localization+in+cultured+Aplysia+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Synapse formation and mRNA localization in cultured Aplysia neurons.</a> Neuron. 49, 349-356 (2006).</li>
<li>Wagatsuma, A., Azami, S., Sakura, M., Hatakeyama, D., Aonuma, H., Ito, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+Novo+synthesis+of+CREB+in+a+presynaptic+neuron+is+required+for+synaptic+enhancement+involved+in+memory+consolidation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">De Novo synthesis of CREB in a presynaptic neuron is required for synaptic enhancement involved in memory consolidation.</a> J. Neurosci. Res. 84, 954-9560 (2006).</li>
<li>Sutton, M. A., Schuman, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+translational+control+in+dendrites+and+its+role+in+long-term+synaptic+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Local translational control in dendrites and its role in long-term synaptic plasticity.</a> J. Neurobiol. 64, 116-131 (2005).</li>
<li>Li, K. -W., Hornshaw, M. P., Van der Schors, R. C., Watson, R., Tate, S., Casetta, B., Jimenez, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics+analysis+of+rat+brain+postsynaptic+density%3A+implications+of+the+diverse+protein+functional+groups+for+the+integration+of+synaptic+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Proteomics analysis of rat brain postsynaptic density: implications of the diverse protein functional groups for the integration of synaptic physiology.</a> J. Biol. Chem. 279, 987-1002 (2004).</li>
<li>Peng, J., Kim, M. J., Cheng, D., Duong, D. M., Gygi, S. P., Sheng, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Semi-quantitative+proteomic+analysis+of+rat+forebrain+postsynaptic+density+fractions+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Semi-quantitative proteomic analysis of rat forebrain postsynaptic density fractions by mass spectrometry.</a> J. Biol. Chem. 279, 21003-21011 (2004).</li>
<li>Kim, S. H., Fraser, P. E., Westaway, D., St. George-Hyslop, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Group+II+metabotropic+glutamate+receptor+stimulation+triggers+production+and+release+of+Alzheimer%27s+amyloid+%CE%B242+from+isolated+intact+nerve+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Group II metabotropic glutamate receptor stimulation triggers production and release of Alzheimer's amyloid β42 from isolated intact nerve terminals.</a> J. Neurosci. 30, 3870-3875 (2010).</li>
<li>Weiler, I. J., Greenough, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potassium+ion+stimulation+triggers+protein+translation+in+synaptoneurosomal+poiyribosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Potassium ion stimulation triggers protein translation in synaptoneurosomal poiyribosomes.</a> Mol. Cell. Neurosci. 2, 305-314 (1993).</li>
<li>Billard, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ageing%2C+hippocampal+synaptic+activity+and+magnesium%5BTitle%5D)+AND+%22Magnes+Res%22%5BJournal%5D)">Ageing, hippocampal synaptic activity and magnesium.</a> Magnes Res. 19, 199-215 (2006).</li>
<li>Murphy, G. G., Fedorov, N. B., Giese, K. P., Ohno, M., Friedman, E., Chen, R., Silva, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+neuronal+excitability%2C+synaptic+plasticity%2C+and+learning+in+aged+Kvbeta1.1+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Increased neuronal excitability, synaptic plasticity, and learning in aged Kvbeta1.1 knockout mice.</a> Curr. Biol. 14, 1907-1915 (2004).</li>
<li>Norris, C. M., Halpain, S., Foster, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversal+of+Age-Related+Alterations+in+Synaptic+Plasticity+by+Blockade+of+L-Type+Ca21+Channels%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Reversal of Age-Related Alterations in Synaptic Plasticity by Blockade of L-Type Ca21 Channels.</a> J. Neurosci. 18, 3171-3179 (1998).</li>
<li>Sallert, M., Malkki, H., Segersträlea, M., Tairaa, T., Lauri, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+the+kainate+receptor+agonist+ATPA+on+glutamatergic+synaptic+transmission+and+plasticity+during+early+postnatal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharm%22%5BJournal%5D)">Effects of the kainate receptor agonist ATPA on glutamatergic synaptic transmission and plasticity during early postnatal development.</a> Neuropharm. 52, 1354-1365 (2007).</li>
<li>Quinlan, E. M., Philpot, B. D., Huganir, R. L., Bear, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid%2C+experience-dependent+expression+of+synaptic+NMDA+receptors+in+visual+cortex+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Rapid, experience-dependent expression of synaptic NMDA receptors in visual cortex in vivo.</a> Nat. Neurosci. 2, 357-35 (1999).</li>
<li>Scheetz, A. J., Nairn, A. C., Constantine-Patton, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMDA+receptor-mediated+control+of+proteins+synthesis+at+developing+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">NMDA receptor-mediated control of proteins synthesis at developing synapses.</a> Nat. Neurosci. 3, 211-216 (2000).</li>
<li>Villasana, L. E., Klann, E., Tejada-Simon, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+isolation+of+synaptoneurosomes+and+postsynaptic+densities+from+adult+mouse+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid isolation of synaptoneurosomes and postsynaptic densities from adult mouse hippocampus.</a> J. Neurosci. Methods. 158, 30-36 (2006).</li>
<li>Weiler, I. J., Greenough, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabotropic+glutamate+receptors+trigger+postsynaptic+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Metabotropic glutamate receptors trigger postsynaptic protein synthesis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 7168-7171 (1993).</li>
<li>Gray, E. G., Whittaker, V. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+isolation+of+nerve+endings+from+brain%3A+An+electron+microscopic+study+of+cell+fragments+derived+by+homogenization+and+centrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Anat%22%5BJournal%5D)">The isolation of nerve endings from brain: An electron microscopic study of cell fragments derived by homogenization and centrifugation.</a> J. Anat. 96, 79-88 (1962).</li>
<li>Gylys, K. H., Fein, J. A., Yang, F., Cole, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enrichment+of+Presynaptic+and+Postsynaptic+Markers+by+Size-Based+Gating+Analysis+of+Synaptosome+Preparations+From+Rat+and+Human+Cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Enrichment of Presynaptic and Postsynaptic Markers by Size-Based Gating Analysis of Synaptosome Preparations From Rat and Human Cortex.</a> Cytometry A. 60, 90-96 (2004).</li>
<li>Hajós, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+method+for+the+preparation+of+synaptosomal+fractions+in+high+purity%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">An improved method for the preparation of synaptosomal fractions in high purity.</a> Brain Res. 93, 485-489 (1975).</li>
<li>Bai, F., Witzmann, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptosome+Proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Subcell.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Synaptosome Proteomics.</a> Subcell. Biochem. 43, 77-98 (2007).</li>
<li>Rao, A., Steward, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+that+protein+constituents+of+postsynaptic+membrane+specializations+are+locally+synthesized%3A+analysis+of+proteins+synthesized+within+synaptosomes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Evidence that protein constituents of postsynaptic membrane specializations are locally synthesized: analysis of proteins synthesized within synaptosomes.</a> J Neurosci. 11, 2881-2895 (1991).</li>
<li>Pertoft, H., Laurent, T. C. Isopycnic separation of cells and cell organelles by centrifugation and modified colloidal silica gradients. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPertoft%2C+H+%22Methods+of+Cell+Separation%22">Methods of Cell Separation</a>. Catsimpoolas, N. , Plenum Press. New York. 25-65 (1977).</li>
<li>Ramarao, C. S., Acharya, S. R., Krishnan, K. S., Kenkare, U. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+affinity+uptake+of+L-glutamate+and+%26gamma%3B-aminobutyric+acid+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biosci%22%5BJournal%5D)">High affinity uptake of L-glutamate and &gamma;-aminobutyric acid in Drosophila melanogaster.</a> J. Biosci. 11, 119-135 (1987).</li>
<li>Munteanu, L. S., Dinu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fractionation+of+granulocytes+from+whole+human+blood+by+centrifugation.+Practical+hints%5BTitle%5D)+AND+%22Romanian+J.+Biophys%22%5BJournal%5D)">Fractionation of granulocytes from whole human blood by centrifugation. Practical hints.</a> Romanian J. Biophys. 14, 53-58 (2004).</li>
<li>Cell separation composition, kit and method. US patent. , 019713 (1997).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Opisane tutaj przygotowanie nieciągłego gradientu Percoll-sacharoza jest szybką i niezawodną metodą izolacji aktywnych SN, które mogą być wykorzystane w różnorodnych eksperymentach nad transmisją synaptyczną. Ta metoda gradientowa, oparta na procedurze opracowanej przez Dunkley i wsp.,3,4 jest procedurą subkomórkowego frakcjonowania mózgu, która izoluje pęcherzyki pochodzące z błon presynaptycznych i postsynaptycznych, które są ze sobą powiązane. Bez dalszej puryfikacji te SN są kompatybilne z wieloma technika...

<table><tbody><tr><td>Nazwa odczynnika</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze (opcjonalnie)</td></tr><tr><td>Zestaw do analizy białek Micro BCA Protein Assay Kit</td><td>Pierce</td><td>23235</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher</td><td>C79-500</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Gaz CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Airgas (UW-MDS)</td><td>CD 50</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>RPI</td><td>E57020</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>EtOH</td><td>Fisher</td><td>A407SK-4</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>HCl</td><td>Fisher</td><td>A142-212</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0891-01</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher</td><td>P285-500</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Zestaw do przygotowania próbek PierceSDS-PAGE Sample Prep Kit</td><td>Pierce</td><td>89888</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>RPI</td><td>S23020</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher</td><td>BP328-500</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PHO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher</td><td>S381-500</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>RPI</td><td>S24060</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Tris w formie zasady</td><td>RPI</td><td>T60040</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Tetrodotoksyna</td><td>Sigma</td><td>T5651</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Mieszanina Express Pro Label Mix S35 Easy Tag</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEG772</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Sprzęt</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze (opcjonalnie)</td></tr><tr><td>Narzędzia do sekcji</td><td>&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Homogenizator Dounce'a, 7 mL (wyposażony w dwa szklane tłuczki oznaczone jako &quot;A&quot; oraz &quot;B&quot;)</td><td>Wheaton</td><td>&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Pipeta P1000 Gilson Pipetman</td><td>Gilson</td><td>F123602</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Wirówka Allegra 6KR</td><td>Beckman Coulter</td><td>366830</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Rotor GH 3.8, rotor z koszami wahadłowymi</td><td>Beckman Coulter</td><td>360581</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Wirówka Beckman J2-21</td><td>Beckman</td><td>&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Probówki Beckman z nakrętkami</td><td>Beckman</td><td>355672</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Adaptery białe</td><td>Beckman</td><td>342327</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Adaptery niebieskie</td><td>Beckman</td><td>&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Rotor JA-17, rotor z kątem stałym</td><td>Beckman</td><td>369691</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_step">Tabela przeciwciał użytych do western blotów:&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nazwa przeciwciała</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Gatunek gospodarza</td></tr><tr><td>&amp;beta;-aktyna</td><td>Sigma</td><td>A5441</td><td>mysz</td></tr><tr><td>GFAP</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-65343</td><td>mysz</td></tr><tr><td>GP73</td><td>Santa Cruz</td><td>Sc-134509</td><td>królik</td></tr><tr><td>HSC70</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-7298</td><td>mysz</td></tr><tr><td>Lamin&amp;beta;</td><td>Santa Cruz</td><td>Sc-6261</td><td>koza</td></tr><tr><td>Prohibityna</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-28259</td><td>królik</td></tr><tr><td>PSD95</td><td>Millipore</td><td>MAB1596</td><td>mysz</td></tr><tr><td>SNAP25</td><td>AbCam</td><td>ab5666-100</td><td>królik</td></tr><tr><td>Synaptofizyna</td><td>Millipore</td><td>MAB368</td><td>mysz</td></tr><tr><td>&amp;beta;-3-tubulina</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-80016</td><td>mysz</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_content"> &lt;/p&gt;</td></tr></tbody></table>

przygotowanie synaptoneurosomów z kory mózgu myszy z wykorzystaniem nieciągłego gradientu gęstości percoll-sukroza

Preparation of Synaptoneurosomes from Mouse Cortex using a Discontinuous Percoll-Sucrose Density Gradient

Synaptonurosomu (SNs) otrzymuje się w wyniku homogenizacji i frakcjonowania kory mózgu myszy. Są to uszczelnione pęcherzyki lub odizolowane zakończenia, które oddzielają się od zakończeń aksonów podczas homogenizacji tkanki korowej. SNs zachowują cechy presynaptyczne i postsynaptyczne, co czyni je użytecznymi w badaniu przekaźnictwa synaptycznego. Zachowują one mechanizmy molekularne wykorzystywane w sygnalizacji neuronalnej oraz są zdolne do pobierania, magazynowania i uwalniania neurotransmiterów.
Produkcja i izolacja aktywnych SN mogą być problematyczne przy użyciu takich mediów jak Ficoll, który może być cytotoksyczny i wymagać przedłużonego wirowania ze względu na wysoką gęstość, a także przy zastosowaniu metod filtracji i wirowania, które mogą prowadzić do niskiej aktywności z powodu uszkodzeń mechanicznych SN. Jednak zastosowanie nieciągłych gradientów gęstości Percoll-sacharoza do izolacji SN stanowi szybką metodę pozwalającą na uzyskanie dobrej wydajności translacyjnie aktywnych SN. Metoda gradientu Percoll-sacharoza jest szybka i łagodna, ponieważ wykorzystuje warunki izotoniczne, wymaga mniejszej liczby krótszych cykli wirowania i pozwala uniknąć etapów wirowania prowadzących do sedymentacji SN i ich uszkodzenia mechanicznego.

Opisano metodę przygotowania translacyjnie aktywnych, nienaruszonych synaptoneurosomów (SNs) z kory mózgu myszy. Metoda ta wykorzystuje nieciągły gradient gęstości Percoll-sukroza, co umożliwia szybkie przygotowanie aktywnych SNs.

Przygotowanie synaptoneurosomów z kory mózgu myszy z wykorzystaniem nieciągłego gradientu gęstości Percoll-sukroza

Synaptonurosomu (SN) otrzymuje się po homogenizacji i frakcjonowaniu kory mózgu myszy. Są to szczelnie zamknięte pęcherzyki lub izolowane zakończenia, które ...

Ogólnym celem tej procedury jest przygotowanie translacyjnie aktywnych stref synaptonemymalnych z kory mózgu myszy, z wykorzystaniem nieciągłego gradientu gęstości sacharozy. Osiąga się to poprzez najpierw pobranie i homogenizację kory mózgu myszy, a następnie wirowanie homogenatu. Następnie homogenat z wirowania, czyli nadsącz, nanosi się na przygotowane gradienty sacharozy.Ostatnim krokiem jest wirowanie i zebranie frakcji synaptosomów. Ostatecznie analiza western blot oraz eksperymenty z wbudowywaniem S 35 metioniny wykazują, że frakcja synaptosomów jest wzbogacona w komponenty synaptyczne i aktywna translacyjnie. Głównymi zaletami tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak wirowanie i filtracja, są po pierwsze uniknięcie uszkodzeń mechanicznych dzięki zastosowaniu gradientów gęstości, a po drugie niska toksyczność percoll dla komórek i ich składników.Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mogą napotkać trudności w realizacji protokołu, ponieważ kluczową rolę odgrywa w nim czas. Po zebraniu kory procedura powinna zostać szybko ukończona. Aby rozpocząć procedurę, należy przygotować warstwy gradientu 3, 10, 15 i 23%, dodając do buforu GM odpowiednie ilości SIP zgodnie z opisem w towarzyszącym manuskrypcie, a następnie dokładnie wymieszać.Przygotuj warstwy gradientu, pipetując po dwa mililitry z każdego z trzech izoosmotycznych roztworów Percoll o stężeniach 15%, 10% i 3% do zakręcanych probówek do wirówki Beckman. Używając pipety P 1000, należy dbać o to, aby granica między warstwami była wyraźnie widoczna i aby nie doszło do ich wymieszania. Przechowuj gradienty w temperaturze czterech stopni Celsius przez co najmniej 20 minut przed użyciem.Przed rozpoczęciem tej procedury należy przygotować pozostałe niezbędne roztwory zgodnie z opisem w towarzyszącym manuskrypcie. Myszy w wieku od P 13 do P 21 należy uśmiercić i przygotować do sekcji, spryskując kark i głowę 70% ethanol. Następnie za pomocą ostrych nożyczek należy przeciąć rdzeń kręgowy u podstawy czaszki.Następnie usuń skórę z górnej części czaszki. Przetnij czaszkę bocznie pomiędzy kością ciemieniową a kością międzyciemieniową, lub pomiędzy obszarem mózgowia a obszarem kory. Po tym etapie przetnij czaszkę od podstawy do nosa wzdłuż szwu strzałkowego.Na tym etapie ostrożnie usuń miękką kość ciemieniową, odsuwając każdą półkulę na bok. Następnie wprowadź szpatułkę do mózgu powyżej móżdżku, aby wydobyć korę. Umieść ją w lodowatym buforze GM i powtórz procedurę, aby zebrać kolejne fragmenty kory.Następnie wypłucz korę w lodowatym buforze GM. Potem przenieś dwie próbki kory do homogenizatora szklanego z dnem zawierającego 5 mL zimnego buforu GM. Delikatnie zhomogenizuj korę, wykonując od 5 do 10 ruchów tłuczkiem A (luźnym), a następnie od 5 do 10 ruchów tłuczkiem B (ciasnym).Liczba cykli zależy od konkretnego homogenizatora. Przenieś homogenizat do 15 mililitrowej probówki stożkowej. Odwiruj go przy 1000 ×g.Wirować przez 10 minut w temperaturze 4 °C w wirówce Allegra six KR, aby odwirować resztki komórkowe i jądra. Nanieść 2 mL nadsączu na każdy gradient sacharozy Per, stosując jeden gradient dla każdej całej kory, a następnie zakręcić probówki. Następnie wirować je w rotorze kątowym przy 32 500 ×g przez 5 minut w temperaturze 4 °C w wirówce Beckman J 2 21.Po zakończeniu procesu, przy użyciu odpowiednich adapterów, gradient powinien wykazać wyraźny prążek SN; należy odpipetować i odrzucić roztwór znajdujący się powyżej prążka SN. Używając szklanej pipety pasteurowskiej, odpipetowujemy prążek SN na interfejsie 15-23%; jeden gradient daje zazwyczaj około 0,9 do 1,1 ml SN. Następnie należy przenieść go do probówki stożkowej i przechowywać w lodzie.Następnie dostosuj stężenie soli w SNS, dodając 1/10 objętości 10-krotnego buforu stymulacyjnego. Opcjonalnie dodaj 1000-krotny chlorek wapnia, aby uzyskać stężenie końcowe 12 nM. Następnie dodaj zapas TTX o stężeniu 1 mM, aby uzyskać stężenie końcowe 1 µM w celu zahamowania niespecyficznego pobudzenia.Kolejnym krokiem jest wykorzystanie SNS w odpowiednim zastosowaniu analitycznym, takim jak badania translacji białek. W przypadku innych zastosowań lizat SN można oczyścić lub zagęścić, korzystając z zestawu do przygotowania próbek do elektroforezy SDS-PAGE firmy Pierce. Stężenie białka w SNS można określić za pomocą zestawu do mikroanalizy białek BCA.Oto przykład sześciu prążków lub frakcji. Po homogenizacji kory mysiej i rozdzieleniu jej na nieciągłych gradientach sacharozy Perol, wzbogacone SNS znajdowały się w prążku piątym na granicy 23 do 15%; prążek ten został usunięty i poddany analizie za pomocą mikroskopii elektronowej. Przykład nienaruszonych pęcherzyków synaptycznych oraz zachowania elementów przedsynaptycznych i postsynaptycznych przedstawiono tutaj na western blocie.Wykazano, że wzrost markerów synaptycznych i spadek zanieczyszczeń w frakcji SN z nieciągłego gradientu sacharozy potwierdzają, iż zwiększone wbudowanie S 35 metioniny po dodaniu glutaminianu wynika z syntezy białek de novo. Dodano 40 µM anemycyny, inhibitora syntezy białek. Rysunek ten przedstawia wyraźny spadek wbudowania S 35 metioniny w obecności anemycyny, z dodatkiem lub bez dodatku glutaminianu, w porównaniu do poziomów podstawowych.W związku z tym, nieciągłe gradienty sacharozy Percoll pozwalają na szybkie otrzymanie wysoce aktywnego i względnie czystego SNS, który może być wykorzystany do badania translacji białek. Rysunek ten pokazuje, że frakcja piąta z nieciągłego gradientu sacharozy Percoll zawiera najwyższy poziom syntezy białek de novo. SNS otrzymany poprzez przepuszczanie homogenizatu kory przez serię filtrów o malejącej wielkości porów, a następnie wirowanie w nieciągłym gradiencie sacharozy Percoll w celu porównania, zawiera więcej uszkodzonych błon i mniej całych SNS niż SNS przygotowany metodą nieciągłego gradientu sacharozy Percoll. Wykazano, że SNS przygotowany metodą nieciągłego gradientu sacharozy Percoll wykazuje większą aktywność syntezy białek de novo niż SNS przygotowany metodą filtracji.Wykazano, że SNS przygotowane z młodszych myszy wykazują większą aktywność translacyjną niż SNS z myszy starszych. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć jasne wyobrażenie o tym, jak izolować translacyjnie aktywne strefy neurosynaptyczne poprzez homogenizację kory mózgu myszy, wirowanie homogenatu w rotorze z koszyczkami wahadłowymi, wirowanie nadsączu w gradiencie sacharozy w rotorze stałokątowym, a następnie pobranie powstałego prążka strefy neurosynaptycznej.

preparation-synaptoneurosomes-from-mouse-cortex-using-discontinuous

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Przygotowanie synaptoneurosomek z kory myszy przy użyciu dyskontynuowanych gradientów gęstości Percoll-Sacharoza

W niniejszym filmie przedstawiono procedurę generowania kultur neuronalnych z kory mózgu myszy w późnym stadium embrionalnym i wczesnym okresie postnatalnym. Kultury te mogą być wykorzystywane do immunocytochemii, biochemii, elektrofizjologii, obrazowania wapnia i sodu, a także stanowią platformę do badania rozwoju neuronalnego zwierząt transgenicznych posiadających postnatalnie letalną mutację genu.

Przygotowanie dysocjowanych kultur neuronów korowych myszy

Ten film demonstruje procedurę izolowania komórek mózgowych i infiltrowanych komórek odpornościowych z niedokrwionych tkanek mózgowych myszy poprzez trawienie enzymatyczne, a następnie usuwanie resztek komórek i mieliny przez wirowanie w gradiacji gęstości, w celu zbadania reakcji na stan zapalny w badaniach nad udarem.

Uzyskiwanie zawiesin komórkowych z niedokrwionych tkanek mózgowych myszy

Źródło: Lunelli, L., et. al. Przyglądanie się polisomom mózgu za pomocą mikroskopii sił atomowych. J. Vis. exp.(2016). Ten film przedstawia obrazowanie polisomów przy użyciu mikroskopii sił atomowych. Arkusz miki pokryty jonami niklu zakotwicza RNA z dołączonymi rybosomami. Próbka jest myta, suszona i umieszczana na stoliku mikroskopowym. Końcówka wspornikowa skanuje powierzchnię próbki, rejestrując ugięcia lasera w celu odwzorowania topologii. Oprogramowanie służy do korekcji zniekształceń i...

 Obrazowanie polisomów wyizolowanych z mózgu myszy za pomocą mikroskopii sił atomowych

Ten artykuł szczegółowo opisuje wzbogacanie białek związanych z błoną plazmatyki synaptycznej przez ultrawirowanie na nieciągłym gradiencie sacharozy. Opisano również późniejsze przygotowanie białek o gęstości postsynaptycznej. Preparaty białkowe nadają się do western blotting lub analizy 2D DIGE.

Otrzymywanie błony plazmatycznej synaps i białek o gęstości postsynaptycznej przy użyciu nieciągłego gradientu sacharozy

Chociaż struktura rybosomów została szczegółowo opisana, organizacja polisomów jest nadal niedostatecznie zbadana. Aby przezwyciężyć ten brak wiedzy, przedstawiamy tutaj szczegółowy protokół przygotowania do dokładnego obrazowania polisomów ssaków za pomocą mikroskopii sił atomowych (AFM) w powietrzu i cieczy.

Przyglądanie się polisosomom mózgu za pomocą mikroskopii sił atomowych

Identyfikacja molekuł i szlaków kontrolujących plastyczność synaptyczną i pamięć jest nadal głównym wyzwaniem w neurobiologii. W tym miejscu opisano przepływ pracy dotyczący względnej kwantyfikacji białek synaptycznych rzekomo zaangażowanych w molekularną reorganizację synaps podczas uczenia się i konsolidacji pamięci w paradygmacie uczenia się słuchowego.

Ilościowe profilowanie proteomu synaptycznego w wysokiej rozdzielczości regionów mózgu myszy po uczeniu się dyskryminacji słuchowej

Tutaj prezentujemy protokół frakcjonowania błony mózgowej, który stanowi solidną procedurę izolowania białek należących do różnych przedziałów synaptycznych.

Frakcjonowanie błony mózgowej: podejście ex vivo do oceny lokalizacji białek subsynaptycznych

Przedstawiono protokół izolacji pierwotnego mikrogleju z mysich mózgów. Technika ta pomaga w pogłębieniu obecnego zrozumienia schorzeń neurologicznych. Wirowanie w gradiencie gęstości i separacja magnetyczna są połączone w celu uzyskania wystarczającej wydajności próbki o wysokiej czystości. Ponadto przedstawiamy etapy charakterystyki mikrogleju.

Charakterystyka i izolacja pierwotnego mikrogleju myszy za pomocą wirowania w gradifikacji gęstości

Wyzwanie dla młodych neuronów w nowych regionach mózgu może ujawnić ważne informacje na temat tego, jak środowisko kształtuje los i dojrzewanie neuronów. Protokół ten opisuje procedurę zbierania prekursorów interneuronów z określonych regionów mózgu i przeszczepiania ich homotopowo lub heterotopowo do mózgu młodych po urodzeniu.

Homochroniczne przeszczepianie prekursorów interneuronów do wczesnych postnatalnych mózgów myszy

Rozwój mózgu ssaków wymaga właściwej kontroli ekspresji genów na poziomie translacji. W tym miejscu opisujemy system profilowania polisomów z łatwą do złożenia platformą do tworzenia gradientu sacharozy i frakcjonowania w celu oceny stanu translacji mRNA w rozwijającym się mózgu.

Analiza translacji w rozwijającym się mózgu myszy przy użyciu profilowania polisomów

Ten protokół przedstawia solidną, szczegółową metodę uzyskiwania wysoce czystych synaptosomów, pęcherzyków synaptycznych i innych frakcji synaptycznych z mózgu myszy. Metoda ta umożliwia ocenę procesów synaptycznych, w tym analizę biochemiczną lokalizacji i funkcji białek z rozdzielczością kompartmentową.

Frakcjonowanie subkomórkowe w celu wyizolowania składników synaptycznych z mózgu myszy

Poznaj metodę izolacji aktywnych translacyjnie synaptoneurosomów z kory mózgu myszy przy użyciu nieciągłego gradientu gęstości Percoll-sacharoza. Technika minimalizuje uszkodzenia mechaniczne i toksyczność.

Przygotowanie synaptoneurosomów z kory mózgu myszy z wykorzystaniem nieciągłego gradientu gęstości Percoll-sukroza

Przeglądaj więcej filmów