Otrzymywanie synaptoneurosomów z kory myszy przy użyciu nieciągłego gradientu gęstości perkolu i sacharozy

Ogólnym celem tej procedury jest przygotowanie translacyjnie aktywnej synapy do stref neurologicznych z kory mózgowej myszy, przy użyciu nieciągłego gradientu gęstości sacharozy peralnej. Osiąga się to poprzez najpierw zebranie i homogenizację kory myszy, a następnie odwirowanie homogenatu. Następnie nanieść homogenat wirówki lub sup natant do praportu na gradienty co sacharozy.

Ostatnim krokiem jest odwirowanie i zebranie frakcji synaptosomu. Ostatecznie analiza western blot i eksperymenty z inkorporacją metioniny S 35 pokazują, że frakcja synaptosomów jest wzbogacona synaptycznie i aktywna translacyjnie. Główne zalety tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak wirowanie i filtracja, nasze pierwsze uszkodzenia mechaniczne są unikane dzięki zastosowaniu gradientów gęstości, a druga na wywołanie ma niską toksyczność dla komórek w ich składnikach.

Ogólnie rzecz biorąc, osoby nowe w tej metodzie będą zmagać się z tym protokołem, ponieważ czas odgrywa kluczową rolę. Po zebraniu korty procedura powinna zostać szybko zakończona. Aby rozpocząć procedurę, należy przygotować warstwy gradientu 3, 10, 15 i 23%, dodając odpowiednie ilości SIP zgodnie z opisem w dołączonym manuskrypcie do bufora GM i dobrze wymieszać.

Wlać warstwy gradientu, pipetując po dwa mililitry z każdego z 23, 15, 10 i 3% izosmotycznych roztworów perolu do probówek wirówkowych Beckman z nakrętkami. Używając pipety P 1000, powierzchnia styku między warstwami powinna być wyraźnie widoczna, bez mieszania warstw. Przechowuj nachylenia czterech stopni Celsjusza przez co najmniej 20 minut przed użyciem.

Przed rozpoczęciem tej procedury należy przygotować inne niezbędne rozwiązania zgodnie z opisem w dołączonym manuskrypcie. Poddaj mysz eutanazji w wieku od P 13 do P 21 i przygotuj ją do sekcji, spryskując tył szyi i głowę 70% etanolem. Następnie użyj ostrych nożyczek, aby przeciąć rdzeń kręgowy u podstawy czaszki.

Następnie usuń skórę z górnej części czaszki. Przetnij czaszkę bocznie między kością ciemieniową a kością międzyciemieniową lub między mózgowiem a obszarami kory. Następnie przetnij czaszkę od podstawy do nosa wzdłuż szwu strzałkowego.

Na tym etapie ostrożnie usuń miękką kość ciemieniową, pociągając każdą półkulę na bok. Następnie włóż szpatułkę do mózgu nad móżdżkiem, aby zgarnąć korę. Umieść go w lodowatym buforze GMO i powtórz procedury ponownie, aby zebrać więcej kory.

Teraz opłucz korę w lodowatym buforze GMO. Następnie przenieś dwie korowe wody do homogenizatora ze szklanym puchem zawierającego pięć mililitrów zimnego buforu GMO. Delikatnie homogenizuj korę za pomocą pięciu do 10 uderzeń tłuczka A, luźnego tłuczka, a następnie od pięciu do 10 uderzeń tłuczka B, tłuczka typu tłuczek.

Liczba uderzeń różni się w zależności od indywidualnego homogenizatora. Przenieś homogenat do stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów. Odwiruj go 1000 razy.

Grawitacja przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza w wirówce Allegra six KR w celu osadzania szczątków komórkowych i jąder. Ułóż dwa mililitry supinatu dla każdego gradientu per lub sacharozy z jednym gradientem dla każdej całej kory i zakryj rurki. Następnie odwiruj je w wirniku o stałym kącie nachylenia 32, 500 razy większym niż grawitacja przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza w wirówce Beckman J 2 21.

Używając odpowiednich adapterów po zakończeniu, gradient powinien usunąć mocną pipetę pasmową SN i wyrzucić roztwór powyżej pasma SN. Używając szklanej pipety do makaronu, pipetuje się pasmo SN na granicy faz od 15 do 23%, jeden gradient zwykle daje około 0,9 do 1,1 mililitra sns. Następnie przenieś go do stożkowej rurki i przechowuj na lodzie.

Następnie dostosuj stężenie soli w SNS, dodając jedną dziesiątą objętość 10-krotnego buforu stymulacyjnego. Opcjonalnie dodać 1000 razy chlorek wapnia, aby uzyskać końcowe stężenie 12 anomolowców. Następnie dodaj jeden milimolowy zapas TTX, aby uzyskać końcowe stężenie jednego mikromola, aby stłumić wzbudzenie nieswoiste.

Następnym krokiem jest użycie SNS w odpowiedniej aplikacji podrzędnej, takiej jak badania translacji białek. W przypadku innych zastosowań lizat SN można oczyścić lub zagęścić za pomocą zestawu do przygotowywania próbek stron Pierce SDS. Stężenie białka w SNS można określić za pomocą zestawu do oznaczania białek mikro BCA.

Oto przykład sześciu pasm lub ułamków. Kiedy kora myszy została zhomogenizowana i oddzielona na nieciągłych gradientach sacharozy perolu, wzbogacony SNS zawarto w paśmie piątym na granicy faz od 23 do 15%, pasmo to usunięto i zbadano za pomocą mikroskopii elektronowej. Przykład nienaruszonych pęcherzyków synaptycznych i zachowania elementów presynaptycznych i postsynaptycznych pokazano tutaj w western blot.

Wykazano, że wzrost markerów synaptycznych i spadek zanieczyszczeń w paśmie SN z nieciągłego gradientu na sacharozę potwierdza, że wzrost inkorporacji metioniny S 35 po dodaniu glutaminianu jest spowodowany syntezą białek de novo. Dodano 40 mikromolowych znieczuleń Mycyna inhibitor syntezy białek. Rysunek ten pokazuje wyraźny spadek inkorporacji metioniny S 35 w obecności anso mycyny z glutaminianem lub bez niego w porównaniu z poziomami podstawowymi.

W ten sposób nieciągłe gradienty sacharozy peralnej szybko wytwarzają wysoce aktywny i stosunkowo czysty SNS, który można wykorzystać do badania translacji białek. Rysunek ten pokazuje, że pasmo piąte z nieciągłego gradientu sacharozy na rdzeń zawiera najwyższe poziomy syntezy białek de novo. Wykazano, że SNS przygotowany przez przepuszczenie homogenizowanej kory przez szereg filtrów o zmniejszającej się wielkości porów, a następnie odwirowanie nad nieciągłym gradientem sacharozy na rdzeń dla porównania, zawiera więcej uszkodzonych błon i mniej całych SNS niż SNS przygotowanych metodą nieciągłego gradientu sacharozy Perol Wykazano, że SNS przygotowany przy użyciu metody nieciągłego gradientu sacharozy peral zawiera większą aktywność syntezy białek de novo niż SNS przygotowany przy użyciu metody filtracji.

Wykazano, że SNS przygotowane od młodszych myszy mają większą aktywność translacyjną niż starsze myszy. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobry pomysł na to, jak wyizolować translacyjnie aktywne synaptyczne strefy neuro poprzez homogenizację kory myszy, odwirowanie homogenatu w kołyszącym się wirniku kubełkowym, odwirowanie supernatantu nad gradientem sacharozy na wywołanie w wirniku o stałym kącie, a następnie zebranie powstałego pasma stref nerwu synaptycznego.