Ilościowe profilowanie proteomu synaptycznego w wysokiej rozdzielczości regionów mózgu myszy po uczeniu się dyskryminacji słuchowej

Ogólnym celem tego podejścia proteomicznego jest charakterystyka reorganizacji molekularnej w synapsach po uczeniu się i formowaniu pamięci, aby zrozumieć podstawowe mechanizmy i szlaki sygnalizacyjne. Główną zaletą tej techniki jest podejście wolne od hipotez, co umożliwia wielkoskalową kwantyfikację i charakterystykę modyfikacji potranslacyjnych w obrębie proteomów synaptycznych. Nasz opracowany schemat postępowania pozwala na powiązanie określonej zmiany molekularnej z konkretnym zachowaniem.

Uczenie się i formowanie pamięci opierają się na zmianach wydajności synaptycznej, dlatego badania proteomiczne powinny skupiać się bardziej na analizie struktur synaptycznych, takich jak synaptosomy, niż na homogenatach z tkanki mózgowej. Wyniki proteomiczne stanowią niezwykle złożone zestawy danych, dlatego wymagają one przetwarzania bioinformatycznego. Rozpocznij trening, umieszczając mysz testową w słabo oświetlonej komorze wahadłowej (shuttle box) wewnątrz wygłuszonej komory.

Zastosuj w pełni sterowany komputerowo harmonogram nauczania dla treningu dyskryminacji słuchowej. Rozpocznij od trzy minutowej przerwy na habituację w ciszy przed rozpoczęciem sesji treningowej. Podczas prób typu „go”, zwierzę musi pokonać przeszkodę w ciągu sześciu sekund od prezentacji sygnału dźwiękowego, aby odnotować sukces.

W przypadku prób no-go zwierzę musi pozostać w aktualnej komorze urządzenia typu shuttle box przez sześć sekund prezentacji sygnału dźwiękowego. Przeprowadź 30 prób go oraz 30 prób no-go w kolejności pseudolosowej, z odstępem między próbami wynoszącym 20 sekund, tak aby jedna sesja składała się z 60 prób i trwała około 25 minut. Po zakończeniu wszystkich prób zwróć trenowaną mysz do klatki domowej aż do momentu uboju.

Po uśmierceniu myszy i wyjęciu mózgu, zlokalizuj korę słuchową, korzystając z punktów orientacyjnych, takich jak naczynia krwionośne i kształt powierzchni. Następnie za pomocą skalpela i igły wycinij obustronnie korę słuchową w formie prostokątnego bloku tkanki. Wykorzystując chiasma opticum jako punkt orientacyjny, wycinij korę przedczołową w formie przekroju mózgu między Bregma 3.56 a 1.54.

Wypreparuj prążkowie w formie plastra mózgu pomiędzy Bregma 1,54 a 0,5. Następnie ostrożnie usuń tkankę korową. Wypreparuj hipokamp, stabilizując mózg za pomocą igły wprowadzonej przez móżdżek i rozwijając korę, zaczynając od płata potylicznego.

Próbki wypreparowanego mózgu zamrozić gwałtownie w ciekłym azocie. Oczyszczanie synaptosomów rozpocząć od przeniesienia wypreparowanej tkanki mózgu do naczyń do homogenizacji zawierających jeden mililitr lodowatego Buforu A. Następnie tkankę poddać homogenizacji przy 900 RPM, wykonując około 12 pociągnięć. Próbki odwirować przy 1 000 ×g przez 10 minut.

Po wirowaniu należy zachować nadsączniki. Osad ponownie homogenizować w ten sam sposób, a następnie połączyć nadsączniki. Połączone nadsączniki wirować przez 20 minut przy 12 000 ×g. Osady zawiesić w 1 mL buforu do homogenizacji i homogenizować, wykonując sześć cykli przy 900 RPM, a następnie wirować przy 1 200 ×g przez 20 minut.

Podczas wirowania w celu otrzymania osadów P2 przygotuj gradienty schodkowe sacharozy w probówkach do ultrawirowania. Zacznij od 2,5 mililitrów buforu sacharozowego 1,0 M, a następnie za pomocą szklanej pipety Pasteura nałóż warstwą 1,5 mililitra buforu sacharozowego 1,2 M. Po zakończeniu wirowania dodaj 0,5 mililitra buforu sacharozowego 0,32 M do osadów P2.

Następnie ponownie przeprowadzić homogenizację, wykonując sześć pociągnięć. Nałożyć homogenaty na wierzch gradientów. Umieścić załadowane gradienty w rotorze z ruchomymi koszykami, a następnie wirować w ultrawirówce przy 85 000 ×g przez dwie godziny.

Po zakończeniu wirowania odrzuć górną warstwę sacharozy 0,32 M, wliczając w to materiał na granicy z buforem sacharozowym 1,0 M. Zbierz synaptosomy z granicy faz buforu sacharozowego 1,0 M i 1,2 M. Dodaj bufor sacharozowy 0,32 M do frakcji synaptosomów w stosunku 1:1.

Należy ostrożnie wymieszać i wirować z przyspieszeniem 150 000 ×g przez jedną godzinę. Synaptosomy znajdują się w osadzie i mogą zostać ponownie zawieszone w buforze w celu dalszej obróbki. Synaptosomy z każdego obszaru mózgu zwierzęcia należy rozpuścić w 20 do 50 µL 8 M mocznika, inkubując na lodzie przez jedną godzinę w kąpieli ultradźwiękowej.

Rozcieńczyć z użyciem jeden procent detergentu usuwalnego, aby uzyskać końcowe stężenie mocznika równe dwa molar. Po określeniu względnych ilości białka za pomocą SDS-PAGE, pipetować jedną trzecią pozostałej części każdej próbki do nowej probówki. Przeprowadzić trawienie w roztworze, dodając dwa milimolar DTT oraz 25 milimolar wodorowęglanu amonu, a następnie delikatnie wymieszać próbkę na wortexie.

Redukować próbki przez 45 minut w temperaturze 20°C. Dodać 10 mM iota-acedomidu w celu karbamidometylacji reszt cysteiny i wymieszać. Inkubować przez 30 minut w ciemności w temperaturze 20°C.

Na koniec dodaj 1 µL roztworu zapasu trypsyny i inkubuj w temperaturze 20 °C przez 12 godzin. Aby usunąć detergent podatny na hydrolizę kwasową, dodaj kwas trifluorooctowy do stężenia końcowego 1% i inkubuj przez kolejną godzinę w temperaturze 20 °C. Po odwirowaniu próbek przy 16 000 ×g przez 10 minut, ostrożnie zbierz supernatanty.

Umieść kolumnę do ekstrakcji w fazie stałej w statywie i wyrównaj matrycę, używając 2 ml metanolu. Po przemyciu dodaj kolejne 2 ml Buforu B i wprowadź próbkę. Po trzykrotnym przemyciu Buforem B eluuj peptydy, dodając 200 µL 70% acetonitrylu i 0,1% kwasu trifluorooctowego.

Następnie wysuszyć oczyszczone próbki w wirówce próżniowej. W tym przykładzie zwierzęta przeszkolone w zadaniu dyskryminacji tonów FM wykazują rosnący odsetek trafień oraz malejący odsetek fałszywych alarmów w miarę trwania sesji treningowych. Istotna dyskryminacja występuje od czwartej sesji.

Porównano względną synaptyczną zawartość wybranych białek u myszy przeszkolonych w zadaniu rozróżniania tonów FM oraz u naiwnych myszy kontrolnych 24 godziny po pierwszej sesji treningowej. Po treningu poziomy białka CYFP2 uległy zmianie we wszystkich badanych obszarach. Należy pamiętać, że zwierzęta często wykazują zmienność wewnątrzindywidualną.

Dlatego też wysoce zaleca się uwzględnienie w badaniu co najmniej pięciu lub więcej powtórzeń biologicznych w dobrze dopasowanych grupach zwierząt. Po opracowaniu technika ta może zostać łatwo zaadaptowana do innych gatunków. Na przykład została ona wykorzystana do monitorowania zmian w ekspresji białek zależnych od uczenia się w pojedynczych mózgach muszki owocówki.