Ilościowe profilowanie proteomu synaptycznego w wysokiej rozdzielczości regionów mózgu myszy po uczeniu się dyskryminacji słuchowej

Ogólnym celem tego podejścia proteomicznego jest scharakteryzowanie reorganizacji molekularnej w synapsach po uczeniu się i tworzeniu pamięci, aby zrozumieć podstawowe mechanizmy i szlaki sygnałowe. Główną zaletą tej techniki jest podejście wolne od hipotez, pozwalające na ilościową ocenę i charakterystykę procesów potranslacyjnych i modyfikacji w obrębie proteomów synaptycznych. Nasz ustalony przepływ pracy pozwala na korelację między pewną zmianą molekularną a określonym zachowaniem.

Uczenie się i tworzenie pamięci opiera się na zmianach skuteczności synaptycznej, dlatego badania proteomiczne powinny koncentrować się bardziej na analizie struktur synaptycznych, takich jak synaptosomy, niż na homogenatach z tkanki mózgowej. Wyniki badań proteomicznych reprezentują bardzo złożone zestawy danych, dlatego wymagają przetwarzania bioinformatycznego. Rozpocznij trening od umieszczenia myszy testowej w słabo oświetlonym pudełku wahadłowym w dźwiękoszczelnej komorze.

Korzystaj z w pełni sterowanego komputerowo harmonogramu nauki do nauki dyskryminacji słuchowej. Rozpocznij od okresu przyzwyczajenia trwającego trzy minuty ciszy przed rozpoczęciem sesji treningowej. Podczas prób go zwierzę musi przekroczyć przeszkodę w ciągu sześciu sekund od prezentacji tonu, aby uzyskać trafienie.

Podczas prób no-go zwierzę musi pozostać w obecnej komorze loży wahadłowej przez sześć sekund prezentacji tonu. Wykonaj 30 prób go i 30 prób no-go w pseudorandomizowanej kolejności, z odstępem między próbami wynoszącym 20 sekund, tak aby jedna sesja składała się z 60 prób i trwała około 25 minut. Po wykonaniu wszystkich prób wróć wyszkoloną mysz do klatki domowej, aż zostanie złożona w ofierze.

Po poświęceniu myszy i usunięciu mózgu, zlokalizuj korę słuchową za pomocą wizualnych punktów orientacyjnych, w tym naczyń krwionośnych i kształtu powierzchni. Następnie użyj skalpela i igły, aby obustronnie wypreparować korę słuchową jako prostokątny blok tkanki. Używając chiasma opticum jako punktu orientacyjnego, przeanalizuj korę czołową jako wycinek mózgu między Bregma 3.56 i 1.54.

Rozetnij prążkowie jako wycinek mózgu między Bregma 1,54 a 0,5. I ostrożnie usuń tkankę korową. Rozwiń hipokamp, stabilizując mózg za pomocą igły przez móżdżek i rozwijając korę, zaczynając od płata potylicznego.

Szokowe zamrażanie wypreparowanych próbek mózgu w ciekłym azocie. Rozpocznij oczyszczanie synaptosomu od przeniesienia wypreparowanej tkanki mózgowej do naczyń homogenizacyjnych zawierających jeden mililitr lodowatego buforu A. Następnie homogenizuj tkankę przy 900 obr./min, wykonując około 12 uderzeń. Odwirować próbki w temperaturze 1 000 razy G przez 10 minut.

Po odwirowaniu zachować supernatanty. Ponownie homogenizować osad jak poprzednio i połączyć supernatanty. Wirować połączone supernatanty przez 20 minut po 12 000 razy G. Ponownie zawiesić granulki w jednym mililitrze buforu homogenizacyjnego i homogenizować sześcioma pociągnięciami przy 900 obr./min, a następnie odwirować 1,200 razy G przez 20 minut.

Podczas wirowania w celu wytworzenia granulek P2 należy przygotować gradienty krokowe sacharozy w probówkach ultrawirówek. Zacznij od 2,5 mililitra 1,0-molowego buforu sacharozy, a następnie użyj szklanej pipety Pasteura, aby nałożyć 1,5 mililitra 1,2-molowego buforu sacharozy. Po odwirowaniu dodaj 0,5 mililitra 0,32 molowego buforu sacharozy do granulek P2.

Następnie ponownie homogenizuj za pomocą sześciu pociągnięć. Załaduj homogenizowane frakcje na wierzch gradientów. Umieść załadowane pochyłości w wahadłowym wirniku kubełkowym, a następnie wiruj z prędkością 85 000 razy G przez dwie godziny w ultrawirówce.

Po zakończeniu wirowania należy wyrzucić górną warstwę sacharozy o masie 0,32 mola, w tym materiał na granicy faz z 1,0 molowym buforem sacharozy. Zbierz synaptosomy na granicy faz bufora sacharozy od jednego do 1,2 mola. Dodać 0,32 molowego buforu sacharozy do frakcji synaptosomalnej w stosunku 1,1.

Dokładnie wymieszaj i wiruj z prędkością 150 000 razy G przez godzinę. Synaptosomy znajdują się w pastylce i mogą być ponownie zawieszone w buforze w celu dalszego przetwarzania. Rozpuść synaptosomy każdego obszaru mózgu zwierzęcia w 20 do 50 mikrolitrach 8-molowego mocznika, inkubując na lodzie przez godzinę w kąpieli ultradźwiękowej.

Rozcieńczyć jednym procentem usuwalnego detergentu, aby zapewnić końcowe stężenie dwóch molowych moczników. Po określeniu względnych ilości białka za pomocą pipety SDS-PAGE należy przelać jedną trzecią pozostałej części każdej próbki do świeżej probówki. Przeprowadzić trawienie w roztworze, dodając dwa milimolowe DTT i 25-milimolowy wodorowęglan amonu i delikatnie zwirować próbkę.

Próbki redukować przez 45 minut w temperaturze 20 stopni Celsjusza. Dodaj 10 milimolowych acedomidów joty do reszt cysteiny karbamidometylanu i wymieszaj. Inkubować przez 30 minut w ciemności w temperaturze 20 stopni Celsjusza.

Na koniec dodaj jeden mikrolitr roztworu podstawowego trypsyny i inkubuj w temperaturze 20 stopni Celsjusza przez 12 godzin. Aby usunąć detergent rozszczepialny w kwasie, dodaj kwas trifluorooctowy do końcowego stężenia jednego procenta i inkubuj przez kolejną godzinę w temperaturze 20 stopni Celsjusza. Po odwirowaniu próbek w temperaturze 16 000 razy G przez 10 minut, ostrożnie zebrać supernatanty.

Umieść kolumnę ekstrakcyjną do fazy stałej na stojaku i zrównoważ matrycę dwoma mililitrami metanolu. Po umyciu dodać dodatkowe dwa mililitry buforu B i załadować próbkę. Po trzykrotnym przemyciu buforem B wymyj peptydy, dodając 200 mikrolitrów 70 procent acetonitrylu i 0,1 procent kwasu triflourooctowego.

Następnie oczyszczone próbki wysuszyć w wirówce próżniowej. W tym przykładzie zwierzęta wyszkolone w zadaniu dyskryminacji tonów FM wykazują rosnącą liczbę trafień i malejącą liczbę fałszywych alarmów w trakcie sesji treningowych. Znacząca dyskryminacja ma miejsce od czwartej sesji.

Względna obfitość synaps wybranych białek jest porównywana między myszami wyszkolonymi w zadaniu dyskryminacji tonów FM a naiwnymi myszami kontrolnymi 24 godziny po pierwszej sesji treningowej. Po treningu poziom białka CYFP2 ulega zmianie we wszystkich badanych regionach. Nie zapominaj, że zwierzęta często wykazują częste zmiany wewnątrzosobnicze.

Dlatego zdecydowanie zaleca się włączenie do badania co najmniej pięciu lub więcej powtórzeń biologicznych dobrze dopasowanych grup zwierząt. Po ustaleniu technika ta może być łatwo zaadaptowana do innych gatunków. Na przykład wykorzystano go do monitorowania zależnych od uczenia się zmian ekspresji białek w mózgach pojedynczych muszek owocowych.