Name: Ilościowe profilowanie proteomu synaptycznego w wysokiej rozdzielczości regionów mózgu myszy po uczeniu się dyskryminacji słuchowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 36 s
Description: Odkryj ilościowe profilowanie proteomu synaptycznego w wysokiej rozdzielczości u myszy po uczeniu się dyskryminacji słuchowej. Ta metoda pozwala korelować zmiany molekularne z zachowaniem.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Yvonne Ducho i Kathrin Pohlmann za doskonałą pomoc techniczną. Prace te były wspierane przez Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 779) oraz przez Krajowy Fundusz Saksonii-Anhalt / Europejski Fundusz Rozwoju Regionalnego (EFRR) za pośrednictwem Centrum Behawioralnych Nauk o Mózgu (CBBS).

<ol><li>Lamprecht, R., LeDoux, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+plasticity+and+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Structural plasticity and memory.</a> Nat Rev Neurosci. 5 (1), 45-54 (2004).</li>
<li>Bingol, B., Schuman, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+protein+degradation+by+the+ubiquitin+proteasome+system%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Synaptic protein degradation by the ubiquitin proteasome system.</a> Curr Opin Neurobiol. 15 (5), 536-541 (2005).</li>
<li>Richter, J. D., Klann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+synaptic+plasticity+and+memory+last%3A+mechanisms+of+translational+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Making synaptic plasticity and memory last: mechanisms of translational regulation.</a> Genes Dev. 23 (1), 1-11 (2009).</li>
<li>Rosenberg, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+roles+of+protein+expression+in+synaptic+plasticity+and+memory+consolidation%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The roles of protein expression in synaptic plasticity and memory consolidation.</a> Front Mol Neurosci. 7, 86(2014).</li>
<li>Scheich, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+semantics+of+learning+and+crossmodal+processing+in+auditory+cortex%3A+the+semantic+processor+concept%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">Behavioral semantics of learning and crossmodal processing in auditory cortex: the semantic processor concept.</a> Hear Res. 271 (1-2), 3-15 (2011).</li>
<li>Kähne, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+proteome+changes+in+mouse+brain+regions+upon+auditory+discrimination+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Synaptic proteome changes in mouse brain regions upon auditory discrimination learning.</a> Proteomics. 12 (15-16), 2433-2444 (2012).</li>
<li>Reichenbach, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+of+dopamine+signalling+on+long-term+memory+formation+and+consolidation+in+rodent+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Proteome+Sci%22%5BJournal%5D)">Differential effects of dopamine signalling on long-term memory formation and consolidation in rodent brain.</a> Proteome Sci. 13, 13(2015).</li>
<li>Kähne, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteome+rearrangements+after+auditory+learning%3A+high-resolution+profiling+of+synapse-enriched+protein+fractions+from+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Proteome rearrangements after auditory learning: high-resolution profiling of synapse-enriched protein fractions from mouse brain.</a> J Neurochem. , (2016).</li>
<li>Li, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organelle+proteomics+of+rat+synaptic+proteins%3A+correlation-profiling+by+isotope-coded+affinity+tagging+in+conjunction+with+liquid+chromatography-tandem+mass+spectrometry+to+reveal+post-synaptic+density+specific+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Organelle proteomics of rat synaptic proteins: correlation-profiling by isotope-coded affinity tagging in conjunction with liquid chromatography-tandem mass spectrometry to reveal post-synaptic density specific proteins.</a> J Proteome Res. 4 (3), 725-733 (2005).</li>
<li>Carlin, R. K., Grab, D. J., Cohen, R. S., Siekevitz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+postsynaptic+densities+from+various+brain+regions%3A+enrichment+of+different+types+of+postsynaptic+densities%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of postsynaptic densities from various brain regions: enrichment of different types of postsynaptic densities.</a> J Cell Biol. 86 (3), 831-845 (1980).</li>
<li>Smalla, K. H., Klemmer, P., Wyneken, U. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSmalla%2C+KH+%22The+Cytoskeleton+-+Imaging%2C+Isolation%2C+and+Interaction%22">The Cytoskeleton - Imaging, Isolation, and Interaction</a>. Dermietzel, R. , Humana Press. 265-282 (2012).</li>
<li>Smalla, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+synaptic+glycoprotein+neuroplastin+is+involved+in+long-term+potentiation+at+hippocampal+CA1+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The synaptic glycoprotein neuroplastin is involved in long-term potentiation at hippocampal CA1 synapses.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (8), 4327-4332 (2000).</li>
<li>Shapiro, A. L., Vinuela, E., Maizel, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+weight+estimation+of+polypeptide+chains+by+electrophoresis+in+SDS-polyacrylamide+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Molecular weight estimation of polypeptide chains by electrophoresis in SDS-polyacrylamide gels.</a> Biochem Biophys Res Commun. 28 (5), 815-820 (1967).</li>
<li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li>
<li>Shevchenko, A., Wilm, M., Vorm, O., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometric+sequencing+of+proteins+silver-stained+polyacrylamide+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometric sequencing of proteins silver-stained polyacrylamide gels.</a> Anal Chem. 68 (5), 850-858 (1996).</li>
<li>Thingholm, T. E., Larsen, M. R., Ingrell, C. R., Kassem, M., Jensen, O. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TiO%282%29-based+phosphoproteomic+analysis+of+the+plasma+membrane+and+the+effects+of+phosphatase+inhibitor+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">TiO(2)-based phosphoproteomic analysis of the plasma membrane and the effects of phosphatase inhibitor treatment.</a> J Proteome Res. 7 (8), 3304-3313 (2008).</li>
<li>Carmona-Saez, P., Chagoyen, M., Tirado, F., Carazo, J. M., Pascual-Montano, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GENECODIS%3A+a+web-based+tool+for+finding+significant+concurrent+annotations+in+gene+lists%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">GENECODIS: a web-based tool for finding significant concurrent annotations in gene lists.</a> Genome Biol. 8 (1), 3(2007).</li>
<li>Bonn, S., Seeburg, P. H., Schwarz, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+expression+of+alpha-+and+gamma-protocadherins+alters+their+presenilin-dependent+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Combinatorial expression of alpha- and gamma-protocadherins alters their presenilin-dependent processing.</a> Mol Cell Biol. 27 (11), 4121-4132 (2007).</li>
<li>Tweedie-Cullen, R. Y., Reck, J. M., Mansuy, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+mapping+of+post-translational+modifications+on+synaptic%2C+nuclear%2C+and+histone+proteins+in+the+adult+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Comprehensive mapping of post-translational modifications on synaptic, nuclear, and histone proteins in the adult mouse brain.</a> J Proteome Res. 8 (11), 4966-4982 (2009).</li>
<li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+differential+hippocampal+phosphoproteome+of+Apodemus+sylvaticus+paralleling+spatial+memory+retrieval+in+the+Barnes+maze%5BTitle%5D)+AND+%22Behav+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">The differential hippocampal phosphoproteome of Apodemus sylvaticus paralleling spatial memory retrieval in the Barnes maze.</a> Behav Brain Res. 264, 126-134 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W badaniu przedstawiono metodologiczny przebieg pracy zoptymalizowany pod kątem dokładnego profilowania ilościowego zmian ekspresji białek synaptycznych podczas uczenia się i konsolidacji pamięci w różnych obszarach mózgu myszy. Konfiguracja daje możliwość badania ekspresji białek na poziomie pojedynczego zwierzęcia, pomimo wymaganego zastosowania co najmniej trzech kontrprób technicznych na próbkę do analizy spektrometrii mas.
Metodologia uwzględnia szczególny skład białkowy pre- i postsynapsy składającej się z białek rusztowania o dużej masie cząsteczkowej, ale także z ważnych białek mediatorowych o średniej lub mniejszej masie cząsteczkowej. Trawienie w roztworze preparatów synaptosomalnych skutkuje wydajnym wytwarzaniem, a tym samym nadreprezentacją peptydów pochodzących z rusztowań. To z kolei może hamować analizę mniejszych lub mniej obfitych białek. Sugerowane przygotowanie frakcji SDS-PAGE z podwielokrotności każdej próbki w połączeniu z równoległą procedurą trawienia w żelu ułatwia analizę białek o średniej i niskiej liczebności i stanowi wysoce zalecaną metodę uzupełniającą. Po oddzielnym zastosowaniu spektrometrii mas wszystkich frakcji pochodzących z próbki (np. trawienie w roztworze, trawienie w żelu, połączone frakcje wzbogacone fosfo) odpowiednie zestawy danych MS/MS mogą być łączone i dalej obliczane w celu identyfikacji i kwantyfikacji białek za pomocą oprogramowania PEAKS lub alternatywnych popularnych pakietów oprogramowania.
Alternatywnie, indywidualne zastosowanie frakcji próbki pochodzących z trawienia w żelu (oddzielnie przetworzone obszary żelu na torze próbki) oraz frakcji wytworzonych z próbki wytrawionej w roztworze (np. metodą chromatografii jonowymiennej) do spektrometrii mas może zwiększyć głębokość analizy. Jednak ten rozszerzony przepływ pracy znacznie wydłuża czas wymagany do akwizycji danych LS-MS/MS. Do wygenerowania szczegółowej sekwencji molekularnej przegrupowań białek synaptycznych podczas uczenia się i tworzenia pamięci wymagany jest określony przebieg profilowania proteomicznego w określonym czasie. Ten kurs czasowy może rozpocząć się natychmiast po lub nawet w trakcie pierwszej sesji treningowej i obejmuje ściśle powiązane ramy czasowe, aż do momentu, gdy wyniki zwierząt osiągną asymptotyczny poziom krzywej uczenia się po ok. 8 - 10 dniach treningu (szczegóły na rysunku 2 ).
Analiza zmian fosforylacji białek synaptycznych wymaga szczególnego skupienia się na wybranych ramach czasowych podczas uczenia się FMTD. Z jednej strony kaskady sygnalizacyjne inicjujące rearanżacje białek synaptycznych, o których wiadomo, że są wywoływane przez fosforylację i defosforylację białek, są oczekiwane na bardzo wczesnych etapach treningu zwierząt. Z drugiej strony, znane są długotrwałe modyfikacje wielu fosforylowanych białek synaptycznych, które regulują łączność i składanie w architekturze synaptycznej19, 20. Te modyfikacje potranslacyjne są oczekiwane nawet w późniejszych punktach konsolidacji pamięci.
Złożone zestawy danych generowane przez ten proteomiczny przepływ pracy wymagają przetwarzania bioinformatycznego w celu zidentyfikowania uczestniczących szlaków molekularnych i kluczowych cząsteczek. Metaanaliza pokazuje znaczące nadreprezentowane ścieżki, które odgrywają rolę w procesach uczenia się i zapamiętywania.

Uczenie się opiera się na tworzeniu śladów pamięciowych i ich utrzymywaniu. Powszechnie przyjmuje się, że jeden z podstawowych mechanizmów może reprezentować zależne od aktywności tworzenie nowych i/lub rearanżacji istniejących kontaktów synaptycznych między neuronami. Na poziomie molekularnym opisano różne modyfikacje białek, relokacje subkomórkowe i zmiany w obrocie białek synaptycznych1-4 (Lamprecht, 2004 #8). Jednak większość dotychczasowych badań koncentrowała się na wybranych białkach, a nie na globalnym, ale złożonym składzie proteomu synaptycznego. Obecne podejście pozwala na bezstronne badanie przesiewowe pod kątem zmian proteomu synaptycznego w regionach mózgu myszy po eksperymencie edukacyjnym. Nadaje się do renderowania zależnych od punktu czasowego molekularnych migawek indukowanej uczeniem się reorganizacji architektury synaptycznej. Opisany przebieg pracy wymaga szczególnej pracy zespołowej różnych specjalistów w zakresie zachowania zwierząt, biochemii białek, spektrometrii mas i bioinformatyki.
Wybrany paradygmat uczenia się, tj. dyskryminacja tonów modulowana częstotliwościowo (FMTD), jest dobrze scharakteryzowanym zadaniem dyskryminacji słuchowej u gryzoni5. Uczenie się i tworzenie pamięci długotrwałej w tym zadaniu Go/No-Go obejmuje mechanizmy zależne od zwiększonej sygnalizacji korowej dopaminy i syntezy białek. W związku z tym ostatnie badania proteomiczne na myszoskoczkach i myszach ujawniły wywołane dopaminą i uczeniem się plastyczne rearanżacje składników synaptycznych w korze mózgowej, ale także w bardziej podstawowych obszarach mózgu, które rzekomo oddziałują podczas uczenia się i pamięci FMTD6-8. Ilustruje to, że tworzenie pamięci obejmuje złożoną interakcję różnych regionów mózgu, a zatem może być różnie regulowane w tych regionach na poziomie proteomu. W związku z tym w procesie pracy uwzględniana jest sekcja wybranych obszarów mózgu myszy w korze korowej i podkorowej.
Ponadto, rzetelna charakterystyka nawet słabych zmian w składzie białek synaptycznych wymaga wzbogacenia przedziałów pre- i postsynaptycznych, a nie analizy homogenatów lub surowych frakcji błonowych9. W związku z tym opisano przygotowanie synaptosomów z wykorzystaniem ustalonych protokołów przed analizą proteomiczną w celu zwiększenia poziomu wykrywania i zakresu dynamicznego dla białek specyficznych dla synaps10,11.
Podstawowym warunkiem koniecznym do korzystania z bezznacznikowej spektrometrii mas o wysokiej rozdzielczości do celów ilościowych jest wysoki stopień podobieństwa próbek białek. Ponieważ oczekuje się, że po nauczeniu się wystąpią raczej niewielkie zmiany w składzie białek synaptycznych, odpowiednie będzie podejście bezznacznikowe do porównania odpowiednich próbek białek uzyskanych od wyszkolonych i niedoświadczonych myszy. Alternatywnie, strategie znakowania białek/peptydów w zależności od stanu przy użyciu stabilnych izotopów (np. TMT, iTRAQ, ICPL i SILAC), a także kwantyfikacja bez znaczników oparta na MS2 (SWATH) są przydatne, ale są droższe niż wybrane podejście bezznacznikowe lub wymagają specjalnego sprzętu do spektrometrii mas.
Ponieważ badania proteomiczne często dostarczają skomplikowanych zestawów danych, zaleca się przetwarzanie bioinformatyczne dla właściwej interpretacji danych. Dodatkowe metaanalizy mogą pomóc w lepszym zrozumieniu potencjalnych mechanizmów molekularnych leżących u podstaw zmian związanych z paradygmatem oraz w identyfikacji zaangażowanych kluczowych procesów komórkowych i szlaków sygnałowych. Odpowiednie metodologie są również opisane poniżej.

<table><tbody><tr><td>3 M Empore Filtr do ekstrakcji do fazy stałej</td><td>3M Bioanalytical Technologies</td><td>4245SD</td><td>7 mm/3 ml</td></tr><tr><td>Uznanie PepMap 100</td><td>Dionex/Thermo Scientific</td><td>164564</td><td>100 &micro; m x 2 cm, C18</td></tr><tr><td>Uznanie PepMap 100</td><td>Dionex/Thermo Scientific</td><td>164569</td><td>75 & mikro; m x 25 cm, C18</td></tr><tr><td>Kwas octowy</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>3738.1</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitryl (ACN)</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>AE70.2</td><td></td></tr><tr><td>Akrylamid (30%)</td><td>AppliChem</td><td>A0951</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan amonu&nbsp; &nbsp;</td><td>Fluka</td><td>9830</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek amonu&nbsp;</td><td>Fluka&nbsp;</td><td>44273</td><td></td></tr><tr><td>Nadsiarczan amonu&nbsp; (APS)</td><td>AppliChem</td><td>A2941</td><td></td></tr><tr><td>Biofuge pico</td><td>Heraeus GmbH</td><td>75003280</td><td></td></tr><tr><td>Niebieski R-250&nbsp;</td><td>SERVA Electrophoresis GmbH</td><td>17525</td><td></td></tr><tr><td>Bromophenol Blue</td><td>Pharmacia Biotech</td><td>17132901</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J myszy</td><td>Charles River&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kantarydyna</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>3322.1</td><td></td></tr><tr><td>Probówki wirówkowe do MLS-50</td><td>Beckman Coulter</td><td>344057</td><td></td></tr><tr><td>Probówki wirówkowe do rotora TLA 100.1</td><td>Beckman Coulter</td><td>343776</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>AppliChem</td><td>A1101</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka Eppendorf 5417R</td><td>VWR</td><td>22636138</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf A-8-11 wirnik</td><td>VWR</td><td>5407000317</td><td></td></tr><tr><td>Kwas mrówkowy</td><td>Fluka</td><td>14265</td><td></td></tr><tr><td>GeneCodis</td><td>http://genecodis.cnb.csic.es/</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Gephi</td><td>https://gephi.org/</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Glycerol</td><td>AppliChem</td><td>A1123</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>AppliChem</td><td>A1067</td><td></td></tr><tr><td>HALT Fosfataza Koktajl inhibitorów&nbsp;</td><td>Pierce /Thermo Scientific</td><td>78420</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór buforowy HEPES&nbsp;</td><td>PAA Laboratories GmbH</td><td>S11-001</td><td></td></tr><tr><td>Naczynie homogenizacyjne 2 ml</td><td>Sartorius AG</td><td>854 2252</td><td></td></tr><tr><td>Kwas solny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1758</td><td></td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I2399</td><td></td></tr><tr><td>Analiza ścieżki Ingenuity</td><td>Jiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jodoacetamid (IAA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I1149</td><td></td></tr><tr><td>Napęd wiertniczy laboratoryjny &nbsp; K-ControlTLC 4957&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Kaltenbach & Vogt GmbH</td><td>182997</td><td></td></tr><tr><td>LTQ Tune Plus 2.7.0.1112 SP2</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LTQ Orbitrap Velos Pro</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rotator rurowy Macs-mix</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-090-753</td><td></td></tr><tr><td>Magic Scan 4.71</td><td>UMAX</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>AE71.2</td><td></td></tr><tr><td>MLS-50 rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>367280</td><td></td></tr><tr><td>Ultrawirówka Optima MAX</td><td>Beckman Coulter</td><td>364300</td><td></td></tr><tr><td>PageRuler Prestained Protein Ladder</td><td>Thermo Scientific</td><td>26616</td><td></td></tr><tr><td>PEAKS 7.5</td><td>Bioinformatatic Solutions&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Koktajl inhibitorów fosfatazy 3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0044</td><td></td></tr><tr><td>PhosphoRS 3.1</td><td>IMP/IMBA/GMI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PhosSTOP</td><td>Roche</td><td>4906845001</td><td></td></tr><tr><td>Tłok/tłuczek wykonany z PTFE</td><td>Sartorius AG</td><td>854 2651</td><td></td></tr><tr><td>Homogenizator PotterS</td><td>Sartorius AG</td><td>853 3024</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitor proteazy kompletna ilość</td><td>mini Roche</td><td>4693159001</td><td></td></tr><tr><td>Jeden 4.5.1</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RapiGest</td><td>Waters</td><td>186002122</td><td></td></tr><tr><td>Shuttle</td><td>box Coulbourne Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dodecylosiarczan sodu (SDS)</td><td>AppliChem</td><td>A1112</td><td></td></tr><tr><td>Molibdenian sodu</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>274.2</td><td></td></tr><tr><td>Sód dwuwodny winian</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>228729</td><td></td></tr><tr><td>SONOREX RK 156 Kąpiel ultradźwiękowa</td><td>BANDELIN electronic GmbH & Co. KG</td><td>305</td><td></td></tr><tr><td>Komora dźwiękoszczelna</td><td>Akustyka przemysłowa Firma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>4621.2</td><td></td></tr><tr><td>Tetrametyloetylen-1,2-diamina (TEMED)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer basic</td><td>CallMedia</td><td>111000</td><td></td></tr><tr><td><a name="ZASIĘG! A60">Titansphere TiO 5&micro; m</a></td><td>GL Sciences Inc. Japonia</td><td>502075000</td><td></td></tr><tr><td>Rotor TLA 100.1</td><td>Beckman Coulter</td><td>343840</td><td></td></tr><tr><td>Kwas trifluorooctowy&nbsp; (Umowa o partnerstwie poufnym)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6508</td><td></td></tr><tr><td>Tris ( hydroksymetylo)aminometan (TRIS)</td><td>AppliChem</td><td>A1086</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8532</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin Gold</td><td>Promega</td><td>V5280</td><td></td></tr><tr><td>Ultimate 3000 Ultra HPLC&nbsp;</td><td>Dionex/Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultrawirówka</td><td>rurka Beckman Coulter</td><td>343776</td><td></td></tr><tr><td>Aspirator z chłodzeniem Unijet II</td><td>Uniequip Laborger&auml; te- und Vertriebs GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wirówka koncentratorowa UNIVAPO 100 H&nbsp;</td><td>Uniequip Laborger&auml; te- und Vertriebs GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mocznik</td><td>AppliChem</td><td>A1049</td><td></td></tr><tr><td>Woda (wysokiej jakości oczyszczona)</td><td></td><td></td><td>Rezystywność: > 18,2 M&Omega;*cm przy 25 stopniach; C&nbsp; Pirogeni: < 0,02 EU/ml&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Spis treści: < 10 ppb</td></tr><tr><td>Xcalibur 3.0.63</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZipTipC18 Końcówki do pipet</td><td>MILLIPORE</td><td>ZTC18S960</td><td></td></tr></tbody></table>

ilościowe profilowanie proteomu synaptycznego w wysokiej rozdzielczości regionów mózgu myszy po uczeniu się dyskryminacji słuchowej

High Resolution Quantitative Synaptic Proteome Profiling of Mouse Brain Regions After Auditory Discrimination Learning

Molekularne mechanizmy synaptyczne leżące u podstaw słuchowego uczenia się i pamięci pozostają w dużej mierze nieznane. W tym miejscu opisano przebieg badania proteomicznego dotyczącego uczenia się dyskryminacji słuchowej u myszy. W tym paradygmacie uczenia się, myszy są szkolone w zadaniu Go / NoGo w celu rozróżniania między rosnącymi i opadającymi tonami modulowanymi częstotliwością, aby uniknąć łagodnego wstrząsu elektrycznego stopą. Protokół polega na wzbogaceniu synaptosomów z czterech obszarów mózgu, a mianowicie kory słuchowej, kory czołowej, hipokampa i prążkowia, na różnych etapach treningu. Wzorce ekspresji białek synaptycznych uzyskane od wyszkolonych myszy są porównywane z naiwnymi kontrolami przy użyciu podejścia proteomicznego. Aby osiągnąć wystarczającą głębokość analityczną, próbki są frakcjonowane na trzy różne sposoby przed spektrometrią mas, a mianowicie trawienie 1D SDS-PAGE/w żelu, trawienie w roztworze i wzbogacanie fosfopeptydów. 
Analiza proteomiczna o wysokiej rozdzielczości na spektrometrze masowym i kwantyfikacja bez znaczników są używane do badania profili białek synaptycznych we frakcjach zubożonych w fosfopeptydy i wzbogaconych w fosfopeptydy próbek białek synaptosomalnych. Komercyjny pakiet oprogramowania jest wykorzystywany do ujawniania białek i fosfopeptydów o znacznie regulowanych względnych poziomach obfitości synaptycznej (wyszkolone/naiwne kontrole). Zaobserwowano wspólne i zróżnicowane tryby regulacji proteomu synaptycznego w badanych obszarach mózgu myszy po treningu. Następnie stosuje się metaanalizy z wykorzystaniem kilku baz danych w celu zidentyfikowania podstawowych funkcji komórkowych i szlaków biologicznych.

Rysunek 1 podsumowuje kompletny schemat ilościowego profilowania proteomu synaptycznego obszarów mózgu myszy po nauce dyskryminacji słuchowej. Proces rozpoczyna się od treningu zwierząt w klatce typu shuttle box. W przykładzie przedstawionym na Rysunku 2 myszy zaczęły wykazywać istotną dyskryminację tonów FM w 4tej sesji treningowej, co wskazuje na efektywną naukę. Zwierzęta są uśmiercane w wybranych punktach czasowych w celu wyizolowania obszarów mózgu. Wymagane wzbogacenie synaps można osiągnąć poprzez przygotowanie synaptosomów lub alternatywnie poprzez przygotowanie frakcji wzbogaconej w PSD, obie metody opisano szczegółowo na Rysunku 3. Metoda wzbogacania PSD została opracowana dla małych ilości tkanki, np. 1 - 2 skrawków hipokampa z mózgu szczura12, 18. Wymaga ona małych probówek, tłuczków PTFE dopasowanych do tych probówek oraz laboratoryjnej wiertarki do napędzania tłuczka.
Ze względu na specyficzny skład białkowy synaptosomów, zdecydowanie zaleca się przeprowadzenie przygotowania próbek w dwóch różnych, ale komplementarnych sposobach. Rusztowania PSD często składają się z białek o bardzo wysokiej masie cząsteczkowej występujących w wysokiej stechiometrii. Trawienie w roztworze jest najlepszym sposobem na ich efektywną ekstrakcję, ale może prowadzić do nadmiernego próbkowania generowanej mieszaniny peptydów. Trawienie w żelu przeprowadzone równolegle na tej samej próbce pozwala wykluczyć te białka o wysokiej masie cząsteczkowej i sprzyja analizie białek o średniej i niskiej masie cząsteczkowej. W celu przeprowadzenia kompleksowej analizy zaleca się zastosowanie obu rodzajów trawienia proteolitycznego.
Różne ilości tkanek z badanych obszarów mózgu wymagają dostosowania ilości użytego materiału w celu lepszego porównania. Wśród czterech badanych obszarów mózgu czynnikiem ograniczającym jest zazwyczaj kora słuchowa. Materiał ze wszystkich pozostałych obszarów mózgu należy starannie dostosować do ilości kory słuchowej po przygotowaniu synaptosomów lub frakcji wzbogaconych w PSD (patrz 3.1.1.). Typowe masy świeżo przygotowanych obszarów mózgu myszy są następujące: kora słuchowa (AC): ~ 50 mg; hipokamp (HIP): ~ 90 mg; prążkowie (STR): ~ 120 mg oraz kora czołowa (FC): ~ 100 mg.
Metoda wzbogacania PSD opisana w sekcji 2.3 pozwoliła na identyfikację około 1500 różnych białek i około 250 różnych fosfopeptydów na region mózgu na poziomie pojedynczego zwierzęcia (Tabela 1). Analiza proteomiczna przeprowadzona 24 h po pierwszej sesji treningowej wykazała, że 7,3% zidentyfikowanych białek i 5,8% fosfopeptydów wykazało istotne (p&lt; 0.05) zmiany ilościowe w ich ekspresji synaptycznej w porównaniu z kontrolą naiwną (Tabela 1). Wyraźna tendencja do obniżania poziomu rusztowań synaptycznych może wskazywać na głęboką reorganizację architektury synaptycznej we wczesnych etapach uczenia się FMTD. Zdecydowana większość regulowanych białek uległa zmianom w sposób specyficzny dla regionu mózgu, natomiast tylko 22% okazało się regulowanych w dwóch lub więcej obszarach mózgu. Sześć wybranych przykładów przedstawiono na Rysunku 4.
Metaanaliza złożonych wyników przeprowadzona za pomocą IPA dostarcza dowodów na szczególny udział/manipulację następujących szlaków kanonicznych: „Clathrin-mediated Endocytosis Signaling”, „Axonal Guidance Signaling”, „Calcium Signaling”, „RhoA Signaling”, „Notch Signaling”, „Remodeling of Epithelial Adherens Junctions”, „Glutamate Receptor Signaling”, „GABA Receptor Signaling”, „Dopamine Receptor Signaling” oraz „Synaptic Long-Term Potentiation”.
Pojedyncza analiza wzbogacenia wykazała znacząco nadreprezentowane procesy biologiczne w korze przedczołowej dotyczące transportu białek, adhezji komórkowej, fosforylacji, endocytozy, transportu zależnego od pęcherzyków, rozwoju przedmózgowia oraz aksonogenezy (Rycina 5). W korze słuchowej zauważalne były procesy biologiczne obejmujące transport jonów, translację, transport mRNA, transport białek oraz uczenie się. Analiza frakcji białkowej hipokampa wykazała znacząco wzbogacone procesy związane z transportem jonów, cyklem komórkowym, translacją, fosforylacją i rozwojem układu nerwowego. W prążkowiu stwierdzono nadreprezentowane procesy biologiczne, w tym transport mRNA, transport zależny od pęcherzyków, aksonogenezę, proteolizę, transport białek i endocytozę.
<img alt="Schemat treningu w pudełku wahadłowym; wysokorozdzielcza LC MS/MS, metoda wzbogacania fosfopeptydów." src="/files/ftp_upload/54992/54992fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Systematyczny schemat podejścia metodologicznego. Niniejszy rysunek schematycznie podsumowuje przebieg wysokorozdzielczego ilościowego profilowania składu białek synaptycznych specyficznych dla obszarów mózgu. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54992/54992fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykres sesji w funkcji reakcji go; dane dotyczące trafień i fałszywych alarmów; analiza eksperymentu behawioralnego." src="/files/ftp_upload/54992/54992fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Przykład wyników myszy w zadaniu dyskryminacji tonów FM. Zwierzęta wykazują rosnącą częstotliwość trafień (krzywa niebieska) i malejącą częstotliwość fałszywych alarmów (krzywa czarna) w trakcie sesji treningowych. Istotna dyskryminacja następuje od czwartej sesji. Słupki błędu przedstawiono jako SEM. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54992/54992fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat przygotowania synaptosomów; przedstawia etapy wirowania, metodę gradientu sacharozy do izolacji błon." src="/files/ftp_upload/54992/54992fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Przygotowanie synaptosomów oraz frakcji wzbogaconej w PSD. A: Przygotowanie synaptosomów. B: Przygotowanie frakcji wzbogaconej w PSD. Oba schematy wyjaśniają szczegółowy przebieg procesu przygotowania synaptosomów lub alternatywnie frakcji wzbogaconych w PSD z tkanek mózgowych. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54992/54992fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres słupkowy porównujący poziomy ekspresji białek w różnych obszarach mózgu do analizy eksperymentalnej." src="/files/ftp_upload/54992/54992fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Wybrane wyniki proteomiki ilościowej. Porównano względną synaptyczną zawartość wybranych białek u myszy przeszkolonych w zadaniu FMTD (AV, n= 6) oraz u naiwnych myszy kontrolnych (NV, n= 6) 24 h po pierwszej sesji treningowej. Wartości zawartości obliczono jako medianę pól powierzchni pików trzech najbardziej intensywnych peptydów danego białka. Białka o istotnych zmianach zawartości (AV/NV; t-test) zaznaczono na wykresach: * p&lt; 0.05, ** p&lt; 0.01, *** p&lt; 0.005. Słupki błędów przedstawiają SD. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54992/54992fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat sieci procesów biologicznych przedstawiający oddziaływania białek i szlaki fosforylacji." src="/files/ftp_upload/54992/54992fig5.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5: Wizualizacja szlaków biologicznych dla kory przedczołowej wykonana za pomocą GeneCodis/Gephi. Przedstawiono tutaj wyłącznie istotne terminy z bazy danych Gene Ontology (GO) (http://geneontology.org) związane z „procesami biologicznymi” (Biological process), przy minimalnej liczbie trzech białek. Węzły reprezentują terminy GO; rozmiar węzła, szerokość linii oraz liczba połączeń danego węzła obrazują liczbę białek, które dzielą ten termin GO z innymi węzłami. Dzięki zastosowaniu metody „Force Atlas” w programie Gephi, powiązane węzły grupują się blisko siebie. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54992/54992fig5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Obszar mózgu</td>
			<td>AC</td>
			<td>FC</td>
			<td>HIP</td>
			<td>STR</td>
			<td>∑</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>zidentyfikowane białka</td>
			<td>1435</td>
			<td>1758</td>
			<td>1572</td>
			<td>1507</td>
			<td>6272</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>białka regulowane (p&lt;0.05)</td>
			<td>59</td>
			<td>130</td>
			<td>162</td>
			<td>108</td>
			<td>459</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>↑ AV/NV</td>
			<td>8</td>
			<td>4</td>
			<td>76</td>
			<td>35</td>
			<td>123</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>↓ AV/NV</td>
			<td>51</td>
			<td>126</td>
			<td>86</td>
			<td>73</td>
			<td>336</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>zidentyfikowane fosfomotywy</td>
			<td>197</td>
			<td>361</td>
			<td>273</td>
			<td>278</td>
			<td>1109</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>regulowane fosfomotywy (p&lt;0.05)</td>
			<td>8</td>
			<td>22</td>
			<td>21</td>
			<td>14</td>
			<td>65</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>↑ AV/NV</td>
			<td>4</td>
			<td>17</td>
			<td>5</td>
			<td>9</td>
			<td>35</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>↓ AV/NV</td>
			<td>4</td>
			<td>5</td>
			<td>16</td>
			<td>5</td>
			<td>30</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Podsumowanie wyników proteomicznych.Tabela ta przedstawia podsumowanie reprezentatywnego eksperymentu proteomicznego przeprowadzonego na myszach wytrenowanych (AV, n= 6) 24 h po pierwszej sesji treningowej w porównaniu z grupą kontrolną myszy naiwnych (NV, n= 6). Suma 459 białek regulowanych obejmuje nakładające się regulacje. Wykazano, że 283 różne regulacje są specyficzne dla mózgu. Szczegółowo: 57 białek jest regulowanych w dwóch obszarach mózgu, regulacje 18 białek wykryto w trzech obszarach mózgu, a tylko 2 białka są regulowane we wszystkich czterech badanych obszarach mózgu.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Tolerancje błędów</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>masa prekursora (spektrometria mas z transformacją Fouriera)</td>
			<td>10 ppm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>masa jonu fragmentacyjnego (liniowa pułapka jonowa)</td>
			<td>0,6 Da</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maksymalna liczba pominiętych miejsc cięcia na peptyd</td>
			<td>3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modyfikacje stałe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dla próbek trawionych w żelu</td>
			<td>Karbamidometylowanie cysteiny</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dla próbek trawionych w roztworze</td>
			<td>Metyltiolacja cysteiny</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modyfikacje zmiennych</td>
			<td>Utlenianie metioniny</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Deamidacje asparaginy i/lub glutaminy </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Baza danych</td>
			<td>UniProt/Swiss-Prot </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taksonomia</td>
			<td>mysz</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Statystyczne ustawienia identyfikacji i akceptacji</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>de novo średnia lokalna pewność (ALC)</td>
			<td> &gt; 50%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wskaźnik fałszywych odkryć (FDR) dla peptydów (na podstawie szacunkowej fuzji decoy)</td>
			<td> &lt; 1% </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Istotność białek (-10logP, na podstawie zmodyfikowanego testu t)</td>
			<td>&gt; 20 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>unikalne peptydy / białko</td>
			<td> ≥ 1 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ustawienia kwantyfikacji:</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptydy wykorzystywane do kwantyfikacji, jeśli:</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Istotność peptydów (-10logP)</td>
			<td>&gt; 30</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Identyfikacja peptydów w </td>
			<td> ≥ 50% próbek</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jakość sygnału peptydowego</td>
			<td>&gt;1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Średnia powierzchnia piku peptydów</td>
			<td> &gt; 1E5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tolerancja czasu retencji peptydów</td>
			<td> &lt; 5 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normalizacja </td>
			<td>poprzez całkowity prąd jonowy (TIC)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Ustawienia dla identyfikacji białek (krok 4.2.2).

Identyfikacja molekuł i szlaków kontrolujących plastyczność synaptyczną i pamięć jest nadal głównym wyzwaniem w neurobiologii. W tym miejscu opisano przepływ pracy dotyczący względnej kwantyfikacji białek synaptycznych rzekomo zaangażowanych w molekularną reorganizację synaps podczas uczenia się i konsolidacji pamięci w paradygmacie uczenia się słuchowego.

Ilościowe profilowanie proteomu synaptycznego w wysokiej rozdzielczości regionów mózgu myszy po uczeniu się dyskryminacji słuchowej

The molecular synaptic mechanisms underlying auditory learning and memory remain largely unknown. Here, the workflow of a proteomic study on auditory ...

Ogólnym celem tego podejścia proteomicznego jest charakterystyka reorganizacji molekularnej w synapsach po uczeniu się i formowaniu pamięci, aby zrozumieć podstawowe mechanizmy i szlaki sygnalizacyjne. Główną zaletą tej techniki jest podejście wolne od hipotez, co umożliwia wielkoskalową kwantyfikację i charakterystykę modyfikacji potranslacyjnych w obrębie proteomów synaptycznych. Nasz opracowany schemat postępowania pozwala na powiązanie określonej zmiany molekularnej z konkretnym zachowaniem.Uczenie się i formowanie pamięci opierają się na zmianach wydajności synaptycznej, dlatego badania proteomiczne powinny skupiać się bardziej na analizie struktur synaptycznych, takich jak synaptosomy, niż na homogenatach z tkanki mózgowej. Wyniki proteomiczne stanowią niezwykle złożone zestawy danych, dlatego wymagają one przetwarzania bioinformatycznego. Rozpocznij trening, umieszczając mysz testową w słabo oświetlonej komorze wahadłowej (shuttle box) wewnątrz wygłuszonej komory.Zastosuj w pełni sterowany komputerowo harmonogram nauczania dla treningu dyskryminacji słuchowej. Rozpocznij od trzy minutowej przerwy na habituację w ciszy przed rozpoczęciem sesji treningowej. Podczas prób typu „go”, zwierzę musi pokonać przeszkodę w ciągu sześciu sekund od prezentacji sygnału dźwiękowego, aby odnotować sukces.W przypadku prób no-go zwierzę musi pozostać w aktualnej komorze urządzenia typu shuttle box przez sześć sekund prezentacji sygnału dźwiękowego. Przeprowadź 30 prób go oraz 30 prób no-go w kolejności pseudolosowej, z odstępem między próbami wynoszącym 20 sekund, tak aby jedna sesja składała się z 60 prób i trwała około 25 minut. Po zakończeniu wszystkich prób zwróć trenowaną mysz do klatki domowej aż do momentu uboju.Po uśmierceniu myszy i wyjęciu mózgu, zlokalizuj korę słuchową, korzystając z punktów orientacyjnych, takich jak naczynia krwionośne i kształt powierzchni. Następnie za pomocą skalpela i igły wycinij obustronnie korę słuchową w formie prostokątnego bloku tkanki. Wykorzystując chiasma opticum jako punkt orientacyjny, wycinij korę przedczołową w formie przekroju mózgu między Bregma 3.56 a 1.54.Wypreparuj prążkowie w formie plastra mózgu pomiędzy Bregma 1,54 a 0,5. Następnie ostrożnie usuń tkankę korową. Wypreparuj hipokamp, stabilizując mózg za pomocą igły wprowadzonej przez móżdżek i rozwijając korę, zaczynając od płata potylicznego.Próbki wypreparowanego mózgu zamrozić gwałtownie w ciekłym azocie. Oczyszczanie synaptosomów rozpocząć od przeniesienia wypreparowanej tkanki mózgu do naczyń do homogenizacji zawierających jeden mililitr lodowatego Buforu A. Następnie tkankę poddać homogenizacji przy 900 RPM, wykonując około 12 pociągnięć. Próbki odwirować przy 1 000 ×g przez 10 minut.Po wirowaniu należy zachować nadsączniki. Osad ponownie homogenizować w ten sam sposób, a następnie połączyć nadsączniki. Połączone nadsączniki wirować przez 20 minut przy 12 000 ×g. Osady zawiesić w 1 mL buforu do homogenizacji i homogenizować, wykonując sześć cykli przy 900 RPM, a następnie wirować przy 1 200 ×g przez 20 minut.Podczas wirowania w celu otrzymania osadów P2 przygotuj gradienty schodkowe sacharozy w probówkach do ultrawirowania. Zacznij od 2,5 mililitrów buforu sacharozowego 1,0 M, a następnie za pomocą szklanej pipety Pasteura nałóż warstwą 1,5 mililitra buforu sacharozowego 1,2 M. Po zakończeniu wirowania dodaj 0,5 mililitra buforu sacharozowego 0,32 M do osadów P2.Następnie ponownie przeprowadzić homogenizację, wykonując sześć pociągnięć. Nałożyć homogenaty na wierzch gradientów. Umieścić załadowane gradienty w rotorze z ruchomymi koszykami, a następnie wirować w ultrawirówce przy 85 000 ×g przez dwie godziny.Po zakończeniu wirowania odrzuć górną warstwę sacharozy 0,32 M, wliczając w to materiał na granicy z buforem sacharozowym 1,0 M. Zbierz synaptosomy z granicy faz buforu sacharozowego 1,0 M i 1,2 M. Dodaj bufor sacharozowy 0,32 M do frakcji synaptosomów w stosunku 1:1.Należy ostrożnie wymieszać i wirować z przyspieszeniem 150 000 ×g przez jedną godzinę. Synaptosomy znajdują się w osadzie i mogą zostać ponownie zawieszone w buforze w celu dalszej obróbki. Synaptosomy z każdego obszaru mózgu zwierzęcia należy rozpuścić w 20 do 50 µL 8 M mocznika, inkubując na lodzie przez jedną godzinę w kąpieli ultradźwiękowej.Rozcieńczyć z użyciem jeden procent detergentu usuwalnego, aby uzyskać końcowe stężenie mocznika równe dwa molar. Po określeniu względnych ilości białka za pomocą SDS-PAGE, pipetować jedną trzecią pozostałej części każdej próbki do nowej probówki. Przeprowadzić trawienie w roztworze, dodając dwa milimolar DTT oraz 25 milimolar wodorowęglanu amonu, a następnie delikatnie wymieszać próbkę na wortexie.Redukować próbki przez 45 minut w temperaturze 20°C. Dodać 10 mM iota-acedomidu w celu karbamidometylacji reszt cysteiny i wymieszać. Inkubować przez 30 minut w ciemności w temperaturze 20°C.Na koniec dodaj 1 µL roztworu zapasu trypsyny i inkubuj w temperaturze 20 °C przez 12 godzin. Aby usunąć detergent podatny na hydrolizę kwasową, dodaj kwas trifluorooctowy do stężenia końcowego 1% i inkubuj przez kolejną godzinę w temperaturze 20 °C. Po odwirowaniu próbek przy 16 000 ×g przez 10 minut, ostrożnie zbierz supernatanty.Umieść kolumnę do ekstrakcji w fazie stałej w statywie i wyrównaj matrycę, używając 2 ml metanolu. Po przemyciu dodaj kolejne 2 ml Buforu B i wprowadź próbkę. Po trzykrotnym przemyciu Buforem B eluuj peptydy, dodając 200 µL 70% acetonitrylu i 0,1% kwasu trifluorooctowego.Następnie wysuszyć oczyszczone próbki w wirówce próżniowej. W tym przykładzie zwierzęta przeszkolone w zadaniu dyskryminacji tonów FM wykazują rosnący odsetek trafień oraz malejący odsetek fałszywych alarmów w miarę trwania sesji treningowych. Istotna dyskryminacja występuje od czwartej sesji.Porównano względną synaptyczną zawartość wybranych białek u myszy przeszkolonych w zadaniu rozróżniania tonów FM oraz u naiwnych myszy kontrolnych 24 godziny po pierwszej sesji treningowej. Po treningu poziomy białka CYFP2 uległy zmianie we wszystkich badanych obszarach. Należy pamiętać, że zwierzęta często wykazują zmienność wewnątrzindywidualną.Dlatego też wysoce zaleca się uwzględnienie w badaniu co najmniej pięciu lub więcej powtórzeń biologicznych w dobrze dopasowanych grupach zwierząt. Po opracowaniu technika ta może zostać łatwo zaadaptowana do innych gatunków. Na przykład została ona wykorzystana do monitorowania zmian w ekspresji białek zależnych od uczenia się w pojedynczych mózgach muszki owocówki.

high-resolution-quantitative-synaptic-proteome-profiling-mouse-brain

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Niniejszy protokół szczegółowo opisuje sposób ilościowego oznaczania liczby synaps zarówno w dysocjowanych kulturach neuronowych, jak i w przekrojach mózgu z wykorzystaniem immunocytochemii. Przy użyciu przeciwciał specyficznych dla poszczególnych przedziałów komórkowych znakujemy terminale presynaptyczne oraz miejsca specjalizacji postsynaptycznej. Synapsy definiujemy jako punkty kolokalizacji sygnałów generowanych przez te markery.

Ilościowe oznaczanie synaps: test oparty na immunocytochemii do ilościowego oznaczania liczby synaps

Ten film demonstruje barwienie immunofluorescencyjne wycinka mózgu myszy w celu ilościowego określenia rozkładu określonego białka presynaptycznego. Proces ten polega na blokowaniu miejsc niespecyficznych, zastosowaniu pierwszorzędowych przeciwciał dla białka docelowego i markera referencyjnego, a następnie wtórnym znakowaniu przeciwciał i przeciwbarwieniu jądrowym. Marker referencyjny zapewnia dokładną kwantyfikację, zapewniając spójną linię wyjściową, a dystrybucja białka presynaptycznego...

Kwantyfikacja rozmieszczenia białka presynaptycznego w mózgu myszy za pomocą immunofluorescencji

Ten film przedstawia szczegółowy protokół krok po kroku dotyczący przygotowania zamrożonych skrawków tkanki mózgowej myszy do dalszych analiz.

Przetwarzanie mózgu myszy do dalszej analizy

Ten protokół opisuje, jak tymczasowo i zdalnie wyciszyć aktywność neuronalną w dyskretnych obszarach mózgu, podczas gdy szczury są zaangażowane w zadania związane z uczeniem się i pamięcią. Podejście to łączy farmakogenetykę (Designer-Receptors-Exclusively-Activated-by-Designer-Drugs) z paradygmatem behawioralnym (sensoryczne warunkowanie wstępne), które ma na celu rozróżnienie różnych elementów uczenia się.

Metoda zdalnego wyciszania aktywności neuronalnej u gryzoni podczas dyskretnych faz uczenia się

Opisujemy protokół immunohistochemiczny do badania profilu aktywacji neuronów hipokampa po ekspozycji na zadanie uczenia przestrzennego w modelu mysim charakteryzującym się deficytami poznawczymi pochodzenia neurorozwojowego. Protokół ten może być stosowany zarówno do genetycznych, jak i farmakologicznych modeli myszy charakteryzujących się deficytami poznawczymi.

Immunohistochemiczna wizualizacja aktywności neuronów hipokampa po uczeniu przestrzennym w mysim modelu zaburzeń neurorozwojowych

Tutaj opisujemy ilościowe podejście do określania rozkładu białka synaptycznego względem białka markerowego za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego, mikroskopii konfokalnej i analizy komputerowej.

Kwantyfikacja niejednorodnego rozmieszczenia białka synaptycznego w mózgu myszy za pomocą immunofluorescencji

Ten manuskrypt opisuje eksperymentalny protokół oceny cech morfologicznych i statusu funkcjonalnego synaps wstęgowych u normalnych myszy. Prezentowany model nadaje się również do modeli z ograniczeniami synaptopatii ślimakowej wywołanych hałasem i związanych z wiekiem. Omówiono również korelacyjne wyniki poprzednich badań na myszach.

Ocena morfologiczna i funkcjonalna synaps wstęgowych w określonych obszarach częstości ślimaka myszy

Ten protokół ma na celu efektywne ilościowe określanie aktywności systemu ubikwityna-proteasom (UPS) w różnych przedziałach komórkowych mózgu gryzoni. Użytkownicy mogą badać działanie UPS we frakcjach jądrowych, cytoplazmatycznych i synaptycznych u tego samego zwierzęcia, co skraca czas i liczbę zwierząt potrzebnych do przeprowadzenia tych złożonych analiz.

Kwantyfikacja subkomórkowej aktywności ubikwityny-proteasomu w mózgu gryzoni

Przedstawiamy protokół do oceny równowagi między uwalnianiem glutaminianu a klirensem w pojedynczych synapsach glutaminergicznym korowo-prążkowych w ostrych wycinkach od dorosłych myszy. Protokół ten wykorzystuje czujnik fluorescencyjny iGluu do wykrywania glutaminianu, kamerę sCMOS do akwizycji sygnału oraz urządzenie do ogniskowego oświetlenia laserowego.

Wskaźniki uwalniania i wychwytu glutaminianu w pojedynczych synapsach w ostrych wycinkach mózgu od myszy normalnych i myszy z chorobą Huntingtona

Ten protokół opisuje użycie specjalnie zaprojektowanego urządzenia rejestrującego i elektrod do rejestrowania lokalnych potencjałów pola i badania przepływu informacji w hipokampie myszy i korze przedczołowej.

Podwójne nagrania zewnątrzkomórkowe w hipokampie myszy i korze przedczołowej myszy

Odkryj ilościowe profilowanie proteomu synaptycznego w wysokiej rozdzielczości u myszy po uczeniu się dyskryminacji słuchowej. Ta metoda pozwala korelować zmiany molekularne z zachowaniem.

Ilościowe profilowanie proteomu synaptycznego w wysokiej rozdzielczości regionów mózgu myszy po uczeniu się dyskryminacji słuchowej (Wideo) | JoVE Journal

Ilościowe profilowanie proteomu synaptycznego w wysokiej rozdzielczości regionów mózgu myszy po uczeniu się dyskryminacji słuchowej

Przeglądaj więcej filmów