Czuły pomiar mitofagii za pomocą cytometrii przepływowej przy użyciu zależnego od pH reportera fluorescencyjnego mt-Keima

Ogólnym celem tej procedury jest zapewnienie czułej techniki pomiaru aktywności mitofagii komórkowej za pomocą cytometrii przepływowej. Tutaj pokazujemy, że metoda ta została z powodzeniem zastosowana do oceny dramatycznego wzrostu mitofagii komórek HeLa po leczeniu CCCP, rozprzęgaczem mitochondrialnym. Technika ta pozwala na bardzo szybki i łatwy pomiar aktywności mitofagów.

Główną zaletą tej techniki jest to, że można z czułością mierzyć aktywność mitofagów w żywych komórkach bez dodatkowego barwienia. Dlatego ta technika ostatecznie będzie w stanie pomóc w zrozumieniu mechanizmu i fizjologicznej roli mitofagów. Procedurę zademonstrują Jee-Hyun Um i Young Yeon Kim z mojego laboratorium.

Rozpocznij tę procedurę od przygotowania mt-Keima, lentiwirusa Keima ukierunkowanego na mitochondria. Pierwszy wysiew HEK293T komórek w naczyniu hodowlanym pokrytym poli-L-lizyną i hodować je w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze do hodowli tkankowych przez jeden dzień. Następnego dnia przetransfekować komórki HEK293T z DNA lentiwirusa mt-Keima i opakowaniem DNazy za pomocą odczynnika do transfekcji zgodnie z instrukcjami producenta.

Po ośmiu godzinach transfekcji usuń pożywkę transfekcyjną i dodaj osiem mililitrów świeżej pożywki. Zbierz pożywkę zawierającą cząsteczki wirusa 48 godzin później i usuń resztki komórkowe przez odwirowanie. Następnie przefiltruj pożywkę zawierającą wirusa za pomocą filtra strzykawkowego o wielkości 0,45 mikrometra.

Umieść komórki HeLa-Parkin w 60-milimetrowym naczyniu hodowlanym na jeden dzień przed pobraniem lentiwirusa mt-Keima i hoduj komórki z czterema mililitrami pożywki wzrostowej przez jeden dzień w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze. Następnego dnia usuń pożywkę wzrostową, dodaj jeden milimetr pożywki wirusowej mt-Keima, dodaj dodatkowe dwa mililitry pożywki wzrostowej zawierającej 3 mikrolitry roztworu podstawowego polibrenu i inkubuj komórki przez jeden dzień w inkubatorze CO2. Po 24 godzinach od zakażenia usuń pożywkę z wirusem, przemyj komórki dwukrotnie PBS i dodaj cztery mililitry pożywki wzrostowej.

Aby usunąć niezainfekowane komórki, traktuj komórki przez dwa dni dwoma mikrogramami na mikrolitr puromycyny. Przygotować świeże podłoże zawierające 10 mikromolowych CCCP. Usunąć pożywkę hodowlaną i dodać cztery mililitry świeżej pożywki wzrostowej zawierającej CCCP.

Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze CO2 przez sześć godzin. Usuń pożywkę wzrostową i umyj komórki raz PBS. Odłącz komórki przez traktowanie roztworem trypsyny EDTA.

Zebrać komórki przez odwirowanie i ponownie zawiesić je w jednym mililitrze PBS. Przenieś komórki do probówki FACS i umieść je na lodzie. W przypadku cytometrii przepływowej włącz cytometr przepływowy i uruchom oprogramowanie analizujące.

Wygeneruj nowy eksperyment i wybierz BV605 dla fioletowego lasera i PE-CF594 dla żółto-zielonego lasera w oknie parametrów. Najpierw uruchom próbkę kontrolną komórek niezakażonych lentiwirusem mt-Keima. Na wykresie rozproszenia do przodu i rozproszenia bocznego narysuj bramę, używając ikony wielokąta, wokół żywych komórek i wyeliminuj martwe komórki i szczątki komórek.

Następnie uruchom komórki HeLa-Parkin zakażone lentiwirusem mt-Keima. Na wykresie punktowym BV605 w stosunku do rozproszenia bocznego dostosuj napięcie tak, aby komórki HeLa-Parkin wyrażające mt-Keima były wyraźnie odróżniane od komórek kontrolnych, które nie wykazują ekspresji mt-Keima. Następnie na wykresie kropkowym PE-CF594 w stosunku do rozproszenia bocznego dostosuj napięcie tak, aby komórki HeLa-Parkin wyrażające mt-Keima były wyraźnie odróżniane od komórek kontrolnych.

Następnie na wykresie kropkowym BV605 w porównaniu z PE-CF594 wybierz populację komórek mt-Keima-dodatnich, rysując bramkę za pomocą ikony wielokąta. Następnie utwórz kolejny wykres punktowy BV605 w porównaniu z PE-CF594 pokazujący tylko komórki bramkowane mt-Keima. Na tym wykresie kropkowym narysuj bramę wokół nieleczonych komórek mt-Keima-dodatnich.

Brama ta nazywana jest bramą niską. Następnie narysuj kolejną bramę zawierającą obszar powyżej niskiej bramy. Ta brama jest określana jako wysoka brama, ponieważ zawiera komórki o wysokiej aktywności mitofagii.

Następnie wybierz menu Pokaż hierarchię populacji. Wartość Procent rodzica reprezentuje procent komórek w wysokiej bramce w populacji mt-Keima-dodatniej. Teraz uruchom każdą próbkę i zarejestruj co najmniej 10 000 zdarzeń w bramce zatrzymującej mt-Keima.

Analiza cytometrii przepływowej nieleczonych komórek HeLa wykazujących ekspresję mt-Keima wykazała niski poziom mitofagii. Leczenie CCCP wywołało dramatyczny wzrost liczby komórek mitofagii w wysokiej bramie. Odsetek komórek mitofagi zwiększył się ponad 10-krotnie po sześciu godzinach od leczenia CCCP.

Ten wzrost mitofagii przez leczenie CCCP został całkowicie zniesiony przez jednoczesne leczenie bafilomycyną A. Gdy komórki wykazujące ekspresję mito-Keima są gotowe, pomiar mitofagów za pomocą cytometrii przepływowej można przeprowadzić w ciągu jednej godziny, jeśli zostanie odpowiednio przygotowany. Aby uzyskać dokładną analizę mitofagów za pomocą cytometrii przepływowej, ważne jest ustawienie prawidłowych bramek wysokich i niskich. Podczas analizy nowych typów komórek konieczne jest użycie dobrze znanych komórek, takich jak komórki HeLa, jako kontroli.

Ponadto należy pamiętać, że mitofag powinien być w pełni potwierdzony przez dodatkowe cechy, takie jak spadek białka mitochondrialnego i zmniejszenie mitochondrialnego DNA. Technika ta może być stosowana do wielu różnych typów komórek. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak analizować mitofag za pomocą cytometrii przepływowej.