Name: Czuły pomiar mitofagii za pomocą cytometrii przepływowej przy użyciu zależnego od pH reportera fluorescencyjnego mt-Keima (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: Poznaj czułą metodę pomiaru mitofagii w żywych komórkach HeLa za pomocą cytometrii przepływowej z reporterem mt-Keima. Technika umożliwia szybką analizę bez dodatkowego barwienia.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca została wsparta grantem z National Research Foundation of Korea (2016R1D1A1B03931949) (dla J. U.) oraz grantem National Research Foundation of Korea (NRF) ufundowanym przez rząd Korei (MSIT) (No. 2016R1A2B2008887, No. 2016R1A5A2007009) (dla J.Y.)

1. Generacja komórek HeLa wykazujących ekspresję mito-Keima (mt-Keima)
<ol>
	<li>Przygotowanie lentiwirusa mt-Keima
	<ol>
		<li>Pokryj naczynie hodowlane o średnicy 100 mm, dodając 2 ml 0,001% soli fizjologicznej buforowanej poli-L-lizyną/fosforanem (PBS) i odstaw na 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Usunąć roztwór poli-L-lizyny za pomocą szklanej pipety podłączonej do próżni i umyć naczynie hodowlane, dodając 2 ml 1x PBS.</li>
		<li>Płytka 1,5 x 106 HEK293T komórek na powlekanym szalku hodowlanym z 10 ml DMEM zawierającego 10% FBS i 1% penicyliny/streptomycyny, a następnie hodować komórki w temperaturze 37 °C w inkubatorze do hodowli tkankowych CO2 przez jeden dzień.</li>
		<li>Transfekcja 2 μg plazmidu lentiwirusowego mt-Keima mt-Keima class=29 DNA wraz z pakietem DNA (psPAX 2 μg i pVSVG 0,25 μg) przy użyciu odczynnika do transfekcji przez 8 godzin zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
		<li>Usuń pożywkę do transfekcji i dodaj 8 ml świeżej pożywki.</li>
		<li>Zebrać pożywkę zawierającą cząstki wirusa 48 godzin później. Usunąć resztki komórkowe z zebranych pożywek przez odwirowanie przy 500 x g przez 5 minut i przefiltrować je za pomocą filtra strzykawkowego 0,45 μm. 
		nuta: W przypadku długotrwałego stosowania należy wykonać porcje cząstek lentiwirusa i przechowywać próbki w temperaturze -80 °C. Należy unikać poddawania próbek wirusa cyklom zamrażania i rozmrażania w celu skutecznego zakażenia wirusowego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zakażenie komórek HeLa-Parkin lentiwirusem mt-Keima
	<ol>
		<li>Płytka 5 x 104 komórki HeLa wykazujące ekspresję parkiny (HeLa-Parkin) w 60-milimetrowym naczyniu hodowlanym z 4 ml DMEM zawierającego 10% FBS i 1% penicyliny/streptomycyny w temperaturze 37 °C na jeden dzień przed pobraniem lentiwirusa mt-Keima. 
		nuta: Ze względu na brak endogennej ekspresji Parkiny w komórkach HeLa30, użyte tutaj komórki HeLa-Parkin wyraźniej pokazują mitofagię indukowaną przez CCCP. Procedura ta może być również stosowana do innych pierwotnych lub unieśmiertelnionych linii komórkowych.</li>
		<li>Następnego dnia usuń pożywkę wzrostową i dodaj 1 ml pożywki lentiwirusowej mt-Keima. Dodać dodatkowe 2 ml pożywki wzrostowej zawierającej 3 μl roztworu podstawowego polibrenu (8 mg/ml w wodzie destylowanej). Inkubować przez jeden dzień w inkubatorze do hodowli tkankowych CO2 .</li>
		<li>Następnego dnia usuń mieszaninę lentiwirusową mt-Keima i dwukrotnie umyj komórki 1x PBS. Dodaj 4 ml pożywki wzrostowej i traktuj komórki 2 μg/ml puromycyny przez dwa dni.</li>
		<li>Po dwóch dniach selekcji puromycyny usuń pożywkę wzrostową i umyj komórki dwukrotnie 1x PBS. Dodać pożywkę wzrostową i hodować komórki w inkubatorze CO2 do momentu użycia. 
		nuta: Metodę tę można zastosować do generowania komórek, które stabilnie eksprymują mt-Keima, w tym innych linii komórkowych i komórek pierwotnych.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Wywoływanie mitofagii za pomocą leczenia CCCP i przygotowanie próbek FACS
<ol style="margines po lewej: 40px;">
	<li>Płytka 5 x 104 komórki HeLa-Parkin wykazujące ekspresję mt-Keima w 60-milimetrowym naczyniu hodowlanym z 4 ml DMEM zawierającego 10% FBS i 1% penicyliny/streptomycyny i hodować je przez jeden dzień w temperaturze 37 °C w inkubatorze do hodowli tkankowychCO2</li>.
	<li>Następnego dnia usunąć pożywkę wzrostową i dodać 4 ml świeżego DMEM zawierającego 10 μM m-chlorofenylohydrazonu cyjanku karbonylu (CCCP). Inkubować komórki HeLa-Parkin-mt-Keima w inkubatorze tkanek CO2 przez 6 godzin.</li>
	<li>Usuń pożywkę wzrostową 6 godzin później i umyj komórki 2 ml 1x PBS. Odłącz komórki, traktując je roztworem trypsyny/EDTA i dezaktywuj trypsynę, dodając pożywkę wzrostową zawierającą 10% FBS. Przenieś komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Odwirować komórki przy 500 x g przez 5 minut.</li>
	<li>Ostrożnie usunąć pożywkę wzrostową przez aspirację i ponownie zawiesić komórki za pomocą 1 ml zimnego 1x PBS.</li>
	<li>Przenieś komórki do odpowiedniej probówki FACS i umieść ją na lodzie. 
	nuta: Przygotować niezakażone komórki HeLa jako kontrolę negatywną. 
	nuta: Komórki są żywotne na lodzie przez kilka godzin, a sygnały fluorescencyjne mt-Keima również pozostają stabilne.</li>
</ol>
3. Analiza FACS mitofagii
Uwaga: W tym badaniu, komórki były analizowane za pomocą cytometru przepływowego wyposażonego w laser o długości fali 405 nm i 561 nm. Komórki wzbudzono fioletowym laserem (405 nm) z emisją wykrytą przy 610 ± 10 nm za pomocą detektora BV605 oraz żółto-zielonym laserem (561 nm) z emisją wykrytą przy 610 ± 10 nm przez detektor PE-CF594 jednocześnie (<silna klasa="xfig">Rysunek 1).
<ol>
	<li>Bramkowanie żywych komórek
	<ol>
		<li>Włącz cytometr przepływowy i komputer, a następnie zaloguj się do oprogramowania do analizy.</li>
		<li>Wygeneruj nowy eksperyment lub zduplikuj istniejący eksperyment. Aby wzbudzić komórki za pomocą lasera fioletowego (405 nm) i żółto-zielonego (561 nm) i wykryć emisję w detektorze 610 ± 10 nm, wybierz BV605 i PE-CF594 oprócz rozpraszania do przodu (FSC) i rozpraszania bocznego (SSC) w oknie parametrów zgodnie z wymaganiami fluorofory. 
		nuta: Wszystkie fluorofory należy dodawać w trybie liniowym.</li>
		<li>Krótko zawirować każdą próbkę komórkową, aby rozproszyć agregaty komórkowe.</li>
		<li>Umieścić probówkę zawierającą próbkę kontrolną komórki HeLa-Parkin, która nie jest zakażona lentiwirusem mt-Keima, w porcie wstrzyknięcia próbki i nacisnąć przycisk "uruchom" na cytometrze.</li>
		<li>Na wykresie kropkowym FSC w porównaniu z SSC dostosuj napięcie FSC i SSC, aby umieścić komórki w środku wykresu kropkowego.</li>
		<li>Narysuj bramkę P1 za pomocą ikony wielokąta wokół żywych komórek i wyeliminuj martwe komórki i szczątki komórek (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dostosuj napięcia dla fioletowego i zielonego lasera
	<ol>
		<li>Umieścić probówkę zawierającą komórki HeLa-Parkin zakażone lentiwirusem mt-Keima na porcie wstrzyknięcia próbki i nacisnąć przycisk "uruchom" na cytometrze.</li>
		<li>Na wykresie kropkowym BV605 (405 nm) w porównaniu z SSC dostosuj napięcie BV605 tak, aby komórki HeLa-Parkin wyrażające mt-Keima były wyraźnie odróżniane od komórek kontrolnych, które nie wykazują ekspresji mt-Keima (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2B).</li>
		<li>Na wykresie kropkowym PE-CF594 (561 nm) w porównaniu z SSC dostosuj napięcie PE-CF594 tak, aby komórki HeLa-Parkin wyrażające mt-Keima były wyraźnie odróżniane od komórek kontrolnych (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2B).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oceń procent komórek w mitofagii
	<ol>
		<li>Uzyskaj wykres punktowy BV605 w porównaniu z PE-CF594 przy użyciu skali liniowej. Narysuj bramkę za pomocą ikony wielokąta wokół komórek wyrażających mt-Keima i wyeliminuj komórki, które nie wyrażają mt-Keima (<silna klasa = "xfig">Rysunek 3A). Populacja komórek mt-Keima fluorescencyjnie dodatnia jest określana jako bramka "mt-Keima".</li>
		<li>Utwórz kolejny wykres punktowy BV605 w porównaniu z PE-CF594 pokazujący tylko komórki bramkowane "mt-Keima". Na tym wykresie kropkowym narysuj bramę wokół nieleczonych komórek mt-Keima-dodatnich. Podstawowa aktywność mitofagii kontrolnych komórek HeLa jest niska, a stosunek emisji w PE-CF594 / BV605 jest mniejszy niż 1. Stąd brama ta nazywana jest bramą "niską".</li>
		<li>Narysuj kolejną bramę zawierającą powyższy obszar "niskiej" bramy. Ta bramka jest określana jako bramka "wysoka", ponieważ zawiera komórki o wysokiej aktywności mitofagii, czyli komórki o wysokim współczynniku emisji w PE-CF594 / BV605 (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3B).</li>
		<li>Aby obliczyć procent komórek w bramce "wysokiej", wybierz menu "Pokaż hierarchię populacji". Wartość "Procent rodzica" (%Parent) reprezentuje procent komórek w "wysokiej" bramce w populacji mt-Keima-dodatniej.</li>
		<li>Ustaw co najmniej 10 000 zdarzeń do nagrania w bramce zatrzymującej "mt-Keima" i uruchom każdą próbkę.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>McBride, H. M., Neuspiel, M., Wasiak, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria%3A+More+than+just+a+powerhouse%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Mitochondria: More than just a powerhouse.</a> Current Biology. 16 (14), R551-R560 (2006).</li>
<li>Zorov, D. B., Krasnikov, B. F., Kuzminova, A. E., Vysokikh, M., Zorova, L. D. Mitochondria revisited. Alternative functions of mitochondria. Bioscience Reports. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aZorov%2C+DB+%22Bioscience+Reports%22">Bioscience Reports</a>. 17 (6), 507-520 (1997).</li>
<li>Taylor, R. W., Turnbull, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+DNA+mutations+in+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial DNA mutations in human disease.</a> Nature Reviews Genetics. 6 (5), 389-402 (2005).</li>
<li>Galluzzi, L., Kepp, O., Trojel-Hansen, C., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+control+of+cellular+life%2C+stress%2C+and+death%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial control of cellular life, stress, and death.</a> Circulation Research. 111 (9), 1198-1207 (2012).</li>
<li>Kang, D., Hamasaki, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+of+mitochondrial+DNA+in+common+diseases+and+disease+states%3A+aging%2C+neurodegeneration%2C+heart+failure%2C+diabetes%2C+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Alterations of mitochondrial DNA in common diseases and disease states: aging, neurodegeneration, heart failure, diabetes, and cancer.</a> Current Medicinal Chemistry. 12 (4), 429-441 (2005).</li>
<li>Sun, N., Youle, R. J., Finkel, T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26942670">The mitochondrial basis of aging.</a> Molecular Cell. 61 (5), 654-666 (2016).</li>
<li>Wallace, D. C., Brown, M. D., Melov, S., Graham, B., Lott, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+biology%2C+degenerative+diseases+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22BioFactors%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial biology, degenerative diseases and aging.</a> BioFactors. 7 (3), 187-190 (1998).</li>
<li>Yun, J., Finkel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitohormesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Mitohormesis.</a> Cell Metabolism. 19 (5), 757-766 (2014).</li>
<li>Ashrafi, G., Schwarz, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pathways+of+mitophagy+for+quality+control+and+clearance+of+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">The pathways of mitophagy for quality control and clearance of mitochondria.</a> Cell Death and Differentiation. 20 (1), 31-42 (2013).</li>
<li>Clark, I. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+pink1+is+required+for+mitochondrial+function+and+interacts+genetically+with+parkin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Drosophila pink1 is required for mitochondrial function and interacts genetically with parkin.</a> Nature. 441 (7097), 1162-1166 (2006).</li>
<li>Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+in+Drosophila+PINK1+mutants+is+complemented+by+parkin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction in Drosophila PINK1 mutants is complemented by parkin.</a> Nature. 441 (7097), 1157-1161 (2006).</li>
<li>Narendra, D., Tanaka, A., Suen, D. F., Youle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkin+is+recruited+selectively+to+impaired+mitochondria+and+promotes+their+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Parkin is recruited selectively to impaired mitochondria and promotes their autophagy.</a> The Journal of Cell Biology. 183 (5), 795-803 (2008).</li>
<li>Zhu, J., Wang, K. Z., Chu, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((After+the+banquet%3A+Mitochondrial+biogenesis%2C+mitophagy%2C+and+cell+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">After the banquet: Mitochondrial biogenesis, mitophagy, and cell survival.</a> Autophagy. 9 (11), 1663-1676 (2013).</li>
<li>Um, J. H., Yun, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+role+of+mitophagy+in+human+diseases+and+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22BMB+Reports%22%5BJournal%5D)">Emerging role of mitophagy in human diseases and physiology.</a> BMB Reports. 50 (6), 299-307 (2017).</li>
<li>Al Rawi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postfertilization+autophagy+of+sperm+organelles+prevents+paternal+mitochondrial+DNA+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Postfertilization autophagy of sperm organelles prevents paternal mitochondrial DNA transmission.</a> Science. 334 (6059), 1144-1147 (2011).</li>
<li>Kim, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SESN2%2Fsestrin2+suppresses+sepsis+by+inducing+mitophagy+and+inhibiting+NLRP3+activation+in+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">SESN2/sestrin2 suppresses sepsis by inducing mitophagy and inhibiting NLRP3 activation in macrophages.</a> Autophagy. 12 (8), 1272-1291 (2016).</li>
<li>Kim, M. J., Yoon, J. H., Ryu, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitophagy%3A+A+balance+regulator+of+NLRP3+inflammasome+activation%5BTitle%5D)+AND+%22BMB+Reports%22%5BJournal%5D)">Mitophagy: A balance regulator of NLRP3 inflammasome activation.</a> BMB Reports. 49 (10), 529-535 (2016).</li>
<li>Sandoval, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+role+for+Nix+in+autophagic+maturation+of+erythroid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Essential role for Nix in autophagic maturation of erythroid cells.</a> Nature. 454 (7201), 232-235 (2008).</li>
<li>Sato, M., Sato, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Degradation+of+paternal+mitochondria+by+fertilization-triggered+autophagy+in+C.+elegans+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Degradation of paternal mitochondria by fertilization-triggered autophagy in C. elegans embryos.</a> Science. 334 (6059), 1141-1144 (2011).</li>
<li>Geisler, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PINK1%2FParkin-mediated+mitophagy+is+dependent+on+VDAC1+and+p62%2FSQSTM1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">PINK1/Parkin-mediated mitophagy is dependent on VDAC1 and p62/SQSTM1.</a> Nature Cell Biology. 12 (2), 119-131 (2010).</li>
<li>Matsuda, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PINK1+stabilized+by+mitochondrial+depolarization+recruits+Parkin+to+damaged+mitochondria+and+activates+latent+Parkin+for+mitophagy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">PINK1 stabilized by mitochondrial depolarization recruits Parkin to damaged mitochondria and activates latent Parkin for mitophagy.</a> The Journal of Cell Biology. 189 (2), 211-221 (2010).</li>
<li>Allen, G. F., Toth, R., James, J., Ganley, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+iron+triggers+PINK1%2FParkin-independent+mitophagy%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">Loss of iron triggers PINK1/Parkin-independent mitophagy.</a> EMBO Reports. 14 (12), 1127-1135 (2013).</li>
<li>Chu, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiolipin+externalization+to+the+outer+mitochondrial+membrane+acts+as+an+elimination+signal+for+mitophagy+in+neuronal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cardiolipin externalization to the outer mitochondrial membrane acts as an elimination signal for mitophagy in neuronal cells.</a> Nature Cell Biology. 15 (10), 1197-1205 (2013).</li>
<li>Kubli, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PINK1+Is+dispensable+for+mitochondrial+recruitment+of+Parkin+and+activation+of+mitophagy+in+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">PINK1 Is dispensable for mitochondrial recruitment of Parkin and activation of mitophagy in cardiac myocytes.</a> PloS One. 10 (6), e0130707(2015).</li>
<li>Dolman, N. J., Chambers, K. M., Mandavilli, B., Batchelor, R. H., Janes, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tools+and+techniques+to+measure+mitophagy+using+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Tools and techniques to measure mitophagy using fluorescence microscopy.</a> Autophagy. 9 (11), 1653-1662 (2013).</li>
<li>Kuma, A., Matsui, M., Mizushima, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LC3%2C+an+autophagosome+marker%2C+can+be+incorporated+into+protein+aggregates+independent+of+autophagy%3A+caution+in+the+interpretation+of+LC3+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">LC3, an autophagosome marker, can be incorporated into protein aggregates independent of autophagy: caution in the interpretation of LC3 localization.</a> Autophagy. 3 (4), 323-328 (2007).</li>
<li>Katayama, H., Kogure, T., Mizushima, N., Yoshimori, T., Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+and+quantitative+technique+for+detecting+autophagic+events+based+on+lysosomal+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+%26+Biology%22%5BJournal%5D)">A sensitive and quantitative technique for detecting autophagic events based on lysosomal delivery.</a> Chemistry & Biology. 18 (8), 1042-1052 (2011).</li>
<li>Lee, I. H., Yun, J., Finkel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emerging+links+between+sirtuins+and+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The emerging links between sirtuins and autophagy.</a> Methods in Molecular Biology. 1077, 259-271 (2013).</li>
<li>Sun, N., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26549682">Measuring In vivo Mitophagy.</a> Molecular Cell. 60 (4), 685-696 (2015).</li>
<li>Denison, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+in+the+common+fragile+site+gene+Parkin+in+ovarian+and+other+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Alterations in the common fragile site gene Parkin in ovarian and other cancers.</a> Oncogene. 22 (51), 8370-8378 (2003).</li>
<li>Adan, A., Alizada, G., Kiraz, Y., Baran, Y., Nalbant, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry%3A+Basic+principles+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry: Basic principles and applications.</a> Critical Reviews in Biotechnology. 37 (2), 163-176 (2017).</li>
<li>Bingol, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitochondrial+deubiquitinase+USP30+opposes+parkin-mediated+mitophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The mitochondrial deubiquitinase USP30 opposes parkin-mediated mitophagy.</a> Nature. 510 (7505), 370-375 (2014).</li>
<li>Burbulla, L. F., Kruger, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+primary+human+fibroblasts+for+monitoring+mitochondrial+phenotypes+in+the+field+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">The use of primary human fibroblasts for monitoring mitochondrial phenotypes in the field of Parkinson's disease.</a> Journal of Visualized Experiments. 68, e4228(2012).</li>
<li>Di Sante, G., Casimiro, M. C., Pestell, T. G., Pestell, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-lapse+video+microscopy+for+assessment+of+EYFP-Parkin+aggregation+as+a+marker+for+cellular+mitophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Time-lapse video microscopy for assessment of EYFP-Parkin aggregation as a marker for cellular mitophagy.</a> Journal of Visualized Experiments. 111, e53657(2016).</li>
<li>Fang, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+in+vivo+detection+of+mitophagy+in+human+cells%2C+C.+Elegans%2C+and+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">In vitro and in vivo detection of mitophagy in human cells, C. Elegans, and mice.</a> Journal of Visualized Experiments. 129, e56301(2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Tutaj przedstawiamy szybką i czułą metodę wykorzystania cytometrii przepływowej do pomiaru aktywności mitofagii komórkowej w komórkach wyrażających mt-Keima. Komórki poddawane wysokiemu poziomowi mitofagii wykazują zwiększony stosunek wzbudzenia PE-CF594 (561 nm)/BV605 (405 nm). Tak więc aktywność mitofagii można wyrazić jako odsetek komórek wykazujących wysoki stosunek 561/405. Obliczyliśmy procent komórek w regionie "wysokiej" bramki na wykresie kropkowym PE-CF594 (561 nm) w porównaniu z BV605 (405 nm), a wyniki wykaza...

Mitochondria to organelle, które są niezbędne do proliferacji komórek i fizjologii. Mitochondria są odpowiedzialne za wytwarzanie ponad 80% podaży ATP poprzez fosforylację oksydacyjną, a także dostarczają różnych produktów pośrednich metabolicznych do biosyntezy i metabolizmu1,2. Oprócz swojej roli w dostarczaniu energii i metabolizmie, mitochondria odgrywają kluczową rolę w wielu innych ważnych procesach, w tym w wytwarzaniu reaktywnych form tlenu (ROS), regulacji śmierci komórki i wewnątrzkomórkowej dynamice Ca2+3. Zmiany w funkcjonowaniu mitochondriów są związane z chorobami ludzkimi, w tym rakiem, cukrzycą i różnymi chorobami neurodegeneracyjnymi4,5. Uważa się również, że zwiększona dysfunkcja mitochondriów i mutacje mitochondrialnego DNA przyczyniają się do prawidłowych procesów starzenia6,7,8. Dlatego kontrola jakości jest kluczową kwestią w mitochondriach. Mitochondria to wysoce dynamiczne organelle, które mogą stale zmieniać swój kształt między wydłużonymi sieciami a krótką, rozdrobnioną formą. Dynamika mitochondriów odgrywa ważną rolę w utrzymaniu funkcji mitochondriów, a także w ich degradacji przez mitofagię9.
Mitofagia to mechanizm, który polega na selektywnej degradacji całych mitochondriów za pomocą maszynerii autofagii. Mitofagia jest głównym mechanizmem leżącym u podstaw obrotu mitochondrialnego i usuwania uszkodzonych lub dysfunkcyjnych mitochondriów. W tym procesie mitochondria są najpierw otoczone błoną, co powoduje powstawanie autofagosomów, które następnie łączą się z lizosomami w celu degradacji hydrolitycznej9. Wcześniejsze badania genetyczne na Drosophila sugerowały, że dwa geny związane z chorobą Parkinsona, indukowana przez PTEN domniemana kinaza 1 (PINK1) (PARK6) i Parkina (PARK2), funkcjonują w tym samym szlaku10,11. Badania podsekwencyjne wykazały, że szlak PINK1-Parkin jest odpowiedzialny za eliminację uszkodzonych mitochondriów, a defekty tego szlaku skutkują dysfunkcyjną mitofagią i mogą przyczyniać się do chorób u ludzi12,13. Defekty w procesach mitofagii zostały ostatnio wykryte w różnych chorobach ludzkich, w tym raku, chorobach serca, chorobach wątroby i chorobach neurodegeneracyjnych 14. Ponadto ostatnie badania wykazały również, że mitofagia ma kluczowe znaczenie dla wielu procesów fizjologicznych, takich jak różnicowanie, rozwój i odpowiedź immunologiczna15,16,17,18,19, co sugeruje, że mitofagia może odgrywać bardziej aktywną rolę w kontrolowaniu funkcji komórek.
Pomimo niedawnego potwierdzenia, że mitofagia odgrywa ważną rolę zarówno w kontroli jakości mitochondriów, jak i w chorobach ludzkich, mechanizmy molekularne leżące u podstaw mitofagii pozostają słabo poznane. Chociaż mechanizmy związane z mitofagią były systematycznie badane u drożdży, badania mające na celu zbadanie mechanizmów związanych z mitofagią w komórkach ssaków koncentrowały się głównie na szlaku PINK1-Parkin. Wcześniejsze badania wykazały, że szlak PINK1-Parkin jest przede wszystkim odpowiedzialny za selektywne usuwanie uszkodzonych mitochondriów poprzez mitofagię12,20,21. Jednak ostatnie badania wykazały, że w niektórych modelach mitofagia może być aktywowana nawet przy braku funkcjonalnego PINK122,23,24. Wyniki te sugerują, że oprócz szlaku PINK1-Parkin istnieje dodatkowy niezidentyfikowany szlak, który może aktywować mitofagię.
Brak wygodnej metody oceny aktywności mitofagii jest główną przeszkodą w badaniu ścieżek regulujących mitofagię i jej rolę w zdarzeniach patofizjologicznych. Mikroskopia elektronowa jest potężnym narzędziem do bezpośredniej wizualizacji mitochondriów pochłoniętych autofagosomami. Jednak mikroskopia elektronowa ma ograniczenia w ilościowym określaniu aktywności mitofagii. Chociaż strategie wykorzystujące sondy fluorescencyjne sprzężone z białkiem lekkim 1 (LC3) związane z mikrotubulami, takie jak GFP-LC3, są obecnie najczęściej stosowanymi podejściami25, przejściowy charakter sygnału opartego na LC3 i wysoki odsetek sygnałów fałszywie dodatnich ograniczają jego czułość na wykrywanie mitofagii w komórkach26. Połączenie western blotting w celu pomiaru poziomu białka mitochondrialnego, kwantyfikacji mitochondrialnego DNA i analizy mikroskopii fluorescencyjnej w celu kolokalizacji mitochondriów z autofagosomami lub lizosomami byłoby dobrym podejściem do oceny mitofagii. Ograniczenia w zakresie kwantyfikacji i brak wygody istniejących metodologii wymagają jednak nowych podejść. Wprowadzenie nowego białka fluorescencyjnego zależnego od pH, mitochondrialnego celu Keima (mt-Keima), znacznie poprawiło zdolność wykrywania mitofagii27. Poprzez fuzję sekwencji ukierunkowanej na mitochondria podjednostki VIII OKSYDAZY CYTOCHROMU C (COX VIII) z Keimą, mt-Keima jest kierowana do macierzy mitochondrialnej. Duże przesunięcie piku wzbudzenia Keimy z 440 nm do 586 nm (odpowiadające odpowiednio pH 7 i pH 4) można wykorzystać do oceny mitofagii z dobrą czułością zarówno w eksperymentach in vitro, jak i in vivo28,29. Co ważniejsze, oporność mt-Keima na degradację lizosomalną powoduje integrację sygnału mt-Keima w lizosomach, co pozwala na łatwy ilościowy pomiar aktywności mitofagii. Zmiana fluorescencji, która występuje w mt-Keima, może być analizowana za pomocą mikroskopii konfokalnej lub cytometrii przepływowej28,29. Jednak do tej pory nie przedstawiono szczegółowo metody pomiaru aktywności mitofagii opartej na cytometrii przepływowej za pomocą mt-Keima.
Tutaj opisujemy szczegółowy protokół dla techniki opartej na cytometrii przepływowej do pomiaru aktywności mitofagii w komórkach za pomocą mt-Keima. Chociaż wykazaliśmy tutaj, że analiza cytometrii przepływowej z powodzeniem wykryła mitofagię wywołaną przez CCCP w komórkach HeLa eksprymujących Parkinę, technikę tę można zastosować do wielu różnych typów komórek.

<table><tbody><tr><td>ODCZYNNIKI</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>poly-L-lizyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2636</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>GIBCO</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>penicylina/streptomycyna</td><td>wellgene</td><td>LS202-02</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Hyclon</td><td>SH30013.02</td><td></td></tr><tr><td>HEK293T</td><td></td><td>ATCC CRL-3216</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>GIBCO</td><td>12800-082</td><td></td></tr><tr><td>OPTI-MEM&nbsp;</td><td>GIBCO</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>Termos turbofektowy</td><td>naukowy</td><td>R0531</td><td></td></tr><tr><td>0,45 &mu; m filtr strzykawkowy</td><td>sartorius</td><td>16555</td><td></td></tr><tr><td>HeLa</td><td>ATCC</td><td>CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>polybrene</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9268</td><td>8 mg/ml</td></tr><tr><td>puromycyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8833</td><td>2 mg/ml&nbsp;</td></tr><tr><td>Cyjanek karbonylu m-chlorofenylohydrazyna (CCCP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2759</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>trypsyna-EDTA</td><td>wellgene</td><td>LS015-01</td><td></td></tr><tr><td>EQUIPMENTS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD LSRFortessa</td><td>BD Bioscience</td><td>LSRFortessa</td><td></td></tr><tr><td>FACSDIVA</td><td>BD Bioscience</td><td>FACSDIVA (v8.0.1)</td><td></td></tr></tbody></table>

czuły pomiar mitofagii za pomocą cytometrii przepływowej przy użyciu zależnego od ph reportera fluorescencyjnego mt-keima

Sensitive Measurement of Mitophagy by Flow Cytometry Using the pH-dependent Fluorescent Reporter mt-Keima

Mitofagia to proces selektywnego usuwania uszkodzonych lub niepotrzebnych mitochondriów za pomocą autofagii. Stwierdzono ścisłe powiązania między wadliwą mitofagią a różnymi chorobami ludzkimi, w tym chorobami neurodegeneracyjnymi, rakiem i chorobami metabolicznymi. Ponadto ostatnie badania wykazały, że mitofagia bierze udział w prawidłowych procesach komórkowych, takich jak różnicowanie i rozwój. Jednak dokładna rola i mechanizmy molekularne leżące u podstaw mitofagii wymagają dalszych badań. Dlatego tak ważne jest opracowanie solidnej i wygodnej metody pomiaru zmian w aktywności mitofagii. W tym miejscu opisujemy szczegółowy protokół ilościowej oceny aktywności mitofagii za pomocą cytometrii przepływowej przy użyciu białka fluorescencyjnego Keima ukierunkowanego na mitochondria (mt-Keima). Ten test cytometrii przepływowej może analizować aktywność mitofagii szybciej i bardziej czułie niż konwencjonalne metody oparte na mikroskopii lub immunoblottingu. Protokół ten można zastosować do analizy aktywności mitofagii w różnych typach komórek.

Przykład analizy cytometrycznej przepływowej mitofagii indukowanej CCCP w komórkach HeLa-Parkin przedstawiono na Rysunku 4. Stosując opisaną powyżej metodę analizy cytometrycznej, można wykryć gwałtowny wzrost liczby komórek mitofagicznych w bramce „high”. Odsetek komórek w bramce „high” wzrósł ponad 10-krotnie w porównaniu z nieleczonymi komórkami kontrolnymi (Rysunek 4A). Wzrost aktywności mitofagii został całkowicie zniesiony ...

Mitofagia, selektywna degradacja mitochondriów, jest związana z homeostazą mitochondriów i jest rozregulowana w różnych chorobach ludzkich. Jednak wygodne metody eksperymentalne do pomiaru aktywności mitofagii są bardzo ograniczone. Tutaj zapewniamy czuły test do pomiaru aktywności mitofagii za pomocą cytometrii przepływowej.

Czuły pomiar mitofagii za pomocą cytometrii przepływowej przy użyciu zależnego od pH reportera fluorescencyjnego mt-Keima

Mitophagy is a process of selective removal of damaged or unnecessary mitochondria using autophagy machinery. Close links have been found between ...

Ogólnym celem tej procedury jest zapewnienie czułej techniki pomiaru aktywności mitofagii komórkowej za pomocą cytometrii przepływowej. Tutaj pokazujemy, że metoda ta została z powodzeniem zastosowana do oceny dramatycznego wzrostu mitofagii komórek HeLa po leczeniu CCCP, rozprzęgaczem mitochondrialnym. Technika ta pozwala na bardzo szybki i łatwy pomiar aktywności mitofagów.Główną zaletą tej techniki jest to, że można z czułością mierzyć aktywność mitofagów w żywych komórkach bez dodatkowego barwienia. Dlatego ta technika ostatecznie będzie w stanie pomóc w zrozumieniu mechanizmu i fizjologicznej roli mitofagów. Procedurę zademonstrują Jee-Hyun Um i Young Yeon Kim z mojego laboratorium.Rozpocznij tę procedurę od przygotowania mt-Keima, lentiwirusa Keima ukierunkowanego na mitochondria. Pierwszy wysiew HEK293T komórek w naczyniu hodowlanym pokrytym poli-L-lizyną i hodować je w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze do hodowli tkankowych przez jeden dzień. Następnego dnia przetransfekować komórki HEK293T z DNA lentiwirusa mt-Keima i opakowaniem DNazy za pomocą odczynnika do transfekcji zgodnie z instrukcjami producenta.Po ośmiu godzinach transfekcji usuń pożywkę transfekcyjn

sensitive-measurement-mitophagy-flow-cytometry-using-ph-dependent

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opisano niezawodną metodę monitorowania transportu organelli do kwaśnego światła wakuoli drożdżowej w celu ich degradacji i recyklingu. Metoda ta opiera się na specyficznym znakowaniu docelowych organelli za pomocą genetycznie kodowanego dwuemisyjnego fluorescencyjnego biosensora pH oraz wizualizacji pojedynczych komórek przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej.

Analiza z wykorzystaniem mikroskopii fluorescencyjnej do monitorowania mitofagii w drożdżach Saccharomyces cerevisiae

Opisana tutaj jest metoda wykrywania i ilościowego oznaczania białek zewnętrznej błony mitochondrialnej poprzez immunoznakowanie mitochondriów wyizolowanych z tkanek gryzoni i analizę za pomocą cytometrii przepływowej. Metoda ta może być rozszerzona o ocenę funkcjonalnych aspektów subpopulacji mitochondrialnych.

Immunodetekcja białek błony zewnętrznej za pomocą cytometrii przepływowej izolowanych mitochondriów

Tutaj szczegółowo opisujemy podejście do pomiaru czasowej rekrutacji EYFP-Parkiny za pomocą poklatkowej mikroskopii podczas selektywnego usuwania uszkodzonych mitochondriów. Ten dynamiczny proces usuwania uszkodzonych mitochondriów zależny od EYFP-Parkina może być wykorzystany jako wskaźnik zdrowia komórek w różnych warunkach eksperymentalnych.

Wideomikroskopia poklatkowa do oceny agregacji EYFP-Parkiny jako markera mitofagii komórkowej

Tutaj, wielospektralna cytometria przepływowa z funkcją analityczną, która porównuje jasne obrazy szczegółów 3 markerów autofagii i określa ilościowo ich kolokalizację, wraz z liczeniem plamek LC3, została użyta do pomiaru autofagii w obiektywny, ilościowy i statystycznie solidny sposób.

Ocena strumienia autofagicznego poprzez pomiar kolokalizacji LC3, p62 i LAMP1 za pomocą cytometrii przepływowej obrazowania wielospektralnego

Mitofagia, proces oczyszczania uszkodzonych mitochondriów, jest niezbędny do homeostazy mitochondriów i utrzymania zdrowia. W tym artykule przedstawiono niektóre z najnowszych metod wykrywania mitofagii w komórkach ludzkich, Caenorhabditis elegans i myszach.

Wykrywanie mitofagii in vitro i in vivo w komórkach ludzkich, C. elegans i myszach

Ksenobiotyczne pompy wypływowe są bardzo aktywne w hematopoetycznych komórkach macierzystych i progenitorowych (HSPC) i powodują ekstruzję TMRM, barwnika fluorescencyjnego o potencjale błony mitochondrialnej. W tym miejscu przedstawiamy protokół do dokładnego pomiaru potencjału błony mitochondrialnej w HSPC za pomocą TMRM w obecności Werapamilu, inhibitora pompy wypływowej.

Poprawa dokładności cytometrycznej oceny potencjału błony mitochondrialnej w hematopoetycznych komórkach macierzystych i progenitorowych poprzez hamowanie pomp wypływowych

Mitofagia jest głównym mechanizmem kontroli jakości mitochondriów. Jednak ocena mitofagii in vivo jest utrudniona ze względu na brak wiarygodnych testów ilościowych. Przedstawiono protokół obserwacji mitofagii w żywych komórkach przy użyciu barwnika mitochondriów o barwie zielonej fluorescencji i barwnika lizosomowego o czerwonej fluorescencji.

Wizualizacja mitofagii za pomocą barwników fluorescencyjnych dla mitochondriów i lizosomów

Badanie mitofagii za pomocą mikroskopii elektronowej, czujników genetycznych i immunofluorescencji wymaga kosztownego sprzętu, wykwalifikowanego personelu i znacznej inwestycji czasu. Tutaj pokazujemy skuteczność komercyjnego zestawu barwników fluorescencyjnych w ilościowym określaniu procesu mitofagii zarówno w Caenorhabditis elegans, jak i w linii komórkowej raka wątroby.

Wykrywanie mitofagii w Caenorhabditis elegans i komórkach ssaków przy użyciu barwników specyficznych dla organelli

Ten protokół przedstawia dwie metody analizy ilościowej mitofagii w komórkach β trzustki: pierwsza, kombinacja przepuszczalnych dla komórek barwników specyficznych dla mitochondriów, a druga, genetycznie kodowany reporter mitofagii. Te dwie techniki są komplementarne i mogą być wdrażane w zależności od konkretnych potrzeb, co pozwala na elastyczność i precyzję w ilościowym podejściu do kontroli jakości mitochondriów.

Uzupełniające podejścia do badania strumienia mitofagii w komórkach β trzustki

Przedstawiono metodę IP-FCM, która umożliwia czułą i niezawodną biochemiczną ocenę natywnych oddziaływań białko-białko, bez konieczności stosowania inżynierii genetycznej lub dużych objętości próbek.

IP-FCM: Immunoprecypitacja wykrywana za pomocą cytometrii przepływowej

Poznaj czułą metodę pomiaru mitofagii w żywych komórkach HeLa za pomocą cytometrii przepływowej z reporterem mt-Keima. Technika umożliwia szybką analizę bez dodatkowego barwienia.

Czuły pomiar mitofagii za pomocą cytometrii przepływowej przy użyciu zależnego od pH reportera fluorescencyjnego mt-Keima

Przeglądaj więcej filmów