Kwantyfikacja mitochondriów i lizosomów w limfocytach T oparta na wielobarwnej cytometrii przepływowej

Metoda ta może pomóc nam odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie immunometabolizmu. Zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ilościowe określenie mitochondriów lub lizosomów w poszczególnych żywych komórkach, w złożonej mieszaninie różnych typów komórek. Ta metoda badania limfocytów T i B może być również stosowana do wielu innych typów komórek, takich jak makrofagi, komórki dendrytyczne lub dowolne komórki pierwotne pobrane z próbki tkanki.

Procedura zostanie zademonstrowana przez Chin-Wen Wei, doktoranta z mojego laboratorium. Aby oznaczyć organelle do oceny ilościowej, najpierw dodaj jeden razy dziesięć do szóstych mysich limfocytów T do jednej okrągłej dolnej rurki faksowej na marker. I granulować komórki przez odwirowanie.

wstępnie podgrzana do 37 stopni Celsjusza pożywka hodowlana bez surowicy w celu rozcieńczenia roztworów podstawowych sondy specyficznych dla organelli do końcowych stężeń roboczych w pożywce. I ponownie zawiesić ogniwa w 100 mikrolitrach barwnika sondy na probówkę. Następnie inkubować komórki w inkubatorze do hodowli komórkowych przez odpowiedni okres barwienia, zatrzymując reakcję pod koniec inkubacji za pomocą jednego mililitra lodowatego buforu faksu na probówkę.

Następnie zbierz komórki za pomocą kolejnego wirowania i ponownie zawiesić granulki w 100 mikrolitrach wstępnie miareczkowanego supernatantu hybrydomy 24G2 na lodzie. Po dziesięciu minutach dodaj jeden mililitr bufora faksu na probówkę. Zebrać komórki przez odwirowanie i oznaczyć komórki 50 mikrolitrami wstępnie miareczkowanego koktajlu przeciwciał sprzężonych z fluorescencją, który jest przedmiotem zainteresowania.

Dodać odpowiednie stężenie zgodnie z tabelą. I bufor faksu przez 20 minut na lodzie, chroniony przed światłem. Pod koniec inkubacji dodać jeden mililitr buforu faksu na probówkę.

Zebrać komórki przez odwirowanie. I ponownie zawieś komórki w 300 mikrolitrach buforu faksowego uzupełnionego jednym mikrogramem na mililitr jodku propidyny. Natychmiast po dodaniu przeciwbarwienia jądrowego i chromosomowego włącz komputer do analizy cytometru przepływowego, cytometr przepływowy, oprogramowanie do akwizycji faksu i wszelkie inne akcesoria w zależności od platformy maszyny.

Przepuść PBS przez system przez około jedną minutę, aby upewnić się, że przewód przepływu jest wypełniony PBS i schować bufor. Otwórz nowy eksperyment i ustaw parametry cytometru zgodnie z instrukcjami producenta. Przefiltruj komórki przez sitko o średnicy 70 mikrometrów.

I wiruj przed pobraniem każdej próbki, aby uniknąć grudek i tworzenia się dubletów. Otwórz ustawienie Automatyczna kompensacja i utwórz wykresy punktowe dla każdego parametru fluorescencyjnego. Po ustawieniu wszystkich napięć wyreguluj kompensację i zastosuj kompensację do próbek.

Utwórz wykres punktowy do przodu i z boku i zoptymalizuj napięcia, aby interesujące komórki pojawiły się na wykresie. Utwórz wykres wysokości rozproszenia punktowego do przodu i bramki pojedynczych komórek. Utwórz wykres obszaru rozproszenia do przodu w stosunku do obszaru rozproszenia bocznego i bramkowania limfocytów.

Utwórz obszar rozproszenia do przodu w stosunku do wykresu jodku propydyny i bramkuje żywe komórki. Po ustawieniu wszystkich napięć wyreguluj kompensację i zastosuj kompensację do próbek. Następnie załaduj pierwszą probówkę z próbką, utwórz odpowiednie wykresy znaczników powierzchni komórek i zbierz co najmniej 1 000 zdarzeń z populacji będącej przedmiotem zainteresowania.

Po uruchomieniu wszystkich próbek należy wyeksportować dane dotyczące przepływu w celu dalszej analizy. I zapisz eksperyment jako szablon, aby zachować ustawienia i parametry cytometru dla podobnych eksperymentów w przyszłości. Zawartość mitochondriów w miejscu końcowym jest najniższa w podwójnie ujemnych limfocytach T jeden, szczyt w podwójnie ujemnym etapie drugim i trzecim oraz nieznaczny spadek w podwójnie ujemnym etapie czwartym.

Przy czym podwójnie dodatnie tymocyty wykazują większą liczbę mitochondriów niż pojedyncze dodatnie tymocyty CD4 i CD8, co sugeruje, że zawartość mitochondriów zmienia się podczas rozwoju. Pojedyncze dodatnie tymocyty CD4 i CD8 wykazują wyższą średnią intensywność fluorescencji mitochondriów niż limfocyty T CD4 lub CD8 śledziony, co sugeruje, że naiwne limfocyty T, które krążą w środowisku krwi bogatej w tlen, mają jeszcze niższą masę mitochondrialną niż tymocyty. Co ciekawe, to zmniejszenie zawartości mitochondriów jest bardziej widoczne w CD8 niż w linii komórek T CD4, a aktywacja limfocytów T dodatkowo zmniejsza obecność tych organelli.

Stosunkowo niską, ale wykrywalną zawartość lizosomów obserwuje się we wszystkich populacjach tymocytów, z bardziej widoczną obecnością w podwójnie ujemnych tymocytach. Na peryferiach wykrywa się stosunkowo dużą liczbę lizosomów w limfocytach T pamięci i efektorowych CD8-dodatnich. Połączenie barwników specyficznych dla organelli i markera powierzchniowego z cytometrią przepływową to skuteczny sposób na scharakteryzowanie statusu metabolicznego komórek w złożonej mieszaninie.

Dodatkowy barwnik specyficzny dla organelli może być użyty do wykrycia retikulum endoplazmatycznego, autofagicznej wakuoli lub innego interesującego przedziału wewnątrzkomórkowego.