Name: Badanie interakcji między enzymami modyfikującymi histony a czynnikami transkrypcyjnymi in vivo poprzez transfer energii rezonansu fluorescencyjnego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 33 s
Description: Poznaj metodę FRET do badania interakcji białek w żywych komórkach roślin Nicotiana benthamiana. Technika ta pozwala wizualizować oddziaływania enzymów modyfikujących histony z czynnikami transkrypcyjnymi.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca w laboratorium V.C. jest wspierana przez granty od NIH (R35GM144059 i R01GM50224), NSF (MCB1913165 i IOS1758046) oraz BARD (IS-5276-20) dla V.C.

Nicotiana benthamiana, Agrobacterium tumefaciens szczep EHA105 lub GV3101 zostały użyte w niniejszym badaniu.
1. Konstrukcja wektora FRET
<ol>
	<li>Wybierz znaczniki fluorescencyjne dla pary FRET donor/akceptor.
	<ol>
		<li>Użyj EGFP z pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N115,28 (patrz tabela materiałów), aby wygenerować wektor dawcy.</li>
		<li>Do wygenerowania wektora akceptora należy użyć mRFP z pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1 (patrz Tabela materiałów).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wygeneruj konstrukty FRET donora/akceptora przy użyciu techniki klonowania rekombinacji specyficznej dla miejsca34, takiej jak system klonowania rekombinacji Gateway35.
	<ol>
		<li>Wzmocnij sekwencje kodujące interesujących nas białek36 (tj. Arabidopsis OTLD1 i LSH10)15. 
		UWAGA: Dobrym pomysłem jest również wykorzystanie kontroli ujemnej, która reprezentuje homolog jednego z oddziałujących białek, ale nie oczekuje się, że będzie wykazywać interakcję; badanie interakcji OTLD1-LSH10 wykorzystuje homolog LSH10, LSH4, który nie rozpoznaje OTLD1. CDNA OTLD1, LSH10 i LSH4 są amplifikowane metodą PCR przy użyciu starterów wymienionych w tabeli 1.</li>
		<li>Sklonuj OTLD1, LSH10 i LSH4 do wektora wejściowego pDONR207 za pomocą techniki klonowania rekombinacji specyficznej dla miejsca34.</li>
		<li>Użyj bramki LR Clonase II (patrz tabela materiałów), aby przenieść LSH10 i LSH4 z pDONR207 do binarnego wektora docelowego pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N1 w celu wygenerowania binarnych konstruktów donorowych p35S::LSH10-GFP (testowany konstrukt) i p35S::LSH4-GFP (kontrola ujemna).</li>
		<li>Użyj tego samego dostępnego na rynku enzymu (krok 1.2.3), aby przenieść OTLD1 z pDONR207 do binarnego wektora docelowego pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1, aby wygenerować binarną konstrukcję akceptora p35S::OTLD1-mRFP (testowana konstrukcja).</li>
		<li>PCR-amplify36 mRFP z pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1 za pomocą starterów wymienionych w Tabeli 1, sklonuj go techniką klonowania rekombinacyjnego do pDONR207, a następnie użyj LR Clonase II do przeniesienia mRFP do pPZP RCS2A-DEST-EGFP-N1 w celu wygenerowania binarnego konstruktu fuzyjnego p35S::mRFP-GFP (kontrola pozytywna).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przeprowadzić transformację konstruktów dawcy i akceptora w Agrobacterium.
	<ol>
		<li>Dodać 1 μg każdego plazmidu z etapów 1.2.3-1.2.5 do 100 μl kultury właściwych komórek Agrobacterium tumefaciens szczep EHA105 lub GV3101, przygotowanych przy użyciu standardowych protokołów37 lub uzyskanych komercyjnie, i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut.</li>
		<li>Dodać 1 ml pożywki LB (1% tryptonu, 0,5% ekstraktu drożdżowego i 1% NaCl; patrz tabela materiałów) do właściwej mieszaniny komórek i mieszać przy 200 obr./min i 28 ° C przez 1,5 godziny. Zebrać komórki przez odwirowanie w temperaturze 3 000 × g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Zawiesić komórki w 0,1 ml pożywki LB przez pipetowanie i rozprowadzić je na agarze LB uzupełnionym odpowiednimi antybiotykami (np. 0,01% spektynomycyny i 0,005% ryfampicyny; patrz tabela materiałów). Rośnie w temperaturze 28 °C przez 2 dni.</li>
		<li>Wybierz poszczególne kolonie i zaszczep każdą z nich osobno w 1 ml bulionu LB uzupełnionego odpowiednimi antybiotykami.</li>
		<li>Hodować komórki w temperaturze 28 °C przez 24 godziny i przenieść 0,2 ml kultury do nowej probówki. Zebrać komórki przez odwirowanie w stężeniu 10 000 × g przez 30 s w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Ekstrahować plazmidowe DNA za pomocą standardowego protokołu izolowania plazmidów z komórek Agrobacterium38 i ponownie zawiesić wyekstrahowane DNA w 30 μl wody. Aby zidentyfikować kolonie zawierające pożądane plazmidy, należy użyć 2 μl preparatu DNA jako matrycy do PCR ze starterami specyficznymi dla genu wymienionymi w tabeli 1. Zmieszać 0,7 ml zidentyfikowanej kultury z 0,3 ml glicerolu i przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Agroinfiltracja
<ol>
	<li>Uprawa roślin Nicotiana benthamiana. 
	UWAGA: Podczas całego eksperymentu wszystkie rośliny muszą być zdrowe.
	<ol>
		<li>Siej i hoduj nasiona N. benthamiana w doniczce zawierającej mokrą glebę o dużej gęstości.</li>
		<li>Umieść posadzone nasiona w komorze wzrostowej ustawionej na 23 °C z 16 godzinami światła i 8 godzinami ciemnego cyklu o natężeniu światła 150-170 μmol/m2s, aż średnica eufilu osiągnie 0,5 cm.</li>
		<li>Przenieś sadzonki do większych doniczek i pozwól im rosnąć w tej samej komorze o tych samych parametrach. 
		UWAGA: Rośliny są gotowe do agroinfiltracji, gdy ich największe liście osiągną średnicę 5-7 cm, zwykle w ciągu 4-5 tygodni. W przypadku mniejszych roślin, które są zbyt młode, skutki agroinfiltracji będą zbyt dotkliwe dla analizy FRET.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj komórki bakteryjne do agroinfiltracji.
	<ol>
		<li>Każdą kolonię Agrobacterium zawierającą konstrukty FRET hodować przez noc w 5 ml pożywki LB uzupełnionej odpowiednimi antybiotykami (etap 1.3.3) i 150 μM acetosyringonu w temperaturze 28 °C (patrz tabela materiałów).</li>
		<li>Odwirować komórki w temperaturze 3 000 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Zawiesić komórki w buforze agroinfiltracyjnym (10 mM MgCl2, 10 mM MES pH 5,6, 150 μM acetosyringonu) do OD600 = 0,5.</li>
		<li>Połączyć zawieszone ogniwa w stosunku 1:1 v/v między komórkami, w których znajdują się odpowiednie konstrukty (krok 2.2.5).</li>
		<li>W przypadku agroinfiltracji o podwójnym konstrukcie należy zmieszać podwielokrotności dwóch kultur, a w przypadku agroinfiltracji o pojedynczym konstrukcie wymieszać podwielokrotności tej samej kultury:
		<ol>
			<li>Badane białka: OTLD1-mRFP + LSH10-GFP (bakterie będące nosicielami konstruktów p35S::OTLD1-mRFP i p35S::LSH10-GFP).</li>
			<li>Kontrola negatywna: OTLD1-mRFP + LSH4-GFP (bakterie będące nosicielami konstruktów p35S::OTLD1-mRFP i p35S::LSH4-GFP).</li>
			<li>Kontrola ujemna: LSH10-GFP + wolne mRFP (bakterie zawierające konstrukty p35S::LSH10-GFP i pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-C1).</li>
			<li>Kontrola pozytywna: mRFP-GFP (bakterie przenoszące konstrukt p35S::mRFP-GFP).</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Inkubować komórki w temperaturze 28 °C przez 0,5-1 h.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj agroinfiltrację.
	<ol>
		<li>Załaduj kulturę bakteryjną do strzykawki bezigłowej o pojemności 1 ml.</li>
		<li>Delikatnie, ale stanowczo dociśnij dyszę strzykawki do strony abaksjalnej w pełni rozwiniętych liści N. benthamiana, przytrzymując liść palcem w rękawiczce po stronie przyosiowej.</li>
		<li>Naciekaj do czterech plamek na liściu, trzech liści na roślinę, dwóch lub trzech roślin na każdą kulturę bakteryjną. Zmieniaj rękawice między próbkami, aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu.</li>
		<li>Rośliny z agroinfiltracją należy utrzymywać w tej samej komorze wzrostowej w tych samych warunkach, jak opisano w kroku 2.1.2, przez 24 do 36 godzin. Nie należy trzymać agroinfiltracji roślin dłużej niż 36 godzin, ponieważ zmniejszy to sygnał fluorescencji.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Mikroskopia konfokalna
<ol>
	<li>Przygotuj preparaty mikroskopowe do wizualizacji fluorescencji.
	<ol>
		<li>Po 24-36 godzinach od infiltracji za pomocą żyletki pokrój każdy agroinfiltrowany liść na małe kawałki (2 mm x 4 mm) między nerwami.</li>
		<li>Umieść kawałki liści na szkiełku podstawowym powierzchnią liścia do góry. Umieść kroplę wody na kawałkach liści i przykryj je szkłem nakrywkowym. Lekko postukaj w szkło nakrywkowe, aby usunąć pęcherzyki powietrza.</li>
		<li>Włącz mikroskop i laser (patrz Tabela materiałów). Umieść szkiełko w uchwycie stolika mikroskopu w celu obrazowania pod określonymi parametrami FRET (kroki 3.2 i 3.3).</li>
		<li>Rozpocznij obserwacje za pomocą soczewki obiektywowej 10x, aby zidentyfikować komórki, które wykazują zarówno sygnały GFP, jak i mRFP, a następnie użyj soczewki obiektywowej 40x do kolejnych szczegółowych obserwacji. 
		UWAGA: Co ważne, SE-FRET i AB-FRET są zwykle wykonywane na tej samej próbce tkanki, co pozwala na użycie tych samych ustawień kanału (krok 3.2), z wyjątkiem kanału FRET, który jest włączany/wyłączany odpowiednio dla obserwacji SE-FRET i AB-FRET (kroki 3.2.2.3 i 3.3.1).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ustaw parametry dla SE-FRET (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A).
	<ol>
		<li>Otwórz narzędzie Akwizycja wielowymiarowa (MDA).</li>
		<li>Ustal zestaw trzech kanałów konfokalnych w tym samym polu view (Rysunek uzupełniający 1).
		<ol>
			<li>Ustaw kanał donorowy (kanał GFP) do wzbudzenia i emisji fluorochromu donorowego za pomocą lasera wzbudzającego 405 nm i filtra emisyjnego 400-597 nm.</li>
			<li>Ustaw kanał akceptorowy (kanał mRFP) dla wzbudzenia i emisji fluorochromu akceptora za pomocą lasera wzbudzającego 561 nm i filtra emisyjnego 400-597 nm. 
			UWAGA: Filtr emisyjny dla mRFP został ustawiony na 400-597 nm, aby oddzielić sygnał mRFP od sygnału FRET przy 597-617 nm (krok 3.2.2.3), a tym samym zmniejszyć emisję mRFP niezależną od FRET.</li>
			<li>Ustawić kanał FRET do wzbudzenia donora i emisji fluorochromów akceptorowych za pomocą lasera wzbudzającego 405 nm i filtra emisyjnego 597-617 nm.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Ustaw intensywność wzbudzenia dawcy na minimalnym poziomie, aby obserwować FRET, unikając fotowybielania, zmniejszając wydajność SE-FRET. 
		UWAGA: Ta intensywność wzbudzenia jest wybierana eksperymentalnie przed przeprowadzeniem procedury FRET, aby uniknąć fotowybielania. Różni się w zależności od grubości liści, wieku i czasu po nadekspresji.</li>
		<li>Pobudź dawcę i zeskanuj w poszukiwaniu komórek zawierających oczekiwany sygnał fluorescencyjny akceptora.</li>
		<li>Wybierz obszar, który zawiera interesujący Cię sygnał fluorescencji.</li>
		<li>Uzyskaj sekwencję obrazów SE-FRET, naciskając przycisk Snap.
		<ol>
			<li>Wyobraź sobie najpierw 10-15 komórek wyrażających konstrukt mRFP-GFP (kontrola pozytywna); dostosuj parametry ostrości, zoomu i inteligentnego wzmocnienia, aby ustawić ostrość na obszarze zainteresowania, który ma zostać uchwycony (rysunek uzupełniający 2).</li>
			<li>Korzystając z tych samych ustawień, zobrazuj 10-15 komórek, z których każda wyraża OTLD1-mRFP, wolny mRFP, LSH10-GFP lub LSH4-GFP oddzielnie. 
			UWAGA: Obrazy te są pozyskiwane za pomocą wtyczki "PixFRET" programu ImageJ (patrz tabela materiałów), która została użyta do analiz danych FRET (krok 3.4.1) w celu określenia wartości widma przebijania (SBT) dla akceptorów i dawców; obrazy te są wykorzystywane przez oprogramowanie do generowania obrazów SE-FRET dla par białek OTLD1-mRFP + LSH10-GFP, OTLD1-mRFP + LSH4-GFP i LSH10-GFP + wolnych par białek mRFP (krok 3.2.6.3).</li>
			<li>Ponadto, korzystając z tych samych ustawień, zobrazuj 10-15 komórek z koekspresją OTLD1-mRFP + LSH10-GFP, OTLD1-mRFP + LSH4-GFP i LSH10-GFP + wolnych par białek mRFP.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ustaw parametry dla AB-FRET (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B).
	<ol>
		<li>Użyj parametrów kanału donora i akceptora ustawionych dla SE-FRET (krok 3.2.2), ale wyłącz kanał FRET.</li>
		<li>Ustawić parametry fotowybielania akceptora (mRFP) (rysunek uzupełniający 3).
		<ol>
			<li>Upewnij się, że wybielanie rozpoczyna się po pięciu obrazach. Zezwalaj na 200 iteracji dla każdego wybielacza obszarowego. Utrzymuj 100% intensywność lasera przy długości fali 561 nm.</li>
			<li>Utrzymuj czas wybielania wynoszący 45 s. Upewnij się, że prędkość skanowania wynosi 512 x 512 pikseli przy 400 Hz.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Narysuj obszar komórki, który ma zostać wybielony; na przykład w przypadku oddziaływań jądrowych obszary zainteresowania są rysowane wokół całego obszaru jądra komórkowego39.</li>
		<li>Aktywuj wybielanie, naciskając przycisk Start eksperymentu; aktywacja tej funkcji spowoduje wykonanie fotowybielania i uzyskanie sekwencji obrazów AB-FRET.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przeanalizuj dane FRET.
	<ol>
		<li>Do analizy danych SE-FRET należy użyć wtyczki "PixFRET" do oprogramowania ImageJ, aby wygenerować skorygowane obrazy wydajności SE-FRET po odjęciu SBT40 (krok 3.2.6.2).</li>
		<li>Aby przeanalizować dane AB-FRET, oblicz %AB-FRET jako procentowy wzrost emisji GFP po fotowybielaniu mRFP, korzystając z następującego wzoru41: %AB-FRET = [(GFPpost - GFPpre) / GFPpre] x 100, gdzie GFPpost to emisja GFP po fotowybielaniu mRFP, a GFPpre to emisja GFP przed fotowybielaniem mRFP.</li>
		<li>Przeglądając obrazy FRET, zwróć uwagę na subkomórkową lokalizację sygnału FRET. 
		UWAGA: W wielu przypadkach te przedziały komórkowe (np. jądro, chloroplasty, ER itp.) można łatwo zidentyfikować i, jako dodatkową korzyść z techniki FRET, dostarczyć ważnych wskazówek na temat biologicznej funkcji oddziałujących białek.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Ten protokół FRET jest prosty i łatwy do odtworzenia; Wymaga również minimalnych inwestycji w zaopatrzenie i wykorzystuje standardowe wyposażenie wielu nowoczesnych laboratoriów. W szczególności pięć głównych cech technicznych wyróżnia wszechstronność tej procedury. Po pierwsze, konstrukty FRET są generowane przy użyciu rekombinacji specyficznej dla miejsca, podejścia do klonowania, które jest łatwe w użyciu, daje dokładne wyniki i oszczędza czas w porównaniu z tradycyjnym klonowaniem opartym na enzymach restrykcyjnych. ...

Roślinne deubikwitynazy histonowe odgrywają ważną rolę w kontrolowaniu ekspresji genów poprzez posttranslacyjną modyfikację histonów, a konkretnie poprzez usuwanie ich śladów monoubikwitylacji1. Jak dotąd, OTLD1 jest jedną z niewielu roślinnych deubikwitynaz histonów scharakteryzowanych na poziomie molekularnym u Arabidopsis2,3. OTLD1 usuwa grupy monoubikwityny z cząsteczek histonu H2B, promując w ten sposób usuwanie lub dodawanie euchromatycznych modyfikacji acetylacji i metylacji histonów H3 w docelowym genie chromatyny4,5. Co więcej, OTLD1 oddziałuje z innym enzymem modyfikującym chromatynę, demetylazą lizyny histonowej KDM1C, wpływając na supresję transkrypcji docelowych genów6,7.
Większość enzymów modyfikujących histony nie ma zdolności wiązania DNA, a tym samym nie może bezpośrednio rozpoznać swoich docelowych genów. Jedną z możliwości jest to, że współpracują one z białkami czynnika transkrypcyjnego wiążącego DNA, które wiążą te enzymy i kierują je do ich docelowych chromatyny. W szczególności w roślinach kilka głównych enzymów modyfikujących histony (tj. metylotransferazy histonów8,9, acetylotransferazy histonów10, demetylazy histonowe11, oraz kompleksy represyjne Polycomb12,13,14) są znane z tego, że są rekrutowane przez czynniki transkrypcyjne. Zgodnie z tą ideą, niedawno zaproponowano jeden z możliwych mechanizmów rekrutacji OTLD1 do docelowych promotorów, który opiera się na specyficznych interakcjach białko-białko OTLD1 z czynnikiem transkrypcyjnym LSH1015.
LSH10 należy do rodziny białek roślinnych ALOG (Arabidopsis LSH1 i Oryza G1), które funkcjonują jako centralne regulatory rozwoju16,17,18,19,20,21,22. Fakt, że członkowie rodziny białek ALOG zawierają motywy wiążące DNA23 i wykazują zdolności do regulacji transkrypcji22, nuclear localization19, and homodimerization24 dodatkowo wspiera pogląd, że te białka, w tym LSH10, mogą działać jako specyficzne czynniki transkrypcyjne podczas epigenetycznej regulacji transkrypcji. Jedną z głównych technik eksperymentalnych stosowanych do scharakteryzowania oddziaływania LSH10-OTLD1 in vivo jest transfer energii rezonansu fluorescencyjnego (FRET)15.
FRET to technika obrazowania do bezpośredniego wykrywania oddziaływań bliskiego zasięgu między białkami w odległości <10 nm od siebie25 wewnątrz żywych komórek. Istnieją dwie główne odmiany podejścia FRET<klasa sup="xref">26: emisja uczulona (SE-FRET) (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A) i bielenie akceptorowe (AB-FRET) (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B). W SER-FRET oddziałujące białka - z których jedno jest oznaczone fluorochromem donorowym (np. zielone białko fluorescencyjne, GFP), a drugie fluorochromem akceptorowym (np. monomeryczne białko czerwonej fluorescencji, mRFP27,28) - nieradiacyjnie przenoszą energię stanu wzbudzonego od dawcy do akceptora. Ponieważ podczas tego transferu nie są emitowane żadne fotony, wytwarzany jest sygnał fluorescencyjny, który ma widmo emisji radiacyjnej podobne do widma akceptora. W AB-FRET interakcje białkowe są wykrywane i określane ilościowo na podstawie podwyższonej emisji radiacyjnej dawcy, gdy akceptor jest trwale dezaktywowany przez fotowybielanie, a zatem nie jest w stanie odebrać energii nieradiacyjnej przekazywanej od dawcy (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1). Co ważne, subkomórkowe umiejscowienie fluorescencji FRET wskazuje na lokalizację oddziałujących białek w komórce.
Zdolność do zastosowania FRET w żywych tkankach i określenia subkomórkowej lokalizacji oddziałujących białek jednocześnie z wykrywaniem tej interakcji per se, sprawia, że FRET jest techniką wyboru do badań i wstępnej charakterystyki interakcji białko-białko in vivo. Porównywalna metodologia obrazowania fluorescencyjnego in vivo, dwucząsteczkowa komplementacja fluorescencji (BiFC)29,30,31,32, jest dobrym alternatywnym podejściem, chociaż w przeciwieństwie do FRET, BiFC może dawać wyniki fałszywie dodatnie z powodu spontanicznego montażu autofluorescencyjnego BiFC reporters33, a kwantyfikacja jego danych jest mniej precyzyjna.
Ten artykuł dzieli się udanymi doświadczeniami w implementacji technik SE-FRET i AB-FRET oraz przedstawia protokół ich wdrożenia do badania interakcji między OTLD1 i LSH10 w komórkach roślinnych.

<table><tbody><tr><td>Acetosyringon (3&,5&prime;-Dimethoxy-4&prime;-hydroksyacetofenon)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#D134406-1G</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>BD Biosciences</td><td>#214010</td><td></td></tr><tr><td>Bacto trypton</td><td>BD Biosciences</td><td>#211705</td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt z drożdży Bacto</td><td>BD Biosciences</td><td>#212750&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Konfokalny laserowy mikroskop skaningowy (CLSM)</td><td>Zeiss</td><td>LSM900</td><td>Odpowiedni jest każdy CLSM o podobnych możliwościach</td></tr><tr><td>EHA105</td><td>VWR</td><td>104013-310</td><td>Używamy kolby z kolekcji laboratorium bakteryjnego Citovsky</td></tr><tr><td>Gateway BP Clonase II&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>#11789100</td><td></td></tr><tr><td>Gateway LR Clonase II</td><td>Invitrogen</td><td>#11791020</td><td></td></tr><tr><td>GV3101</td><td>VWR</td><td>104013-296</td><td>Używamy kolby z kolekcji laboratorium bakteryjnego Citovsky</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td></td><td>https://imagej.nih.gov/ij/download.html</td></tr><tr><td>MES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#69889-10G</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#63068-250G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#S5886-500G</td><td></td></tr><tr><td>Nicotiana benthamiana nasiona</td><td>Herbalistics Pty</td><td>RA4 lub LAB</td><td>Używamy zapasów z kolekcji Citovsky seed lab</td></tr><tr><td>pDONR207</td><td>Invitrogen</td><td>#12213013</td><td></td></tr><tr><td>pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N1&nbsp;</td><td>Nie dotyczy</td><td></td><td>Refs. 15, 28</td></tr><tr><td>pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-C1</td><td>N/A</td><td></td><td>Wygenerowane na podstawie konstrukcji pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-C1 (patrz ref. 15, 28)</td></tr><tr><td>pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1&nbsp;</td><td>Nie dotyczy</td><td></td><td>Wygenerowano na podstawie konstruktu pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N1</td></tr><tr><td>Rifampicin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#R7382-5G</td><td></td></tr><tr><td>Spectinomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#S4014-5G</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawki bez igieł</td><td>Oprogramowanie BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>Zen do obrazowania CLSM</td><td>Wersja Zeiss</td><td>ZEN 3.0</td><td>Oprogramowanie powinno być kompatybilne z używanym CLSM</td></tr></tbody></table>

badanie interakcji między enzymami modyfikującymi histony a czynnikami transkrypcyjnymi in vivo poprzez transfer energii rezonansu fluorescencyjnego

Investigating Interactions Between Histone Modifying Enzymes and Transcription Factors in vivo by Fluorescence Resonance Energy Transfer

Epigenetyczna regulacja ekspresji genów jest często zakłócana przez enzymy modyfikujące histony (HME), które generują heterochromatyczne lub euchromatyczne znaczniki histonowe odpowiednio do represji lub aktywacji transkrypcji. HME są rekrutowane do docelowej chromatyny przez czynniki transkrypcyjne (TF). W związku z tym wykrywanie i charakteryzowanie bezpośrednich interakcji między wymiennikami HME i TF ma kluczowe znaczenie dla lepszego zrozumienia ich funkcji i specyficzności. Badania te byłyby bardziej istotne z biologicznego punktu widzenia, gdyby były przeprowadzane in vivo w żywych tkankach. W tym miejscu opisano protokół wizualizacji interakcji w liściach roślin między roślinną deubikwitynazą histonową a roślinnym czynnikiem transkrypcyjnym za pomocą transferu energii rezonansu fluorescencyjnego (FRET), który umożliwia wykrywanie kompleksów między cząsteczkami białka, które znajdują się w odległości <10 nm od siebie. Przedstawiono dwie odmiany techniki FRET: SE-FRET (emisja uczulona) i AB-FRET (bielenie akceptorowe), w której energia jest przenoszona nieradiacyjnie od dawcy do akceptora lub emitowana promieniowo przez dawcę podczas fotowybielania akceptora. Zarówno metody SE-FRET, jak i AB-FRET można łatwo dostosować do odkrywania innych interakcji między innymi białkami w roślinie.

Rysunek 2 przedstawia typowe wyniki eksperymentu SE-FRET, w którym jądra komórkowe rejestrowano jednocześnie w trzech kanałach (tj. donora GFP, akceptora mRFP oraz SE-FRET). Dane te posłużyły do wygenerowania obrazów wydajności SE-FRET zakodowanych w skali pseudokolorów. W tej skali przejście od koloru niebieskiego do czerwonego odpowiada wzrostowi wydajności FRET, która jest miarą bliskości białko-białko w zakresie od 0% do 100%. W tym reprezentatywnym eksperymencie sygnał SE-FRET zarejestr...

Transfer energii rezonansu fluorescencji (FRET) to technika obrazowania służąca do wykrywania interakcji białek w żywych komórkach. W tym miejscu przedstawiono protokół FRET w celu zbadania związku enzymów modyfikujących histony z czynnikami transkrypcyjnymi, które rekrutują je do docelowych promotorów w celu epigenetycznej regulacji ekspresji genów w tkankach roślinnych.

Badanie interakcji między enzymami modyfikującymi histony a czynnikami transkrypcyjnymi in vivo poprzez transfer energii rezonansu fluorescencyjnego

Epigenetic regulation of gene expression is commonly affected by histone modifying enzymes (HMEs) that generate heterochromatic or euchromatic histone ...

Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na pytania dotyczące interakcji białko-białko, pozwoli nam bezpośrednio wykryć dwa białka znajdujące się w odległości 10 nanometrów od siebie wewnątrz żywej komórki. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest prosta i łatwa do odtworzenia. Wymaga również prostych materiałów, które są dostępne w wielu nowoczesnych laboratoriach.Środek ten może być stosowany z dowolną żywą tkanką lub komórką hodowlaną, która przejściowo rozprzestrzenia się w białku będącym przedmiotem zainteresowania. Jeśli używasz tej techniki po raz pierwszy, zaleca się, aby najpierw użyć kontroli pozytywnej i kontroli negatywnej do przetestowania systemu. Na początek siej nasiona Nicotiana benthamiana w doniczce zawierającej mokrą glebę o dużej gęstości.Trzymaj posadzone nasiona w komorze wzrostowej ustawionej na 23 stopnie Celsjusza. Gdy średnica eufilu osiągnie od 0,3 do 0,5 centymetra, przenieś sadzonki do większych doniczek i pozwól im rosnąć w tej samej komorze o tych samych parametrach. Następnie przygotuj komórki bakteryjne do agroinfiltracji, zaszczepiając każdą kolonię agrobacterium zawierającą konstrukty FRET w pięciu mililitrach pożywki LB uzupełnionej antybiotykami i 150 mikromolowym acetosyringonem.Inkubuj kulturę przez noc w temperaturze 28 stopni Celsjusza. Po inkubacji odwirować komórki w temperaturze 3 000 G przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Ponownie zawiesić komórki w buforze agroinfiltracji do OD 600 0,5.W przypadku podwójnej agroinfiltracji konstruktu, połącz zawieszone komórki w stosunku objętościowym jeden do jednego z komórkami zawierającymi odpowiednie konstrukty. Inkubować komórki w temperaturze 28 stopni Celsjusza przez 30 minut do jednej godziny. Aby przeprowadzić agroinfiltrację, załaduj kulturę bakteryjną do jednomililitrowej strzykawki bezigłowej.Delikatnie, ale stanowczo, dociśnij dyszę strzykawki do strony abaksjalnej w pełni rozwiniętych liści Nicotiana benthamiana, trzymając liść palcem w rękawiczce po stronie adaksjalnej. Naciekaj do czterech plamek na liściu, trzech liści na roślinę i dwóch lub trzech roślin na każdą kulturę bakteryjną. Utrzymuj agroinfiltrowane rośliny w tej samej komorze wzrostowej w tych samych warunkach, jak opisano wcześniej, przez 24 do 36 godzin.Po 24 do 36 godzinach infiltracji użyj żyletki, aby pociąć każdy agroinfiltrowany liść na małe kawałki o długości od dwóch do czterech milimetrów między żyłami. Umieść kawałki liści na szkiełku podstawowym powierzchnią liścia do góry. Umieść kroplę wody na kawałkach liści i przykryj je szkłem nakrywkowym.Lekko postukaj w szkło nakrywkowe, aby usunąć pęcherzyki powietrza. Następnie włącz mikroskop i laser. Umieść szkiełko w uchwycie stolika mikroskopu.Aby skonfigurować parametry dla SE-FRET, otwórz narzędzie do akwizycji wielowymiarowej. Następnie ustaw kanał donorowy na wzbudzenie i emisję donorowego fluorochromu GFP przy laserze wzbudzającym 405 nanometrów i filtrze emisyjnym na 400 do 597 nanometrów. Ustaw kanał akceptorowy dla wzbudzenia i emisji akceptora fluorochromu mRFP oraz laser wzbudzający o długości 561 nanometrów i filtr emisyjny o długości od 400 do 597 nanometrów.Ustaw kanał FRET do wzbudzenia donora i emisji fluorochromów akceptorowych za pomocą lasera wzbudzającego o długości 405 nanometrów i filtra emisyjnego o długości od 597 do 617 nanometrów. Ustaw intensywność wzbudzenia dawcy na minimalnym poziomie, aby obserwować FRET, unikając fotowybielania. Pobudź dawcę i zeskanuj w poszukiwaniu komórek zawierających oczekiwany sygnał fluorescencyjny akceptora.Wybierz obszar, który zawiera interesujący Cię sygnał fluorescencji. Uzyskaj sekwencję obrazów SE-FRET, naciskając przycisk przyciągania. Aby skonfigurować parametry dla AB-FRET, użyj parametrów kanału dawcy i akceptora ustawionych dla SE-FRET, ale wyłącz kanał FRET.Następnie przygotuj się do ustawienia parametrów fotowybielania akceptora mRFP. Upewnij się, że wybielanie rozpoczyna się po pięciu obrazach. Zezwalaj na 200 iteracji dla każdego wybielacza obszarowego.Utrzymuj 100% intensywność lasera na poziomie 561 nanometrów. Utrzymuj czas wybielania wynoszący 45 sekund. Upewnij się, że prędkość skanowania wynosi 512 na 512 pikseli przy 400 hercach.Wyszukaj i narysuj obszar komórki, który ma zostać wybielony, a następnie aktywuj wybielanie, naciskając przycisk rozpoczęcia eksperymentu. W przypadku kontroli pozytywnej, po pięciu obrazach, rozpoczyna się bielenie, a obszar zainteresowania zmienia kolor na zielony. Sprawdź średni zwrot z inwestycji, aby potwierdzić, że intensywność mRFP maleje, podczas gdy GFP rośnie.Alternatywnie, sprawdź układ, który pokazuje, że mRFP bielił, a GFP wzrastał. Do analizy danych SE-FRET należy użyć oprogramowania ImageJ. Otwórz obrazy i utwórz stos tylko dawców.Zapisz obrazy w ośmiobitowym formacie jako plik TIF. Podobnie utwórz stos tylko dla osoby akceptującej, a następnie utwórz połączony stos darczyńcy i osoby akceptującej. Następnie użyj wtyczki PixFRET, aby wygenerować obrazy wydajności SE-FRET.Otwórz utworzone stosy i wygeneruj skorygowane obrazy FRET po odjęciu przebijania spektralnego. Przedstaw obraz jako obraz pseudokolorowy. Aby przeanalizować dane AB-FRET, oblicz procent AB-FRET jako procentowy wzrost emisji GFP po fotowybielaniu mRFP przy użyciu tego wzoru.Specyficzne oddziaływanie białko-białko deubikwitynazy histonowej OTLD1 z czynnikiem transkrypcyjnym LSH10 badano za pomocą SE-FRET. Jądra komórkowe były jednocześnie rejestrowane w trzech kanałach i wygenerowano skalę pseudokolorów, aby zobrazować wydajność SE-FRET. Przejście z koloru niebieskiego na czerwony odpowiada wzrostowi wydajności FRET i bliskości białko-białko.Intensywność SE-FRET po koekspresji LSH10 i OTLD1 była porównywalna z obserwowaną dla mRFP-GFP kontroli pozytywnej. Nie zaobserwowano SE-FRET w kontrolach ujemnych, takich jak koekspresja OTLD1, mRFP i LSH4-GFP lub wolne mRFP i LSH10-GFP. Obrazy AB-FRET wykazały, że koekspresja LSH10-GFP i OTLD1-mRFP powodowała zwiększoną fluorescencję donora GFP po fotowybielaniu akceptora RFP.Podobny wzrost fluorescencji dawcy zaobserwowano w kontroli pozytywnej, ale nie w kontrolach ujemnych, gdy fluorescencja akceptorowa była inaktywowana. Analiza ilościowa danych AB-FRET wykazała statystycznie istotny wzrost fluorescencji donorów po koekspresji LSH10 i OTLD1. Kontrola pozytywna wytworzyła procent AB-FRET wynoszący około 30%, podczas gdy kontrole ujemne nie wytworzyły żadnego.SE-FRET i AB-FRET wykazały sygnał w jądrze komórkowym zgodny z subkomórkową lokalizacją kompleksów enzymatycznych modyfikujących histony czynnika transkrypcyjnego, a także nukleocytoplazmatycznym charakterem białek GFP-MRFP. Najważniejszą rzeczą, o której należy pamiętać przed zastosowaniem protokołu, jest przeprowadzenie testu na odpowiedniej parze ekspresji akceptora dawcy w zależności od modelu nanoskopii konfokalnej. Po uruchomieniu i wykonaniu naszej iteracji otrzymanie wyników zajmuje tylko 24 do 36 godzin.Po obejrzeniu tego filmu należy dobrze zrozumieć, jak używać techniki FRET do badania interakcji białko-białko.

investigating-interactions-between-histone-modifying-enzymes

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Niniejszy protokół opisuje sposób obrazowania oddziaływań białko-białko z wykorzystaniem testu bliskości opartego na FRET.

Obrazowanie oddziaływań białko-białko in vivo

Opisujemy metody fotowybielania, w tym Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) oraz Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP), służące do monitorowania dynamiki białek chromatyny w embrionalnych komórkach macierzystych (ES). Dynamika białek chromatyny, uznawana za jeden ze sposobów badania plastyczności chromatyny, jest zwiększona w komórkach pluripotencjalnych.

Analizy fotoblaknięcia (FRAP i FLIP) do pomiaru dynamiki białek chromatyny w żywych embrionalnych komórkach macierzystych

Ten film opisuje wysoce wydajną anizotropię fluorescencji, która pomaga monitorować interakcję między czynnikami transkrypcyjnymi a DNA. Test monitoruje interakcje cząsteczki DNA znakowanej fluoroforem z jej specyficznym czynnikiem transkrypcyjnym, mierząc stopień polaryzacji spowodowanej rotacją molekularną lub anizotropią DNA znakowanego fluoroforem.

Anizotropia fluorescencyjna w celu określenia powinowactwa wiązania czynnika transkrypcyjnego i DNA

Interakcje między białkami są fundamentalne dla wszystkich procesów komórkowych. Korzystając z transferu energii rezonansu bioluminescencyjnego, można monitorować interakcję między parą białek w żywych komórkach i w czasie rzeczywistym. Ponadto można ocenić skutki potencjalnie patogennych mutacji.

Badanie interakcji białko-białko w żywych komórkach za pomocą transferu energii rezonansu bioluminescencyjnego

Immunoprecypitacja chromatyny to potężna technika identyfikacji miejsc wiązania DNA białek Arabidopsis in vivo. Procedura ta obejmuje sieciowanie i fragmentację chromatyny, immunoprecypitację selektywnymi przeciwciałami przeciwko białku będącemu przedmiotem zainteresowania oraz analizę qPCR związanego DNA. Opisujemy prosty test ChIP zoptymalizowany dla roślin Arabidopsis.

Test immunoprecypitacji chromatyny do identyfikacji interakcji białko-DNA Arabidopsis in vivo

Regulacja środowiska chromatyny jest niezbędnym procesem niezbędnym do prawidłowej ekspresji genów. W tym miejscu opisujemy metodę kontrolowania ekspresji genów poprzez rekrutację maszynerii modyfikującej chromatynę w sposób specyficzny dla genu i odwracalny.

Tłumienie transkrypcji genów poprzez przekierowywanie maszynerii komórkowej za pomocą chemicznych modyfikatorów epigenetycznych

Tutaj prezentujemy nowatorską metodę określania powinowactwa wiązania w równowadze i w roztworze z wysoką czułością na dużą skalę. Poprawia to analizę ilościową wiązania czynnika transkrypcyjnego z DNA. Metoda opiera się na zautomatyzowanych pomiarach anizotropii fluorescencji w kontrolowanym systemie dostarczania.

Pomiar wysokiej czułości powinowactwa wiązania czynnika transkrypcyjnego z DNA za pomocą miareczkowania kompetencyjnego przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej

Immunoprecypitacja chromatyny (ChIP) jest potężnym narzędziem do zrozumienia molekularnych mechanizmów regulacji genów. Metoda ta wiąże się jednak z trudnościami w uzyskaniu powtarzalnej fragmentacji chromatyny przez mechaniczne ścinanie. W tym miejscu przedstawiamy ulepszony protokół testu ChIP z wykorzystaniem trawienia enzymatycznego.

Test immunoprecypitacji chromatyny z wykorzystaniem nukleaz mikrokokowych w komórkach ssaków

Ta metoda jest przeznaczona do śledzenia tworzenia domen chromatyny za pośrednictwem PRC2 w liniach komórkowych, a metoda może być dostosowana do wielu innych systemów.

Metoda badania tworzenia się de novo domen chromatyny

Ten protokół skupia się na przygotowaniu chromatyny z zamrożonych tkanek i nadaje się do sieciowania immunoprecypitacji chromatyny (X-ChIP), a następnie analizy ilościowej PCR (X-ChIP-qPCR) lub sekwencjonowania nowej generacji (X-ChIP-seq).

Ekstrakcja chromatyny z zamrożonej chimerycznej tkanki wątroby do analizy immunoprecypitacji chromatyny

Poznaj metodę FRET do badania interakcji białek w żywych komórkach roślin Nicotiana benthamiana. Technika ta pozwala wizualizować oddziaływania enzymów modyfikujących histony z czynnikami transkrypcyjnymi.

Badanie interakcji między enzymami modyfikującymi histony a czynnikami transkrypcyjnymi in vivo poprzez transfer energii rezonansu fluorescencyjnego (Wideo) | JoVE Journal

Badanie interakcji między enzymami modyfikującymi histony a czynnikami transkrypcyjnymi in vivo poprzez transfer energii rezonansu fluorescencyjnego

Przeglądaj więcej filmów