Badanie interakcji między enzymami modyfikującymi histony a czynnikami transkrypcyjnymi in vivo poprzez transfer energii rezonansu fluorescencyjnego

Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na pytania dotyczące interakcji białko-białko, pozwoli nam bezpośrednio wykryć dwa białka znajdujące się w odległości 10 nanometrów od siebie wewnątrz żywej komórki. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest prosta i łatwa do odtworzenia. Wymaga również prostych materiałów, które są dostępne w wielu nowoczesnych laboratoriach.

Środek ten może być stosowany z dowolną żywą tkanką lub komórką hodowlaną, która przejściowo rozprzestrzenia się w białku będącym przedmiotem zainteresowania. Jeśli używasz tej techniki po raz pierwszy, zaleca się, aby najpierw użyć kontroli pozytywnej i kontroli negatywnej do przetestowania systemu. Na początek siej nasiona Nicotiana benthamiana w doniczce zawierającej mokrą glebę o dużej gęstości.

Trzymaj posadzone nasiona w komorze wzrostowej ustawionej na 23 stopnie Celsjusza. Gdy średnica eufilu osiągnie od 0,3 do 0,5 centymetra, przenieś sadzonki do większych doniczek i pozwól im rosnąć w tej samej komorze o tych samych parametrach. Następnie przygotuj komórki bakteryjne do agroinfiltracji, zaszczepiając każdą kolonię agrobacterium zawierającą konstrukty FRET w pięciu mililitrach pożywki LB uzupełnionej antybiotykami i 150 mikromolowym acetosyringonem.

Inkubuj kulturę przez noc w temperaturze 28 stopni Celsjusza. Po inkubacji odwirować komórki w temperaturze 3 000 G przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Ponownie zawiesić komórki w buforze agroinfiltracji do OD 600 0,5.

W przypadku podwójnej agroinfiltracji konstruktu, połącz zawieszone komórki w stosunku objętościowym jeden do jednego z komórkami zawierającymi odpowiednie konstrukty. Inkubować komórki w temperaturze 28 stopni Celsjusza przez 30 minut do jednej godziny. Aby przeprowadzić agroinfiltrację, załaduj kulturę bakteryjną do jednomililitrowej strzykawki bezigłowej.

Delikatnie, ale stanowczo, dociśnij dyszę strzykawki do strony abaksjalnej w pełni rozwiniętych liści Nicotiana benthamiana, trzymając liść palcem w rękawiczce po stronie adaksjalnej. Naciekaj do czterech plamek na liściu, trzech liści na roślinę i dwóch lub trzech roślin na każdą kulturę bakteryjną. Utrzymuj agroinfiltrowane rośliny w tej samej komorze wzrostowej w tych samych warunkach, jak opisano wcześniej, przez 24 do 36 godzin.

Po 24 do 36 godzinach infiltracji użyj żyletki, aby pociąć każdy agroinfiltrowany liść na małe kawałki o długości od dwóch do czterech milimetrów między żyłami. Umieść kawałki liści na szkiełku podstawowym powierzchnią liścia do góry. Umieść kroplę wody na kawałkach liści i przykryj je szkłem nakrywkowym.

Lekko postukaj w szkło nakrywkowe, aby usunąć pęcherzyki powietrza. Następnie włącz mikroskop i laser. Umieść szkiełko w uchwycie stolika mikroskopu.

Aby skonfigurować parametry dla SE-FRET, otwórz narzędzie do akwizycji wielowymiarowej. Następnie ustaw kanał donorowy na wzbudzenie i emisję donorowego fluorochromu GFP przy laserze wzbudzającym 405 nanometrów i filtrze emisyjnym na 400 do 597 nanometrów. Ustaw kanał akceptorowy dla wzbudzenia i emisji akceptora fluorochromu mRFP oraz laser wzbudzający o długości 561 nanometrów i filtr emisyjny o długości od 400 do 597 nanometrów.

Ustaw kanał FRET do wzbudzenia donora i emisji fluorochromów akceptorowych za pomocą lasera wzbudzającego o długości 405 nanometrów i filtra emisyjnego o długości od 597 do 617 nanometrów. Ustaw intensywność wzbudzenia dawcy na minimalnym poziomie, aby obserwować FRET, unikając fotowybielania. Pobudź dawcę i zeskanuj w poszukiwaniu komórek zawierających oczekiwany sygnał fluorescencyjny akceptora.

Wybierz obszar, który zawiera interesujący Cię sygnał fluorescencji. Uzyskaj sekwencję obrazów SE-FRET, naciskając przycisk przyciągania. Aby skonfigurować parametry dla AB-FRET, użyj parametrów kanału dawcy i akceptora ustawionych dla SE-FRET, ale wyłącz kanał FRET.

Następnie przygotuj się do ustawienia parametrów fotowybielania akceptora mRFP. Upewnij się, że wybielanie rozpoczyna się po pięciu obrazach. Zezwalaj na 200 iteracji dla każdego wybielacza obszarowego.

Utrzymuj 100% intensywność lasera na poziomie 561 nanometrów. Utrzymuj czas wybielania wynoszący 45 sekund. Upewnij się, że prędkość skanowania wynosi 512 na 512 pikseli przy 400 hercach.

Wyszukaj i narysuj obszar komórki, który ma zostać wybielony, a następnie aktywuj wybielanie, naciskając przycisk rozpoczęcia eksperymentu. W przypadku kontroli pozytywnej, po pięciu obrazach, rozpoczyna się bielenie, a obszar zainteresowania zmienia kolor na zielony. Sprawdź średni zwrot z inwestycji, aby potwierdzić, że intensywność mRFP maleje, podczas gdy GFP rośnie.

Alternatywnie, sprawdź układ, który pokazuje, że mRFP bielił, a GFP wzrastał. Do analizy danych SE-FRET należy użyć oprogramowania ImageJ. Otwórz obrazy i utwórz stos tylko dawców.

Zapisz obrazy w ośmiobitowym formacie jako plik TIF. Podobnie utwórz stos tylko dla osoby akceptującej, a następnie utwórz połączony stos darczyńcy i osoby akceptującej. Następnie użyj wtyczki PixFRET, aby wygenerować obrazy wydajności SE-FRET.

Otwórz utworzone stosy i wygeneruj skorygowane obrazy FRET po odjęciu przebijania spektralnego. Przedstaw obraz jako obraz pseudokolorowy. Aby przeanalizować dane AB-FRET, oblicz procent AB-FRET jako procentowy wzrost emisji GFP po fotowybielaniu mRFP przy użyciu tego wzoru.

Specyficzne oddziaływanie białko-białko deubikwitynazy histonowej OTLD1 z czynnikiem transkrypcyjnym LSH10 badano za pomocą SE-FRET. Jądra komórkowe były jednocześnie rejestrowane w trzech kanałach i wygenerowano skalę pseudokolorów, aby zobrazować wydajność SE-FRET. Przejście z koloru niebieskiego na czerwony odpowiada wzrostowi wydajności FRET i bliskości białko-białko.

Intensywność SE-FRET po koekspresji LSH10 i OTLD1 była porównywalna z obserwowaną dla mRFP-GFP kontroli pozytywnej. Nie zaobserwowano SE-FRET w kontrolach ujemnych, takich jak koekspresja OTLD1, mRFP i LSH4-GFP lub wolne mRFP i LSH10-GFP. Obrazy AB-FRET wykazały, że koekspresja LSH10-GFP i OTLD1-mRFP powodowała zwiększoną fluorescencję donora GFP po fotowybielaniu akceptora RFP.

Podobny wzrost fluorescencji dawcy zaobserwowano w kontroli pozytywnej, ale nie w kontrolach ujemnych, gdy fluorescencja akceptorowa była inaktywowana. Analiza ilościowa danych AB-FRET wykazała statystycznie istotny wzrost fluorescencji donorów po koekspresji LSH10 i OTLD1. Kontrola pozytywna wytworzyła procent AB-FRET wynoszący około 30%, podczas gdy kontrole ujemne nie wytworzyły żadnego.

SE-FRET i AB-FRET wykazały sygnał w jądrze komórkowym zgodny z subkomórkową lokalizacją kompleksów enzymatycznych modyfikujących histony czynnika transkrypcyjnego, a także nukleocytoplazmatycznym charakterem białek GFP-MRFP. Najważniejszą rzeczą, o której należy pamiętać przed zastosowaniem protokołu, jest przeprowadzenie testu na odpowiedniej parze ekspresji akceptora dawcy w zależności od modelu nanoskopii konfokalnej. Po uruchomieniu i wykonaniu naszej iteracji otrzymanie wyników zajmuje tylko 24 do 36 godzin.

Po obejrzeniu tego filmu należy dobrze zrozumieć, jak używać techniki FRET do badania interakcji białko-białko.