Pomiar wysokiej czułości powinowactwa wiązania czynnika transkrypcyjnego z DNA za pomocą miareczkowania kompetencyjnego przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej
7 lutego 2019
Tutaj prezentujemy nowatorską metodę określania powinowactwa wiązania w równowadze i w roztworze z wysoką czułością na dużą skalę. Poprawia to analizę ilościową wiązania czynnika transkrypcyjnego z DNA. Metoda opiera się na zautomatyzowanych pomiarach anizotropii fluorescencji w kontrolowanym systemie dostarczania.
Aby lepiej zrozumieć wiązanie czynnika transkrypcyjnego z DNA, opracowaliśmy metodę pomiaru stałych dysocjacji na dużą skalę, wykorzystując na przykład pomiary anizotropii. Technika ta pozwala na automatyczne uzyskanie pełnych krzywych miareczkowania w celu wyznaczenia stałej dysocjacji z dużą czułością. Pracuje w roztworze w równowadze, ma umiarkowaną przepustowość i duży zakres dynamiczny.
Zastosowaliśmy HiP-FA w celu udoskonalenia krajobrazu powinowactwa do wiązania czynników transkrypcyjnych. Protokół może być jednak stosowany do innych rodzajów zdarzeń wiążących, takich jak na przykład interakcje białko-białko lub białko-lek. Radzę najpierw wykonać wiele miareczkowania z tymi samymi partnerami wiążącymi, aby uzyskać oszacowanie odtwarzalności pomiarów.
Jeśli to możliwe, użyj zautomatyzowanego systemu, aby uzyskać jeszcze lepszą redukowalność. Aby wyżarzać oligomery DNA referencyjnego DNA, wymieszaj siedem mikrolitrów każdej dziesięciomilimolowej di-tagowanej do przodu i nieznakowanej wstecznej nici w jednej probówce. W przypadku DNA konkurenta wymieszaj 20 mikrolitrów każdej 100-milimolowej nieznakowanej nici w dwóch dołkach 96-dołkowej płytki PCR.
Następnie użyj standardowej maszyny do PCR, aby podgrzać roztwory DNA do 70 stopni Celsjusza przez trzy minuty. Następnie zmniejsz do temperatury pokojowej w tempie 0,1 stopnia Celsjusza na sekundę. Użyj kuchenki mikrofalowej, aby stopić 0,5 grama agarozy w 100 mililitrach buforu wiążącego.
Dodaj podwójnie destylowaną wodę, aby dostosować końcową objętość i skompensować możliwe parowanie. Przygotuj dziesięć mililitrowych porcji bulionu. Aby przygotować studzienki miareczkowania i kalibracyjne na 96-dołkowej płytce, należy przenieść dwie porcje żelu do wytrząsarki inkubatora o temperaturze 75 stopni Celsjusza.
Do każdej studzienki miareczkowania dodać 1,4 nanomola referencyjnego DNA, białka czynnika transkrypcyjnego, o końcowym stężeniu 20-60 nanomoli, 0,2 milimolowego DTT i buforu wiążącego do 240 mikrolitrów stopionego żelu. Dokładnie wymieszaj, odwracając i potrząsając probówką. Następnie powoli odpipetować 200 mikrolitrów na studzienkę żelu zawierającego DNA w wyznaczonych dołkach miareczkowania na 96-dołkowej płytce.
Do każdej studzienki kalibracyjnej dodaj 5 nanomoli niebieskiego barwnika nilowego do 240 mikrolitrów stopionego żelu. Unikając pęcherzyków powietrza, powoli odpipetuj 200 mikrolitrów roztworu żelu zawierającego barwnik w pięciu do sześciu dołkach płytki 96-dołkowej. Umieść żel na idealnie poziomej powierzchni i inkubuj przez dziesięć minut w temperaturze pokojowej i kolejne 10 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza.
Użyj wielodołkowego czytnika płytek, aby sprawdzić jednorodność poziomów wysokości żelu w różnych dołkach płytki. Aby przygotować konkurencyjny roztwór DNA, najpierw połącz znakowane referencyjne DNA, białko i trzykrotnie skoncentrowany bufor wiążący. Następnie wymieszaj 20 mikrolitrów roztworu z 40 mikrolitrami każdego z wyżarzonych roztworów DNA konkurencji.
Dla każdej studzienki kalibracyjnej należy połączyć odpowiednie ilości jednego z wyżarzonych konkurencyjnych roztworów DNA i trzykrotnie skoncentrowanego buforu wiążącego zawierającego 15-milimolowy roztwór barwnika błękitu nilowego. Na koniec dodaj 50 mikrolitrów zmieszanych roztworów konkurencji na żele tak równocześnie, jak to możliwe. Aby rozpocząć akwizycję obrazu, umieść 96-dołkową płytkę na stoliku mikroskopu.
Następnie wykonaj serie czasowe obrazów stosu Z studzienek, aż do całkowitego rozwiązania białka z referencyjnego DNA. Wykonać test miareczkowania zgodnie z manuskryptem. Następnie za pomocą oprogramowania HiP-FA utwórz krzywe miareczkowania dla poszczególnych sekwencji konkurencji.
Następnie kliknij przycisk eksportu, aby uzyskać stałą dysocjacji i stężenie aktywnego białka w każdym dołku miareczkowania. Należy zachować szczególną ostrożność podczas pipetowania lepkich roztworów żelu. Niedokładne pipetowanie może obniżyć dokładność wyznaczania stałych dysocjacji.
W tym badaniu zastosowano metodę HiP-FA w celu określenia preferencji wiązania DNA czynnika transkrypcyjnego z zamkniętą B-zipem. Gigantyczny, z sieci genów segmentacji much. Duże podobieństwo PWM dla powtórzeń przygotowanych ręcznie lub przy użyciu technik automatyzacji wykazało wysoką odtwarzalność metody HiP-FA.
PWM uzyskane tą metodą i innymi metodami są ogólnie podobne. Jednak znaczne odchylenia można zaobserwować w pozycjach drugiej i siódmej motywu rdzenia, gdzie mutacje mogą prowadzić albo do całkowitej utraty wiązania, albo do znacznie silniejszego wiązania niż w poprzednich pomiarach. Używamy HiP-FA do generowania udoskonaleń dla wiązań dziesiątek czynników transkrypcyjnych i pokazuje, że w efekcie końcowym uzyskuje się lepsze przewidywanie danych.
Uważamy, że jego miara wysokiej dokładności może być bardzo przydatna do lepszego zrozumienia wiązania TF-DNA dla całego systemu lub dla wszystkich rodzajów interakcji.
Przegląd
Niniejsza praca przedstawia nową metodę określania powinowactwa wiązania czynników transkrypcyjnych do DNA z wykorzystaniem zautomatyzowanych pomiarów anizotropii fluorescencji. Metoda HiP-FA zapewnia wysoką czułość i możliwość prowadzenia analiz na dużą skalę w roztworze w stanie równowagi.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biochemia
- Biologia molekularna
- Genetyka
Wstęp
- Zrozumienie wiązania czynników transkrypcyjnych z DNA ma kluczowe znaczenie dla regulacji genów.
- Obecne metody mogą charakteryzować się niewystarczającą czułością lub skalowalnością.
- Techniki zautomatyzowane mogą zwiększyć powtarzalność i wydajność.
- Metoda HiP-FA oferuje nowe podejście do dokładnego pomiaru stałych dysocjacji.
Cel badania
- Opracowanie metody pomiaru stałych dysocjacji na dużą skalę.
- Udoskonalenie mapy powinowactwa wiązania czynników transkrypcyjnych.
- Dostarczenie protokołu możliwego do zastosowania w różnych zdarzeniach wiązania, wykraczających poza oddziaływania TF-DNA.
Zastosowane metody
- Zautomatyzowane pomiary anizotropii fluorescencji.
- Przygotowanie oligomerów DNA i roztworów konkurencyjnego DNA.
- Użycie czytnika płytek wielodołkowych do akwizycji obrazów.
- Oprogramowanie HiP-FA do generowania krzywych miareczkowania i obliczania stałych dysocjacji.
Główne wyniki
- Metoda HiP-FA wykazała wysoką powtarzalność w pomiarach powinowactw wiązania.
- Osiągnięto doprecyzowanie preferencji wiązania dla czynnika transkrypcyjnego Giant z motywem B-zip.
- Znaczące odchylenia w powinowactwach wiązania zaobserwowano w konkretnych pozycjach motywu.
- Metoda okazała się skuteczna w przewidywaniu danych dotyczących wiązania dla wielu czynników transkrypcyjnych.
Wnioski
- HiP-FA jest cennym narzędziem do badania oddziaływań TF-DNA z wysoką dokładnością.
- Metodę tę można dostosować do różnych rodzajów oddziaływań wiążących.
- Lepsze zrozumienie powinowactwa wiązania może usprawnić badania nad regulacją genów.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ilościowy pomiar powinowactwa wiązania czynników transkrypcyjnych z DNA ma kluczowe znaczenie dla minimalizacji ryzyka podczas walidacji celu oraz optymalizacji strategii regulacji genów we wczesnej fazie odkrywania leków. Test konkurencyjnego miareczkowania HiP-FA umożliwia wysokoczułe i powtarzalne profilowanie powinowactwa w przypadku dużych paneli wariantów, co bezpośrednio wspiera pewność predykcyjną w zakresie zaangażowania celu. Możliwość ta usprawnia selekcję projektów w portfolio i dostarcza podstaw do decyzji mechanistycznych w kluczowych punktach zwrotnych w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia precyzyjne mapowanie krajobrazów specyficzności wiązania czynników transkrypcyjnych w celu funkcjonalnej walidacji celów.
- Wspiera mechanistyczną redukcję ryzyka poprzez kwantyfikację wpływu mutacji punktowych na powinowactwo wiązania.
- Zwiększa pewność prognostyczną w zakresie angażowania celu poprzez wyznaczanie bezwzględnej stałej dysocjacji (KD).
- Ułatwia selekcję portfolio poprzez rozróżnianie słabych i silnych ligandów w formacie skalowalnym.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Zapewnia zwalidowane, ilościowe krzywe miareczkowania dla każdego wariantu DNA w formacie wielodołkowej płytki.
- Umożliwia powtarzalne, wysokoczułe odczyty odpowiednie dla późniejszych etapów procesów przesiewowych.
- Standaryzuje pomiar powinowactwa w układach manualnych i zautomatyzowanych, wspierając powtarzalność testu.
- Przygotowuje wysokiej jakości dane do wiarygodnej oceny związków lub wariantów w kampaniach przesiewowych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Zgadza specyficzność wiązania in vitro z przewidywaniami zajętości in vivo, usprawniając opracowywanie biomarkerów translacyjnych.
- Zapewnia ciągłość od etapu odkrywania po walidację przedkliniczną poprzez doprecyzowanie macierzy wag pozycyjnych (PWMs).
- Zmniejsza ryzyko niepowodzenia na późnym etapie badań poprzez wyjaśnienie zależności między sekwencją a funkcją w systemach istotnych dla danej choroby.
Integracja potoku i przepływu pracy
Test HiP-FA integruje się z kontinuum od etapu odkrywania do badań przedklinicznych, umożliwiając wysokoprzepustowe, ilościowe profilowanie powinowactwa i wspierając decyzje o dalszym rozwoju oparte na danych.
- Biologia odkrywcza: Ułatwia testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków poprzez kompleksowe mapowanie krajobrazu wiązania.
- Przesiewanie: Dostarcza zestandaryzowanych, powtarzalnych danych z miareczkowania w celu przygotowania testów i zapewnienia skalowalności platformy.
- Analityka: Generuje bezwzględne wartości KD oraz stężenia aktywnych białek dla rzetelnego porównania statystycznego.
- Badania translacyjne: Optymalizuje macierze wag pozycji (PWM), aby poprawić przewidywania wiązania in vivo i dopasowanie biomarkerów.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje wielokrotnego użytku, skalowalną platformę do zróżnicowanych badań oddziaływań białko-DNA oraz białko-ligand.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celów.
- Wartość operacyjna: Zapewnia zestandaryzowane, powtarzalne i skalowalne pomiary powinowactwa w różnych platformach.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie świadomych decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) oraz efektywne zarządzanie kapitałem w portfelu projektów.
- Wpływ na portfel: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój zwalidowanych celów.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza z zakresu anizotropii fluorescencji i ilościowej analizy danych.
- Wymagany jest dostęp do zautomatyzowanej mikroskopii fluorescencyjnej oraz infrastruktury do obsługi płytek wielodołkowych.
- Niezbędna jest rygorystyczna standaryzacja pipetowania i przygotowywania żelu pomiędzy członkami zespołu w celu zapewnienia powtarzalności.
- Metoda jest możliwa do adaptacji dla różnych układów białko-DNA i białko-ligand przy zastosowaniu odpowiedniej optymalizacji.
- Dokładność zależy od ostrożnego obchodzenia się z lepkimi roztworami żelu oraz precyzyjnego przygotowania miareczkowania.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:04
Title
1:00
Oligomer Annealing
1:45
Gel Preparation
3:35
Addition of the Competitor DNA Solution and Image Acquisition
4:41
Competitive Titration Assay and the Fitting Procedure
5:17
Results: Determining TF-DNA Binding Affinities Using Fluorescence Microscopy
6:07
Conclusion
