Pomiar wysokiej czułości powinowactwa wiązania czynnika transkrypcyjnego z DNA za pomocą miareczkowania kompetencyjnego przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej

Aby lepiej zrozumieć wiązanie czynnika transkrypcyjnego z DNA, opracowaliśmy metodę pomiaru stałych dysocjacji na dużą skalę, wykorzystując na przykład pomiary anizotropii. Technika ta pozwala na automatyczne uzyskanie pełnych krzywych miareczkowania w celu wyznaczenia stałej dysocjacji z dużą czułością. Pracuje w roztworze w równowadze, ma umiarkowaną przepustowość i duży zakres dynamiczny.

Zastosowaliśmy HiP-FA w celu udoskonalenia krajobrazu powinowactwa do wiązania czynników transkrypcyjnych. Protokół może być jednak stosowany do innych rodzajów zdarzeń wiążących, takich jak na przykład interakcje białko-białko lub białko-lek. Radzę najpierw wykonać wiele miareczkowania z tymi samymi partnerami wiążącymi, aby uzyskać oszacowanie odtwarzalności pomiarów.

Jeśli to możliwe, użyj zautomatyzowanego systemu, aby uzyskać jeszcze lepszą redukowalność. Aby wyżarzać oligomery DNA referencyjnego DNA, wymieszaj siedem mikrolitrów każdej dziesięciomilimolowej di-tagowanej do przodu i nieznakowanej wstecznej nici w jednej probówce. W przypadku DNA konkurenta wymieszaj 20 mikrolitrów każdej 100-milimolowej nieznakowanej nici w dwóch dołkach 96-dołkowej płytki PCR.

Następnie użyj standardowej maszyny do PCR, aby podgrzać roztwory DNA do 70 stopni Celsjusza przez trzy minuty. Następnie zmniejsz do temperatury pokojowej w tempie 0,1 stopnia Celsjusza na sekundę. Użyj kuchenki mikrofalowej, aby stopić 0,5 grama agarozy w 100 mililitrach buforu wiążącego.

Dodaj podwójnie destylowaną wodę, aby dostosować końcową objętość i skompensować możliwe parowanie. Przygotuj dziesięć mililitrowych porcji bulionu. Aby przygotować studzienki miareczkowania i kalibracyjne na 96-dołkowej płytce, należy przenieść dwie porcje żelu do wytrząsarki inkubatora o temperaturze 75 stopni Celsjusza.

Do każdej studzienki miareczkowania dodać 1,4 nanomola referencyjnego DNA, białka czynnika transkrypcyjnego, o końcowym stężeniu 20-60 nanomoli, 0,2 milimolowego DTT i buforu wiążącego do 240 mikrolitrów stopionego żelu. Dokładnie wymieszaj, odwracając i potrząsając probówką. Następnie powoli odpipetować 200 mikrolitrów na studzienkę żelu zawierającego DNA w wyznaczonych dołkach miareczkowania na 96-dołkowej płytce.

Do każdej studzienki kalibracyjnej dodaj 5 nanomoli niebieskiego barwnika nilowego do 240 mikrolitrów stopionego żelu. Unikając pęcherzyków powietrza, powoli odpipetuj 200 mikrolitrów roztworu żelu zawierającego barwnik w pięciu do sześciu dołkach płytki 96-dołkowej. Umieść żel na idealnie poziomej powierzchni i inkubuj przez dziesięć minut w temperaturze pokojowej i kolejne 10 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza.

Użyj wielodołkowego czytnika płytek, aby sprawdzić jednorodność poziomów wysokości żelu w różnych dołkach płytki. Aby przygotować konkurencyjny roztwór DNA, najpierw połącz znakowane referencyjne DNA, białko i trzykrotnie skoncentrowany bufor wiążący. Następnie wymieszaj 20 mikrolitrów roztworu z 40 mikrolitrami każdego z wyżarzonych roztworów DNA konkurencji.

Dla każdej studzienki kalibracyjnej należy połączyć odpowiednie ilości jednego z wyżarzonych konkurencyjnych roztworów DNA i trzykrotnie skoncentrowanego buforu wiążącego zawierającego 15-milimolowy roztwór barwnika błękitu nilowego. Na koniec dodaj 50 mikrolitrów zmieszanych roztworów konkurencji na żele tak równocześnie, jak to możliwe. Aby rozpocząć akwizycję obrazu, umieść 96-dołkową płytkę na stoliku mikroskopu.

Następnie wykonaj serie czasowe obrazów stosu Z studzienek, aż do całkowitego rozwiązania białka z referencyjnego DNA. Wykonać test miareczkowania zgodnie z manuskryptem. Następnie za pomocą oprogramowania HiP-FA utwórz krzywe miareczkowania dla poszczególnych sekwencji konkurencji.

Następnie kliknij przycisk eksportu, aby uzyskać stałą dysocjacji i stężenie aktywnego białka w każdym dołku miareczkowania. Należy zachować szczególną ostrożność podczas pipetowania lepkich roztworów żelu. Niedokładne pipetowanie może obniżyć dokładność wyznaczania stałych dysocjacji.

W tym badaniu zastosowano metodę HiP-FA w celu określenia preferencji wiązania DNA czynnika transkrypcyjnego z zamkniętą B-zipem. Gigantyczny, z sieci genów segmentacji much. Duże podobieństwo PWM dla powtórzeń przygotowanych ręcznie lub przy użyciu technik automatyzacji wykazało wysoką odtwarzalność metody HiP-FA.

PWM uzyskane tą metodą i innymi metodami są ogólnie podobne. Jednak znaczne odchylenia można zaobserwować w pozycjach drugiej i siódmej motywu rdzenia, gdzie mutacje mogą prowadzić albo do całkowitej utraty wiązania, albo do znacznie silniejszego wiązania niż w poprzednich pomiarach. Używamy HiP-FA do generowania udoskonaleń dla wiązań dziesiątek czynników transkrypcyjnych i pokazuje, że w efekcie końcowym uzyskuje się lepsze przewidywanie danych.

Uważamy, że jego miara wysokiej dokładności może być bardzo przydatna do lepszego zrozumienia wiązania TF-DNA dla całego systemu lub dla wszystkich rodzajów interakcji.