Name: Pomiar wysokiej czułości powinowactwa wiązania czynnika transkrypcyjnego z DNA za pomocą miareczkowania kompetencyjnego przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-07T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 38 s
Description: Poznaj metodę HiP-FA do pomiaru powinowactwa wiązania czynników transkrypcyjnych z DNA za pomocą anizotropii fluorescencji. Technika ta umożliwia wysokoczułą analizę w skali dużej z dużą dokładnością.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy J. Müllerowi za klony cDNA oraz członkom laboratorium z Galii, w szczególności S. Bergeltowi, za cenne rady i ożywioną dyskusję. Prace te były wspierane przez SFB 646, Regulatory Networks in Genome Expression and Maintenance (C.J., P.B.), Center for Integrated Protein Science (U.G.) oraz Graduate School for Quantitative Biosciences Munich (M.S.). U.G. dziękuje za wsparcie ze strony Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 646, SFB 1064, CIPSM, QBM), Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF: ebio - Innovationswettbewerb Systembiologie) oraz Fundacji Humboldta (Alexander von Humboldt, profesura).

<ol><li>Berg, O. G., von Hippel, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+DNA+binding+sites+by+regulatory+proteins.+Statistical-mechanical+theory+and+application+to+operators+and+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Selection of DNA binding sites by regulatory proteins. Statistical-mechanical theory and application to operators and promoters.</a> Journal of Molecular Biology. 193, 723-750 (1987).</li>
<li>Hammar, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+measurement+of+transcription+factor+dissociation+excludes+a+simple+operator+occupancy+model+for+gene+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Direct measurement of transcription factor dissociation excludes a simple operator occupancy model for gene regulation.</a> Nature Genetics. 46, 405-408 (2014).</li>
<li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+dynamics+of+enhanceosome+assembly+in+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Single-molecule dynamics of enhanceosome assembly in embryonic stem cells.</a> Cell. 156, 1274-1285 (2014).</li>
<li>Segal, E., Raveh-Sadka, T., Schroeder, M., Unnerstall, U., Gaul, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predicting+expression+patterns+from+regulatory+sequence+in+Drosophila+segmentation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Predicting expression patterns from regulatory sequence in Drosophila segmentation.</a> Nature. 451, 535-540 (2008).</li>
<li>Schroeder, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+control+in+the+segmentation+gene+network+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Transcriptional control in the segmentation gene network of Drosophila.</a> PLoS Biology. 2, 271(2004).</li>
<li>He, X., Samee, M. A., Blatti, C., Sinha, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermodynamics-based+models+of+transcriptional+regulation+by+enhancers%3A+the+roles+of+synergistic+activation%2C+cooperative+binding+and+short-range+repression%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Computionnal+Biology%22%5BJournal%5D)">Thermodynamics-based models of transcriptional regulation by enhancers: the roles of synergistic activation, cooperative binding and short-range repression.</a> PLoS Computionnal Biology. 6, (2010).</li>
<li>Wilson, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Species-Specific+Transcription+in+Mice+Carrying+Human+Chromosome+21%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Species-Specific Transcription in Mice Carrying Human Chromosome 21.</a> Science. 322, 434-438 (2008).</li>
<li>Galas, D. J., Schmitz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dnaase+footprinting+-+simple+method+for+detection+of+protein-DNA+binding+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Dnaase footprinting - simple method for detection of protein-DNA binding specificity.</a> Nucleic Acids Research. 5, 3157-3170 (1978).</li>
<li>Hellman, L. M., Fried, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+mobility+shift+assay+%28EMSA%29+for+detecting+protein-nucleic+acid+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions.</a> Nature Protocols. 2, 1849-1861 (2007).</li>
<li>Liedberg, B., Nylander, C., Lundstrom, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface-plasmon+resonance+for+gas-detection+and+biosensing%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors+and+Actuators%22%5BJournal%5D)">Surface-plasmon resonance for gas-detection and biosensing.</a> Sensors and Actuators. 4, 299-304 (1983).</li>
<li>Wienken, C. J., Baaske, P., Rothbauer, U., Braun, D., Duhr, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-binding+assays+in+biological+liquids+using+microscale+thermophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Protein-binding assays in biological liquids using microscale thermophoresis.</a> Nature Communications. 1, (2010).</li>
<li>Berger, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compact%2C+universal+DNA+microarrays+to+comprehensively+determine+transcription-factor+binding+site+specificities%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Compact, universal DNA microarrays to comprehensively determine transcription-factor binding site specificities.</a> Nature Biotechnology. 24, 1429-1435 (2006).</li>
<li>Nitta, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conservation+of+transcription+factor+binding+specificities+across+600+million+years+of+bilateria+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Conservation of transcription factor binding specificities across 600 million years of bilateria evolution.</a> eLife. 4, (2015).</li>
<li>Jolma, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-Binding+Specificities+of+Human+Transcription+Factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">DNA-Binding Specificities of Human Transcription Factors.</a> Cell. 152, 327-339 (2013).</li>
<li>Noyes, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+characterization+of+factors+that+regulate+Drosophila+segmentation+via+a+bacterial+one-hybrid+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">A systematic characterization of factors that regulate Drosophila segmentation via a bacterial one-hybrid system.</a> Nucleic Acids Research. 36, 2547-2560 (2008).</li>
<li>Nutiu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+measurement+of+DNA+affinity+landscapes+on+a+high-throughput+sequencing+instrument%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Direct measurement of DNA affinity landscapes on a high-throughput sequencing instrument.</a> Nature Biotechnology. 29, (2011).</li>
<li>Riley, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SELEX.-seq%3A+a+method+for+characterizing+the+complete+repertoire+of+binding+site+preferences+for+transcription+factor+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">SELEX.-seq: a method for characterizing the complete repertoire of binding site preferences for transcription factor complexes.</a> Methods Molecular Biology. 1196, 255-278 (2014).</li>
<li>Maerkl, S. J., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systems+approach+to+measuring+the+binding+energy+landscapes+of+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A systems approach to measuring the binding energy landscapes of transcription factors.</a> Science. 315, 233-237 (2007).</li>
<li>Isakova, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SMiLE-seq+identifies+binding+motifs+of+single+and+dimeric+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">SMiLE-seq identifies binding motifs of single and dimeric transcription factors.</a> Nature Methods. 14, 316-322 (2017).</li>
<li>Jung, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((True+equilibrium+measurement+of+transcription+factor-DNA+binding+affinities+using+automated+polarization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">True equilibrium measurement of transcription factor-DNA binding affinities using automated polarization microscopy.</a> Nature Communications. 9, 1605(2018).</li>
<li>Weber, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarization+of+the+fluorescence+of+macromolecules%3A+Fluorescent+conjugates+of+ovalbumin+and+bovine+serum+albumin%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Polarization of the fluorescence of macromolecules: Fluorescent conjugates of ovalbumin and bovine serum albumin.</a> Biochemical Journal. 51, 155-168 (1952).</li>
<li>Github. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://github.com/Reutern/PySite">https://github.com/Reutern/PySite</a> (2018).</li>
<li>Github. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://githum.com/GeneCenterMunich/HiP-FA">https://githum.com/GeneCenterMunich/HiP-FA</a> (2018).</li>
<li>Roehrl, M. H., Wang, J. Y., Wagner, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+general+framework+for+development+and+data+analysis+of+competitive+high-throughput+screens+for+small-molecule+inhibitors+of+protein-protein+interactions+by+fluorescence+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A general framework for development and data analysis of competitive high-throughput screens for small-molecule inhibitors of protein-protein interactions by fluorescence polarization.</a> Biochemistry. 43, 16056-16066 (2004).</li>
<li>St Johnston, D., Nuesslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+of+pattern+and+polarity+in+the+Drosophila+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The origin of pattern and polarity in the Drosophila embryo.</a> Cell. 68, 201-220 (1992).</li>
<li>Pankratz, M., Jäckle, H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPankratz%2C+M+%22The+Development+of+Drosophila+melanogaster%2C+Vol.+1%22">The Development of Drosophila melanogaster, Vol. 1</a>. Bate, M., Martinez Arias, A. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor. 467-516 (1993).</li>
<li>Zhao, Y., Ruan, S. X., Pandey, M., Stormo, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+Models+for+Transcription+Factor+Binding+Site+Identification+Using+Nonindependent+Interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Improved Models for Transcription Factor Binding Site Identification Using Nonindependent Interactions.</a> Genetics. 191, (2012).</li>
<li>Noureddine, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+functional+impact+of+sequence+variation+on+p53-DNA+interactions+using+a+novel+microsphere+assay+for+protein-DNA+binding+with+human+cell+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Probing the functional impact of sequence variation on p53-DNA interactions using a novel microsphere assay for protein-DNA binding with human cell extracts.</a> PLoS Genetics. 5, 1000462(2009).</li>
<li>Veprintsev, D. B., Fersht, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Algorithm+for+prediction+of+tumour+suppressor+p53+affinity+for+binding+sites+in+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Algorithm for prediction of tumour suppressor p53 affinity for binding sites in DNA.</a> Nucleic Acids Research. 36, 1589-1598 (2008).</li>
<li>Geertz, M., Shore, D., Maerkl, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massively+parallel+measurements+of+molecular+interaction+kinetics+on+a+microfluidic+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Massively parallel measurements of molecular interaction kinetics on a microfluidic platform.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109, 16540-16545 (2012).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

HiP-FA to nowa, kompleksowa metoda określania krajobrazów preferencji wiązań interakcji TF-DNA. Mierzy powinowactwo wiązania wariantów motywu mutacji DNA, unikając wszelkich podstawowych założeń, że preferencje wiązania znajdują odzwierciedlenie w częstości występowania nukleotydów w zestawie spoiw ponadprogowych. Pomiar odbywa się w roztworze bez unieruchomienia i mechanicznej lub chemicznej ingerencji w reakcję wiązania, jak najdokładniej przybliżając warunki równowagi. Kontrolowany system dostarczania umożliwia pomiar pełnej krzywej miareczkowania w jednym dołku i zwiększa zarówno przepustowość, jak i niezawodność, jednocześnie oszczędzając białko. Korzystanie z obiektywu z dużą aperturą numeryczną i kamerą EM-CCD o wysokiej skuteczności zbierania światła pozwala na bardzo czułe wykrywanie światła fluorescencyjnego. W związku z tym przy tej konfiguracji można dokładnie wykryć niewielkie zmiany FA tak niskie, jak 10-15 mP; W praktyce oznacza to, że każda reakcja wiązania, w której wzrost masy po związaniu jest minimalny (tak niski, jak stosunek mas wynoszący 2), jest łatwo wykrywalna. Zwykle nie ma to miejsca w przypadku systemów komercyjnych, takich jak czytniki mikropłytek. Ze względu na wysoką czułość, HiP-FA rozszerza zakres stałych dysocjacji, które można niezawodnie zmierzyć, na zakres pikomolarny. Energie wiązania są określane dokładnie dla wielu rzędów wielkości.
Aby ocenić jakość zmienionych PWM, przeprowadziliśmy dwa rodzaje analiz20. Przetestowaliśmy, dla pięciu czynników sieci genów segmentacji, jak dobrze różne PWM mogą przewidywać eksperymentalne profile ChIP-seq w regionach genomowych 21 genów segmentacji. W drugim teście użyliśmy modelu sekwencja do ekspresji4 , który przewiduje wzorce ekspresji wzmacniaczy segmentacji na podstawie preferencji wiązania i stężenia białek uczestniczących TF. W obu ćwiczeniach stwierdziliśmy, że mniej specyficzne PWM HiP-FA działają znacznie lepiej niż bardziej specyficzne PWM z footprintingiem i PWM B1H20.
W przeciwieństwie do metod de novo, HiP-FA wymaga pewnej wcześniejszej wiedzy na temat preferencji wiązania danego TF. Jednak sekwencje konsensusu są znane dla wielu TF, a wiele istniejących metod może je dostarczyć 13,14,15. W razie potrzeby prawdziwą optymalną sekwencję wiązania można znaleźć iteracyjnie.
Użyliśmy referencyjnych oligomerów DNA znakowanych fluorescencyjnie Cy5 i Bodipy-650. Barwniki te okazały się dobrze sprawdzać w pomiarach FA, ponieważ anizotropia związanego i niezwiązanego znakowanego referencyjnego DNA była największa spośród różnych testowanych barwników. Zapewnia to maksymalny zakres dynamiczny dla wartości FA. Ogólnie rzecz biorąc, każdy barwnik fluorescencyjny o żywotności fluorescencji ≥ 1 ns może być odpowiedni, ale najpierw musi zostać przetestowany. Jeśli to możliwe, zaleca się stosowanie barwników fluoryzujących w zakresie bliskiej podczerwieni, aby zminimalizować autofluorescencję białek.
Najbardziej krytycznym etapem procedury eksperymentalnej jest pipetowanie żelu do płytek dołka. Dobra odtwarzalność wymaga, aby objętości żelu były jak najbardziej jednolite. Zmiany wysokości żelu są przekładane na zmiany dyfuzyjności dla konkurencyjnego oligomeru DNA, a tym samym na pozorne zmiany powinowactwa podczas oceny danych. Jest to główne źródło wariancji w replikacji technicznej. Zastosowanie pipety elektronicznej lub technik automatyzacji poprawia odtwarzalność. Pęcherzyków powietrza w żelu można uniknąć, powolnemu i ostrożnemu pipetowaniu. Ważne jest również, aby dodać wszystkie konkurencyjne roztwory do dołków miareczkowych z jak najmniejszym opóźnieniem. Aby uzyskać najlepszą powtarzalność, cały proces można zautomatyzować za pomocą robota pipetującego z inkubatorami ciepła. Kluczowym elementem przeniesienia protokołu do automatyzacji jest niezbędna optymalizacja temperatury inkubatora i czasu inkubacji. Upewnij się, że znajdziesz optymalną równowagę między lepkością żelu (tj. nie za zimno) a stabilnością białek (tj. nie za gorąco). Zależy to zarówno od szybkości dozowania żeli do studzienek, jak i od stabilności użytego białka.
HiP-FA wykorzystuje kontrolowany system dostarczania dla konkurencyjnych oligomerów DNA. Aby skonstruować krzywe miareczkowania, konieczne jest wyznaczenie konkurencyjnego stężenia DNA c(z,t) dla każdej danej pozycji z w matrycy żelu i punkcie czasowym t. Jest to kolejny krytyczny krok, ponieważ określenie KDs zależy bezpośrednio od c(z,t). W tym celu stosuje się studzienki kalibracyjne zawierające barwnik NB jako czujnik stężenia DNA (Rysunek 1d, Rysunek 2a). Zwykle wystarczą 3-5 dołków kalibracyjnych zawierających NB na płytkę. Przed oceną jakiegokolwiek eksperymentu HiP-FA należy skonstruować krzywą kalibracyjną NB na potrzeby konfiguracji, wykonując konwencjonalną serię miareczkowania NB rozpuszczonego w żelu agarozowym z konkurencyjnym DNA o dowolnej sekwencji w różnych stężeniach (Rysunek 3a), jak wyjaśniono szczegółowo w kroku 8. W przypadku bardzo silnego wiązania (KD < 500 pM) ekstrapolacja stosowana do oznaczania niskich stężeń konkurencyjnego DNA staje się ograniczająca, ponieważ jest mniej dokładna niż pomiar bezpośredni. Jednak w przypadku TF o tak niskimK D skonfiguracja HiP-FA może być użyta do przeprowadzenia konwencjonalnego miareczkowania konkurencyjnego w buforze wiążącym bez użycia matrycy żelu agarozowego (Figura 5). Na przykład jedno pełne miareczkowanie z 12 różnymi stężeniami konkurencyjnego DNA można przeprowadzić w jednym rzędzie 96-dołkowej płytki.
Kontrolowany system dostarczania wymaga również szybkiej kinetyki wiązania TF-DNA i stabilnych białek, ponieważ dyfuzja przez żel agarozowy jest dynamiczna (choć powolna). Obie właściwości można testować bezpośrednio za pomocą konfiguracji HiP-FA, śledząc, w miarę upływu czasu, FA interesujących TF po związaniu z ich odpowiednim fluorescencyjnie znakowanym referencyjnym DNA. Zmierzyliśmy wskaźniki KON i KOFF dla badanych czynników i stwierdziliśmy, że są one rzędu milisekund dosekund 20, zgodnie z innymi badaniami30. Jest to wystarczająco szybkie, aby zapewnić, że pomiary odbywają się w stanie równowagi. W przypadku innych reakcji wiązania o wolniejszej kinetyce, dyfuzyjność konkurenta można dostroić poprzez obniżenie jego stężenia lub zmniejszenie wielkości porów żelu. W przypadku badanych TF, z których wszystkie mają szybkie TOFF (~sekundy), łączny czas pomiaru wynoszący około 1-2 h jest wystarczający do zapewnienia równowagi termodynamicznej przy każdym pomiarze.
Innym potencjalnym problemem związanym z białkiem jest tworzenie się agregatów białkowych, które mogą zmieniać pomiary FA. Stosowanie innych warunków buforowych zawierających różne dodatki (takie jak środki powierzchniowo czynne) może w razie potrzeby zapobiec tworzeniu się agregatów.
Pracowaliśmy przy założeniu liniowości PWM; jednak HIP-FA można skalować tak, aby obejmował wszystkie możliwe mutacje dinukleotydowe sekwencji konsensusu. Wreszcie, HiP-FA można dostosować do pomiaru innych typów interakcji wiązania. Warunkiem wstępnym jest dostępność odpowiedniej cząsteczki referencyjnej związanej przez białko, która może być znakowana fluorescencyjnie. Dzięki kontrolowanemu systemowi dostarczania można wygenerować gradient stężenia dla dowolnego rodzaju liganda; W związku z tym interakcje białko-białko i lek-białko mogą być mierzone z podobnie wysoką dokładnością i przepustowością.

Biorąc pod uwagę centralną rolę czynników transkrypcyjnych (TF) w regulacji genów, określenie ich preferencji wiązania w sposób ilościowy ma ogromne znaczenie. Przełomowe badania von Hippela wprowadziły pogląd, że regulatorowe TF szybko rozpoznają DNA, tak że ich wiązanie jest dobrze opisane przez równowagę termodynamiczną, podczas gdy dalsze zdarzenia rekrutacji polimerazy RNA do promotora są kontrolowane przez wolniejszą kinetykę1. Ostatnie badania wiązania in vivo sugerują, że ten obraz jest prawdopodobnie bardziej złożony2,3; Niemniej jednak te ogólne założenia służą jako dobre przybliżenia i wspierały wiele podejść obliczeniowych do znajdowania elementów regulatorowych CIS i przewidywania wyrażeń na podstawie sekwencji4,5,6. Podczas gdy wiązanie równowagowe zostało z powodzeniem zastosowane jako koncepcja, obecne metody określania interakcji TF-DNA koncentrują się na specyficzności wiązania i zazwyczaj nie mierzą bezpośrednio powinowactwa wiązania w stanie równowagi. Systematyczny pomiar wiązania TF-DNA stanowi spore wyzwanie techniczne, a istniejące metody mają kilka różnych ograniczeń.
Immunoprecypitacja chromatyny, po której następuje głębokie sekwencjonowanie (ChIP-seq)7, najbardziej rozpowszechniona technika in vivo, nie pozwala na pomiar powinowactwa wiązania ani dokładnej lokalizacji miejsc wiązania we fragmentach genomu. Kilka metod in vitro, w tym ślad DNazy8, przesunięcie ruchliwości elektroforetycznej (EMSA)9, powierzchniowy rezonans plazmonowy (SPR)10 i termoforeza w mikroskali11 są w stanie zmierzyć powinowactwo wiązań, ale mają stosunkowo niską przepustowość. I odwrotnie, techniki o wysokiej przepustowości, w tym mikromacierze wiążące białka12, HT-SELEX13,14 i bakteryjna jednohybrydowa (B1H)15 nie są w stanie zmierzyć powinowactwa wiązania i zazwyczaj dają zbyt specyficzne sekwencje wiązania, co wynika głównie z rygorystycznej selekcji lub niezbędnych etapów mycia. Nowsze osiągnięcia obejmują oparte na głębokim sekwencjonowaniu HiTS-FLIP16, SELEX-seq17 oraz oparte na mikrofluidyce MITOMI18 lub SMILE-Seq19, które pozwalają na ekstrakcję bezwzględnych powinowactw wiązania; jednak polegają na pomiarze intensywności fluorescencji znakowanego TF i DNA. Sygnały fluorescencyjne stają się zatem ograniczające przy niskich stężeniach białka i przy określaniu niskich wartościK D (< ~10 nM). Co więcej, wiązanie TF-DNA w tych metodach zachodzi na cienkich powierzchniach, co stwarza problemy z niespecyficznym wiązaniem i/lub tłem autofluorescencji, co utrudnia dokładne ilościowe określenie słabego wiązania.
Aby rozwiązać te problemy, opracowaliśmy nową metodę określania krajobrazów powinowactwa TF-DNA w stanie równowagi i w roztworze, którą nazwaliśmy anizotropią fluorescencji o wysokiej wydajności (HiP-FA)20. Technika ta opiera się na ustalonym teście anizotropii fluorescencji (FA) 21, ale zmodyfikowana w celu pomiaru stałych wiązania z wysoką czułością i na dużą skalę przy użyciu dostosowanego zautomatyzowanego mikroskopu i konfiguracji analitycznej.
Test FA monitoruje interakcję fluorescencyjnie znakowanych gatunków (takich jak oligomer DNA) z partnerem wiążącym, w tym przypadku TF, poprzez pomiar rotacji molekularnej znakowanej cząsteczki. Po związaniu się z TF jego prędkość obrotowa zmniejsza się ze względu na większy promień hydrodynamiczny i masę cząsteczkową związanego kompleksu, co powoduje wzrost FA. Dokładny pomiar bardzo silnego wiązania (KD < ~1 nM) wymaga użycia niskich stężeń znakowanego, referencyjnego DNA (c < ~1 nM). Jest to trudne do osiągnięcia za pomocą komercyjnego urządzenia, takiego jak standardowy czytnik mikropłytek. Ponadto zwykle konieczna jest duża różnica wielkości (10-100 razy) między związanymi i niezwiązanymi kompleksami, co uniemożliwia pomiar interakcji między domenami wiążącymi TF a krótkimi oligomerami DNA, które zwykle mają mniej więcej podobną masę cząsteczkową. Wreszcie, pełna krzywa miareczkowania zwykle wymaga przygotowania i pomiaru wielu studzienek zawierających szereg stężeń dla gatunków miareczkujących.
Aby rozwiązać te problemy, używamy zestawu mikroskopii szerokokątnej, zmodyfikowanego tak, aby osiągnąć wysoką czułość wykrywania i umożliwić pomiary FA w różnych pozycjach z pojedynczego dołka. Dzięki temu możemy monitorować interakcje wiążące między gatunkami o podobnej masie cząsteczkowej i wysokim powinowactwie. Wyższą przepustowość uzyskuje się poprzez pomiar FA w formatach płytek wielodołkowych i przeprowadzenie całej serii miareczkowania w jednym dołku przy użyciu kontrolowanego systemu dostarczania (<silna klasa="xfig">Rysunek 1a). Ponadto, stosując test wiązania konkurencyjnego, ekstrahujemy nie tylko stałe wiązania, ale także stężenie aktywnego białka. Jest to ważna cecha testu, ponieważ tylko część wyrażonych cząsteczek TF jest aktywna z powodu nieprawidłowego fałdowania lub degradacji białek. Układ eksperymentalny oparty jest na komercyjnym mikroskopie epifluorescencyjnym wyposażonym w stoliki piezoelektryczne XY i Z. Zmodernizowaliśmy system o zewnętrzne wzbudzenie laserowe, a następnie wykryliśmy dwie emitowane składowe polaryzacji liniowej na chipie kamery EM-CCD o wysokiej wydajności kwantowej do wykrywania światła (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1b i 1c). System wykorzystuje obiektyw o dużej aperturze numerycznej (NA) sprzężony z ultraczułym czujnikiem, dzięki czemu zapewnia bardzo czułe pomiary FA. Rejestrując fluorescencyjne stosy z, interakcje wiążące można mierzyć wzdłuż optycznej osi z przy użyciu heterogenicznej matrycy dla reagentów. Wszystkie te modyfikacje można łatwo wdrożyć w istniejącym systemie i są one opłacalne.
Stosujemy konkurencyjny test wiązania, w którym mierzy się powinowactwo wiązania nieznakowanego oligomeru DNA w porównaniu do fluorescencyjnie znakowanego DNA, które służy jako punkt odniesienia. TF i referencyjny DNA są włączane w ustalonych stężeniach do porowatej matrycy żelu agarozowego (wielkość porów ~1 μm), która stanowi nieoddziałujące środowisko dla wiązania. Referencyjne DNA jest znakowane Cy5. Barwnik ten okazał się dobrze nadający się do pomiarów FA ze względu na stosunkowo długi czas trwania fluorescencji (~1ns) i emisję fluorescencji w dalekiej czerwieni widma widzialnego (tło o niskiej autofluorescencji). Stężenie TF jest molowo nadmiarowe w stosunku do DNA referencyjnego Cy5, co zapewnia, że całe referencyjne DNA jest związane z białkiem. Roztwór nieznakowanego DNA konkurenta jest następnie osadzany na powierzchni żelu i dyfunduje wewnątrz porowatej matrycy, ustanawiając gradient stężenia c(z, t), który zmienia się w zależności od położenia z płaszczyzny ogniskowej i czasu t (<silna klasa="xfig">Rysunek 1a, <silna klasa="xfig">Rysunek 2a-2c). TF związany z DNA referencyjnym Cy5 jest zatem lokalnie wystawiony na różne stężenia konkurencyjnego DNA, który konkuruje o wiązanie, co prowadzi do dynamicznie zmieniającego się FA DNA referencyjnego Cy5 FAREF(z, t) (<silna klasa = "xfig">Figura 2b i 2c).
Aby określić stężenie konkurencji c(z,t), mierzymy w oddzielnych studzienkach ( studnie kalibracyjne) dynamicznie zmieniający się sygnał FA Nile Blue (NB) FANB(z,t) (<silna klasa="xfig">Rysunek 2a i 3). Barwnik ten interkaluje się w DNA i w ten sposób działa jako czujnik DNA dla DNA konkurencji. Dzięki temu kontrolowanemu systemowi dostarczania można zmierzyć dziesiątki do setek różnych powinowactw wiązania DNA-białko na jednej płytce wielodołkowej (format płytki 96- lub 384-dołkowej). Pomiar jest następnie wykonywany sekwencyjnie, aż do całkowitego przemieszczenia znakowanego referencyjnego DNA z TF. Określiliśmy specyficzność wiązania dla danego czynnika, mierząc powinowactwo wszystkich 3 N mutacji jednozasadowych w sekwencji konsensusu o długości N. HiP-FA wymaga niewielkich ilości białka (~pmols na krzywą miareczkowania) i wykazuje niską zmienność w oznaczaniu KDs [współczynnik zmienności (CV) < 20%], umożliwiając jednocześnie pomiary w stosunkowo dużej skali. Metoda może być przeprowadzana ręcznie lub w pełni zautomatyzowana za pomocą systemu zrobotyzowanego, co skutkuje jeszcze niższymi CV (<silna klasa="xfig">Rysunek 4, górny panel). Stałe dysocjacji są mierzone z dużą dokładnością do 0,5 nM. W przypadku ekstremalnie wysokich powinowactw (KD < 500 pM) stosujemy standardowe miareczkowanie konkurencyjne (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 5) ze względu na niedokładności w pomiarze stężeń DNA konkurentów na niskich poziomach (< 100 nM).
HiP-FA może być zaimplementowany na prawie każdym standardowym, odwróconym, epifluorescencyjnym mikroskopie fluorescencyjnym, pod warunkiem dostępności zautomatyzowanego stolika XY i stolika piezoelektrycznego osi z. Komponenty optyczne zostały zbudowane w oparciu o zautomatyzowaną konfigurację szerokokątną wyposażoną w obiektyw dalekiego zasięgu. W praktyce test można dostosować do celów o innych cechach (w szczególności roboczej, odległości i apertury numerycznej). Wymaga to jednak optymalizacji parametrów (odległości między plastrami Z, porowatość i wysokość żelu agarozowego itp.). Możliwe jest również użycie innych rodzajów laserów lub kamery. Szczegółowy opis całej procedury eksperymentalnej i analizy danych znajduje się poniżej w sekcji dotyczącej protokołu.

<table><tbody><tr><td>Cy5-labled 16- / 18-bp DNA-oligomery</td><td>Eurofins</td><td></td><td>Niestandardowa synteza</td></tr><tr><td>16- / 18-bp DNA-oligomery</td><td>Eurofins</td><td></td><td>Niestandardowa synteza</td></tr><tr><td>Nile Blue A</td><td>Sigma</td><td>N5632-25G</td><td></td></tr><tr><td>Sensoplate plus mikropłytka 96- lub 384-dołkowa, PS</td><td>Greiner</td><td>655891</td><td>175 &mikro; m grube szklane dno</td></tr><tr><td>384 Well Sensoplate,</td><td>Greiner</td><td>788896</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza, niska temperatura żelowania</td><td>Sigma</td><td>A9414-50G</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Merck</td><td>1.06404.1000</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P1379-1L</td><td></td></tr><tr><td>Di-Potassium wodorofosforan trójwodny</td><td>Merck</td><td>1.05099.1000</td><td></td></tr><tr><td>Diwodorofosforan potasu</td><td>Merck</td><td>1.04873.1000</td><td></td></tr><tr><td>Element Q-POD Merck</td><td>Millipore</td><td>ZMQSP0DE1</td><td></td></tr><tr><td>Millipak 40 Filtr złota gamma</td><td>Merck Millipore</td><td>MPGL04GK2</td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q Integral 3 System oczyszczania wody</td><td>Merck Millipore</td><td>ZRXQ003WW</td><td></td></tr><tr><td>Quantum TIX</td><td>Merck Millipore</td><td>QTUMOTIX1</td><td></td></tr><tr><td>DL-Dithiothreitol</td><td>Sigma</td><td>43815-1G</td><td></td></tr><tr><td>Mastercycler gradient</td><td>Eppendorf</td><td>Z316083</td><td></td></tr><tr><td>Probówka SafeSeal 1,5 ml</td><td>Sarstedt</td><td>72.706.200</td><td></td></tr><tr><td>Probówka 15 ml</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.502</td><td></td></tr><tr><td>Kubek Multiply-Pro 0,2 ml PP</td><td>Sarstedt</td><td>72.737.002</td><td></td></tr><tr><td>KONFIGURACJA MIKROSKOPII:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zautomatyzowany mikroskop szerokokątny</td><td>LEICA</td><td>DMI6000</td><td></td></tr><tr><td>Obiektyw dalekiego zasięgu</td><td>LEICA</td><td>HCX PL FLUOAR L 60x/0.60 N.A. Suchy</td><td></td></tr><tr><td>638 nm liniowy ciągły laser diodowy</td><td>Omicron</td><td>PHOxX 638-40, 40mW</td><td></td></tr><tr><td>Podświetlana kamera EM-CCD</td><td>Andor</td><td>iXon DV897</td><td></td></tr><tr><td>Lustro dichroiczne</td><td>AHF</td><td>640nm odcięcie</td><td></td></tr><tr><td>Filtr pasmowo-przepustowy</td><td>AHF</td><td>ET pasmowoprzepustowy 700/75</td><td></td></tr><tr><td>Polaryzator liniowy</td><td>Thorlabs</td><td>LPVISC050-MP2</td><td></td></tr><tr><td>Rozdzielacz wiązki polaryzacyjnej</td><td>Thorlabs</td><td>BS010</td><td></td></tr><tr><td>Soczewka achromatyczna</td><td>Thorlabs</td><td>Ogniskowa</td><td></td>200 mm</tr><tr><td>Światłowód wielomodowy</td><td>Optronis</td><td>FVP600660710</td><td></td></tr><tr><td><mocny> SYSTEM ROBOTYCZNY: </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nasz system robotyczny obejmuje stacje robocze Biomek NXP z 96-kanałową głowicą i pipetorami Span-8, połączone serwo-wahadłem, są używane do wszystkich etapów przenoszenia cieczy. Dodatkowo system wyposażony jest w wytrząsarki orbitalne oraz czytnik mikropłytek (Paradigm, Molecular device) obsługiwany przez chwytak Span-8</td><td>Beckman Coulter</td><td>Biomek NXP</td><td></td></tr><tr><td>SOFTWARE:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Język programowania</td><td>National Instruments</td><td>Labview 9.0</td><td></td></tr><tr><td>Script dla oprogramowania HiP-FA dostępny pod adresem</td><td></td><td></td><td>https://github.com/GeneCenterMunich/HiP-FA</td></tr></tbody></table>

pomiar wysokiej czułości powinowactwa wiązania czynnika transkrypcyjnego z dna za pomocą miareczkowania kompetencyjnego przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Dokładna kwantyfikacja interakcji czynnika transkrypcyjnego (TF)-DNA jest niezbędna do zrozumienia regulacji ekspresji genów. Ponieważ istniejące podejścia mają znaczne ograniczenia, opracowaliśmy nową metodę określania powinowactwa do wiązania TF-DNA z wysoką czułością na dużą skalę. Test opiera się na ustalonej zasadzie anizotropii fluorescencji (FA), ale wprowadza ważne ulepszenia techniczne. Po pierwsze, mierzymy pełną krzywą miareczkowania kompetycyjnego FA w pojedynczym dołku, włączając TF i znakowane fluorescencyjnie referencyjne DNA do porowatej matrycy żelu agarozowego. Nieznakowany oligomer DNA jest ładowany na górze jako konkurent i poprzez dyfuzję tworzy gradient czasoprzestrzenny. Powstały gradient FA jest następnie odczytywany za pomocą dostosowanej konfiguracji mikroskopu epifluorescencyjnego. Ta ulepszona konfiguracja znacznie zwiększa czułość wykrywania sygnału FA, umożliwiając wiarygodne ilościowe określenie zarówno słabego, jak i silnego wiązania, nawet w przypadku cząsteczek o podobnej masie cząsteczkowej. W ten sposób możemy zmierzyć jedną krzywą miareczkowania na dołek płytki wielodołkowej, a dzięki procedurze dopasowania możemy wyodrębnić zarówno bezwzględną stałą dysocjacji (KD), jak i stężenie aktywnego białka. Testując wszystkie warianty mutacji jednopunktowych danej sekwencji wiązania konsensusu, możemy zbadać cały krajobraz specyficzności wiązania TF, zazwyczaj na jednej płytce. Uzyskane macierze wagowe pozycji (PWM) przewyższają te uzyskane za pomocą innych metod w przewidywaniu zajętości TF in vivo. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy przewodnik dotyczący implementacji HiP-FA w konwencjonalnym zautomatyzowanym mikroskopie fluorescencyjnym i potoku analizy danych.

Zastosowaliśmy metodę HiP-FA w odniesieniu do czynników transkrypcyjnych (TFs) sieci genów segmentacyjnych25,26, która odpowiada za tworzenie wzorca ciała w osi przednio-tylnej zarodków Drosophila, głównie poprzez regulację transkrypcyjną. Z tej sieci wybrano czynnik transkrypcyjny Giant (Gt) z domeną bZIP do szczegółowej analizy (Rysunek 4). Ponieważ pełnej długości czynniki transkrypcyjne są trudne do ekspresji i wykazują w większości takie same preferencje wiązania jak ich domeny wiążące DNA (DBD)13, wykorzystaliśmy DBD połączoną z GST i wyekspresowaliśmy ten konstrukt w E.coli; białka fuzyjne GST zapewniają takie same wyniki jak same domeny DBD20.
Sekwencja konsensuse Gt (ATTACGTAAC) reprezentuje najsilniejszą sekwencję wiążącą, którą określiliśmy zgodnie z powyższym opisem. Następnie zbadaliśmy wpływ na energię wiązania wszystkich możliwych mutacji punktowych w obrębie 10-merowej sekwencji konsensuse Gt (łącznie 30), flankowanej dodatkowymi zasadami na końcach 5' i 3'. Wykonaliśmy dwa pomiary powtórne, których próbki do żelu zostały przygotowane automatycznie, oraz jeden dodatkowy pomiar wykonany ręcznie w celu porównania. Wartości KDs dla sekwencji z pojedynczą mutacją mieściły się w zakresie od 0,6 do &gt; 2000 nM; potwierdziliśmy również całkowity brak wiązania z sekwencją „niewiążącą” (dane nie przedstawiono).
Specyficzność wiązania TF-DNA jest zazwyczaj modelowana przy użyciu macierzy wag pozycyjnych (PWM), w której każdemu możliwemu nukleotydowi w każdej pozycji motywu wiązania przypisywana jest określona wartość. PWM zakłada, że każda pozycja niezależnie wpływa na siłę wiązania i w większości przypadków stanowi wystarczający model preferencji wiązania TF27. Wygenerowaliśmy zrewidowane macierze PWM na podstawie naszych pomiarów powinowactwa, stosując uznane procedury28,29, i porównaliśmy je z dwiema macierzami PWM opisanymi wcześniej w literaturze. Pierwsza z nich opiera się na liczbach częstotliwości nukleotydów z miejsc wiązania zidentyfikowanych metodą footprintingu DNA4,5, natomiast druga macierz PWM została uzyskana za pomocą bakteryjnej selekcji jednohybrydowej (B1H).15
Wysokie podobieństwo PWM dla trzech powtórzeń (Rysunek 4, górny panel), w tym dla próbki przygotowanej ręcznie (powtórzenie 3), wykazuje wysoką powtarzalność metody HiP-FA. Chociaż PWM uzyskane za pomocą HiP-FA są ogólnie podobne do PWM uzyskanych innymi metodami (Rysunek 4, dolny panel), występują istotne odchylenia: w pozycji 2 (czarna strzałka), na początku rdzenia motywu bZIP, mutacje T>(G,C,A) prowadzą do całkowitej utraty wiązania w motywie otrzymanym za pomocą HiP-FA, co jest zgodne z motywem B1H, ale nie z motywem uzyskanym metodą sekwencjonowania z wykorzystaniem nukleazy DNase (DNase footprinting), w której wiązanie pozostaje stosunkowo silne dla zasad (G,A). I odwrotnie, w pozycji 7 (szara strzałka) mutacja T>C prowadzi do znacznie silniejszego wiązania, niż wynikałoby to z wcześniej zmierzonych PWM.
Inne odchylenia są subtelniejsze, ale równie istotne. Ogólnie PWM dla HiP-FA jest mniej specyficzny niż dwa pozostałe, co odzwierciedla fakt, że wiele mutacji względem konsensusu wciąż skutkuje umiarkowanie silnym wiązaniem. Można to określić ilościowo za pomocą zawartości informacji (IC). IC wynosi 11,5 bita dla macierzy HiP-FA (średnia z trzech powtórzeń), w porównaniu do IC = 13,4 bita i 16,8 bita dla macierzy z footprintingu DNase oraz B1H, odpowiednio. Zazwyczaj (choć nie w każdym przypadku) PWM uzyskane metodą HiP-FA są mniej specyficzne niż te otrzymane innymi metodami, co oparto na badaniach 26 czynników TF20.
<img alt="Eksperyment dyfuzyjny z użyciem Cy5-DNA w żelu agarozowym, detekcja fluorescencyjna, schemat układu laserowego." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58763/58763fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1:Schematyczne przedstawienie analizy HIP-FA i układu eksperymentalnego. (a) System dostarczania do żelu w celu miareczkowania konkurencyjnego DNA w pojedynczych studzienkach. (b) Układ mikroskopowy HIP-FA. Dostosowany zautomatyzowany mikroskop szerokopolowy z detekcją polaryzowanego światła fluorescencyjnego na kamerze EM-CCD. (c) Surowy obraz fluorescencyjny z dwoma obszarami zainteresowania (ROI) wykorzystanymi do wyznaczenia składowej spolaryzowanej równolegle (czerwona) i prostopadle (zielona). (d) Typowy układ płytki 96-dołkowej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58763/58763fig1large.jpg" target="_blank">Aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Wykres analizy fluorescencyjnej i wykresy KD wiązania porównujące silne i umiarkowane ligandy, analiza danych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58763/58763fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Surowe dane FA i zrekonstruowane krzywe miareczkowania. (a) Typowa trajektoria FA(z,t) dla dołka kalibracyjnego zawierającego NB. (b,c) Trajektorie czasowe FA(z,t) dla dwóch dołków miareczkowania mierzących wiązanie do silnego (b) i bardziej umiarkowanego (c) konkurenta wiążącego DNA. (d, e) Odpowiadające im zrekonstruowane pomiary miareczkowania FA i dopasowane krzywe dla wiązania silnego (d) i umiarkowanego (e). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58763/58763fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza wiązania DNA; wykresy przedstawiające stężenie konkurencyjnego DNA względem ΔFA, stężenie względem cyklu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58763/58763fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Wyznaczanie stężenia konkurencyjnego DNA c(z,t) przy użyciu Nile Blue (NB). (a) Krzywa kalibracyjna FA-stężenie dla 16-par zasad oligomerów DNA. W konwencjonalnej serii miareczkowania NB jest osadzony w żelu agarozy wraz z różnymi stężeniami konkurencyjnego DNA. powinowactwo NB do DNA jest niezależne od sekwencji20; zatem te same krzywe kalibracyjne mogą być stosowane do wyznaczania c(z,t) dla różnych sekwencji DNA o tej samej długości. (b) Profil dyfuzji czasowej konkurencyjnego DNA na dowolnej wysokości z wyznaczony przy użyciu pięciu studni kalibracyjnych. Dla każdego cyklu pomiarowego średnie wartości FA z czterech studni zawierających NB są przedstawione jako białe kropki. Krzywe zostały dopasowane przy użyciu równania 3 (biała linia, poszczególne studnie w kolorze), a c(z,t) przy niskich stężeniach (C &lt; ~100 nM) jest wyznaczane za pomocą ekstrapolowanej krzywej dopasowania. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58763/58763fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Porównanie metody HiP-FA; wykres logo sekwencji; zautomatyzowana vs manualna analiza footprintingu DNA." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58763/58763fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Specyficzność wiązania rodziny domen bZIP czynnika transkrypcyjnego Giant (Gt). Macierze PWM HIP-FA z trzech powtórzeń: dwóch przygotowanych automatycznie i jednego przygotowanego manualnie (panel górny) są porównane z macierzami PWM wygenerowanymi metodą footprintingu DNase oraz metodą selekcji bakteryjnego jednego hybrydy (B1H) (panel dolny). Ogólnie motywy wiązania HIP-FA są zgodne z wcześniejszymi danymi, ale wykazują również istotne różnice, zaznaczone czarnymi i szarymi strzałkami. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58763/58763fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Mapa cieplna anizotropii fluorescencji FA i krzywe wiązania; test konkurencji DNA; wyznaczanie Kd." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58763/58763fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Konwencjonalne miareczkowanie konkurencyjne z użyciem HIP-FA. (a) Projekt płytki przedstawia 8 różnych DNA konkurencyjnych rozcieńczonych seryjnie w buforze wiążącym w jednym rzędzie płytki 96-dołkowej. Przedstawiono mapę cieplną FA dla różnych dowolnych sił wiązania. (b) Miareczkowanie konkurencyjne trzech DNA konkurencyjnych wiążących się z TF Bcd z różnym powinowactwem. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58763/58763fig5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Tutaj prezentujemy nowatorską metodę określania powinowactwa wiązania w równowadze i w roztworze z wysoką czułością na dużą skalę. Poprawia to analizę ilościową wiązania czynnika transkrypcyjnego z DNA. Metoda opiera się na zautomatyzowanych pomiarach anizotropii fluorescencji w kontrolowanym systemie dostarczania.

Pomiar wysokiej czułości powinowactwa wiązania czynnika transkrypcyjnego z DNA za pomocą miareczkowania kompetencyjnego przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Aby lepiej zrozumieć wiązanie czynnika transkrypcyjnego z DNA, opracowaliśmy metodę pomiaru stałych dysocjacji na dużą skalę, wykorzystując na przykład pomiary anizotropii. Technika ta pozwala na automatyczne uzyskanie pełnych krzywych miareczkowania w celu wyznaczenia stałej dysocjacji z dużą czułością. Pracuje w roztworze w równowadze, ma umiarkowaną przepustowość i duży zakres dynamiczny.Zastosowaliśmy HiP-FA w celu udoskonalenia krajobrazu powinowactwa do wiązania czynników transkrypcyjnych. Protokół może być jednak stosowany do innych rodzajów zdarzeń wiążących, takich jak na przykład interakcje białko-białko lub białko-lek. Radzę najpierw wykonać wiele miareczkowania z tymi samymi partnerami wiążącymi, aby uzyskać oszacowanie odtwarzalności pomiarów.Jeśli to możliwe, użyj zautomatyzowanego systemu, aby uzyskać jeszcze lepszą redukowalność. Aby wyżarzać oligomery DNA referencyjnego DNA, wymieszaj siedem mikrolitrów każdej dziesięciomilimolowej di-tagowanej do przodu i nieznakowanej wstecznej nici w jednej probówce. W przypadku DNA konkurenta wymieszaj 20 mikrolitrów każdej 100-milimolowej nieznakowanej nici w dwóch dołkach 96-dołkowej płytki PCR.Następnie użyj standardowej maszyny do PCR, aby podgrzać roztwory DNA do 70 stopni Celsjusza przez trzy minuty. Następnie zmniejsz do temperatury pokojowej w tempie 0,1 stopnia Celsjusza na sekundę. Użyj kuchenki mikrofalowej, aby stopić 0,5 grama agarozy w 100 mililitrach buforu wiążącego.Dodaj podwójnie destylowaną wodę, aby dostosować końcową objętość i skompensować możliwe parowanie. Przygotuj dziesięć mililitrowych porcji bulionu. Aby przygotować studzienki miareczkowania i kalibracyjne na 96-dołkowej płytce, należy przenieść dwie porcje żelu do wytrząsarki inkubatora o temperaturze 75 stopni Celsjusza.Do każdej studzienki miareczkowania dodać 1,4 nanomola referencyjnego DNA, białka czynnika transkrypcyjnego, o końcowym stężeniu 20-60 nanomoli, 0,2 milimolowego DTT i buforu wiążącego do 240 mikrolitrów stopionego żelu. Dokładnie wymieszaj, odwracając i potrząsając probówką. Następnie powoli odpipetować 200 mikrolitrów na studzienkę żelu zawierającego DNA w wyznaczonych dołkach miareczkowania na 96-dołkowej płytce.Do każdej studzienki kalibracyjnej dodaj 5 nanomoli niebieskiego barwnika nilowego do 240 mikrolitrów stopionego żelu. Unikając pęcherzyków powietrza, powoli odpipetuj 200 mikrolitrów roztworu żelu zawierającego barwnik w pięciu do sześciu dołkach płytki 96-dołkowej. Umieść żel na idealnie poziomej powierzchni i inkubuj przez dziesięć minut w temperaturze pokojowej i kolejne 10 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza.Użyj wielodołkowego czytnika płytek, aby sprawdzić jednorodność poziomów wysokości żelu w różnych dołkach płytki. Aby przygotować konkurencyjny roztwór DNA, najpierw połącz znakowane referencyjne DNA, białko i trzykrotnie skoncentrowany bufor wiążący. Następnie wymieszaj 20 mikrolitrów roztworu z 40 mikrolitrami każdego z wyżarzonych roztworów DNA konkurencji.Dla każdej studzienki kalibracyjnej należy połączyć odpowiednie ilości jednego z wyżarzonych konkurencyjnych roztworów DNA i trzykrotnie skoncentrowanego buforu wiążącego zawierającego 15-milimolowy roztwór barwnika błękitu nilowego. Na koniec dodaj 50 mikrolitrów zmieszanych roztworów konkurencji na żele tak równocześnie, jak to możliwe. Aby rozpocząć akwizycję obrazu, umieść 96-dołkową płytkę na stoliku mikroskopu.Następnie wykonaj serie czasowe obrazów stosu Z studzienek, aż do całkowitego rozwiązania białka z referencyjnego DNA. Wykonać test miareczkowania zgodnie z manuskryptem. Następnie za pomocą oprogramowania HiP-FA utwórz krzywe miareczkowania dla poszczególnych sekwencji konkurencji.Następnie kliknij przycisk eksportu, aby uzyskać stałą dysocjacji i stężenie aktywnego białka w każdym dołku miareczkowania. Należy zachować szczególną ostrożność podczas pipetowania lepkich roztworów żelu. Niedokładne pipetowanie może obniżyć dokładność wyznaczania stałych dysocjacji.W tym badaniu zastosowano metodę HiP-FA w celu określenia preferencji wiązania DNA czynnika transkrypcyjnego z zamkniętą B-zipem. Gigantyczny, z sieci genów segmentacji much. Duże podobieństwo PWM dla powtórzeń przygotowanych ręcznie lub przy użyciu technik automatyzacji wykazało wysoką odtwarzalność metody HiP-FA.PWM uzyskane tą metodą i innymi metodami są ogólnie podobne. Jednak znaczne odchylenia można zaobserwować w pozycjach drugiej i siódmej motywu rdzenia, gdzie mutacje mogą prowadzić albo do całkowitej utraty wiązania, albo do znacznie silniejszego wiązania niż w poprzednich pomiarach. Używamy HiP-FA do generowania udoskonaleń dla wiązań dziesiątek czynników transkrypcyjnych i pokazuje, że w efekcie końcowym uzyskuje się lepsze przewidywanie danych.Uważamy, że jego miara wysokiej dokładności może być bardzo przydatna do lepszego zrozumienia wiązania TF-DNA dla całego systemu lub dla wszystkich rodzajów interakcji.

high-sensitivity-measurement-transcription-factor-dna-binding

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

W tym filmie demonstrujemy test przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej do wykrywania interakcji białko-DNA za pomocą sond DNA znakowanych fluorescencyjnie w podczerwieni. Kiedy białko wiąże się z sondą DNA, tworzy duży kompleks, który migruje powoli i pojawia się jako przesunięta prążek na żelu.

Test przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej do wykrywania kompleksów czynnik transkrypcyjny-DNA

Ten film opisuje wysoce wydajną anizotropię fluorescencji, która pomaga monitorować interakcję między czynnikami transkrypcyjnymi a DNA. Test monitoruje interakcje cząsteczki DNA znakowanej fluoroforem z jej specyficznym czynnikiem transkrypcyjnym, mierząc stopień polaryzacji spowodowanej rotacją molekularną lub anizotropią DNA znakowanego fluoroforem.

Anizotropia fluorescencyjna w celu określenia powinowactwa wiązania czynnika transkrypcyjnego i DNA

Opracowaliśmy ilościowy test wiążący DNA, oparty na ELISA, do pomiaru interakcji czynników transkrypcyjnych z DNA.  Wysoką swoistość białka RUNX2 osiągnięto dzięki oligonukleotydowi rozpoznającemu DNA i swoistemu przeciwciału monoklonalnemu. Detekcja kolorymetryczna z reakcją substratową przeciwciał sprzężoną z enzymem była monitorowana w czasie rzeczywistym.

Test ilościowy do badania interakcji białko-DNA, odkrywania transkrypcyjnych regulatorów ekspresji genów i identyfikowania nowych środków przeciwnowotworowych

Tutaj opisujemy oprzyrządowanie i metody wykrywania pojedynczych fluorescencyjnie znakowanych cząsteczek białka oddziałujących z pojedynczą cząsteczką DNA zawieszoną pomiędzy dwiema optycznie uwięzionymi mikrosferami.

Połączenie manipulacji pojedynczymi cząsteczkami i obrazowania w celu badania interakcji białko-DNA

Różnicowa fluorymetria skaningowa jest powszechnie stosowaną metodą badania bibliotek małych cząsteczek pod kątem interakcji z białkami. W tym miejscu przedstawiamy prostą metodę rozszerzenia tych analiz w celu oszacowania stałej dysocjacji między małą cząsteczką a jej białkiem partnera.

Oznaczanie oddziaływań białko-ligand za pomocą różnicowej fluorymetrii skaningowej

Opisujemy technikę jednoczesnego pomiaru kinetyki wiązania pojedynczego receptora-liganda o regulowanej sile oraz obrazowania w czasie rzeczywistym sygnalizacji wapniowej w pojedynczym limfocycie T.

Sonda siły biomembrany fluorescencyjnej: jednoczesna kwantyfikacja kinetyki receptor-ligand i sygnalizacji wewnątrzkomórkowej indukowanej wiązaniem na pojedynczej komórce

Ten manuskrypt opisuje, jak przeprowadzić (pojedyncze cząsteczki) testy oparte na transferze energii rezonansu Förstera (FRET) w celu zmierzenia dynamiki wiązania między receptorem antygenu limfocytów T (TCR) a cząsteczkami MHC naładowanymi peptydami antygenowymi, które występują w synapsie immunologicznej limfocytu T w kontakcie z funkcjonalizowaną dwuwarstwą lipidową podpartą planarnie.

Pomiar wiązania TCR-pMHC in situ za pomocą testu mikroskopowego opartego na FRET

Ten protokół opisuje kombinatoryczne zastosowanie ChIP-seq, 4sU-seq, total RNA-seq i profilowania rybosomów dla linii komórkowych i komórek pierwotnych. Umożliwia śledzenie zmian w wiązaniu czynnika transkrypcyjnego, transkrypcji de novo, przetwarzaniu RNA, obrocie i translacji w czasie oraz wyświetlanie ogólnego przebiegu zdarzeń w aktywowanych i/lub szybko zmieniających się komórkach.

Analiza w czasie rzeczywistym wiązania czynników transkrypcyjnych, transkrypcji, translacji i obrotu w celu wyświetlenia globalnych zdarzeń podczas aktywacji komórkowej

Ten protokół przedstawia metodę pomiaru wiązania nukleotydów adeninowych z receptorami w czasie rzeczywistym w środowisku komórkowym. Wiązanie mierzy się jako transfer energii rezonansu Förstera (FRET) między pochodnymi nukleotydów trinitrofenylowych a białkiem znakowanym niekanonicznym, fluorescencyjnym aminokwasem.

Pomiar wiązania nukleotydów z nienaruszonymi, funkcjonalnymi białkami błonowymi w czasie rzeczywistym

Tutaj prezentujemy metodę wizualizacji tworzenia się kompleksu trójskładnikowego między trzema partnerami białkowymi za pomocą białek znakowanych fluorescencyjnie za pomocą testu FRET-FLIM opartego na BiFC. Metoda ta jest cenna w badaniu kompleksów interakcji białko-białko in vivo.

Oznaczanie trójstronnej interakcji między dwoma monomerami czynnika transkrypcyjnego MADS-box i białka czujnika wapnia za pomocą testu BiFC-FRET-FLIM

Metylotransferazy DNA są potencjalnymi celami leków przeciwnowotworowych. W tym miejscu przedstawiono protokół oceny małych cząsteczek pod kątem hamowania metylotransferazy DNA. Test ten wykorzystuje endonukleazę do sprzężenia metylacji DNA z generowaniem fluorescencji i pozwala na monitorowanie aktywności enzymu w czasie rzeczywistym.

Ciągły test metylacji DNA sprzężony z endonukleazą oparty na fluorescencji w celu wykrycia inhibitorów metylotransferazy DNA

Poznaj metodę HiP-FA do pomiaru powinowactwa wiązania czynników transkrypcyjnych z DNA za pomocą anizotropii fluorescencji. Technika ta umożliwia wysokoczułą analizę w skali dużej z dużą dokładnością.

Pomiar wysokiej czułości powinowactwa wiązania czynnika transkrypcyjnego z DNA za pomocą miareczkowania kompetencyjnego przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej (Wideo) | JoVE Journal

Pomiar wysokiej czułości powinowactwa wiązania czynnika transkrypcyjnego z DNA za pomocą miareczkowania kompetencyjnego przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej

Przeglądaj więcej filmów