Analiza surowych i przetworzonych próbek kłącza Cyperi przy użyciu chromatografii cieczowej i tandemowej spektrometrii mas u szczurów z pierwotnym bolesnym miesiączkowaniem

Metabonomika mierzy ogólną i dynamiczną odpowiedź metaboliczną i jest spójna z określaniem ogólnej skuteczności tradycyjnej medycyny chińskiej. Zmiany w składnikach leku spowodowane odpowiedzią metaboliczną organizmu można określić za pomocą metabonomiki. Stosując tę technikę, można zawęzić zakres badań przesiewowych aktywnych składników TCM.

Jednostronności można uniknąć, badając poszczególne składniki. Metoda ta może być jednoczesna, oznaczać endogenne metabolity i składniki egzogenne wchłaniane do krwi. Metabonomika jest szeroko stosowana w badaniach nad TCM, toksykologią leków, zarządzaniem zdrowiem, sportem, żywnością i innymi dziedzinami.

Na początek określ wymagany ekstrakt z kłącza Cyperi lub CR lub kłącza Cyperi przetworzonego octem lub CRV, aby leczyć grupę sześciu szczurów Sprague Dawley przez trzy dni. Oblicz objętość CR lub CRV, którą należy zastosować na szczura, korzystając z tego równania. Aby przetworzyć CRV, dokładnie wymieszaj 100 gramów CR i 20 gramów octu, który zawiera ponad 5,5 grama kwasu octowego na 100 mililitrów i inkubuj przez 12 godzin.

Po inkubacji smaż mieszaninę na żelaznej patelni przez 10 minut w temperaturze od 110 do 120 stopni Celsjusza. Następnie usuń mieszaninę i pozwól jej ostygnąć w temperaturze pokojowej. Aby przygotować ekstrakt CR, namocz CR przez dwie godziny czystą wodą 10 razy większą niż pobrana ilość CR, upewniając się, że materiały lecznicze znajdują się poniżej poziomu płynu.

Następnie doprowadź mieszaninę wody i lekarstwa do wrzenia na dużym ogniu i gotuj na małym ogniu przez 20 minut. Następnie przefiltruj zawartość przez tkaninę filtracyjną o siatce 100 i zbierz filtrat. Następnie zagęścić zebrany filtrat do ekstraktu za pomocą wyparki obrotowej do jednego grama na mililitr.

Aby przygotować ekstrakt CRV, należy wykonać etapy namaczania, gotowania i zagęszczania, jak pokazano dla ekstrakcji CR. W celu przetestowania ekstraktów CR i CRV należy odpipetować 500 mikrolitrów ekstraktu do 500 mikrolitrów metanolu w 1,5-mililitrowych probówkach do mikrowirówek i wirować przez 30 sekund w celu wymieszania. Odwirowywać próbki przez 15 minut w temperaturze 16,500 g w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Następnie usunąć supernatant i przenieść go do fiolki z próbką w celu przeprowadzenia testów. Po przetestowaniu próbek należy przeprowadzić analizę głównych składowych (PCA) i modelowanie za pomocą oprogramowania analitycznego. Zaimportuj ustandaryzowane dane metabolitów do oprogramowania, a następnie użyj funkcji Autofit do zbudowania modelu analizy.

Na koniec użyj wyników, aby uzyskać wykres punktowy punktacji PCA. Aby przeprowadzić ortogonalną częściową analizę dyskryminacyjną metodą najmniejszych kwadratów (OPLS-DA), należy zaimportować do oprogramowania znormalizowane dane dotyczące metabolitów oraz grup CR i CRV. Następnie zaimportuj dane CR i CRV do odpowiednich utworzonych grup.

Następnie użyj funkcji Autodopasowanie, aby zbudować model analizy i użyj wyniku, aby uzyskać wykres punktowy wyniku OPLS-DA. Na koniec użyj adresu VIP, aby uzyskać zmienną istotność w projekcji lub wartość VIP w OPLS-DA. Aby zidentyfikować potencjalnie zróżnicowane metabolity, należy odsiać metabolity o wartościach VIP większych niż jeden.

Następnie użyj oprogramowania statystycznego, aby obliczyć wartość P przesiewanych metabolitów za pomocą testu T studenta. Następnie, aby zidentyfikować metabolity różnicowe, należy użyć metabolitów z adnotacjami i odsiać metabolity różnicowe, które mają zostać dopasowane w bazie danych KEGG. Przedstawienie zmian w metabolitach różnicowych w grupach CR i CRV poprzez narysowanie mapy cieplnej.

Aby zbadać potencjalne szlaki metaboliczne, przejdź do bazy MetaboAnalyst. Użyj analizy ścieżek, aby przesłać różne metabolity w celu uzyskania potencjalnych szlaków metabolicznych. Prześlij różne metabolity do bazy danych KEGG, aby przeanalizować potencjalne szlaki metaboliczne.

Analizowany eksperyment modelowy z bolesnym miesiączkowaniem wykazał istotne różnice w poziomach prostaglandyn. Szczury w modelowych grupach CR i CRV wykazywały znaczne reakcje wijące się po wstrzyknięciu oksytocyny. Wyniki analizy PCA wykazały, że klastry CR i CRV w porównaniu z grupami modelowymi były istotnie oddzielone zarówno w trybie jonów dodatnich, jak i ujemnych.

OPLS-DA wykorzystano do badań przesiewowych pod kątem różnic metabolicznych, a wyniki wykresu punktowego wykazały, że grupy CR i CRV zostały rozdzielone. Przeprowadzono jednoczynnikowe analizy statystyczne w celu zidentyfikowania zmian metabolicznych. Pokazany jest wykres wulkanu, na którym każdy punkt odpowiada innemu metabolitowi.

Istotne zmiany zaobserwowano w 63 metabolitach w trybie dodatnim i 30 w trybie ujemnym. Zróżnicowane metabolity oznaczono za pomocą baz danych KEGG i HDMB, a następnie wymieniono dokładnie dopasowane związki. Obliczono i zgrupowano ilościowe wartości metabolitów różnicowych między grupami CR i CRV.

Kolorowe plamy wskazują, w jaki sposób każdy metabolit jest wyrażany w stosunku do pozostałych. W porównaniu z grupą CR, poziomy czterech zróżnicowanych metabolitów w grupie CRV wzrosły, podczas gdy 11 metabolitów zmniejszyło się w trybie jonów dodatnich. W przypadku trybu jonów ujemnych cztery metabolity różnicowe zwiększyły się, a siedem metabolitów zmniejszyło się.

Wyniki analizy szlaków KEGG wykazały, że zróżnicowane metabolity były związane z dziewięcioma szlakami w trybie dodatnim i ujemnym. Im więcej zróżnicowanych metabolitów, tym lepsze wyniki, dzięki czemu można połączyć wystarczającą liczbę szlaków metabolicznych, a kluczowe szlaki metaboliczne poddawane badaniom przesiewowym będą dokładniejsze.