Name: Analiza surowych i przetworzonych próbek kłącza Cyperi przy użyciu chromatografii cieczowej i tandemowej spektrometrii mas u szczurów z pierwotnym bolesnym miesiączkowaniem (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-23T14:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 36 s
Description: Dowiedz się, jak analizować surowe i przetworzone kłącze Cyperi metodą UPLC-MS/MS u szczurów z pierwotnym bolesnym miesiączkowaniem. Badanie porównuje poziomy metabolitów we krwi po zastosowaniu CR i CRV.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Projekt Nauki i Technologii Medycyny Chińskiej Miejskiej Miejskiej i Zdrowia w Chongqing (numer projektu: ZY201802297), Ogólny projekt Fundacji Nauk Przyrodniczych Chongqing (Numer projektu: cstc2019jcyj-msxmX065), Charakterystyczny Nowoczesny Obszar Górski Chongqing Charakterystyka Wysokowydajnego Systemu Innowacji Technologii Rolniczej Plan Budowy 2022 [10] oraz Projekt Budowy Kluczowej Dyscypliny Komisji Zdrowia Miasta Chongqing Chińskiego Przetwarzania Materia Medica.

Wszystkie eksperymenty związane ze zwierzętami zostały przeprowadzone za zgodą Komisji Etyki Eksperymentów Instytutu Chongqing TCM. W tym eksperymencie wykorzystano 24 samice szczurów Sprague Dawley (SD), które miały 8-10 tygodni i ważyły 200 g ± 20 g.
1. Przygotowanie ekstrakcji
<ol>
	<li>kalkulacja
	<ol>
		<li>Należy zaplanować podawanie ekstraktu CR lub CRV grupie sześciu szczurów Sprague-Dawley (10 g/[kg∙dzień]) przez 3 dni. Użyj ekstraktu CR lub CRV o stężeniu 1 g/ml (1 ml ekstraktu uzyskuje się z 1 g ziół). 
		UWAGA: Dawka CR wynosi 6-10 g. W tym badaniu jako dawkę zastosowano maksymalną dawkę 10 g. Ponieważ średnia waga osoby dorosłej wynosi 60 kg, dawka dla osoby dorosłej wynosi 0,1667 g/kg. Zgodnie z algorytmem konwersji wagi24, ponieważ współczynnik konwersji dawki między ludźmi a szczurami wynosi 6,3, dawka dla szczurów wynosi 1,05 g/kg. Dawkę leku zwiększono 10-krotnie do 10,5 g/kg u szczurów. Dawka została ustalona na 10 g/kg dla wygody obliczeń i właściwego eksperymentu. Na przykład, zgodnie z obliczeniami, jeśli potrzebne jest łącznie 36 g CR lub CRV, chiński lek ziołowy powinien być przygotowany co najmniej dwa razy. W związku z tym wymagane było 200 g CR - 100 g CR zostało użyte jako CR, a 100 g CR zostało przetworzone na CRV.</li>
		<li>Obliczyć objętość CR lub CRV, którą należy zastosować na szczura, stosując równanie (1): 
		V = 10 g/(kg∙dzień) × 200 g/(1 g/ml) = 2 ml (1)</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przetwarzanie CRV
	<ol>
		<li>Dokładnie wymieszaj 100 g CR i 20 g octu (>5,5 g kwasu octowego/100 ml) i inkubuj przez 12 godzin 
		UWAGA: Aby upewnić się, że wnętrze CR zostało zwilżone octem po 12 godzinach, CR i ocet wymieszano, dobrze wymieszano, a następnie ponownie wymieszano, aż wewnętrzna część będzie wilgotna.</li>
		<li>Mieszaj mieszaninę na żelaznej patelni przez 10 minut w temperaturze 110-120 °C. Następnie wyjmij mieszaninę i pozwól jej ostygnąć w temperaturze pokojowej. 
		UWAGA: Aby zapobiec przypaleniu się CR, konieczne jest ciągłe mieszanie podczas podgrzewania. Jeśli przetworzony CRV jest zbyt mokry, można go wysuszyć w temperaturze 60 °C. Gdy powierzchnia CR jest w sepii, smażenie można przerwać.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>wydobywanie
	<ol>
		<li>Ekstrakt z CR
		<ol>
			<li>Dodaj 10 razy (ilość CR) czystej wody do CR i moczyć przez 2 godziny. Upewnij się, że materiały lecznicze znajdują się poniżej poziomu płynu podczas moczenia. 
			UWAGA: CR należy przeciąć tylko na pół przed ekstrakcją. Celem namaczania jest skuteczniejsza ekstrakcja składników aktywnych. Proces namaczania jest niezbędny.</li>
			<li>Doprowadź mieszaninę wody i leku do wrzenia na dużym ogniu i gotuj na małym ogniu przez 20 minut. Przefiltruj za pomocą tkaniny filtracyjnej (100 oczek) i zbierz filtrat. 
			UWAGA: Podczas dekoktowania przed gotowaniem używano wysokiej temperatury, a do utrzymania wrzenia, używano niskiego ciepła.</li>
			<li>Powtórzyć krok 1.3.1.2 jeden raz i połączyć filtraty.</li>
			<li>Zagęścić ekstrakt za pomocą wyparki obrotowej do 1 g/ml (w oparciu o oryginalny lek, temperatura stężenia musi być niższa niż 60 °C). 
			UWAGA: Składniki aktywne w CR są lotne, dlatego temperatura stężenia nie powinna być wyższa niż 60 °C.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Ekstrakt z CRV
		<ol>
			<li>Wykonać te same czynności (1.3.1.1-1.3.1.3), jak w przypadku metody ekstrakcji CR.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Ekstrakt CR do badań
		<ol>
			<li>Odpipetować 500 μl ekstraktu CR i 500 μl metanolu do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i wirować przez 30 sekund, aby wymieszać. 
			UWAGA: Mieszanina metanolu i wody lepiej ekstrahuje składniki aktywne. Ekstrakt nie powinien być bezpośrednio filtrowany do testów.</li>
			<li>Odwirować każdą próbkę przez 15 minut w temperaturze 1,6502 × g w temperaturze 4 °C. Przefiltrować supernatant, a następnie przenieść go do fiolki z próbką w celu przeprowadzenia testu. 
			UWAGA: Po szybkim odwirowaniu mieszaniny metanolu i ekstraktu, supernatant można bezpośrednio przenieść do butelki na próbkę w celu oznaczenia bez filtracji. Ze względu na ciepło wytwarzane w procesie wirowania zaleca się stosowanie wirówki kriogenicznej.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Wyciąg CRV do badań
		<ol>
			<li>Wykonaj kroki 1.3.3.1-1.3.3.2, aby przygotować ekstrakt CRV do badania.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Zwierzęta
<ol>
	<li>kalkulacja
	<ol>
		<li>Weź 50 mg benzoesanu estradiolu i dodaj go do 50 ml oliwy z oliwek, aby przygotować roztwór o stężeniu 1 mg/ml. Weź 50 mg oksytocyny i dodaj ją do 50 ml soli fizjologicznej, aby przygotować roztwór o stężeniu 1 mg/ml. 
		UWAGA: Dawka dootrzewnowego wtrysku benzoesanu estradiolu i oksytocyny wynosi 10 mg/(kg∙dobę). Benzoesan estradiolu rozpuszcza się w oliwie z oliwek, a oksytocyna rozpuszcza się w zwykłej soli fizjologicznej. Benzoesan estradiolu nie jest łatwy do rozpuszczenia w oliwie z oliwek i może być leczony ultradźwiękami w celu przyspieszenia rozpuszczania. Zarówno roztwory benzoesanu estradiolu, jak i oksytocyny muszą być przygotowywane codziennie.</li>
		<li>Obliczyć objętość roztworu benzoesanu estradiolu, który należy zastosować na szczura (tj. V = 10 mg/[kg∙dzień] × 200 g/[1 g/ml] = 2 ml). Obliczyć objętość roztworu oksytocyny, którą należy zastosować na szczura (tj. V = 10 mg/[kg∙dzień] × 200 g/[1 g/ml] = 2 ml).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Grupowanie i podawanie zwierząt 
	UWAGA: Na administrację przeznaczono dziesięć dni25,26. Podczas leczenia szczury miały nieograniczony dostęp do standardowej karmy i wody. W ciągu 30 minut od podania oksytocyny śledzono aktywność wicia się każdego szczura. Model szczura PD został opracowany pomyślnie, o czym świadczą modelowe reakcje skrętne szczurów, które obejmowały skurcz macicy, obrót jednej kończyny, wyprost kończyny tylnej, pusty tułów i skurcz brzucha26.
	<ol>
		<li>Przypisz 24 samice szczurów Sprague-Dawley (szczury SD, w wieku 8-10 tygodni, o wadze 200 g ± 20 g) do czterech grup w losowej kontroli - kontrolnej, modelowej, CR i CRV - i karm je przez 7 dni.</li>
		<li>Administracja zwierząt
		<ol>
			<li>Szczurom w grupach modelowych, CR i CRV wstrzykuje się dootrzewnowo 2 ml roztworu benzoesanu estradiolu każdego dnia. Dootrzewnowo wstrzyknąć szczurom w grupie kontrolnej 2 ml soli fizjologicznej.</li>
			<li>Od 8 dnia wykonaj krok 2.2.2.1. Następnie podaj dożołądkowo 2 ml ekstraktu CRV szczurom w grupie CRV, 2 ml ekstraktu CR szczurom w grupie CR i 2 ml soli fizjologicznej szczurom w grupie kontrolnej i modelowej.</li>
			<li>W dniu 10 wykonaj krok 2.2.2.2. Następnie wstrzyknąć dootrzewnowo szczurom w grupach modelowych, CR i CRV 2 ml roztworu oksytocyny, a szczurom w grupie kontrolnej 2 ml soli fizjologicznej.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Zapisz czas wicia się szczurów w ciągu 30 minut od wstrzyknięcia oksytocyny.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pobieranie próbek
	<ol>
		<li>Pobrać próbki krwi z aorty brzusznej, szybko i całkowicie wyciąć macicę i ostrożnie oddzielić tkankę łączną i tłuszcz przylegający do ściany macicy. 
		UWAGA: Krew pobrano w ciągu 1 godziny po podaniu ostatniej dawki.</li>
		<li>Użyj probówek do mikrowirówek, aby zachować i przenieść tkankę macicy do ciekłego azotu. Próbki tkanek przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
		<li>Odwirować próbki krwi przez 10 minut przy 4,125 × g. Usunąć supernatant zawierający surowicę i odwirować w temperaturze 16 502 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Odwirować surowicę, a następnie przechowywać ją w probówce w temperaturze -80 °C do przechowywania. 
		UWAGA: Próbki krwi należy pozostawić w temperaturze pokojowej na 1 godzinę w celu ponownego przetworzenia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przetwarzanie próbek
	<ol>
		<li>Próbki surowicy
		<ol>
			<li>Umieść 400 μl metanolu i 200 μl surowicy w probówce do mikrowirówki i mieszaj przez 30 sekund. Odwirować każdą próbkę przez 15 minut w temperaturze 16 502 × g w temperaturze 4 °C. Po pobraniu i przefiltrowaniu napełnić butelki z próbkami supernatantem. Wymieszać wszystkie supernatanty z każdej próbki o tej samej objętości, aby przygotować próbki kontroli jakości do badań.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Próbki tkanki macicy
		<ol>
			<li>Weź 100 mg tkanki macicy z segmentu ipsilateralnego i zmiel ją dziewięciokrotną objętością normalnej soli fizjologicznej. Odwirować homogenat przez 10 minut w temperaturze 4,125 × g i zebrać supernatant. Umieścić supernatant w lodówce w temperaturze 4 °C do celów badania lub w temperaturze −80 °C, jeżeli nie ma być badany tego samego dnia.</li>
			<li>Umieść zwykłą sól fizjologiczną, tkankę i kulki stalowe w probówce do mikrowirówki o pojemności 2 ml, włóż probówkę do mikrowirówki do ciekłego azotu na 3-5 sekund, a następnie włóż tkankę do młynka do tkanek w celu zmielenia.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przykładowe testy
	<ol>
		<li>Użyj testu immunoenzymatycznego (ELISA), aby zmierzyć zawartość PGF2α i PGE2 w tkankach macicy w próbkach szczurów. 
		UWAGA: Do pomiaru zawartości PGE2 użyto zestawu PGE2 ELISA dla szczurów, a do pomiaru poziomu PGF2α użyto zestawu PGF2α dla szczurów. Szczegółowe kroki można znaleźć w instrukcji producenta. Szczegóły zestawu podane są w Tabeli Materiałów.</li>
		<li>Ocenić próbkę surowicy, ekstrakt CR i ekstrakt CRV za pomocą UPLC-MS/MS.
		<ol>
			<li>W przypadku UPLC należy użyć kolumny C18 (2,6 μm, 2,1 mm x 100 mm) i metody gradientu binarnego z fazą ruchomą A zawierającą 0,1% kwasu mrówkowego i fazą ruchomą B zawierającą acetonitryl. Ustaw gradient elucji w następujący sposób: od 0 min do 1 min, 15% B; od 1 min do 8,5 min, od 15% do 85% B; od 8,5 min do 11,5 min, 85% B; od 11,5 min do 11,6 min, 99% do 1% B; i od 11,6 min do 15 min, 15% B. Ustawić natężenie przepływu na 0,35 mL/min, a objętość wtrysku na 2 μL.</li>
			<li>W przypadku MS należy ustawić temperaturę na 600 °C, natężenie przepływu gazu kurtynowego (CUR) na 0,17 MPa, a zarówno osłonę, jak i natężenie przepływu gazu pomocniczego na 0,38 MPa. Ustawić napięcie rozpylania jonów w trybie jonów dodatnich i ujemnych odpowiednio na 5,5 kV i −4,5 kV, napięcie potencjału deklastrującego (DP) na 80 V lub −80 V, energię zderzenia (CE) na 40 eV lub −25 eV, a superpozycję energii zderzenia (CES) na 35 eV ± 15 eV.</li>
			<li>Wykonaj test zgodnie z protokołem producenta za pomocą UPLC-MS/MS. Wykonaj MS dla zakresu mas 50-1,000 m/z.</li>
			<li>Uzyskaj wyniki UPLC-MS/MS za pomocą pasującego programu stacji roboczej w połączeniu z akwizycją zależną od informacji w trybie wykrywania, filtrem wielu wad masy i dynamiczną dedukcją tła. Wykorzystać próbki kontroli jakości połączonej surowicy do zbadania powtarzalności i stabilności sprzętu UPLC-MS/MS w celu zweryfikowania konwencjonalnego podejścia. Przed próbkami badawczymi należy wstrzykiwać próbki kontroli jakości przez cztery kolejne serie, a następnie wstrzykiwać je po każdych pięciu próbkach surowicy.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Przetwarzanie danych
<ol>
	<li>Przygotowanie danych
	<ol>
		<li>Użyj oprogramowania do konwersji, aby przekonwertować surowe dane do formatu mzXML. Znormalizuj dane całkowitego prądu jonów (TIC) każdej próbki. 
		UWAGA: Wewnętrzna aplikacja (www.lims2.com) oparta na języku R zbudowana na XCMS została użyta do analizy informacji na potrzeby integracji, wyrównania, ekstrakcji i wykrywania szczytów27.</li>
		<li>Wykonaj adnotację metabolitów przy użyciu zastrzeżonej bazy danych MS2 (www.lims2.com). Ustaw próg adnotacji na 0.328. 
		UWAGA: Endogenne metabolity zidentyfikowano w każdej grupie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza składowych głównych i ortogonalna cząstkowa analiza dyskryminacyjna metodą najmniejszych kwadratów
	<ol>
		<li>Użyj oprogramowania analitycznego, aby przeprowadzić analizę głównych składowych (PCA) i modelowanie. Zaimportuj znormalizowane dane metabolitów do oprogramowania analitycznego. Następnie użyj funkcji autodopasowania, aby zbudować model analizy. Na koniec użyj wyniku, aby uzyskać wykres punktowy wyniku PCA. 
		UWAGA: Grupowanie każdej grupy uzyskano za pomocą wykresu punktowego punktacji PCA. PCA to tryb analizy bez nadzoru, który głównie grupuje próbki poprzez redukcję wymiarów bez interwencji.</li>
		<li>Użyj oprogramowania analitycznego, aby przeprowadzić ortogonalną częściową analizę dyskryminacyjną metodą najmniejszych kwadratów (OPLS-DA).
		<ol>
			<li>Zaimportuj znormalizowane dane dotyczące metabolitów w grupach CR i CRV do oprogramowania analitycznego.</li>
			<li>Zaimportuj dane z grupy CR do utworzonej grupy CRV i zaimportuj dane z grupy CRV do utworzonej grupy CRV. 
			UWAGA: OPLS-DA jest trybem analizy nadzorowanej i konieczne jest grupowanie próbek.</li>
			<li>Następnie użyj autodopasowania, aby zbudować model analizy i użyj wyniku, aby uzyskać wykres punktowy wyniku OPLS-DA. Na koniec należy użyć adresu VIP, aby uzyskać wartość zmiennej istotności projekcji (VIP) w OPLS-DA. 
			UWAGA: Zmienną istotność w wartościach projekcji (VIP) metabolitów w grupach CR i CRV uzyskano za pomocą OPLS-DA.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Identyfikacja potencjalnych metabolitów różnicowych
	<ol>
		<li>Należy odsiać metabolity o wartościach VIP większych niż 1 w kroku 3.2.2.3.</li>
		<li>Użyj oprogramowania statystycznego, aby obliczyć wartość P metabolitów, które zostały odsiane w kroku 3.3.1 za pomocą testu t-Studenta. 
		UWAGA: Istotne różnice w potencjalnych metabolitach różnicowych w grupach CR i CRV określono za pomocą testu t-Studenta. Potencjalnymi metabolitami różnicowymi były metabolity o wartości p w teście t-Studenta wynoszącej < 0,05 i zmiennej istotności w projekcji (VIP) większej niż 1. Przedstawienie zostało zrealizowane przy użyciu poletka wulkanicznego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Identyfikacja metabolitów różnicowych
	<ol>
		<li>Odsiać potencjalne metabolity różnicowe w kroku 3.3. Wykorzystać wyniki kroku 3.1.2 w celu zidentyfikowania tych różnicowych metabolitów. 
		UWAGA: Zidentyfikowano niewielką liczbę potencjalnych metabolitów różnicowych, które stały się potencjalnymi metabolitami różnicowymi.</li>
		<li>Odsiać metabolity różnicowe, które mają zostać dopasowane w bazie danych KEGG. Pokaż zmiany w metabolitach różnicowych w grupach CR i CRV, rysując mapę cieplną. 
		UWAGA: Niewielka liczba kandydujących metabolitów różnicowych została dopasowana i stały się one metabolitami różnicowymi.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Badanie potencjalnych szlaków metabolicznych
	<ol>
		<li>Prześlij różne metabolity do bazy danych Metaboanalyst (www.metaboanalyst.ca).</li>
		<li>Użyj analizy ścieżek, aby uzyskać potencjalne szlaki metaboliczne. 
		UWAGA: Potencjalne szlaki metaboliczne uzyskano w grupach CR i CRV. Wartość P i wartość wpływu były dwoma bardzo ważnymi wskaźnikami przy wyborze ścieżek krytycznych. Wartość P była ważniejsza niż wartość wpływu. Istotność określono za pomocą wartości P < 0,05; Większe wartości wpływu wiązały się z lepszymi korelacjami.</li>
		<li>Analizuj potencjalne szlaki metaboliczne, przesyłając różne metabolity do bazy danych KEGG (http://www.kegg.jp/kegg/pathway.html). 
		UWAGA: Należy również wziąć pod uwagę związek między funkcją szlaku metabolicznego a chorobą Parkinsona. Uzyskano kluczowe szlaki metaboliczne.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Identyfikacja składników wchłanianych do krwi
	<ol>
		<li>Zidentyfikuj składniki chemiczne w ekstraktach CR i CRV, korzystając z wewnętrznej bazy danych MS2 (www.lims2.com), bazy danych ludzkiego metabolomu (HMDB) oraz baz danych Massbank i Chemspider.</li>
		<li>Określ składniki wchłaniane do krwi w grupach CR i CRV i porównaj składniki między grupami CR i CRV. 
		UWAGA: Składniki wchłonięte do krwi muszą być wykryte w grupie CR lub CRV, ale nie mogą być wykryte w grupie kontrolnej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>analiza statystyczna
	<ol>
		<li>Analizuj dane za pomocą analizy jednowymiarowej (UVA) i wielowymiarowych metod statystycznych, w tym analizy wariancji (ANOVA) i testu t-Studenta. 
		UWAGA: Informacje eksperymentalne przedstawiono za pomocą oprogramowania statystycznego jako średnią ± odchylenie standardowe (±SD). P < 0,01 było uważane za bardzo istotną różnicę, a P < 0,05 reprezentowało istotną różnicę28.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Ze względu na ogromną różnorodność i odmienną naturę TCM, zioła te czasami nie przynoszą efektów w praktyce klinicznej, co może wynikać z niewłaściwego przetwarzania i gotowania wywarów TCM. Mechanizmy działania TCM stają się coraz bardziej przejrzyste dzięki zastosowaniu współczesnej nauki i technologii29,30. Niniejsze badanie wykazuje, że zarówno CR, jak i CRV wykazują działanie terapeutyczne u szczurów w modelu PD, przy czym efekt terapeutyczny CRV jest bardzi...

Pierwotne bolesne miesiączkowanie (PD) jest najbardziej rozpowszechnionym schorzeniem w ginekologii klinicznej. Charakteryzuje się bólem pleców, obrzękiem, bólem brzucha lub dyskomfortem przed lub w trakcie menstruacji bez patologii miednicy w układzie rozrodczym1. Raport na temat jego rozpowszechnienia wykazał, że 85,7% uczniów cierpi na PD2. Doustne środki antykoncepcyjne w małych dawkach są standardową terapią, ale ich niepożądane skutki uboczne, takie jak zakrzepica żył głębokich, przyciągają coraz większą uwagę3. Częstość występowania zakrzepicy żył głębokich wśród osób stosujących doustne środki antykoncepcyjne wynosi >1 na 1000 kobiet, a ryzyko jest najwyższe w ciągu pierwszych 6-12 miesięcy oraz u użytkowników w wieku powyżej 40 lat4.
Długo używany w tradycyjnej medycynie chińskiej (TCM), Cyperi rhizoma (CR) pochodzi z suszonego kłącza Cyperus rotundus L. z rodziny Cyperaceae. CR reguluje zaburzenia miesiączkowania oraz łagodzi depresję i ból5. CR jest szeroko stosowany w ginekologii i jest uważany za lek ogólny w leczeniu chorób kobiecych6. CR przetwarzany octem (CRV) jest zwykle stosowany klinicznie. W porównaniu z CR, CRV wykazuje zwiększoną regulację miesiączki i łagodzenie bólu. Współczesne badania wykazały, że CR hamuje cyklooksygenazę-2 (COX-2) i późniejszą syntezę prostaglandyn (PGs), osiągając w ten sposób działanie przeciwzapalne. Tymczasem CR wykazuje działanie przeciwbólowe bez skutków ubocznych7, co czyni CR dobrym wyborem dla pacjentek z bolesnym miesiączkowaniem. Jednak mechanizm leżący u podstaw regulacji miesiączki i łagodzenia bólu przez CRV jest niejasny. Badania CR koncentrowały się głównie na zmianach w jego aktywnych składnikach chemicznych i działaniach farmakologicznych, takich jak działanie przeciwzapalne, przeciwdepresyjne i przeciwbólowe8,9,10,11,12.
Chociaż składniki TCM są złożone, są wchłaniane do krwi i muszą osiągnąć określone stężenie we krwi, aby były skuteczne13. Zakres badań przesiewowych składników czynnych TCM można zawęzić, wykorzystując strategię oznaczania składników we krwi. Ślepoty można uniknąć badając składniki chemiczne in vitro, a jednostronności można uniknąć badając poszczególne składniki14. Porównując skład CR i CRV we krwi, można skutecznie i szybko wykryć zmiany w składnikach aktywnych przetwarzanego CR. Skuteczność leku to proces, w którym lek wpływa na organizm. Zmiany w składnikach leku spowodowane odpowiedzią metaboliczną organizmu, które mogą być związane z mechanizmem działania leku, można określić za pomocą metabonomiki. Metabonomika ma na celu zmierzenie ogólnych i dynamicznych odpowiedzi metabolicznych, co jest zgodne z określeniem ogólnej skuteczności tradycyjnej medycyny chińskiej15. Co więcej, metabolity są końcowym produktem ekspresji genów, która jest najściślej związana z fenotypami16. W związku z tym metabonomika może być odpowiednia do badania różnic w szlakach metabolicznych między CR i CRV w leczeniu PD. Nieukierunkowana metabolomika oparta na chromatografii cieczowej z tandemową spektrometrią mas o wysokiej rozdzielczości (LC-MS/MS) charakteryzuje się wysoką przepustowością, wysoką czułością i wysoką rozdzielczością i może być stosowana do pomiaru wielu różnych składników małocząsteczkowych<klasa sup="xref">17,18. Metoda ta pozwala jednocześnie określić endogenne metabolity i składniki egzogenne wchłaniane do krwi. Metabonomika jest szeroko stosowana w badaniach nad TCM19, toksykologią leków20, zarządzaniem zdrowiem21, sports22, food23 i innymi dziedzinami.
W tym badaniu, różnice w egzogennych składnikach wchłanianych do krwi i endogennych metabolitach zostały zmierzone między szczurami z bolesnym miesiączkowaniem leczonym CR i CRV przy użyciu nieukierunkowanej metabolomiki opartej na LC-MS/MS, aby ujawnić mechanizmy przeciwbólowego działania CRV.

<table><tbody><tr><td>Acetonitryl&nbsp;</td><td>Fisher Scientific, Pittsburg, PA, Stany Zjednoczone</td><td>197164</td><td></td></tr><tr><td>BECKMAN COULTER Microfuge 20</td><td>Beckman&nbsp; Coulter, Inc.</td><td></td><td></td>MRZ15K047</tr><tr><td>Benzoesan estradiolu</td><td>Shanghai Macklin Biochemical Co., Ltd</td><td>C10042616</td><td></td></tr><tr><td>kwas mrówkowy</td><td>Fisher Scientific, Pittsburg, PA, Stany</td><td>Zjednoczone 177799</td><td></td></tr><tr><td>System LC 30A</td><td>Shimadzu, Kioto, Japonia</td><td>228-45162-46</td><td></td></tr><tr><td>Oliwa z oliwek</td><td>Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd</td><td>H25A11P111909</td><td></td></tr><tr><td>Oksytocyna syntetyczna</td><td>Biologia peptydów Zhejiang Co., Ltd&nbsp;</td><td></td><td></td>2019092001</tr><tr><td>Szczur PGF2&alpha; Zestaw ELISA</td><td>Shanghai lmai Bioengineering Co., Ltd</td><td>202101</td><td></td></tr><tr><td>Szczur Zestaw ELISA PGFE2</td><td>Shanghai lmai Bioengineering Co., Ltd</td><td>EDL202006217</td><td></td></tr><tr><td>SPF Szczury Sprague-Dawley</td><td>Hunan SJA Laboratory Animal Co., Ltd</td><td>Numer certyfikatu: SCXK (Hunan) 2019-0004</td><td></td></tr><tr><td>Tecan Infinite 200 PRO&nbsp; &nbsp;</td><td>Tecan Austria GmbH, Austria</td><td>1510002987</td><td></td></tr><tr><td>Potrójny system TOF 4600</td><td>SCIEX, Framingham, MA, Stany Zjednoczone</td><td>BK20641402</td><td></td></tr><tr><td>wody</td><td>Fisher Scientific, Pittsburg, PA, USA</td><td>152720</td><td></td></tr></tbody></table>

analiza surowych i przetworzonych próbek kłącza cyperi przy użyciu chromatografii cieczowej i tandemowej spektrometrii mas u szczurów z pierwotnym bolesnym miesiączkowaniem

Analysis of Raw and Processed Cyperi Rhizoma Samples Using Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry in Rats with Primary Dysmenorrhea

Cyperi rhizoma (CR) jest szeroko stosowana w ginekologii i jest ogólnym lekiem do leczenia chorób kobiecych w Chinach. Ponieważ działanie przeciwbólowe CR jest wzmocnione po przetworzeniu octem, CR przetworzony z octem (CRV) jest powszechnie stosowany klinicznie. Jednak mechanizm, za pomocą którego działanie przeciwbólowe jest wzmacniane przez przetwarzanie octu, jest niejasny. W tym badaniu zastosowano technikę ultrawysokociśnieniowej chromatografii cieczowej i tandemowej spektrometrii mas (UPLC-MS/MS) w celu zbadania zmian we krwi poziomów egzogennych składników i metabolitów między szczurami leczonymi CR i CRV z bolesnym miesiączkowaniem. Wyniki ujawniły różne poziomy 15 składników i dwóch metabolitów we krwi tych szczurów. Wśród nich poziomy kwasu (-)-myrtenolu i kwasu [(1R,2S,3R,4R)-3-hydroksy-1,4,7,7-tetrametylobikucyklo[2.2.1]hept-2-ylo]octowego w grupie CRV były znacznie wyższe niż w grupie CR. CRV obniżał poziom prostanoidów serii 2 i leukotrienów serii 4 o działaniu prozapalnym, agregacji płytek krwi i zwężeniu naczyń krwionośnych oraz zapewniał działanie przeciwbólowe poprzez modulację metabolizmu kwasu arachidonowego i kwasu linolowego oraz biosyntezę nienasyconych kwasów tłuszczowych. Badanie to wykazało, że przetwarzanie octu wzmacnia przeciwbólowe działanie CR i przyczynia się do zrozumienia mechanizmu działania CRV.

Analiza eksperymentu z modelem dysmenorrhea 
W grupie kontrolnej w ciągu 30 min nie wystąpiła reakcja wićnięcia, ponieważ szczury te nie otrzymały dokanałowo oksytocyny i benzoesanu estradiolu w celu wywołania bólu. Szczury w grupach modelowej, CR oraz CRV wykazały znaczące reakcje wićnięcia po iniekcji oksytocyny. Wyniki te potwierdzają skuteczność kombinacji benzoesanu estradiolu i oksytocyny w indukowaniu dysmenorrhea. Różnice w poziomach PGF2α, PGE2 oraz stosunku PGF2α</...

Tutaj przedstawiono analizę porównawczą surowych i przetworzonych próbek kłącza Cyperi (CR) za pomocą ultra-wysokosprawnej chromatografii cieczowej i tandemowej spektrometrii mas o wysokiej rozdzielczości (UPLC-MS/MS) u szczurów z pierwotnym bolesnym miesiączkowaniem. Zmiany w stężeniach metabolitów i składników próbki we krwi badano między szczurami leczonymi CR i CR przetwarzanymi octem (CRV).

Analiza surowych i przetworzonych próbek kłącza Cyperi przy użyciu chromatografii cieczowej i tandemowej spektrometrii mas u szczurów z pierwotnym bolesnym miesiączkowaniem

Cyperi rhizoma (CR) is widely used in gynecology and is a general medicine for treating women's diseases in China. Since the analgesic effect of CR is ...

Metabonomika mierzy ogólną i dynamiczną odpowiedź metaboliczną i jest spójna z określaniem ogólnej skuteczności tradycyjnej medycyny chińskiej. Zmiany w składnikach leku spowodowane odpowiedzią metaboliczną organizmu można określić za pomocą metabonomiki. Stosując tę technikę, można zawęzić zakres badań przesiewowych aktywnych składników TCM.Jednostronności można uniknąć, badając poszczególne składniki. Metoda ta może być jednoczesna, oznaczać endogenne metabolity i składniki egzogenne wchłaniane do krwi. Metabonomika jest szeroko stosowana w badaniach nad TCM, toksykologią leków, zarządzaniem zdrowiem, sportem, żywnością i innymi dziedzinami.Na początek określ wymagany ekstrakt z kłącza Cyperi lub CR lub kłącza Cyperi przetworzonego octem lub CRV, aby leczyć grupę sześciu szczurów Sprague Dawley przez trzy dni. Oblicz objętość CR lub CRV, którą należy zastosować na szczura, korzystając z tego równania. Aby przetworzyć CRV, dokładnie wymieszaj 100 gramów CR i 20 gramów octu, który zawiera ponad 5,5 grama kwasu octowego na 100 mililitrów i inkubuj przez 12 godzin.Po inkubacji smaż mieszaninę na żelaznej patelni przez 10 minut w temperaturze od 110 do 120 stopni Celsjusza. Następnie usuń mieszaninę i pozwól jej ostygnąć w temperaturze pokojowej. Aby przygotować ekstrakt CR, namocz CR przez dwie godziny czystą wodą 10 razy większą niż pobrana ilość CR, upewniając się, że materiały lecznicze znajdują się poniżej poziomu płynu.Następnie doprowadź mieszaninę wody i lekarstwa do wrzenia na dużym ogniu i gotuj na małym ogniu przez 20 minut. Następnie przefiltruj zawartość przez tkaninę filtracyjną o siatce 100 i zbierz filtrat. Następnie zagęścić zebrany filtrat do ekstraktu za pomocą wyparki obrotowej do jednego grama na mililitr.Aby przygotować ekstrakt CRV, należy wykonać etapy namaczania, gotowania i zagęszczania, jak pokazano dla ekstrakcji CR. W celu przetestowania ekstraktów CR i CRV należy odpipetować 500 mikrolitrów ekstraktu do 500 mikrolitrów metanolu w 1,5-mililitrowych probówkach do mikrowirówek i wirować przez 30 sekund w celu wymieszania. Odwirowywać próbki przez 15 minut w temperaturze 16,500 g w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Następnie usunąć supernatant i przenieść go do fiolki z próbką w celu przeprowadzenia testów. Po przetestowaniu próbek należy przeprowadzić analizę głównych składowych (PCA) i modelowanie za pomocą oprogramowania analitycznego. Zaimportuj ustandaryzowane dane metabolitów do oprogramowania, a następnie użyj funkcji Autofit do zbudowania modelu analizy.Na koniec użyj wyników, aby uzyskać wykres punktowy punktacji PCA. Aby przeprowadzić ortogonalną częściową analizę dyskryminacyjną metodą najmniejszych kwadratów (OPLS-DA), należy zaimportować do oprogramowania znormalizowane dane dotyczące metabolitów oraz grup CR i CRV. Następnie zaimportuj dane CR i CRV do odpowiednich utworzonych grup.Następnie użyj funkcji Autodopasowanie, aby zbudować model analizy i użyj wyniku, aby uzyskać wykres punktowy wyniku OPLS-DA. Na koniec użyj adresu VIP, aby uzyskać zmienną istotność w projekcji lub wartość VIP w OPLS-DA. Aby zidentyfikować potencjalnie zróżnicowane metabolity, należy odsiać metabolity o wartościach VIP większych niż jeden.Następnie użyj oprogramowania statystycznego, aby obliczyć wartość P przesiewanych metabolitów za pomocą testu T studenta. Następnie, aby zidentyfikować metabolity różnicowe, należy użyć metabolitów z adnotacjami i odsiać metabolity różnicowe, które mają zostać dopasowane w bazie danych KEGG. Przedstawienie zmian w metabolitach różnicowych w grupach CR i CRV poprzez narysowanie mapy cieplnej.Aby zbadać potencjalne szlaki metaboliczne, przejdź do bazy MetaboAnalyst. Użyj analizy ścieżek, aby przesłać różne metabolity w celu uzyskania potencjalnych szlaków metabolicznych. Prześlij różne metabolity do bazy danych KEGG, aby przeanalizować potencjalne szlaki metaboliczne.Analizowany eksperyment modelowy z bolesnym miesiączkowaniem wykazał istotne różnice w poziomach prostaglandyn. Szczury w modelowych grupach CR i CRV wykazywały znaczne reakcje wijące się po wstrzyknięciu oksytocyny. Wyniki analizy PCA wykazały, że klastry CR i CRV w porównaniu z grupami modelowymi były istotnie oddzielone zarówno w trybie jonów dodatnich, jak i ujemnych.OPLS-DA wykorzystano do badań przesiewowych pod kątem różnic metabolicznych, a wyniki wykresu punktowego wykazały, że grupy CR i CRV zostały rozdzielone. Przeprowadzono jednoczynnikowe analizy statystyczne w celu zidentyfikowania zmian metabolicznych. Pokazany jest wykres wulkanu, na którym każdy punkt odpowiada innemu metabolitowi.Istotne zmiany zaobserwowano w 63 metabolitach w trybie dodatnim i 30 w trybie ujemnym. Zróżnicowane metabolity oznaczono za pomocą baz danych KEGG i HDMB, a następnie wymieniono dokładnie dopasowane związki. Obliczono i zgrupowano ilościowe wartości metabolitów różnicowych między grupami CR i CRV.Kolorowe plamy wskazują, w jaki sposób każdy metabolit jest wyrażany w stosunku do pozostałych. W porównaniu z grupą CR, poziomy czterech zróżnicowanych metabolitów w grupie CRV wzrosły, podczas gdy 11 metabolitów zmniejszyło się w trybie jonów dodatnich. W przypadku trybu jonów ujemnych cztery metabolity różnicowe zwiększyły się, a siedem metabolitów zmniejszyło się.Wyniki analizy szlaków KEGG wykazały, że zróżnicowane metabolity były związane z dziewięcioma szlakami w trybie dodatnim i ujemnym. Im więcej zróżnicowanych metabolitów, tym lepsze wyniki, dzięki czemu można połączyć wystarczającą liczbę szlaków metabolicznych, a kluczowe szlaki metaboliczne poddawane badaniom przesiewowym będą dokładniejsze.

analysis-raw-processed-cyperi-rhizoma-samples-using-liquid

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Nieukierunkowana metabolomika dostarcza hipotezy generującej migawkę profilu metabolicznego.  Protokół ten zademonstruje ekstrakcję i analizę metabolitów z komórek, surowicy lub tkanki.  Szereg metabolitów jest badany za pomocą ekstrakcji ciecz-faza cieczowa, ultraprzepływowej chromatografii cieczowej/spektrometrii mas o wysokiej rozdzielczości (UPLC-HRMS) w połączeniu z oprogramowaniem do analizy różnicowej.

Nieukierunkowana metabolomika ze źródeł biologicznych przy użyciu ultrasprawnej chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas o wysokiej rozdzielczości (UPLC-HRMS)

Ten artykuł demonstruje ustandaryzowany proces działania moksowania linii medycznej Zhuang u zwierząt doświadczalnych. Aby osiągnąć powtarzalność i dokładność moksoterapii linii medycznej Zhuang, opracowaliśmy symulator do utrzymania siły, ciepła i częstotliwości. Skonstruowaliśmy model bolesnego miesiączkowania do eksperymentalnej weryfikacji u szczurów z zespołem zimnego krzepnięcia.

Lecznicza terapia moksybustion nici medycyny Zhuang i jej zastosowanie w szczurzym modelu zespołu zimno-krzepnięcia pierwotnego bolesnego miesiączkowania

Opisujemy ogólny protokół, który integruje analizę spektrometrii mas o wysokiej rozdzielczości i dokowanie molekularne w badaniach tradycyjnej medycyny chińskiej.

Tandemowa spektrometria mas o wysokiej rozdzielczości do badania składników chemicznych Gynura bicolor DC

Tutaj szczegółowo opisujemy procedury operacyjne i środki ostrożności, które należy podjąć podczas moksyterapii pępka z podziałem ziół w leczeniu pierwotnego bolesnego miesiączkowania u szczurów z zimną krzepliwością i zastojem krwi, co może znacznie poprawić reakcję wicia się u szczurów z bolesnym miesiączkowaniem i złagodzić ból.

Moksowanie z podziałem ziół na pępek w szczurzym modelu pierwotnego bolesnego miesiączkowania z zimną krzepnięciem i zastojem krwi

Farmakoterapia polegająca na zastępowaniu dopaminy za pomocą L-DOPA jest najczęściej stosowanym leczeniem objawowym choroby Parkinsona, jednak wiąże się z efektami ubocznymi, w tym z mimowolnymi, nieprawidłowymi ruchami, określanymi mianem dyskinezy 1. W niniejszym materiale przedstawiono protokół obrazowania metodą spektrometrii mas MALDI, który pozwala wykryć zmiany w poziomach neuropeptydów w mózgu szczura związane z dyskinezą.

Obrazowanie spektrometrią mas MALDI neuropeptydów w chorobie Parkinsona

Uszkodzenia mózgu wynikające z niedokrwienia mózgu mogą być nieinwazyjnie obrazowane i badane u szczurów za pomocą przedklinicznej pozytonowej tomografii emisyjnej połączonej z wstrzykiwaną sondą radioaktywną, 18F-fluorodeoksyglukozą. Co więcej, wykorzystanie nowoczesnych narzędzi programowych, które zawierają szablony mózgu dotyczące ilości zainteresowania (VOI), znacznie zwiększa ilość informacji uzyskanych z tych badań.

Nieinwazyjne obrazowanie i analiza niedokrwienia mózgu u żywych szczurów przy użyciu pozytonowej tomografii emisyjnej z 18F-FDG

Użycie pobierania próbek cytoszczotek do pobierania limfocytów i monocytów z szyjki macicy jest minimalnie inwazyjną techniką, która dostarcza próbek do analizy odporności żeńskich dróg rodnych. W tym protokole opisujemy pobieranie próbek cytoszczotek i izolację komórek odpornościowych do testów cytometrii przepływowej.

Pobieranie, izolacja i analiza cytometryczna przepływowa próbek z ludzkiej szyjki macicy

Dogłębne analizy proteomów komórek nowotworowych ułatwiają identyfikację nowych celów leków i biomarkerów diagnostycznych. Opisujemy eksperymentalny przepływ pracy do analizy ilościowej (fosfo-)proteomów w subpopulacjach komórek nowotworowych pochodzących z guzów płynnych i litych. Osiąga się to poprzez połączenie strategii wzbogacania komórek z ilościową spektrometrią mas opartą na Super-SILAC.

Ilościowe profilowanie spektrometryczne mas proteomów komórek nowotworowych pochodzących z guzów płynnych i litych

Encefalopatia wcześniaków obejmuje nieprawidłowości ośrodkowego układu nerwowego związane z uszkodzeniem spowodowanym przedwczesnym porodem. W niniejszym raporcie opisano klinicznie istotny szczurzy model przejściowego ogólnoustrojowego niedotlenienia i niedokrwienia w macicy oraz podawania lipopolisacharydów owodniowych (LPS), który naśladuje zapalenie błon płodowych i związanego z tym wpływu bodźców zakaźnych i niedostatecznej perfuzji łożyska na rozwój OUN.

Modelowanie encefalopatii wcześniaków za pomocą prenatalnej hipoksji-niedokrwienia lipopolisacharydem wewnątrzowodniowym u szczurów

Tutaj opisujemy protokół wykorzystujący mikrodysekcję laserową w połączeniu z analizą LC/MS do przestrzennego ilościowego określania dystrybucji leków w ziarniniakach gruźlicy płuc. Podejście to ma szerokie zastosowanie w ilościowym określaniu stężeń leków w tkankach przy dużej szczegółowości przestrzennej.

Kwantyfikacja przestrzenna leków w zmianach gruźlicy płuc za pomocą mikrodysekcji laserowej Chromatografia cieczowa ze spektrometrią mas (LCM-LC/MS)

Dowiedz się, jak analizować surowe i przetworzone kłącze Cyperi metodą UPLC-MS/MS u szczurów z pierwotnym bolesnym miesiączkowaniem. Badanie porównuje poziomy metabolitów we krwi po zastosowaniu CR i CRV.

Analiza surowych i przetworzonych próbek kłącza Cyperi przy użyciu chromatografii cieczowej i tandemowej spektrometrii mas u szczurów z pierwotnym bolesnym miesiączkowaniem (Wideo) | JoVE Journal

Analiza surowych i przetworzonych próbek kłącza Cyperi przy użyciu chromatografii cieczowej i tandemowej spektrometrii mas u szczurów z pierwotnym bolesnym miesiączkowaniem

Przeglądaj więcej filmów