Name: Pobieranie, izolacja i analiza cytometryczna przepływowa próbek z ludzkiej szyjki macicy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 34 s
Description: Poznaj metodę izolacji komórek mononuklearnych z szyjki macicy przy użyciu cytobrusha i cytometrii przepływowej. Ta technika umożliwia analizę fenotypu i funkcji komórek odpornościowych w drogach rodnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Joshua Kimani, dyrektorowi klinicznemu programu badawczego na Uniwersytecie w Nairobi, za jego pomoc w badaniach immunologicznych błony śluzowej związanych z tym protokołem. Autorzy pragną podziękować za dofinansowanie z grantu CHVI MOP 86721.

Oświadczenie etyczne: Komisje etyki badań zarówno Uniwersytetu Manitoba, jak i Narodowego Szpitala Kenyatta / Uniwersytetu w Nairobi zatwierdziły to badanie i uzyskano pisemną świadomą zgodę od wszystkich uczestników badania.
1. Przygotowanie pożywek i probówek do zbierania CMC
<ol>
	<li>Przygotować roztwór soli fizjologicznej buforowany fosforanami (PBS) (137,93 mM NaCl, 2,67 mM KCl, 8,1 mM Na2HPO4, 1,47 mM KH2PO4). Autoklaw do sterylności. Można go przechowywać w temperaturze 4 ºC przez kilka miesięcy.</li>
	<li>Wstępnie podwielokrotne 5 ml PBS przelać do probówki sokoła o pojemności 50 ml (po jednej na próbkę, która ma zostać pobrana) i przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu pobrania próbki.</li>
	<li>Oznaczyć 2-4 kriowiale lub 1,5 ml probówek mikrowirówkowych na próbkę, aby zebrać popłuczyny do przechowywania.</li>
	<li>Przygotować pożywkę do hodowli komórkowych: RPMI 1640 + 1% penicylina/streptomycyna/amfoterycyna B (stężenie końcowe odpowiednio 100 jednostek/ml, 100 μg/ml i 250 ng/ml, bez dodatku FCS/FBS.</li>
</ol>
2. Zbiór próbek Cytobrush
Pobieranie próbek cytobrush to nieinwazyjna procedura, która musi być wykonana przez przeszkolonego lekarza lub ginekologa.
<ol>
	<li>Zbierz komórki jednojądrzaste szyjki macicy (CMC) za pomocą cytoszczoteczki, jak i drewnianego lub plastikowego skrobaka. Pobrać CMC od uczestnika poddanego badaniu wziernika, wkładając skrobak i obracając wokół szyjki macicy (ryc. 1). Włóż cytoszczoteczkę do szyjki macicy, obróć o 360° i natychmiast umieść zarówno cytoszczoteczkę, jak i skrobak w 50 ml probówce Falcon zawierającej 5 ml PBS.</li>
	<li>Przechowywać próbki na lodzie/w temperaturze 4 ºC do czasu przetworzenia. Aby utrzymać żywotność komórek, należy przetwarzać próbki w ciągu 2 godzin od pobrania.</li>
	<li>Jeśli to możliwe, należy pobrać dopasowane próbki krwi w zielonych górnych wakutainerach heparyny do izolacji komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC), aby służyły jako komparator/kontrola do analizy CMC.</li>
</ol>
3. Izolacja CMC
Przeprowadź przetwarzanie próbki w laboratorium poziomu bezpieczeństwa biologicznego 2, w sterylnej komorze bezpieczeństwa biologicznego w podwójnych rękawicach.
<ol>
	<li>Podczas pobierania próbki CMC mogą zostać zanieczyszczone krwią. Należy wykluczyć z badania próbki z widocznym zanieczyszczeniem krwi, aby zapobiec mylącemu włączeniu PBMC do próbki końcowej. Ze względu na małą liczbę limfocytów wyizolowanych z próbek CMC, niewielkie zanieczyszczenie krwi może łatwo przytłoczyć składnik limfocytów CMC.</li>
	<li>Wiruj probówki sokoła zawierające zarówno cytoszczotkę, jak i skrobak przez 45 sekund, aby oddzielić komórki od szczotek. Podczas tego procesu próbki mogą się pienić; To normalne.</li>
	<li>Użyj cytoszczotki, aby zeskrobać pozostały materiał ze skrobaka i wyrzuć skrobak do roztworu wybielacza. Aby zebrać wszelkie pozostałe komórki przyczepione do szczotki/skrobaka, użyj świeżej rękawicy, aby ścisnąć skrobak między kciukiem a palcem wskazującym. Przesuń szczoteczkę w dół, pozwalając na zebranie komórek i PBS w tej samej probówce o pojemności 50 ml. Wyrzuć cytoszczotę do roztworu wybielacza i wyrzuć rękawicę. 
	WAŻNE: Do każdej próbki należy używać nowych rękawic.</li>
	<li>Dopasuj nylonowe sitko o średnicy 100 μm do świeżej probówki Falcon o pojemności 50 ml. Za pomocą pipety transferowej pobrać zawiesinę komórek PBS z probówki z próbką i przefiltrować przez sitko do świeżej probówki.</li>
	<li>Dodać 5 ml RPMI 1640 do oryginalnej probówki na próbkę. Za pomocą pipety transferowej umyj boki probówki z próbką za pomocą RPMI i przenieś przez filtr do nowej probówki zbiorczej. Umyj również spód nylonowego filtra za pomocą RPMI.</li>
	<li>Odwirowywać próbki przez 10 minut przy 514 x g. Na tym etapie bardzo ważne jest, aby pozostawić wyłączony hamulec wirówki, aby zapobiec przemieszczeniu się granulki CMC.</li>
	<li>Delikatnie usunąć sklarowany osad z probówki, uważając, aby nie naruszyć osadu. Wielkość granulek będzie bardzo zmienna; W niektórych próbkach osad jest dość duży ze względu na obecność dużej liczby komórek nabłonkowych, podczas gdy w innych przypadkach osad jest ledwo widoczny i wysoce przezroczysty.</li>
	<li>Zawiesić granulkę poprzez delikatne poruszenie rurki sokoła. Dodać 5 ml PBS w celu przepłukania próbki.</li>
	<li>Wirować ponownie przez 10 minut przy 514 x g bez hamulca wirówki.</li>
	<li>Ostrożnie wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad jak powyżej. Komórki są gotowe do kriokonserwacji (przy użyciu protokołu kriokonserwacji PBMC), stymulacji lub fenotypowania metodą cytometrii przepływowej.</li>
</ol>
4. Barwienie powierzchni CMC i cytometria przepływowa
<ol>
	<li>Zawiesić osad z etapu 3.10 w 100 μl roztworu blokującego i przenieść do płytki 96-dołkowej lub probówki FACS. Receptura roztworu blokującego (do blokowania receptorów Fcγ) jest następująca: 1,8 μl mysiej IgG (stężenie końcowe 0,2 μg/μl), 5 μl FBS i 93,2 μl FACS wash (PBS+2%FBS). Barwienie można przeprowadzić w płytce 96-dołkowej, jeśli rozmiary granulek są wystarczająco małe, ale może być konieczne wykonanie w probówkach FACS, jeśli granulki są rutynowo duże. Ważne jest, aby odpowiednio miareczkować przeciwciała.</li>
	<li>Zatrzymać próbki na 10 minut na lodzie/w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przemyć komórki 100 μl FACS Wash (PBS + 2% FBS) w 96-dołkowych płytkach lub 500 μl w probówkach FACS. Wirować przy 600 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C z hamulcem włączonym na niskim poziomie (lub wyłączonym, jeśli ustawienie hamulca na niskim poziomie jest niedostępne).</li>
	<li>Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy przez mieszanie. Dodaj Plamę żywotności (barwnik żywotności Live Dead, który można naprawić). Przygotuj barwnik żywotności zgodnie z instrukcjami producenta. Może być konieczne miareczkowanie do użycia w każdym zestawie laboratorium/cytometru. Inkubować przez 30 minut w ciemności w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przemyć komórki 100 μl/500 μl PBS (dla płytki 96-dołkowej/probówek FACS). Wirować przy 600 x g przez 10 minut z hamulcem przy niskim lub zerowym hamowaniu. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki.</li>
	<li>Inkubować komórki z koktajlem przeciwciał markerowych powierzchniowych w łącznej objętości 100 μl. WAŻNE: Zoptymalizuj i miareczkuj każdy panel cytometrii przepływowej przed barwieniem próbki. Inkubować komórki przez 30 minut w ciemności w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Powtórzyć krok 4.5. w przypadku barwienia na płytce 96-dołkowej, przenieść komórki do probówki FACS i rozcieńczyć do końcowej objętości 750 μl FACS Wash zawierającego 1% paraformaldehydu (PFA) (lub CytoFix, rozcieńczony 1:4). Przejdź do akwizycji danych na cytometrze przepływowym.</li>
</ol>
5. Pobieranie i przygotowanie płukania szyjki macicy (CVL)
<ol>
	<li>Przed pobraniem próbek cytoszczoteczki należy użyć strzykawki, aby przemyć szyjkę macicy 2 ml sterylnego PBS i odessać płukanie z tylnego otworu.</li>
	<li>Pobrać zasysaną próbkę płukania do probówki sokoła o pojemności 15 ml i przechowywać na lodzie/w temperaturze 4 °C do czasu przetworzenia.</li>
	<li>Odwirować próbkę o masie 400 x g przez 7 minut w celu usunięcia resztek komórkowych.</li>
	<li>Zebrać supernatant, podzielić próbkę na 1 ml lub 500 μl podwielokrotności i przechowywać w temperaturze -70 °C. Podwielokrotności można rozmrażać w celu przeprowadzenia testu ELISA lub analizy matrycy kulkowej białek CVL, ale należy unikać wielokrotnych cykli zamrażania/rozmrażania.</li>
	<li>W razie potrzeby ponownie zawieś osad resztek komórkowych w RNA Później, aby zmierzyć ekspresję RNA, postępując zgodnie z protokołem producenta.</li>
</ol>
6. Akwizycja danych
<ol>
	<li>Przygotuj zestaw probówek kompensacyjnych, który pasuje do panelu przeciwciał. Uruchom rurki kompensacyjne, aby dostosować nakładanie się widma. Uruchom próbki na dowolnym wielokolorowym cytometrze przepływowym, który jest skonfigurowany dla przeciwciał sprzężonych z fluorochromem używanych w panelu.</li>
	<li>Najpierw pobierz próbkę PBMC, aby dostosować napięcie rozpraszania do przodu (FSC) i rozpraszania bocznego (SSC) w celu wykrycia populacji limfocytów. Staraj się, aby były one na poziomie 100 na każdej osi w skali liniowej. Przeprowadzenie kontroli PBMC znacznie ułatwi znalezienie populacji limfocytów CMC.</li>
	<li>Próg FSC dla próbek CMC może wymagać podwyższenia w stosunku do próbek PBMC ze względu na rozmazanie osi SSC przy niskich wartościach FSC.</li>
	<li>Wiruj każdą rurkę przed nabyciem. Zdobądź całą probówkę, aby zmaksymalizować liczbę zebranych zdarzeń bramki limfocytów. Uważnie monitoruj maszynę, aby uniknąć zatkania.</li>
	<li>Wyeksportuj dane do programu do analizy cytometrii przepływowej, takiego jak FlowJo.</li>
</ol>
7. Strategia bramkowania
<ol>
	<li>Wybierz opcję Forward side scatter high (FSC-H)/Forward side scatter area (FSC-A), aby określić populację singletów.</li>
	<li>Wybierz opcję Czas w funkcji markera fluorescencyjnego (jako przykład FITC), aby kontrolować jakość akwizycji. Zmiana natężenia przepływu może spowodować pojawienie się artefaktów w danych. Wyklucz wszystkie obszary, które wykazują rozbieżność w natężeniu przepływu.</li>
	<li>Zidentyfikuj populację limfocytów na wykresie SSC-A/FSC-A. Użyj kontrolki PBMC, aby ułatwić identyfikację. Należy pamiętać, że populacja limfocytów CMC może nie być tak wyraźna jak kontrola PBMC.</li>
	<li>Bramka na barwniku SSC-A / żywotności w celu wykluczenia martwych komórek z żywych komórek. Martwe komórki mogą niespecyficznie zawierać przeciwciała, które wprowadzą artefakty.</li>
	<li>Bramka na SSC-A / CD3 w celu identyfikacji populacji limfocytów T. Z tej bramki zidentyfikuj populacje CD4+ i CD8+.</li>
</ol>

<ol><li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UNAIDS.+Global+Report+2013%5BTitle%5D)+AND+%22http%3A%2F%2Fwww.unaids.org%2Fen%2Fmedia%2Funaids%2Fcontentassets%2Fdocuments%2Fepidemiology%2F2013%2Fgr2013%2FUNAIDS_Global_Report_2013_en.pdf%22%5BJournal%5D)">UNAIDS. Global Report 2013.</a> http://www.unaids.org/en/media/unaids/contentassets/documents/epidemiology/2013/gr2013/UNAIDS_Global_Report_2013_en.pdf. , (2013).</li>
<li>Rodriguez-Garcia, M., Patel, M. V., Wira, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+and+adaptive+anti-HIV+immune+responses+in+the+female+reproductive+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+reproductive+immunology%22%5BJournal%5D)">Innate and adaptive anti-HIV immune responses in the female reproductive tract.</a> Journal of reproductive immunology. 97, 74-84 (2013).</li>
<li>Douek, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+disease+progression%3A+immune+activation%2C+microbes%2C+and+a+leaky+gut%5BTitle%5D)+AND+%22Topics+in+HIV+medicine+%3A+a+publication+of+the+International+AIDS+Society%2C+USA%22%5BJournal%5D)">HIV disease progression: immune activation, microbes, and a leaky gut.</a> Topics in HIV medicine : a publication of the International AIDS Society, USA. 15, 114-117 (2007).</li>
<li>Hofer, U., Speck, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disturbance+of+the+gut-associated+lymphoid+tissue+is+associated+with+disease+progression+in+chronic+HIV+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+immunopathology%22%5BJournal%5D)">Disturbance of the gut-associated lymphoid tissue is associated with disease progression in chronic HIV infection.</a> Seminars in immunopathology. 31, 257-266 (2009).</li>
<li>Kaushic, C., Ferreira, V. H., Kafka, J. K., Nazli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+infection+in+the+female+genital+tract%3A+discrete+influence+of+the+local+mucosal+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+reproductive+immunology%22%5BJournal%5D)">HIV infection in the female genital tract: discrete influence of the local mucosal microenvironment.</a> American journal of reproductive immunology. 63, 566-575 (2010).</li>
<li>Hladik, F., Hope, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+infection+of+the+genital+mucosa+in+women%5BTitle%5D)+AND+%22Current+HIV%2FAIDS+reports%22%5BJournal%5D)">HIV infection of the genital mucosa in women.</a> Current HIV/AIDS reports. 6, 20-28 (2009).</li>
<li>Sharkey, D. J., Tremellen, K. P., Jasper, M. J., Gemzell-Danielsson, K., Robertson, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seminal+fluid+induces+leukocyte+recruitment+and+cytokine+and+chemokine+mRNA+expression+in+the+human+cervix+after+coitus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunology%22%5BJournal%5D)">Seminal fluid induces leukocyte recruitment and cytokine and chemokine mRNA expression in the human cervix after coitus.</a> Journal of immunology. 188, 2445-2454 (2012).</li>
<li>Saba, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Productive+HIV-1+infection+of+human+cervical+tissue+ex+vivo+is+associated+with+the+secretory+phase+of+the+menstrual+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+immunology%22%5BJournal%5D)">Productive HIV-1 infection of human cervical tissue ex vivo is associated with the secretory phase of the menstrual cycle.</a> Mucosal immunology. 6, 1081-1090 (2013).</li>
<li>St John, E. P., Martinson, J., Simoes, J. A., Landay, A. L., Spear, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cell+activation+and+maturation+induced+by+mucosal+fluid+from+women+with+bacterial+vaginosis%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+immunology%22%5BJournal%5D)">Dendritic cell activation and maturation induced by mucosal fluid from women with bacterial vaginosis.</a> Clinical immunology. 125, 95-102 (2007).</li>
<li>Liebenberg, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stability+and+transport+of+cervical+cytobrushes+for+isolation+of+mononuclear+cells+from+the+female+genital+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunological+methods%22%5BJournal%5D)">Stability and transport of cervical cytobrushes for isolation of mononuclear cells from the female genital tract.</a> Journal of immunological methods. 367, 47-55 (2011).</li>
<li>Hirbod, T., Kaldensjo, T., Broliden, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+distribution+of+HIV-binding+CCR5+and+C-type+lectin+receptors+in+the+human+endocervical+mucosa%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">In situ distribution of HIV-binding CCR5 and C-type lectin receptors in the human endocervical mucosa.</a> PloS one. 6, (2011).</li>
<li>Hasselrot, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feasibility+and+safety+of+cervical+biopsy+sampling+for+mucosal+immune+studies+in+female+sex+workers+from+Nairobi%2C+Kenya%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Feasibility and safety of cervical biopsy sampling for mucosal immune studies in female sex workers from Nairobi, Kenya.</a> PloS one. 7, (2012).</li>
<li>McKinnon, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+viable+leukocyte+sampling+from+the+female+genital+tract+for+clinical+trials%3A+an+international+multi-site+study%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Optimizing viable leukocyte sampling from the female genital tract for clinical trials: an international multi-site study.</a> PloS one. 9, (2014).</li>
<li>Lajoie, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+distinct+cytokine+and+chemokine+profile+at+the+genital+mucosa+is+associated+with+HIV-1+protection+among+HIV-exposed+seronegative+commercial+sex+workers%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+immunology%22%5BJournal%5D)">A distinct cytokine and chemokine profile at the genital mucosa is associated with HIV-1 protection among HIV-exposed seronegative commercial sex workers.</a> Mucosal immunology. 5, (2012).</li>
<li>Burgener, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+Proteomic+Study+Identifies+Serpin+and+Cystatin+Antiproteases+as+Novel+Correlates+of+HIV-1+Resistance+in+the+Cervicovaginal+Mucosa+of+Female+Sex+Workers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+proteome+research%22%5BJournal%5D)">Comprehensive Proteomic Study Identifies Serpin and Cystatin Antiproteases as Novel Correlates of HIV-1 Resistance in the Cervicovaginal Mucosa of Female Sex Workers.</a> Journal of proteome research. 10, (2011).</li>
<li>Burgener, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systems+biology+examination+of+the+human+female+genital+tract+shows+compartmentalization+of+immune+factor+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+virology%22%5BJournal%5D)">A systems biology examination of the human female genital tract shows compartmentalization of immune factor expression.</a> Journal of virology. 87, (2013).</li>
<li>Bere, A., Denny, L., Naicker, P., Burgers, W. A., Passmore, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-specific+T+cell+responses+detected+in+the+genital+tract+of+chronically+HIV-infected+women+are+largely+monofunctional%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">HIV-specific T cell responses detected in the genital tract of chronically HIV-infected women are largely monofunctional.</a> Immunology. 139, (2013).</li>
<li>McKinnon, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+Human+Cervical+CD4%2B+T+Cell+Subset+Coexpressing+Multiple+Markers+of+HIV+Susceptibility%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunology%22%5BJournal%5D)">Characterization of a Human Cervical CD4+ T Cell Subset Coexpressing Multiple Markers of HIV Susceptibility.</a> Journal of immunology. , (2011).</li>
<li>Bere, A., Denny, L., Burgers, W. A., Passmore, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyclonal+expansion+of+cervical+cytobrush-derived+T+cells+to+investigate+HIV-specific+responses+in+the+female+genital+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Polyclonal expansion of cervical cytobrush-derived T cells to investigate HIV-specific responses in the female genital tract.</a> Immunology. 130, 23-33 (2010).</li>
<li>Iqbal, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+T+cell+counts+and+RANTES+expression+in+the+genital+mucosa+of+HIV-1-resistant+Kenyan+commercial+sex+workers%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+infectious+diseases%22%5BJournal%5D)">Elevated T cell counts and RANTES expression in the genital mucosa of HIV-1-resistant Kenyan commercial sex workers.</a> The Journal of infectious diseases. 192, 728-738 (2005).</li>
<li>Hirbod, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+CD4+expression+and+local+immune+activation+in+the+ectocervical+mucosa+of+HIV-infected+women%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunology%22%5BJournal%5D)">Stable CD4 expression and local immune activation in the ectocervical mucosa of HIV-infected women.</a> Journal of immunology. 191, 3948-3954 (2013).</li>
<li>Horton, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+analysis+of+gene+expression+patterns+and+cell+phenotypes+between+cervical+and+peripheral+blood+mononuclear+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">A comparative analysis of gene expression patterns and cell phenotypes between cervical and peripheral blood mononuclear cells.</a> PloS one. 4, (2009).</li>
<li>Begaud, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+CD4+T+cell+activation+and+in+vitro+susceptibility+to+HIV-1+infection+in+exposed+uninfected+Central+Africans%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">Reduced CD4 T cell activation and in vitro susceptibility to HIV-1 infection in exposed uninfected Central Africans.</a> Retrovirology. 3, 35 (2006).</li>
<li>McLaren, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-exposed+seronegative+commercial+sex+workers+show+a+quiescent+phenotype+in+the+CD4%2B+T+cell+compartment+and+reduced+expression+of+HIV-dependent+host+factors%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+infectious+diseases%22%5BJournal%5D)">HIV-exposed seronegative commercial sex workers show a quiescent phenotype in the CD4+ T cell compartment and reduced expression of HIV-dependent host factors.</a> The Journal of infectious diseases. 202 Suppl 3, (2010).</li>
<li>Card, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+Cellular+Susceptibility+to+In+Vitro+HIV+Infection+Is+Associated+with+CD4T+Cell+Quiescence%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Reduced Cellular Susceptibility to In Vitro HIV Infection Is Associated with CD4T Cell Quiescence.</a> PloS one. 7, (2012).</li>
<li>Prodger, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Foreskin+T-cell+subsets+differ+substantially+from+blood+with+respect+to+HIV+co-receptor+expression%2C+inflammatory+profile%2C+and+memory+status%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+immunology%22%5BJournal%5D)">Foreskin T-cell subsets differ substantially from blood with respect to HIV co-receptor expression, inflammatory profile, and memory status.</a> Mucosal immunology. 5, 121-128 (2012).</li>
<li>Reusch, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonlinear+optical+microscopy+and+ultrasound+imaging+of+human+cervical+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biomedical+optics%22%5BJournal%5D)">Nonlinear optical microscopy and ultrasound imaging of human cervical structure.</a> Journal of biomedical optics. 18, (2013).</li>
<li>Oertelt-Prigione, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunology+and+the+menstrual+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Autoimmunity+reviews%22%5BJournal%5D)">Immunology and the menstrual cycle.</a> Autoimmunity reviews. 11, (2012).</li>
<li>Rahman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucosal+serpin+A1+and+A3+levels+in+HIV+highly+exposed+sero-negative+women+are+affected+by+the+menstrual+cycle+and+hormonal+contraceptives+but+are+independent+of+epidemiological+confounders%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+reproductive+immunology%22%5BJournal%5D)">Mucosal serpin A1 and A3 levels in HIV highly exposed sero-negative women are affected by the menstrual cycle and hormonal contraceptives but are independent of epidemiological confounders.</a> American journal of reproductive immunology. 69, 64-72 (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Biorąc pod uwagę duże luki w wiedzy na temat odporności na żeńskie drogi rodne (FGT), analiza fenotypowa CMC może dostarczyć szerokiego wachlarza informacji na temat wielu populacji limfocytów w szyjce macicy. W połączeniu z analizą proteomiczną i pomiarami wiremii w płukaniu szyjki macicy, odporność na infekcje przenoszone drogą płciową (STI) i inne patogeny można przeanalizować w różnych populacjach.
Uwagi techniczne - CMC: Izolacja i skuteczne barwienie próbek CMC może być ...

Większość nowych zakażeń wirusem HIV na całym świecie powstaje poprzez transmisję heteroseksualną, przy czym kobiety stanowiły 47% nowych infekcji w 2011 roku (UNAIDS1). Zrozumienie żeńskich dróg rodnych (FGT), jednego z głównych portali wejściowych dla HIV i innych patogenów przenoszonych drogą płciową, ma ogromne znaczenie na drodze do znalezienia skutecznych strategii zapobiegania zakażeniom. Odpowiedzi immunologiczne na błonie śluzowej narządów płciowych są wyraźnie unikalne i różnią się od tych mierzonych we krwi obwodowej2. Jednak obecna wiedza na temat dynamiki immunologicznej w FGT jest w najlepszym razie ograniczona. Do tej pory badania środowiska immunologicznego błony śluzowej koncentrowały się głównie na tkankach limfatycznych związanych z jelitami (GALT), gdzie stało się jasne, że wczesne zdarzenia w tkankach błony śluzowej po zakażeniu mają silny wpływ na późniejszą progresję choroby3,4. Pobieranie próbek z błony śluzowej narządów płciowych stanowi duże wyzwanie i jest przynajmniej częściowo odpowiedzialne za brak zrozumienia immunologii FGT. Rozwiązanie zagadki dynamiki immunologicznej między gospodarzem a patogenem w kontekście odrębnego środowiska, jakim jest FGT, wymaga skutecznych metod zbierania i analizowania próbek z tego miejsca.
FGT jest podzielony na dwie sekcje: górny odcinek rozrodczy, który obejmuje jajowody, endometrium i szyjkę macicy, oraz dolny odcinek zawierający ectocervix i pochwę (sprawdzone przez Kaushic et al5). Nadal nie jest jasne, jaki jest względny udział tych różnych miejsc w zakażeniu wirusem HIV, ale uważa się, że oba miejsca mogą przyczyniać się do pojawienia się wirusa HIV6. Limfocyty T stanowią 40-50% leukocytów w górnych i dolnych drogach rozrodczych, podczas gdy makrofagi stanowią około 10% (przegląd w Rodriguez-Garcia i wsp. 2). Limfocyty T można wykryć w pochwie, szyjce macicy i błonie śluzowej macicy. Makrofagi są silniej zlokalizowane w błonie śluzowej macicy i tkance łącznej mięśniówki macicy niż w szyjce macicy, chociaż można je wykryć w obu tkankach. Wreszcie, plazmocytoidalne komórki dendrytyczne (pDC) i komórki Langerhansa można również wykryć w tkankach FGT. Fenotyp i proporcje populacji immunologicznych oraz ich podatność na zakażenie wirusem HIV mogą się znacznie różnić w zależności od cykli hormonalnych, stosowania hormonalnych środków antykoncepcyjnych, bakteryjnego zapalenia pochwy lub aktywności seksualnej5,7-9.
Do badania populacji immunologicznej i środowiska FGT opracowano różne metody. Biopsja szyjki macicy, cytoszczoteczki szyjkowe i płukanie szyjki macicy i pochwy (CVL)10-12 są najczęściej stosowane w literaturze. Pobieranie CVL metodą płukania PBS jest najprostszą metodą i pozwala na badanie białek modulujących układ odpornościowy, ale skutkuje wyjątkowo niską wydajnością komórek, a zatem nie nadaje się do badania populacji komórek odpornościowych FGT13. Z drugiej strony próbki CVL są bardzo przydatne do oceny środowiska immunologicznego FGT poprzez pomiar ekspresji różnych cytokin, chemokin lub czynników przeciwdrobnoustrojowych przy użyciu metod takich jak ELISA, cytokina perełkowa14 lub spektrometria mas15,16. Charakterystykę częstości, fenotypów i funkcji komórek odpornościowych można osiągnąć poprzez pobieranie komórek jednojądrzastych szyjki macicy (CMC) za pomocą cytoszczotek szyjki macicy lub biopsji szyjki macicy.
Pobieranie próbek z biopsji szyjki macicy jest metodą inwazyjną, która zwiększa dyskomfort i ryzyko krwawienia, a gojenie po zabiegu trwa od 2 do 11 dni, w zależności od statusu immunologicznego kobiety12. Z kolei cytoszczoteczki szyjkowe szyjki macicy, mimo mniejszej wydajności pobranych komórek, są mniej inwazyjną i wygodniejszą metodą pobierania komórek odpornościowych z FGT. Obie metody mogą osiągnąć tę samą wydajność leukocytów CD45+, ale do uzyskania tej samej ilości komórek zawartych w jednej biopsji13 konieczne są dwie sekwencyjne cytoszczoteczki szyjki macicy. Niemniej jednak pobieranie próbek cytoszczoteczki nadal zapewnia akceptowalną liczbę komórek (około 5000 komórek CD45+/cytoszczoteczkę) do dalszego fenotypowania ex vivo za pomocą cytometrii przepływowej14. Na tych próbkach można również przeprowadzić charakterystykę funkcjonalną, ponieważ stymulację i wewnątrzkomórkową cytometrię przepływową lub qPCR przeprowadzono przy użyciu CMC pochodzących z cytoszczotek w celu zidentyfikowania odpowiedzi immunologicznych specyficznych dla HIV17 lub polaryzacji komórek Th18. Ekspansja populacji limfocytów T może również ułatwić badania funkcjonalne z CMCs19.
Ważne jest, aby zauważyć, że biopsje i cytoszczotki pobierają próbki z różnych części FGT. Biopsje są pobierane z górnej części nabłonka i zrębu szyjki macicy12,13, podczas gdy cytoszczotki szyjkowe pobierają próbki z szyjki macicy, zbierając komórki pochodzące z nabłonka szyjki macicy i przypuszczalnie strefy transformacji. Próbki Cytobrush pobierają zatem próbki z regionu składającego się z pojedynczej warstwy nabłonka walcowatego, podczas gdy biopsje obejmują obszar wyłożony płaskonabłonkowym nabłonkiem warstwowym5. W rezultacie charakter populacji leukocytów pobranych za pomocą biopsji szyjki macicy i cytoszczoteczki różni się. Biopsje pobierają większą ilość limfocytów T CD3 +, podczas gdy cytoszczoteczki powodują pobranie większej ilości monocytów / makrofagów CD14 +13.
Studiowanie immunologii FGT jest przedmiotem zainteresowania od wielu lat20-22 i zgromadziliśmy dużą wiedzę specjalistyczną w zakresie badań CMC pochodzących z cytoszczotek. Nasze badania koncentrują się głównie na badaniu zakażonych wirusem HIV, niezakażonych i narażonych na zakażenie wirusem HIV seronegatywnych (HESN) pracownic seksualnych z Nairobi w Kenii. Wirus HIV preferencyjnie replikuje się w aktywowanych limfocytach T23, a mniejsza liczba aktywowanych komórek, które mogą być celem wirusa HIV w FGT, może przyczynić się do ochrony przed nabyciem wirusa HIV. Zgodnie z tą hipotezą, kilka badań opisało niższą aktywację immunologiczną wśród osób świadczących usługi seksualne HESN, które są wysoce narażone na HIV, ale pozostają niezakażone24,25, a ten spoczynkowy fenotyp obserwuje się również w FGT14. W tym miejscu opisano metodologię przetwarzania i oceny aktywacji limfocytów T w próbkach CMC pochodzących z cytoszczotek szyjki macicy za pomocą cytometrii przepływowej ex vivo.

<table><tbody><tr><td>100 &mu; m Sitko komórkowe do probówki Falcon 50 ml</td><td>BD</td><td>352360</td><td>Przetwarzanie CMC</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Hyclone</td><td>SH30027.01</td><td>Przetwarzanie CMC</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu</td><td>Technologia życia</td><td>16000044</td><td>Przetwarzanie CMC</td></tr><tr><td>Technologia Fungizone</td><td>Life</td><td>15290-018</td><td>Przetwarzanie</td></tr><tr><td>CMC Penicylina/streptomycyna</td><td>Sigma</td><td>P4333-20ml</td><td>Przetwarzanie CMC</td></tr><tr><td>50 ml probówka Falcon</td><td>Fisher</td><td>14-959-49A</td><td>Przetwarzanie CMC</td></tr><tr><td>Jednorazowa pipeta transferowa do banku krwi</td><td>Fisher</td><td>13-711-6M</td><td>Przetwarzanie CMC</td></tr><tr><td>Cytobrush plus</td><td>Cooper chirurgiczne</td><td>C0121</td><td>CMC pobieranie</td></tr> próbek <tr><td>Jednorazowy skrobak do szyjki macicy</td><td>Szybkie medyczne</td><td>pobieranie próbek CMC 2183</td><td></td></tr><tr><td>15 ml Rurka Falcon</td><td>Fisher</td><td>14-959-70c</td><td>Probówka CVL</td></tr><tr><td>1,5 ml Eppendorf</td><td>Fisher</td><td>05-402-18</td><td>Przechowywanie CPL</td></tr><tr><td>ŻYWY/MARTWY Zestaw do naprawiania barwienia komórek</td><td>Invitrogen</td><td>Various</td><td>Odczynnik do cytometrii przepływowej</td></tr><tr><td>Bufor utrwalający (4% PFA)</td> <td>554655</td><td>Cytometria przepływowa Regeant</td><td></td></tr> <tr><td>Mysz IgG</td><td>Sigma</td><td>I8765</td><td>Regeant do cytometrii przepływowej</td></tr></tbody></table>

pobieranie, izolacja i analiza cytometryczna przepływowa próbek z ludzkiej szyjki macicy

Collection, Isolation, and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Samples

Pomimo znaczenia patogenów błony śluzowej (w tym HIV) dla zdrowia publicznego, stosunkowo niewiele wiadomo na temat odporności błony śluzowej, szczególnie na żeńskie drogi rodne (FGT). Ponieważ transmisja heteroseksualna stanowi obecnie dominujący mechanizm przenoszenia wirusa HIV i biorąc pod uwagę ciągłe rozprzestrzenianie się infekcji przenoszonych drogą płciową (STI), kluczowe znaczenie ma zrozumienie wzajemnych zależności między gospodarzem a patogenem w błonie śluzowej narządów płciowych. Znaczne luki w wiedzy na temat odporności na FGT wynikają częściowo z trudności w skutecznym pobieraniu i przetwarzaniu próbek błony śluzowej. Aby ułatwić badania przy wystarczającej wielkości próby, techniki pobierania muszą być minimalnie inwazyjne i skuteczne. W tym celu zoptymalizowano protokół pobierania próbek cytoszczoteczki szyjki macicy, a następnie izolacji komórek jednojądrzastych szyjki macicy (CMC). Korzystając z immunofenotypowania opartego na cytometrii przepływowej ex vivo, możliwe jest dokładne i wiarygodne ilościowe określenie częstości występowania i fenotypów populacji limfocytów/monocytów CMC. Technikę tę można połączyć z pobraniem płukania szyjki macicy i pochwy (CVL), które zawiera rozpuszczalne mediatory immunologiczne, w tym cytokiny, chemokiny i antyproteazy, z których wszystkie można wykorzystać do określenia środowiska przeciw- lub prozapalnego w pochwie.

Wieloparametryczna cytometria przepływowa jest potężnym narzędziem do analizy fenotypów i funkcji podgrup komórek w tkankach, które nie zostały wcześniej scharakteryzowane. Analiza próbek CMC może dostarczyć informacji na temat populacji limfocytów i monocytów przy zastosowaniu odpowiednich strategii bramkowania.
Reprezentatywną strategię bramkowania CMC, w porównaniu z dopasowanym profilem PBMC, przedstawiono na Rysunku 2. Wykres FSC-A względem FSC-H pozwala na wykluczenie du...

Użycie pobierania próbek cytoszczotek do pobierania limfocytów i monocytów z szyjki macicy jest minimalnie inwazyjną techniką, która dostarcza próbek do analizy odporności żeńskich dróg rodnych. W tym protokole opisujemy pobieranie próbek cytoszczotek i izolację komórek odpornościowych do testów cytometrii przepływowej.

Pobieranie, izolacja i analiza cytometryczna przepływowa próbek z ludzkiej szyjki macicy

Despite the public health importance of mucosal pathogens (including HIV), relatively little is known about mucosal immunity, particularly at the female ...

Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie komórek jednojądrzastych szyjki macicy z zeskrobywania szyjki macicy za pomocą szczoteczki do cytografii. Po wyizolowaniu komórki te można wykorzystać w wielu testach, w tym w cytometrii przepływowej, w której można określić fenotyp i funkcję komórek odpornościowych w żeńskich drogach rodnych. Pobranie próbek cytoszczoteczki i płukania szyjki macicy jest zabiegiem nieinwazyjnym, który musi być wykonany przez ginekologa lub przeszkolonego lekarza.Płukanie szyjki macicy z pochwy wykonuje się najpierw, w którym szyjkę macicy przemywa się dwoma młynkami PBS, która jest następnie pobierana z tylnej części otworu po płukaniu. Wklęsły koniec skrobaka do szyjki macicy umieszcza się przy szyjce macicy i obraca w celu pobrania próbki otworu szyjki macicy lub odcinka szyjki macicy. Następnie szczoteczkę cyto wkłada się do systemu operacyjnego szyjki macicy i obraca o 360 stopni.Zastosowanie delikatnego nacisku pomoże zapewnić, że próbka nie zostanie zanieczyszczona krwią. Szczotka cyto w skrobaku jest zbierana do probówki zawierającej pięć milili PBS. Po przetransportowaniu na lodzie próbka jest szybko wirowana w celu oddzielenia komórek od cyto s

collection-isolation-flow-cytometric-analysis-human-endocervical

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Opisujemy tutaj metodę izolacji w celu uzyskania ludzkich śródnabłonkowych limfocytów wewnątrzszyjkowych do analizy śródnabłonkowych limfocytów T gamma delta. Protokół ten można rozszerzyć o oczyszczanie komórek T gamma delta szyjki macicy za pomocą kulek magnetycznych lub sortowania komórek.

Izolacja i analiza cytometryczna przepływowa ludzkich komórek T gamma Delta w obrębie szyjki macicy

Opisujemy tutaj metodę izolowania i oczyszczania komórek dendrytycznych z różnych anatomicznych przedziałów w ludzkim żeńskim układzie rozrodczym w celu oceny ich cech fenotypowych i funkcjonalnych. Metodę tę można dostosować do izolowania innych komórek odpornościowych lub komórek dendrytycznych z innych tkanek błony śluzowej.

Izolacja komórek dendrytycznych z ludzkiego żeńskiego układu rozrodczego do badań fenotypowych i funkcjonalnych

Komórki śródbłonka guza są ważnymi determinantami mikrośrodowiska guza i przebiegu choroby. W tym miejscu opisano protokół izolacji czystych i żywotnych komórek śródbłonka z ludzkiego raka jelita grubego i normalnej okrężnicy, który ma być stosowany w testach narkotykowych i badaniach nad patogenezą.

Izolacja ludzkich komórek śródbłonka z normalnego raka jelita grubego i raka jelita grubego - ulepszony protokół

Ten protokół demonstruje metodę izolacji pierwotnych ludzkich komórek dziesiętnych pobranych z błon płodowych łożysk terminowych, które mogą być używane do różnych zastosowań (np. immunocytochemia, cytometria przepływowa, itp.), mając na celu zbadanie roli różnych populacji komórek w komplikacjach ciąży.

Izolacja pierwotnych ludzkich komórek liściastych z błon płodowych łożysk donoszonych

Tutaj prezentujemy protokół charakteryzowania podzbiorów monocytów za pomocą cytometrii przepływu krwi pełnej. Obejmuje to nakreślenie, w jaki sposób bramkować podzbiory i oceniać ich ekspresję markerów powierzchniowych oraz podanie przykładu oceny ekspresji markerów M1 (zapalnych) i M2 (przeciwzapalnych).

Charakterystyka podzbiorów ludzkich monocytów za pomocą analizy cytometrii przepływu krwi pełnej

Pieprzyki bąblowce to nieprawidłowe ciąże ludzkie o niejednorodnej etiologii, które można sklasyfikować według ich cech morfologicznych i wkładu rodziców w genomy trzonowców. W tym miejscu szczegółowo opisano protokoły multipleksowego mikrosatelitarnego genotypowania DNA i cytometrii przepływowej tkanek trzonowych zatopionych w parafinie utrwalonych w formalinie, wraz z interpretacją i integracją wyników.

Genotypowanie DNA mikrosatelitarnego i cytometria przepływowa Analizy ploidalne tkanek trzonowców bąblowcowych utrwalonych w formalinie

To jest metoda izolowania komórek limfoidalnych macicy zarówno od ciężarnych, jak i nieciężarnych myszy. Metoda ta może być stosowana w wielu dalszych zastosowaniach, takich jak fenotypowanie FACS, sortowanie komórek, testy funkcjonalne, sekwencja RNA i proteomika. Protokół tutaj pokazuje, jak fenotypować wrodzone komórki limfoidalne macicy grupy 1 za pomocą cytometrii przepływowej.

Izolacja wrodzonych komórek limfatycznych macicy do analizy metodą cytometrii przepływowej

Obecny protokół dostarcza praktycznego rozwiązania, które pozwala na pomiar apoptozy, potencjału błony mitochondrialnej i uszkodzeń DNA w plemnikach ludzkich za pomocą pojedynczego cytometru.

Analiza cytometryczna przepływowa biomarkerów do wykrywania wad funkcjonalnych plemników ludzkich

Ten artykuł opisuje zastosowanie zautomatyzowanego sprzętu do łatwego i efektywnego oddzielania i zbierania substancji, takich jak bezkomórkowe DNA i krążące komórki nowotworowe, z krwi pełnej.

Automatyczne oddzielanie i pobieranie substancji nowotworowych z próbek klinicznych

Ten protokół opisuje jednodniową metodę izolacji komórek nabłonka ludzkiego jajowodu. Izolowane komórki nabłonkowe można siać w hodowli dwuwymiarowej (2D) lub dysocjować do zawiesin jednokomórkowych i wykorzystywać w dalszych eksperymentach, w tym cytometrii przepływowej i sekwencjonowaniu RNA pojedynczej komórki.

Skuteczna metoda ekstrakcji nabłonka ludzkiego jajowodu do analiz pojedynczych komórek

Poznaj metodę izolacji komórek mononuklearnych z szyjki macicy przy użyciu cytobrusha i cytometrii przepływowej. Ta technika umożliwia analizę fenotypu i funkcji komórek odpornościowych w drogach rodnych.

Pobieranie, izolacja i analiza cytometryczna przepływowa próbek z ludzkiej szyjki macicy

Przeglądaj więcej filmów