Pobieranie, izolacja i analiza cytometryczna przepływowa próbek z ludzkiej szyjki macicy

Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie komórek jednojądrzastych szyjki macicy z zeskrobywania szyjki macicy za pomocą szczoteczki do cytografii. Po wyizolowaniu komórki te można wykorzystać w wielu testach, w tym w cytometrii przepływowej, w której można określić fenotyp i funkcję komórek odpornościowych w żeńskich drogach rodnych. Pobranie próbek cytoszczoteczki i płukania szyjki macicy jest zabiegiem nieinwazyjnym, który musi być wykonany przez ginekologa lub przeszkolonego lekarza.

Płukanie szyjki macicy z pochwy wykonuje się najpierw, w którym szyjkę macicy przemywa się dwoma młynkami PBS, która jest następnie pobierana z tylnej części otworu po płukaniu. Wklęsły koniec skrobaka do szyjki macicy umieszcza się przy szyjce macicy i obraca w celu pobrania próbki otworu szyjki macicy lub odcinka szyjki macicy. Następnie szczoteczkę cyto wkłada się do systemu operacyjnego szyjki macicy i obraca o 360 stopni.

Zastosowanie delikatnego nacisku pomoże zapewnić, że próbka nie zostanie zanieczyszczona krwią. Szczotka cyto w skrobaku jest zbierana do probówki zawierającej pięć milili PBS. Po przetransportowaniu na lodzie próbka jest szybko wirowana w celu oddzielenia komórek od cyto szczotki.

Po umyciu próbek pożywką są one następnie filtrowane przez nylonowy filtr o grubości stu mikronów. Pozwala to na pobranie limfocytów, monocytów i komórek nabłonkowych z próbki. Komórki są teraz gotowe do barwienia przeciwciałami przeciwko białkom powierzchniowym, a po ich utrwaleniu można je uruchomić na cytometrze przepływowym.

Pokażemy Ci, w jaki sposób analizujemy uzyskane dane, aby ocenić fenotyp zarówno populacji limfocytów T CD czterech, jak i CD 8 obecnych w szyjce macicy. Cześć, jestem doktorantem w laboratorium ludowym dr Keitha. Nasze badania koncentrują się na związku między aktywacją immunologiczną a podatnością na HIV, a także progresją choroby.

Ponieważ większość zakażeń wirusem HIV ma obecnie miejsce podczas stosunku heteroseksualnego, jesteśmy również zainteresowani określeniem korelatów ochrony przed transmisją wirusa HIV na żeńskie drogi rodne. Niestety, pobranie próbek z dróg rodnych może być bardzo trudne, a także dość inwazyjne dla uczestników badania. Stosowanie szczoteczek cytograficznych do pobierania CMC lub komórek jednojądrzastych szyjki macicy jest szybszą i łatwiejszą metodą w porównaniu z innymi protokołami, takimi jak biopsje.

W tym filmie pokażemy, jak wyizolować i przygotować CMC do użycia w cytometrii przepływowej lub innych dalszych zastosowaniach. Po zebraniu cyto szczotka i skrobak są transportowane w pięciu mililitrach zimnego PBS. Ważne jest, aby transportować próbki na lodzie do czasu przetwarzania, który nie powinien przypadać później niż dwie godziny po pobraniu próbki.

Wszelkie próbki, które w tym momencie są zanieczyszczone śladami krwi, powinny zostać wyłączone z dalszej analizy w celu dysocjacji komórek od cyto szczoteczki. Obracaj probówkę na wysokich obrotach przez 45 sekund, ponieważ komórki nadal pozostaną na szczotce cyto i skrobaku. Należy je usunąć ręcznie.

Załóż nową parę rękawiczek i użyj szczotki cyto, aby zeskrobać pozostały materiał ze skrobaka. Po wyrzuceniu do roztworu wybielacza użyj kciuka i palca wskazującego, aby usunąć wszystkie pozostałe komórki ze szczoteczki cyto, ściskając w górę iw dół nad rurką sokoła. Po wyrzuceniu szczoteczki do cyto zmień rękawiczki przed przygotowaniem kolejnej próbki, użyj pipety transferowej, aby umyć boki probówki PBS, upewniając się, że cała próbka została zebrana.

Dopasuj nylon o grubości stu mikronów. Przefiltrować świeżą probówkę Falcona i użyć pipety, aby przefiltrować całą objętość roztworu PBS. Dodaj pięć milicali nośnika RPMI bez FBS do oryginalnej tuby.

Za pomocą pipety dokładnie umyj boki probówki, aby usunąć wszelkie przylegające śluzy lub zanieczyszczenia. Następnie przenieś media przez filtr. Użyj części przefiltrowanych mediów, aby umyć spód filtra przed wyrzuceniem do wybielacza.

Do osadzania izolowanych komórek. Odwirowywać próbki przez 10 minut przy 1500 obr./min, aby zapobiec przemieszczeniu się osadu. Należy pamiętać o wyłączeniu hamulca wirówki, jeśli komórki będą używane do cytometrii przepływowej.

Przygotować roztwór blokujący niezbędny do zapobieżenia nieswoistemu wiązaniu przeciwciał. Na etapie wirowania należy użyć 100 mikrolitrów roztworu blokującego na próbkę. Roztwór blokujący zawiera 93,2 mikrolitrów faksu, płynu do płukania lub PBS oraz 2% FBS, pięć mikrolitrów FBS i 1,8 mikrolitra mysiej IgG.

Po wirowaniu większość próbek z żywotnymi komórkami będzie miała widoczną osadkę. W niektórych przypadkach granulka będzie dość duża. Podczas gdy w innych próbkach może być ledwo widoczny.

Wielkość osadu nie zawsze jest związana z wydajnością komórek. Ostrożnie, aby przechylić supernatant, upewniając się, że nie zakłócisz ponownego zawieszenia komórek przez delikatne mieszanie. Umyj komórki pięcioma mililitrami PBS i powtórz wirowanie przez 10 minut w temperaturze 1500.

RRP M po odłamaniu, jeszcze raz zdekantować supernatant i ponownie zawiesić osad jak poprzednio. W tym momencie komórki są gotowe do kriokonserwacji lub barwienia powierzchni przed barwieniem W przypadku przeciwciał fluorescencyjnych korzystne jest blokowanie niespecyficznego wiązania poprzez inkubację komórek z roztworem blokującym przygotowanym podczas wcześniejszego wirowania. Po ponownym zawieszeniu osadu komórkowego dodać do próbki sto mikrolitrów roztworu blokującego i dokładnie wymieszać.

Pozostałe kroki protokołu można wykonać w 96-dołkowej płytce lub lampie faksowej. W zależności od wielkości granulki CMC. Przenieść roztwór blokujący i mieszaninę komórek do rurki faksowej.

Inkubować próbkę przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Podczas 10-minutowej inkubacji przygotuj barwnik żywotności, który zostanie użyty do rozróżnienia żywych i martwych komórek. Podczas analizy danych należy przygotować barwnik żywotności zgodnie z zaleceniami producenta i w razie potrzeby wstępnie go miareczkować.

Pamiętaj, aby przykryć mieszaninę barwników przed światłem, dopóki nie będzie gotowa do użycia. Po 10 minutach inkubacji przemyć komórki 500 mikrolitrami faksu, przepłukać lub PBS 2% FBS, a następnie odwirować przez 10 minut przy 1600 obr./min. Po odwirowaniu zdekantować supernatant z rurki faksu.

Ponownie zawiesić komórki przez mieszanie. Teraz dodaj odpowiednią objętość barwnika żywotności, który został wcześniej przygotowany. Inkubuj komórki przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, upewnij się, że próbki pozostają pokryte światłem, zawijając je w folię aluminiową.

Podczas tej inkubacji można przygotować główną mieszankę przeciwciał fluorescencyjnych, które zostaną użyte do znakowania komórek. Należy pamiętać o wstępnym miareczkowaniu i walidacji przeciwciał w próbkach kontrolnych krwi obwodowej przed użyciem ich na CMC. Wymieszać miareczkowane przeciwciała i doprowadzić do końcowej objętości stu mikrolitrów na próbkę.

Za pomocą faksu, umyj, chroń wszystkie przeciwciała przed światłem podczas tych kroków. Po 30-minutowej inkubacji ponownie umyć próbkę 500 mikrolitrami faksu, umyć, odwirować, zdekantować i ponownie zawiesić komórki jak poprzednio. Nadszedł czas na inkubację komórek za pomocą 100 mikrolitrów koktajlu przeciwciał przygotowanego podczas poprzedniej inkubacji.

Ponownie inkubuj próbki przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, upewniając się, że są chronione przed światłem. Inkubujące CMC są teraz gotowe do przemycia po raz ostatni 500 mikrolitrami PBS. Odwirować próbkę z prędkością 1600 obr./min przez 10 minut.

Po dekantacji i ponownym zawieszeniu osadu rozcieńczyć komórki w końcowej objętości 750 mikrolitrów w 1% roztworze paraldehydu. Aby je naprawić, ważne jest, aby ponownie zawiesić komórki w tej dużej objętości, aby zapobiec zatkaniu cytometru przepływowego. Nawet przy tej objętości probówka z próbką może wydawać się dość mętna.

Utrzymuj komórki w ciemności w temperaturze czterech stopni Celsjusza, dopóki nie zostaną zarejestrowane na cytometrze przepływowym. Oprócz próbki szczoteczki cyto, rutynowo zbieramy dwa miliony płukania PBS z szyjki macicy i pochwy. Próbkę tę odwirowuje się z prędkością 1400 obr./min przez siedem minut w celu usunięcia resztek komórkowych z płukania.

Pozostały supernatant można następnie przydzielić i zamrozić w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza w celu przyszłej analizy stężenia białka rozpuszczalnego. Dane te mogą być szczególnie przydatne w połączeniu z danymi o fenotypie komórkowym uzyskanymi za pomocą cytometrii przepływowej. Przed uruchomieniem przykładu CMC.

Pomocne jest przygotowanie kontroli PBMC, aby pomóc w rurach kompensacyjnych biegu bramkowania, przy użyciu koralików lub pojedynczych komórek barwiących w celu dostosowania do nakładania się widmowego. Zdobądź całą probówkę CMC, aby zebrać wszystkie zdarzenia w porównaniu z próbkami PBMC. CMC będą wykazywać więcej dubletów na wykresie powierzchni FSC w stosunku do wysokości i mogą nie wykazywać tak charakterystycznej populacji limfocytów jak pbmc.

Po pobraniu próbek wyeksportuj pliki do analizy w programie takim jak FlowJo. Tutaj pokażemy główne składniki typowej strategii bramkowania dla pochodzących z CMC czterech dodatnich limfocytów T CD i ośmiu dodatnich limfocytów T CD. Użyj wykresu powierzchni FSC w funkcji wysokości do G na podkoszulkach w próbce.

W tym dopasowanym porównaniu można wyraźnie zobaczyć zwiększoną liczbę dubletów w próbie CMC w porównaniu z p BMC. Następnie, wykreślenie markera fluorescencyjnego lub FSC w funkcji czasu służy jako etap kontroli jakości. Jeśli jakiekolwiek zmiany w natężeniu przepływu wprowadziły artefakty do danych, można je usunąć na tym etapie.

U góry widać spójny profil fluorescencji w czasie, co wskazuje na wysoką jakość próbki. Poniżej znajduje się próbka z wieloma przerwami i natężeniem przepływu, które można wykluczyć z dalszej analizy. Identyfikacja populacji limfocytów w próbkach CMC może być trudna.

Korzystanie z kontroli A-P-B-M-C pomoże w ułożeniu chodu. Jak widać, niektóre próbki wykazują duże czyste populacje, podczas gdy inne próbki nie mają populacji limfocytów. Próbki te należy całkowicie wykluczyć.

Chociaż skupimy się na populacjach limfocytów. Możliwe jest również żerowanie na monocytach poprzez bramkowanie na komórkach, które nie mają ekspresji markerów linii. Możliwe jest zidentyfikowanie komórek, które wyrażają kombinacje markerów komórek dendrytycznych i monocytów, takich jak CD 16 i CD 11 C. Włączenie markera żywotności lub barwnika ma kluczowe znaczenie dla analizy CMC nawet na świeżych komórkach.

Jak widać, większość limfocytów CMC jest żywotna, ale niektóre próbki zawierają wysokie częstotliwości martwych komórek, które należy wykluczyć z analizy. Martwe komórki mogą niespecyficznie przyjmować przeciwciała i zakłócać analizę danych w obrębie chodu limfocytów. Barwienie płyty CD 3 powinno być mocne.

Odsetek limfocytów T CD trzech dodatnich jest niższy i bardziej zmienny niż w próbkach PBMC, dlatego tak ważne jest pozyskanie całej próbki CMC i maksymalizacja liczby zebranych zdarzeń. Populacje limfocytów T CD 4 dodatnich i CD 8 dodatnich można zidentyfikować tak samo jak w próbkach TBMC. W niektórych próbkach CMC.

Stosunek CD 4 do CD 8 jest niższy niż obserwowany we krwi obwodowej, a niektóre osoby wykazują dużą podwójnie ujemną populację limfocytów T. Po zidentyfikowaniu populacji limfocytów T z czterema dodatnimi i ośmioma dodatnimi limfocytami T z CD możliwe jest ilościowe określenie ekspresji wielu markerów fenotypowych. Chociaż ekspresję CD 1 61 można wykryć w CMC, jasna populacja CD 1 61, która jest widoczna we krwi, jest nieobecna w drogach rodnych.

Podobnie, ekspresja markerów aktywacji, takich jak CD 69 i H-L-A-D-R, a także markerów, takich jak CCR 5 i PD 1, może być wiarygodnie mierzona wśród próbek CMC i określana ilościowo. Wykorzystanie próbek cyto brush pozwala nam scharakteryzować zarówno fenotyp, jak i funkcję komórek odpornościowych błony śluzowej, szczególnie w kontekście chorób zakaźnych. Nie tylko daje nam to lepszy wgląd w mechanizmy regulujące immunologię błon śluzowych i rozrodczości, ale także stanowi podstawę do opracowania nowych metod pomiaru skuteczności szczepionki błony śluzowej.