Oznaczanie immunogenności szczepionki przy użyciu komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów bydlęcych

Protokół ten stanowi funkcjonalny test in vitro z wykorzystaniem komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów bydlęcych do pomiaru immunogenności szczepionki przed badaniami in vivo. W ten sposób wypełnia istniejącą lukę w wakcynologii zwierząt gospodarskich. Jest to wytwarzanie i stosowanie komórek dendrytycznych.

Jako najsilniejsze komórki prezentujące antygen, komórki dendrytyczne stały się kluczowym celem badawczym w celu zrozumienia wewnątrzkomórkowych mechanizmów odpornościowych, w tym skuteczności szczepionki. Test ten może być wdrożony jako narzędzie do badań przesiewowych kandydatów na szczepionki, jako stan kontroli jakości produkcji szczepionki oraz do selekcji antygenów i adiuwantów. Procedurę zademonstruje Richard Kangethe, naukowiec z laboratorium produkcji zwierzęcej i zdrowia.

Zacznij od odwrócenia i wymieszania krwi uzyskanej z nakłucia żyły szyjnej cielęcia z heparynizowanymi wakutainerami. Następnie przenieś 20 mililitrów heparynizowanej krwi do sterylnej probówki o pojemności 50 mililitrów i rozcieńcz ją 10 mililitrami soli fizjologicznej buforowanej fosforanem lub PBS. Odpipetować 15 mililitrów pożywki do izolacji limfocytów do sterylnej probówki o pojemności 50 mililitrów i przechylić probówkę do pozycji 45 stopni.

Ostrożnie ułóż 30 mililitrów pożywki PBS krwi na izolacji limfocytów za pomocą pipety o pojemności 25 mililitrów i powoli przywróć probówkę do pozycji pionowej przed odwirowaniem. Następnie zbierz cienką białą warstwę komórek jednojądrzastych krwi obwodowej lub warstwę PBMC za pomocą pipety Pasteura i przenieś ją do nowej probówki o pojemności 50 mililitrów. Umyj zebrane PBMC dwa razy, używając 40 mililitrów PBS na pranie i dokładnie wymieszaj.

Po odwirowaniu ponownie zawiesić osad w 15 mililitrach buforu potasowego chlorku amonu lub buforu ACK. Po 10 do 15 minutach inkubacji w temperaturze pokojowej dodać do 40 mililitrów PBS i odwirować probówkę z maksymalnym przyspieszeniem i opóźnieniem. Zawiesić osad w 10 mililitrach kompletnej pożywki hodowlanej.

Następnie dodaj pięć mikrolitrów buforu CD14 MicroBead na 10 milionów komórek i dokładnie wymieszaj za pomocą pipety. Do analizy cytometrii przepływowej dodaj 10 mikrolitrów izotiocyjanianu fluoresceiny CD14 lub przeciwciała barwiącego FITC do PBMC i inkubuj przez 15 minut w temperaturze od czterech do ośmiu stopni Celsjusza przed przystąpieniem do cytometrii przepływowej. Do niebarwionych PBMC dodać jeden mililitr buforu faksowego i odwirowywać go przez siedem minut w temperaturze 500 g i czterech stopniach Celsjusza.

Następnie ponownie zawieś osad w 500 mikrolitrach bufora faksu na 100 milionów komórek. Następnie włóż immunomagnetyczną kolumnę do separacji komórek do separatora i umieść 50-mililitrową rurkę zbiorczą pod wylotem kolumny w celu zebrania przepływu. Po umyciu kolumny jednym mililitrowym odgazowanym buforem faksowym należy wymienić zużytą rurkę o pojemności 15 mililitrów na nową.

Jednorazowo odpipetować sto milionów komórek w 500 mikrolitrach buforu, pozwalając zawiesinie komórek przejść przez kolumnę. Następnie przepłukać kolumnę trzykrotnie trzema mililitrami odgazowanego buforu faksowego za każdym razem. Po zebraniu przepływu oznacz pierwszą eluowaną naiwną frakcję limfocytów jako frakcję komórek CD14 ujemną.

Wyjmij kolumnę z separatora i umieść nową sterylną rurkę o pojemności 15 mililitrów pod kolumną do zbierania ścieków. Dodać pięć mililitrów bufora faksu do kolumny i natychmiast przepchnąć go przez nią za pomocą tłoka. Zbierz i oznacz drugi przepływ lub naiwną frakcję monocytów jako frakcję komórek CD14-dodatnich.

Dodaj kompletną pożywkę hodowlaną do zebranych monocytów CD14-dodatnich, aby uzyskać 1 milion komórek na mililitr. Następnie dodaj jeden mililitr zawiesiny komórek do każdej studzienki sterylnej 24-dołkowej płytki przed uzupełnieniem każdej studzienki 40 mikrolitrami koktajlu cytokin dostarczonego w zestawie. Drugiego dnia przenieś połowę zawartości każdej studzienki do pojedynczych 1,5 mililitrowych probówek za pomocą pipety.

Po odwirowaniu 1,5 mililitrowych probówek o masie 500 g przez siedem minut, odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 500 mikrolitrach świeżej, kompletnej pożywki hodowlanej. Przenieś 500 mikrolitrów tej zawieszonej zawiesiny komórek z powrotem do odpowiednich studzienek, tak aby końcowa objętość w studzience wynosiła jeden mililitr. Wzbogać każdą studzienkę o 20 mikrolitrów koktajlu cytokinowego.

Aby wygenerować MoDC impulsowe antygenowo, dodaj jeden mikrolitr na mililitr szczepionki przeciwko wirusowi wścieklizny lub zawiesiny RV do jednego mililitra naiwnej kultury MoDC na 24-dołkowej płytce i inkubuj płytkę przez 48 godzin w 5% dwutlenku węgla i 37 stopniach Celsjusza. Siódmego dnia trzymaj 24-dołkową płytkę zawierającą pulsujące antygenem MoDC na lodzie przez 10 minut, a następnie dodaj jeden mililitr lodowatego PBS na studzienkę i dokładnie wymieszaj. Przenieś zawieszenie do 15-mililitrowej dętki.

Umyj studzienki dwoma mililitrami lodowatego PBS. Zebrać pozostałe komórki w każdej studzience i przenieść umytą zawartość do odpowiednich probówek. Odwirować zawiesinę komórkową o masie 500 g przez siedem minut.

Po odrzuceniu supernatantu ponownie zawieś osad komórkowy MoDCs z impulsem antygenu w kompletnej pożywce hodowlanej, aby dostosować końcowe stężenie 100 000 komórek na mililitr. W przypadku kohodowli limfocytów MoDC należy wysiać studzienki sterylnej 24-dołkowej płytki z jednym mililitrem pierwotnej zawiesiny komórek limfocytów i jednym mililitrem zawiesiny MoDC pulsacyjnej antygenowej lub niepulsacyjnej antygenu w siódmym dniu impulsu antygenu. Po dwóch dniach inkubacji uzupełnij każdą studzienkę 20 nanogramami na mililitr rekombinowanej interleukiny-2 i kontynuuj inkubację przez kolejne 120 godzin.

W dniu 14 przenieś jeden mililitr kokultury do sterylnej probówki o pojemności 1,5 mililitra i odwiruj probówkę. Następnie ponownie zawieś osad komórkowy za pomocą jednego mililitra MoDC impulsowych lub niepulsacyjnych MoDC. Dobrze wymieszać i przenieść zawiesiny komórek do odpowiednich dołków.

Po barwieniu powierzchni komórek PBMC oraz nieprawidłowo urodzonych limfocytów i monocytów, przenieś jeden mililitr zawiesiny komórkowej do sterylnej probówki o pojemności 1,5 mililitra za pomocą pipety i wiruj przez 10 minut w temperaturze 500 g. Następnie ponownie zawieś granulat w jednym mililitrze PBS i przenieś go do 15-mililitrowej probówki. Zbierz również pozostałe komórki i odpowiadające im probówki za pomocą jednego mililitra PBS.

Następnie dodać 10 mililitrów PBS do 15-mililitrowej probówki zawierającej komórki i wymieszać pipetując. Po odwirowaniu probówki przez siedem minut w temperaturze 850 g, usunąć supernatant i ostrożnie ponownie zawiesić osad komórkowy z pozostałą zawiesiną pozostałą po dekantacji supernatantu. Przenieś zawiesinę komórek na 96-dołkową płytkę z dnem w kształcie litery V i uszczelnij studzienki, aby uniknąć rozlania.

Po zakończeniu barwienia wykonaj analizę cytometrem przepływowym. Z podglądu w czasie rzeczywistym dostosuj próg fluorescencji, w tym napięcie i wzmocnienie oraz rozmiar komórki, aby ostatecznie narysować bramki wokół żądanej populacji komórek, wykluczając wszelkie zanieczyszczenia komórkowe. Barwienie komórek CD14 i cytometria przepływowa wykazały, że naiwna frakcja monocytów składała się w 98% z komórek monocytów CD14 dodatnich i była funkcjonalnie zdolna do wychwytu antygenu.

Naiwne MoDCs fenotypowo charakteryzujące się oceną ekspresji MHC klasy 2 i kostymulujących markerów powierzchniowych komórek CD86 i CD40 walidowały komórki dendrytyczne lub fenotyp podobny do DC. Podczas kohodowli limfocytów MoDC w dziewiątym dniu zaobserwowano zmianę morfologiczną wskazującą na wydłużenie dendrytów w impulsie RV do MoDC. W porównaniu z niepulsacyjną hodowlą limfocytów MoDC, znaczny wzrost proliferacji limfocytów wykazano poprzez regulację w górę markerów aktywacji Ki67 i CD25 na limfocytach T CD4 dodatnich i CD8 w dniu 16 w pulsacyjnej kokulturze limfocytów MoDC.

Limfocyty T CD8-dodatnie z dojrzałych kokultur MoDC z impulsem RV wykazywały ośmiokrotną regulację w górę Ki67 w porównaniu z grupą niespecyficzną. Komórki CD4-dodatnie w tej samej kohodowli wykazały siedmiokrotny wzrost Ki67 w porównaniu z kontrolami, wykazując zdolność MoDC zaszczepionych RV do prezentowania antygenu RV do naiwnych limfocytów i aktywowania ich w warunkach in vitro. Kwantyfikacja qPCR kokultur wykazała ponad 30% wzrost ekspresji interferonu gamma i ponad 5% wzrost ekspresji Ki67 we wszystkich kokulturach przy użyciu GAPDH jako kalibratora.

Istotnie wyższe stężenie wydzielanego interferonu gamma zaobserwowano w kohodowli limfocytów MoDC z impulsem RV w porównaniu z grupą leczoną nieswoistą. Etap nakładania warstw należy wykonywać bardzo powoli i ostrożnie, upewniając się, że krew została położona na pożywce do izolacji limfocytów. Zachowaj szczególną ostrożność, aby zebrać wszystkie PBMC bez zbierania zbyt dużej ilości materiału z innych warstw.

Po tej procedurze można zastosować inne metody, takie jak między innymi cytometria przepływowa, ELISA i ilościowy PCR, w celu oceny aktywacji markerów immunologicznych.