Name: Oznaczanie immunogenności szczepionki przy użyciu komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów bydlęcych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-19T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 54 s
Description: Poznaj metodę generowania komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów bydlęcych do oceny immunogenności szczepionek in vitro. Protokół umożliwia skuteczne badanie kandydatów na szczepionki weterynaryjne.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy dr Eveline Wodak i dr Angelice Loistch (AGES) za wsparcie w określaniu stanu zdrowia zwierząt i za dostarczenie BTV, dr Bernhardowi Reineltowi za dostarczenie krwi bydlęcej oraz dr Bharani Settypalli i dr Williamowi Dundonowi z MAEA za przydatne porady dotyczące eksperymentów PCR w czasie rzeczywistym i edycji języka.

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Badanie to demonstruje standaryzowaną metodę in vitro do generowania i fenotypowania bydlęcych MoDC oraz ich późniejszego wykorzystania do pomiaru immunogenności szczepionki komercyjnej (np. RV). MoDC bydła mogą być wykorzystywane jako narzędzie do badań przesiewowych potencjalnych antygenów szczepionkowych przeciwko chorobom bydła i przewidywania ich potencjalnego wpływu klinicznego na podstawie odpowiedzi immunologicznych przed przystąpieniem do badań na zwierzętach in vivo . Wygenerowane MoDC zostały...

Szczepienia weterynaryjne stanowią kluczowy aspekt hodowli i zdrowia zwierząt, ponieważ przyczyniają się do poprawy bezpieczeństwa żywnościowego i dobrostanu zwierząt, zapewniając ochronę przed chorobami, które dotykają sektor hodowlany na całym świecie1. Skuteczna metoda in vitro służąca do oceny immunogenności potencjalnych szczepionek przyczyniłaby się do przyspieszenia procesu opracowywania i produkcji szczepionek. W związku z tym konieczne jest rozszerzenie dziedziny testów immunologicznych o innowacyjne metodologie oparte na badaniach in vitro, ponieważ pomogłoby to ujawnić złożoność procesów immunologicznych związanych z immunizacją i infekcją patogenów. Obecnie do pomiaru immunogenności potencjalnych szczepionek i adiuwantów stosuje się badania in vivo na zwierzętach i badania prowokacyjne, które wymagają okresowego pobierania próbek (np. krwi i śledziony). Testy te są drogie, czasochłonne i mają implikacje etyczne, ponieważ w większości przypadków eutanazja zwierząt jest przeprowadzana pod koniec badań.
Jako alternatywa dla testów in vivo, komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMC) zostały użyte do oceny odpowiedzi immunologicznej wywołanej szczepionką in vitro2. PBMC to niejednorodna populacja komórek składająca się z 70%-90% limfocytów, 10%-20% monocytów i ograniczonej liczby komórek dendrytycznych (DCs, 1%-2%)3. PBMC zawierają komórki prezentujące antygen (APC), takie jak limfocyty B, monocyty i DC, które stale patrolują organizm w poszukiwaniu oznak infekcji lub uszkodzenia tkanki. Lokalnie wydzielane chemokiny ułatwiają rekrutację i aktywację APC do tych miejsc poprzez wiązanie się z receptorami na powierzchni komórki. W przypadku monocytów chemokiny kierują swoim losem tak, aby różnicowały się w DC lub makrofagi4. Gdy tylko DC napotkają i wychwycą patogen, migrują do wtórnych narządów limfatycznych, gdzie mogą prezentować przetworzone antygeny peptydowe patogenu za pomocą białek powierzchniowych głównego kompleksu zgodności tkankowej (MHC) klasy I lub klasy II odpowiednio do limfocytów T CD8 + lub limfocytów T CD4 +, wywołując w ten sposób odpowiedź immunologiczną 5,6.
Kluczowa rola odgrywana przez DC w organizowaniu ochronnej odpowiedzi immunologicznej przeciwko różnym patogenom czyni je interesującym celem badawczym dla zrozumienia wewnątrzkomórkowych mechanizmów odpornościowych, zwłaszcza podczas projektowania szczepionek i adiuwantów przeciwko czynnikom zakaźnym7. Ponieważ frakcja DC, którą można uzyskać z PBMC, jest raczej mała (1%-2%), monocyty zostały zamiast tego wykorzystane do wygenerowania DC in vitro8. Te DC pochodzące z monocytów (MoDC) zostały początkowo opracowane jako możliwa strategia leczenia w immunoterapii nowotworów9. Ostatnio MoDC były używane do badań nad szczepionkami10,11,12, a klasyczne monocyty są dominującym podtypem (89%) dla produkcji MoDC13. Wytwarzanie MoDC in vitro zostało wcześniej osiągnięte poprzez dodanie czynnika stymulującego tworzenie kolonii granulocytów i makrofagów (GM-CSF) podawanego w połączeniu z innymi cytokinami, takimi jak interleukina-4 (IL-4), czynnik martwicy nowotworu α (TNF-α) lub IL-1314,15,16.
Sukces testu in vitro MoDC zależy od zdolności stymulowanych antygenem dojrzałych MoDC do modulowania zakresu i rodzaju odpowiedzi immunologicznej specyficznej dla typu wykrytego antygenu17. Rodzaj patogenu rozpoznanego i prezentowanego przez MoDC determinuje różnicowanie komórek pomocniczych T (Th) CD4 + na komórki efektorowe Th1, Th2 lub Th17 i charakteryzuje się profilem cytokin wydzielniczych specyficznym dla patogenu. Odpowiedź Th1 jest wywoływana przeciwko patogenom wewnątrzkomórkowym i powoduje wydzielanie interferonu gamma (IFN-γ) i czynnika martwicy nowotworu beta (TNF-β), który moduluje ochronę zależną od fagocytarów. Odpowiedź Th2 jest wyzwalana przeciwko organizmom pasożytniczym i charakteryzuje się wydzielaniem IL-4, IL-5, IL-10 i IL-13, co inicjuje niezależną od fagocytów ochronę humoralną. Th17 zapewnia zależną od neutrofili ochronę przed zewnątrzkomórkowymi infekcjami bakteryjnymi i grzybiczymi, w których pośredniczy wydzielanie IL-17, IL-17F, IL-6, IL-22 i TNF-α18,19,20,21. Na podstawie wcześniejszych badań zauważono, że nie wszystkie patogeny mieszczą się w oczekiwanym profilu cytokinowym. Na przykład skórne MoDC, w odpowiedzi na zakażenie pasożytnicze Leishmania, stymulują wydzielanie IFN-γ z limfocytów T CD4 + i limfocytów T CD8 +, indukując w ten sposób ochronną prozapalną odpowiedź Th1 22.
Wykazano również, że u kurczaków MoDC zaszczepionych lipopolisacharydem Salmonelli (LPS), mogą wywołać zmienną odpowiedź przeciwko Salmonella typhimurium poprzez aktywację zarówno odpowiedzi Th1, jak i Th2, podczas gdy Salmonella gallinarum indukuje samą odpowiedź Th2, co może tłumaczyć wyższą odporność tej ostatniej na klirens MoDC23. Aktywacja MoDC przeciwko Brucella canis (B. canis) została również zgłoszona zarówno u psów, jak i u ludzi, co oznacza, że może to reprezentować mechanizm infekcji odzwierzęcej24. Ludzkie MoDC zaszczepione B. canis indukują silną odpowiedź Th1, która nadaje odporność na ciężką infekcję, podczas gdy psie MoDC indukują dominującą odpowiedź Th17 ze zmniejszoną odpowiedzią Th1, co w konsekwencji prowadzi do powstania przewlekłej infekcji25. Bydlęce MoDC wykazują zwiększone powinowactwo do wirusa pryszczycy (FMDV) sprzężonego z immunoglobuliną G (IgG) w porównaniu z samą niesprzężoną FMDV, ponieważ MoDC tworzą kompleks wirusowo-przeciwciałowy w odpowiedzi na były10. Podsumowując, badania te pokazują, w jaki sposób MoDC zostały wykorzystane do analizy złożoności odpowiedzi immunologicznych podczas infekcji patogenem. Adaptacyjne odpowiedzi immunologiczne można ocenić poprzez kwantyfikację specyficznych markerów związanych z proliferacją limfocytów. Ki-67, białko wewnątrzkomórkowe wykrywane tylko w dzielących się komórkach, jest uważane za wiarygodny marker w badaniach proliferacji26, i podobnie, CD25 wyrażony na powierzchni limfocytów T podczas późnej fazy aktywacji odpowiada proliferacji limfocytów27,28.
To badanie demonstruje standaryzowaną metodę generowania in vitro MoDC bydła, a następnie ich zastosowanie w teście immunologicznym in vitro używanym do testowania immunogenności szczepionek. Dostępna na rynku szczepionka przeciwko wściekliźnie (RV) została wykorzystana do walidacji skuteczności tego testu. Aktywację i proliferację limfocytów T mierzono za pomocą cytometrii przepływowej, ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym (qPCR) i testu immunoenzymatycznego (ELISA) poprzez analizę dobrze znanych markerów aktywacji komórek, takich jak Ki-67 i CD25 oraz wydzielanie IFN-γ28,29,30,31. Podczas testu MoDC nie przeprowadza się żadnych badań eksperymentalnych na zwierzętach ani ludziach.

<table><tbody><tr><td>ACK Lysing Buffer</td><td>Gibco, Thermo Fisher</td><td>A1049201</td><td>Bufor amonowo-chlorkowo-potasowy do lizy resztkowych krwinek czerwonych w zebranych</td></tr><tr><td>probówkach do heparyny próżniowej frakcji</td> PBMC <td>Becton, Dickinson (BD) and Company</td><td>366480</td><td>10 mL, dodatek heparyny sodowej 158 jednostek USP, szklana probówka, rozmiar 16 x 100 mm</td></tr><tr><td>zestaw do wzrostu bydlęcych komórek dendrytycznych</td><td>Bio-Rad, Wielka Brytania</td><td>PBP015KZZ</td><td>Koktajl cytokin złożony z rekombinowanego bydlęcego IL-4 i</td></tr><tr><td>bydlęcego IFN-&gamma GM-CSF; Zestaw ELISA</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA5638KZZ</td><td>Zestaw służy do pomiaru ekspresji IFN-&gamma; w hodowli supernatant</td></tr><tr><td>Przeciwciało CD14</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA2678F</td><td>Mysie przeciwciało monoklonalne anty-bydlęce CD14, klon CC-G33, izotyp IgG1</td></tr><tr><td>Przeciwciało CD25</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA2430PE</td><td>Mysie przeciwciało monoklonalne antybydlęce CD25, klon IL-A11, izotyp IgG1</td></tr><tr><td>Przeciwciało CD4</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA1653A647</td><td>Mysie przeciwciało monoklonalne antybydlęce CD4, klon CC8, przeciwciało izotypu IgG2a</td></tr><tr><td>CD40</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA2431F</td><td>Mysie przeciwciało monoklonalne antybydlęce CD40, klon IL-A156, izotyp IgG1</td></tr><tr><td>Przeciwciało CD8</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA837F</td><td>Mysie przeciwciało monoklonalne antybydlęce CD8, klon CC63, przeciwciało izotypu IgG2a</td></tr><tr><td>CD86</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA2437PE</td><td>Mysie przeciwciało monoklonalne antybydlęce CD86, klon IL-A190, izotyp IgG1</td></tr><tr><td>CFX96 Dotykowy system wykrywania PCR w czasie rzeczywistym Maszyna do PCR</td><td>Bio-Rad-Thermal</td><td></td> <td>cycler</td></tr><tr><td>Probówka wirówkowa</td><td>Corning Falcon Corning&nbsp;</td><td>352096 & 352070</td><td>15 ml i 50 mL, stożkowe dno poypropylenu o wysokiej przejrzystości, z podziałką, sterialne, nakrętka z uszczelką, rurka sokoła</td></tr><tr><td>Cytofix/Cytoperm Plus</td><td>BD Bio Sciences</td><td>555028</td><td>Zestaw do utrwalania/przepuszczalności z BD golgiPlug, służy do barwienia komórek cytometru przepływowego</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1009832500</td><td>Absolutny do analizy EMSURE&nbsp; ACS, ISO, Reag. Ph Eur</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Gibco, Thermo Fisher</td><td></td><td>10500064 Kwalifikowana, inaktywowana termicznie</td></tr><tr><td>Ficoll Plaque PLUS</td><td>GE Opieka zdrowotna Nauki przyrodnicze, USA</td><td>341691</td><td>Pożywka do izolacji limfocytów</td></tr><tr><td>FlowClean Środek czyszczący</td><td>Beckman Coulter, nauki przyrodnicze</td><td>A64669</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>FlowJo</td><td>FlowJo, Becton, Dickinson (BD) and Company, LLC, USA-</td><td></td><td>Cytometr przepływowy Oprogramowanie do histogramu</td></tr><tr><td>FlowTubes/ FACS&nbsp; (Sortowanie pojedynczych komórek aktywowane fluorescencją) Rura</td><td>Falcon Corning&nbsp;</td><td>352235</td><td>5 mL, steryczna, okrągłodenna probówka z polistyrenu z zatrzaskiem sitka komórkowego, do stosowania w analizie cytometrii przepływowej</td></tr><tr><td>Fluoresceinisothiocynat-Dextran</td><td>Sigma Aldrich, Niemcy</td><td>60842-46-8</td><td>FITC-dekstran MW</td></tr><tr><td>Gallios Cytometr przepływowy</td><td>Beckman Coulter-Flow</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Płytki PCR z twardą skorupą 96 dołków</td><td>Bio-Rad</td><td>HSP9601</td><td>96 dołk, niskoprofilowe, cienkościenne, z listwą, biały/przezroczysty</td></tr><tr><td>Ludzkie mikrokulki CD14</td><td>Miltenyi Bioteck, Niemcy</td><td>130-050-201</td><td>2 ml mikrogranulki sprzężone z monoklonalnym przeciwciałem anty-ludzkim CD14 izotyp IgG2a, używane do selekcji monocytów bydlęcych z PBMC</td></tr><tr><td>Kaluza</td><td>Beckman Coulter,</td> <td>Niemcy-Cytometr przepływowy oprogramowanie do wielokolorowej analizy danych</td><td></td></tr> <tr><td>Kolumna MACS</td><td>Miltenyi Bioteck, Niemcy</td><td>130-042-401</td><td>Magnetyczne sortowanie komórek lub immunologiczna agentyczna separacja komórek do separacji różnych populacji komórek CD14 na podstawie antygenów powierzchniowych</td></tr><tr><td>komórek MHC Klasa II DQ DR Przeciwciało polimorficzne</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA2228F</td><td>Mysie przeciwciało przeciw owcom MHC Klasa II DQ DR Polimorficzny: FITC, klon 49.1, izotyp IgG2a, reaktywny krzyżowo z</td></tr><tr><td>probówką do mikrowirówki</td> bydlęcej <td>Sigma Aldrich</td><td>HS4325</td><td>1,5 mL, dno stożkowe, z podziałką, rurka sterialna</td></tr><tr><td>Microsoft Power Point</td><td></td> <td>Microsoft-Graficzne</td> <td>ilustracje projektu eksperymentalnego</td></tr><tr><td>Mysia kontrola ujemna IgG1: FITC dla przeciwciała CD14, CD40</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA928F</td><td>Kontrola izotypu Przeciwciało monoklonalne CD14 i CD40&nbsp;</td></tr><tr><td>Mysia kontrola ujemna IgG1: PE dla przeciwciała CD86</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA928PE</td><td>kontrola izotypu Przeciwciało monoklonalne CD86&nbsp;</td></tr><tr><td>Mysia kontrola ujemna IgG1: RPE dla przeciwciała CD25</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA928PE</td><td>Kontrola izotypu Przeciwciało monoklonalne CD25&nbsp;</td></tr><tr><td>Mysia kontrola ujemna IgG2a: FITC dla przeciwciała MHC klasy II</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA929F</td><td>Kontrola izotypu dla przeciwciała monoklonalnego MHC klasy II&nbsp;</td></tr><tr><td>Nobivac Wścieklizna</td><td>MSD Zdrowie zwierząt,</td> <td>UK-1</td> <td>i mikro; L/ml inaktywowanej szczepionki z hodowli komórkowej zawierającej > 2 m.j./ml szczepu wirusa wścieklizny</td></tr><tr><td>Uszczelki optyczne</td><td>Bi0-Rad</td><td>TCS0803</td><td>0,2 ml płaska probówka do PCR 8-nasadkowa, paski optyczne, ultraprzezroczyste, kompatybilne z maszyną qPCR</td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Gibco, Thermo Fisher</td><td>15140122</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>Bufor fosforanowy sól fizjologiczna (PBS)</td><td>Gibco, Thermo Fisher</td><td>10010023</td><td>pH 7,4, 1x stężenie</td></tr><tr><td>Pryzmat - Oprogramowanie GraphPad 5&nbsp;</td><td>Dotmatics-Oprogramowanie</td><td></td> <td>statystyczne</td></tr><tr><td>Oczyszczone przeciwciało anty-ludzkie Ki-67</td><td>Biolegend, USA</td><td>350501</td><td>Przeciwciało monoklonalne, reaktywne krzyżowo z krową, klon ki-67</td></tr><tr><td>Oczyszczona mysz IgG1 k Izotyp Ctrl Przeciwciało</td><td>Biolegend</td><td>400101</td><td>Kontrola izotypu dla przeciwciała monoklonalnego Ki-67</td></tr><tr><td>READIDROP Jodek propidium</td><td>BD Bio Sciences</td><td>1351101</td><td>Marker żywej / martwej komórki stosowany do cytometrii przepływowej, barwnik reaktywny aminami</td></tr><tr><td>Rekombinowane ludzkie białko IL-2</td><td>R& D System, USA</td><td>202-IL-010/CF</td><td>Interleukina-2, 20 ng/ml</td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74106</td><td>Zestaw do ekstrakcji całkowitego RNA; Bufor RLT = bufor do lizy; Bufor RW1 = rygorystyczny bufor płuczący zawierający guanidynę; Bufor RDD = Bufor DNazy; Bufor RPE = łagodny bufor do mycia; RNaseOUT = inhibitor RNazy.</td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R8758</td><td>Pożywka do hodowli komórkowych z L-glutaminą i wodorowęglanem sodu</td></tr><tr><td>SMART-servier sztuka medyczna&nbsp;</td><td>Les Laboratories Servier-Licensed</td><td></td> <td>na licencji Creative Commons uznanie autorstwa 3.0 unported</td></tr><tr><td>license SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix</td><td>Bio-Rad</td><td>172-5270</td><td>2x qPCR mix conatins dNTPs, polimeraza fuzyjna Ss07d, MgCl2, SYBR Green I supermix = supermix, barwniki normalizujące ROX.</td></tr><tr><td>SuperScript III First-Strand Synthesis System</td><td>Invitrogen, Thermo Fisher</td><td></td><td>18080051 Kit do syntezy cDNA</td></tr><tr><td>Kultura tkankowa Płytka testowa 24</td><td>TPP, Szwajcaria</td><td>92024</td><td>Płytka 24-dołkowa, sterylizowana promieniowaniem, traktowana ze zwiększoną naturą, objętość 3,18 ml</td></tr><tr><td>Roztwór błękitu trypanowego</td><td>Gibco, Thermo Fisher</td><td>15250061</td><td>0,4%, 100 mL, barwnik do oceny żywotności komórek</td></tr><tr><td>UltraPure Invitrogen do wody destylowanej bez DNaz/RNaz</td><td>, Thermo Fisher</td><td>10977023</td><td>0,1 i mikro; m membrana filtrowana woda destylowana</td></tr><tr><td>Probówki do pobierania krwi VACUETTE Heparyna Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>15206067</td><td>Probówki do pobierania krwi VACUETTE Heparin mają zieloną górę i zawierają suszoną rozpyłowo heparynę litową, sodową lub amonową na wewnętrznych ściankach i są stosowane w chemii klinicznej, immunologii i serologii. Heparyna przeciwzakrzepowa aktywuje antytrombinę, która blokuje kaskadę krzepnięcia i w ten sposób wytwarza próbkę krwi pełnej/osocza.</td></tr><tr><td>Woda</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W3500-1L</td><td>Sterylnie filtrowany, bioOdczynnik odpowiedni do hodowli komórkowych</td></tr></tbody></table>

oznaczanie immunogenności szczepionki przy użyciu komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów bydlęcych

Determination of Vaccine Immunogenicity Using Bovine Monocyte-Derived Dendritic Cells

Komórki dendrytyczne (DC) są najsilniejszymi komórkami prezentującymi antygen (APC) w układzie odpornościowym. Patrolują organizm w poszukiwaniu patogenów i odgrywają wyjątkową rolę w układzie odpornościowym, łącząc wrodzoną i nabytą odpowiedź immunologiczną. Komórki te mogą fagocytować, a następnie prezentować przechwycone antygeny efektorowym komórkom odpornościowym, wywołując różnorodny zakres odpowiedzi immunologicznych. W artykule przedstawiono standaryzowaną metodę wytwarzania in vitro komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów bydlęcych (MoDC) wyizolowanych z komórek jednojądrzastych krwi obwodowej bydła (PBMC) i ich zastosowanie w ocenie immunogenności szczepionki.
Do wyizolowania monocytów CD14+ z PBMC zastosowano sortowanie komórek oparte na magnesach, a suplementacja kompletnej pożywki hodowlanej interleukiną (IL)-4 i czynnikiem stymulującym tworzenie kolonii granulocytów i makrofagów (GM-CSF) została użyta do wywołania różnicowania monocytów CD14+ w naiwne MoDCs. Wytwarzanie niedojrzałych MoDC potwierdzono poprzez wykrycie ekspresji głównego kompleksu zgodności tkankowej II (MHC II), CD86 i markerów powierzchniowych komórek CD40. Dostępna na rynku szczepionka przeciwko wściekliźnie została użyta do impulsacji niedojrzałych MoDC, które następnie były hodowane wspólnie z naiwnymi limfocytami.
Analiza cytometrii przepływowej MoDC z pulsacją antygenu i kohodowli limfocytów ujawniła stymulację proliferacji limfocytów T poprzez ekspresję markerów Ki-67, CD25, CD4 i CD8. Analiza ekspresji mRNA IFN-γ i Ki-67 przy użyciu ilościowej reakcji PCR wykazała, że MoDC mogą indukować specyficzne dla antygenu pobudzenie limfocytów w tym systemie kohodowli in vitro. Ponadto wydzielanie IFN-γ oceniane za pomocą testu ELISA wykazało znacznie wyższe miano (**p < 0,01) w kokulturze limfocytów MoDC z impulsem szczepionki przeciwko wściekliźnie niż w kohodowli limfocytów MoDC bez impulsu antygenu. Wyniki te pokazują ważność tego testu MoDC in vitro do pomiaru immunogenności szczepionki, co oznacza, że test ten może być wykorzystany do identyfikacji potencjalnych kandydatów na szczepionki dla bydła przed przystąpieniem do badań in vivo, a także do oceny immunogenności szczepionek komercyjnych.

Niniejsza metodologia opisuje generowanie komórek MoDC bydła in vitro w celu oceny kandydujących antygenów szczepionkowych przed przeprowadzeniem badań in vivo. Rysunek 1 przedstawia schemat doświadczalny generowania bydlęcych MoDC oraz zastosowanie MoDC w analizie in vitro. Dzięki zastosowaniu techniki magnetycznego sortowania komórek możliwe było zebranie około 26 milionów monocytów CD14+ z pobranych PBMC, które uprzednio wyizolowano z 50 mL krwi bydła...

Metodologia opisuje wytwarzanie komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów bydlęcych (MoDC) i ich zastosowanie do oceny in vitro kandydatów na antygeny podczas opracowywania potencjalnych szczepionek weterynaryjnych u bydła.

Oznaczanie immunogenności szczepionki przy użyciu komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów bydlęcych

Dendritic cells (DCs) are the most potent antigen-presenting cells (APCs) within the immune system. They patrol the organism looking for pathogens and ...

Protokół ten stanowi funkcjonalny test in vitro z wykorzystaniem komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów bydlęcych do pomiaru immunogenności szczepionki przed badaniami in vivo. W ten sposób wypełnia istniejącą lukę w wakcynologii zwierząt gospodarskich. Jest to wytwarzanie i stosowanie komórek dendrytycznych.Jako najsilniejsze komórki prezentujące antygen, komórki dendrytyczne stały się kluczowym celem badawczym w celu zrozumienia wewnątrzkomórkowych mechanizmów odpornościowych, w tym skuteczności szczepionki. Test ten może być wdrożony jako narzędzie do badań przesiewowych kandydatów na szczepionki, jako stan kontroli jakości produkcji szczepionki oraz do selekcji antygenów i adiuwantów. Procedurę zademonstruje Richard Kangethe, naukowiec z laboratorium produkcji zwierzęcej i zdrowia.Zacznij od odwrócenia i wymieszania krwi uzyskanej z nakłucia żyły szyjnej cielęcia z heparynizowanymi wakutainerami. Następnie przenieś 20 mililitrów heparynizowanej krwi do sterylnej probówki o pojemności 50 mililitrów i rozcieńcz ją 10 mililitrami soli fizjologicznej buforowanej fosforanem lub PBS. Odpipetować 15 mililitrów pożywki do izolacji limfocytów do sterylnej probówki o pojemności 50 mililitrów i przechylić probówkę do pozycji 45 stopni.Ostrożnie ułóż 30 mililitrów pożywki PBS krwi na izolacji limfocytów za pomocą pipety o pojemności 25 mililitrów i powoli przywróć probówkę do pozycji pionowej przed odwirowaniem. Następnie zbierz cienką białą warstwę komórek jednojądrzastych krwi obwodowej lub warstwę PBMC za pomocą pipety Pasteura i przenieś ją do nowej probówki o pojemności 50 mililitrów. Umyj zebrane PBMC dwa razy, używając 40 mililitrów PBS na pranie i dokładnie wymieszaj.Po odwirowaniu ponownie zawiesić osad w 15 mililitrach buforu potasowego chlorku amonu lub buforu ACK. Po 10 do 15 minutach inkubacji w temperaturze pokojowej dodać do 40 mililitrów PBS i odwirować probówkę z maksymalnym przyspieszeniem i opóźnieniem. Zawiesić osad w 10 mililitrach kompletnej pożywki hodowlanej.Następnie dodaj pięć mikrolitrów buforu CD14 MicroBead na 10 milionów komórek i dokładnie wymieszaj za pomocą pipety. Do analizy cytometrii przepływowej dodaj 10 mikrolitrów izotiocyjanianu fluoresceiny CD14 lub przeciwciała barwiącego FITC do PBMC i inkubuj przez 15 minut w temperaturze od czterech do ośmiu stopni Celsjusza przed przystąpieniem do cytometrii przepływowej. Do niebarwionych PBMC dodać jeden mililitr buforu faksowego i odwirowywać go przez siedem minut w temperaturze 500 g i czterech stopniach Celsjusza.Następnie ponownie zawieś osad w 500 mikrolitrach bufora faksu na 100 milionów komórek. Następnie włóż immunomagnetyczną kolumnę do separacji komórek do separatora i umieść 50-mililitrową rurkę zbiorczą pod wylotem kolumny w celu zebrania przepływu. Po umyciu kolumny jednym mililitrowym odgazowanym buforem faksowym należy wymienić zużytą rurkę o pojemności 15 mililitrów na nową.Jednorazowo odpipetować sto milionów komórek w 500 mikrolitrach buforu, pozwalając zawiesinie komórek przejść przez kolumnę. Następnie przepłukać kolumnę trzykrotnie trzema mililitrami odgazowanego buforu faksowego za każdym razem. Po zebraniu przepływu oznacz pierwszą eluowaną naiwną frakcję limfocytów jako frakcję komórek CD14 ujemną.Wyjmij kolumnę z separatora i umieść nową sterylną rurkę o pojemności 15 mililitrów pod kolumną do zbierania ścieków. Dodać pięć mililitrów bufora faksu do kolumny i natychmiast przepchnąć go przez nią za pomocą tłoka. Zbierz i oznacz drugi przepływ lub naiwną frakcję monocytów jako frakcję komórek CD14-dodatnich.Dodaj kompletną pożywkę hodowlaną do zebranych monocytów CD14-dodatnich, aby uzyskać 1 milion komórek na mililitr. Następnie dodaj jeden mililitr zawiesiny komórek do każdej studzienki sterylnej 24-dołkowej płytki przed uzupełnieniem każdej studzienki 40 mikrolitrami koktajlu cytokin dostarczonego w zestawie. Drugiego dnia przenieś połowę zawartości każdej studzienki do pojedynczych 1,5 mililitrowych probówek za pomocą pipety.Po odwirowaniu 1,5 mililitrowych probówek o masie 500 g przez siedem minut, odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 500 mikrolitrach świeżej, kompletnej pożywki hodowlanej. Przenieś 500 mikrolitrów tej zawieszonej zawiesiny komórek z powrotem do odpowiednich studzienek, tak aby końcowa objętość w studzience wynosiła jeden mililitr. Wzbogać każdą studzienkę o 20 mikrolitrów koktajlu cytokinowego.Aby wygenerować MoDC impulsowe antygenowo, dodaj jeden mikrolitr na mililitr szczepionki przeciwko wirusowi wścieklizny lub zawiesiny RV do jednego mililitra naiwnej kultury MoDC na 24-dołkowej płytce i inkubuj płytkę przez 48 godzin w 5% dwutlenku węgla i 37 stopniach Celsjusza. Siódmego dnia trzymaj 24-dołkową płytkę zawierającą pulsujące antygenem MoDC na lodzie przez 10 minut, a następnie dodaj jeden mililitr lodowatego PBS na studzienkę i dokładnie wymieszaj. Przenieś zawieszenie do 15-mililitrowej dętki.Umyj studzienki dwoma mililitrami lodowatego PBS. Zebrać pozostałe komórki w każdej studzience i przenieść umytą zawartość do odpowiednich probówek. Odwirować zawiesinę komórkową o masie 500 g przez siedem minut.Po odrzuceniu supernatantu ponownie zawieś osad komórkowy MoDCs z impulsem antygenu w kompletnej pożywce hodowlanej, aby dostosować końcowe stężenie 100 000 komórek na mililitr. W przypadku kohodowli limfocytów MoDC należy wysiać studzienki sterylnej 24-dołkowej płytki z jednym mililitrem pierwotnej zawiesiny komórek limfocytów i jednym mililitrem zawiesiny MoDC pulsacyjnej antygenowej lub niepulsacyjnej antygenu w siódmym dniu impulsu antygenu. Po dwóch dniach inkubacji uzupełnij każdą studzienkę 20 nanogramami na mililitr rekombinowanej interleukiny-2 i kontynuuj inkubację przez kolejne 120 godzin.W dniu 14 przenieś jeden mililitr kokultury do sterylnej probówki o pojemności 1,5 mililitra i odwiruj probówkę. Następnie ponownie zawieś osad komórkowy za pomocą jednego mililitra MoDC impulsowych lub niepulsacyjnych MoDC. Dobrze wymieszać i przenieść zawiesiny komórek do odpowiednich dołków.Po barwieniu powierzchni komórek PBMC oraz nieprawidłowo urodzonych limfocytów i monocytów, przenieś jeden mililitr zawiesiny komórkowej do sterylnej probówki o pojemności 1,5 mililitra za pomocą pipety i wiruj przez 10 minut w temperaturze 500 g. Następnie ponownie zawieś granulat w jednym mililitrze PBS i przenieś go do 15-mililitrowej probówki. Zbierz również pozostałe komórki i odpowiadające im probówki za pomocą jednego mililitra PBS.Następnie dodać 10 mililitrów PBS do 15-mililitrowej probówki zawierającej komórki i wymieszać pipetując. Po odwirowaniu probówki przez siedem minut w temperaturze 850 g, usunąć supernatant i ostrożnie ponownie zawiesić osad komórkowy z pozostałą zawiesiną pozostałą po dekantacji supernatantu. Przenieś zawiesinę komórek na 96-dołkową płytkę z dnem w kształcie litery V i uszczelnij studzienki, aby uniknąć rozlania.Po zakończeniu barwienia wykonaj analizę cytometrem przepływowym. Z podglądu w czasie rzeczywistym dostosuj próg fluorescencji, w tym napięcie i wzmocnienie oraz rozmiar komórki, aby ostatecznie narysować bramki wokół żądanej populacji komórek, wykluczając wszelkie zanieczyszczenia komórkowe. Barwienie komórek CD14 i cytometria przepływowa wykazały, że naiwna frakcja monocytów składała się w 98% z komórek monocytów CD14 dodatnich i była funkcjonalnie zdolna do wychwytu antygenu.Naiwne MoDCs fenotypowo charakteryzujące się oceną ekspresji MHC klasy 2 i kostymulujących markerów powierzchniowych komórek CD86 i CD40 walidowały komórki dendrytyczne lub fenotyp podobny do DC. Podczas kohodowli limfocytów MoDC w dziewiątym dniu zaobserwowano zmianę morfologiczną wskazującą na wydłużenie dendrytów w impulsie RV do MoDC. W porównaniu z niepulsacyjną hodowlą limfocytów MoDC, znaczny wzrost proliferacji limfocytów wykazano poprzez regulację w górę markerów aktywacji Ki67 i CD25 na limfocytach T CD4 dodatnich i CD8 w dniu 16 w pulsacyjnej kokulturze limfocytów MoDC.Limfocyty T CD8-dodatnie z dojrzałych kokultur MoDC z impulsem RV wykazywały ośmiokrotną regulację w górę Ki67 w porównaniu z grupą niespecyficzną. Komórki CD4-dodatnie w tej samej kohodowli wykazały siedmiokrotny wzrost Ki67 w porównaniu z kontrolami, wykazując zdolność MoDC zaszczepionych RV do prezentowania antygenu RV do naiwnych limfocytów i aktywowania ich w warunkach in vitro. Kwantyfikacja qPCR kokultur wykazała ponad 30% wzrost ekspresji interferonu gamma i ponad 5% wzrost ekspresji Ki67 we wszystkich kokulturach przy użyciu GAPDH jako kalibratora.Istotnie wyższe stężenie wydzielanego interferonu gamma zaobserwowano w kohodowli limfocytów MoDC z impulsem RV w porównaniu z grupą leczoną nieswoistą. Etap nakładania warstw należy wykonywać bardzo powoli i ostrożnie, upewniając się, że krew została położona na pożywce do izolacji limfocytów. Zachowaj szczególną ostrożność, aby zebrać wszystkie PBMC bez zbierania zbyt dużej ilości materiału z innych warstw.Po tej procedurze można zastosować inne metody, takie jak między innymi cytometria przepływowa, ELISA i ilościowy PCR, w celu oceny aktywacji markerów immunologicznych.

determination-vaccine-immunogenicity-using-bovine-monocyte-derived

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Ten film demonstruje test oparty na MoDC na komórkach dendrytycznych pochodzących z monocytów, do pomiaru immunogenności dostępnych na rynku szczepionek. Testy MoDC badają odpowiedzi komórek dendrytycznych na antygeny, patogeny lub leczenie i mogą dostarczyć informacji na temat odpowiedzi immunologicznej, opracowywania szczepionek i badań nad immunoterapią.

Test in vitro oparty na pulsacyjnych komórkach dendrytycznych opartych na szczepionce w celu indukowania proliferacji limfocytów

Opisano najczęściej używaną metodę generowania dużej liczby autologicznych komórek dendrytycznych (DC) do wykorzystania w immunoterapii nowotworów.  Metoda wykorzystuje IL-4 i GM-CSF do różnicowania DC od monocytów.  Niedojrzałe DC są stymulowane do dojrzewania, a następnie ładowane antygenami przed wstrzyknięciem z powrotem pacjentowi.

Przygotowanie dojrzałych komórek dendrytycznych obciążonych antygenem nowotworowym do immunoterapii

Długoterminowy test immunologiczny związany z interferonem γ enzymem jest używany jako miara odpowiedzi pamięci centralnej i koreluje z ochronnymi odpowiedziami na szczepionkę przeciw prątkom. Dzięki temu testowi komórki jednojądrzaste krwi obwodowej są stymulowane antygenami prątkami i interleukiną-2 przez 14 dni, umożliwiając różnicowanie i ekspansję limfocytów T pamięci centralnej.

Zastosowanie długotrwale hodowanego testu immunologicznego związanego z enzymem interferonu γ do oceny odpowiedzi efektorowych i pamięciowych limfocytów T u bydła

Tutaj pokazujemy, jak monocyty są izolowane przez magnetyczne oddzielanie kulek od komórek jednojądrzastych krwi obwodowej po odwirowaniu w gradionym gradifikacji gęstości ludzkiej krwi antykoagulowanej. Po inkubacji przez 5 dni ludzkie monocyty różnicują się w niedojrzałe komórki dendrytyczne i są gotowe do procedur eksperymentalnych w warunkach nieklinicznych.

Wytwarzanie ludzkich komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów z krwi pełnej

Prezentowana jest nowatorska technika szybkiego wyświetlania antygenu na powierzchni bakteryjnej, która polega na powierzchniowej biotynylacji, a następnie ekspozycji na interesujące białka podczas fuzji z monomeryczną awidyną. Ładowanie BCG wybranymi antygenami skutecznie poprawia jego immunogenność, co sugeruje, że dekoracja powierzchni może zastąpić tradycyjne podejścia genetyczne.

Ekspresja antygenów egzogennych w szczepionce BCG przeciwko Mycobacterium bovis poprzez niegenetyczne zdobienie powierzchni za pomocą systemu Avidin-biotyna

DC (MoDC) pochodzące z monocytów może wykrywać niewielkie ilości cząsteczek związanych z niebezpieczeństwem i dlatego jest łatwo zapoczątkowane. Przedstawiamy szczegółowy protokół izolacji MoDC z krwi i nowotworów oraz ich aktywacji za pomocą kompleksów immunologicznych, podkreślając jednocześnie kluczowe środki ostrożności, które należy wziąć pod uwagę, aby uniknąć ich przedwczesnej aktywacji.

Protokół izolacji komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów myszy i ich późniejsza aktywacja in vitro za pomocą nowotworowych kompleksów immunologicznych

Tutaj prezentujemy protokół rozwoju i charakterystyki tolerogennych komórek dendrytycznych (TolDCs) oraz oceny ich immunoterapeutycznej użyteczności.

Rozwój i charakterystyka funkcjonalna mysich tolerogennych komórek dendrytycznych

Eksperymentalne procedury późniejszej ekstrakcji tkanek limfatycznych w celu przetestowania aktywacji limfoidalnych komórek dendrytycznych są opisane po leczeniu immunostymulującym nanomateriałem.

Ocena czynnika immunostymulującego: ekstrakcja tkanki limfatycznej i aktywacja komórek dendrytycznych zależna od drogi iniekcji

Opisujemy protokół chemicznej koniugacji modelowego antygenu albuminy jaja kurzego z przeciwciałem specyficznym dla receptora endocytozy do celowania in vivo w komórki dendrytyczne. Protokół obejmuje oczyszczenie przeciwciała, chemiczne sprzęgnięcie antygenu, a także oczyszczenie koniugatu i weryfikację sprawnej koniugacji.

Chemiczna koniugacja oczyszczonego przeciwciała skierowanego przeciwko DEC-205 z białkiem o pełnej długości do celowania w mysie komórki dendrytyczne in vitro i in vivo

Przedstawiono unikalny, kompleksowy protokół generowania de-sialylowanych ludzkich komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów (mo-DCs) z izolowanych komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMCs) za pomocą leczenia sialidazą. Ponadto opisano metody oceny charakterystyki fenotypowej i funkcjonalnej mo-DC oraz oceny, w jaki sposób leczenie sialidazą poprawia poziom dojrzewania mo-DC.

Generowanie komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów o różnych fenotypach sjalowanych

Opisujemy procedurę oceny zdolności środków farmakologicznych do generowania tolerogennych komórek dendrytycznych z naiwnych komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów in vitro i walidacji ich siły poprzez autologiczne generowanie regulatorowych limfocytów T.

Prosta i skuteczna metoda testowania środków immunomodulujących do wytwarzania tolerogennych komórek dendrytycznych z ludzkich monocytów CD14+

Poznaj metodę generowania komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów bydlęcych do oceny immunogenności szczepionek in vitro. Protokół umożliwia skuteczne badanie kandydatów na szczepionki weterynaryjne.

Oznaczanie immunogenności szczepionki przy użyciu komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów bydlęcych

Przeglądaj więcej filmów