Generowanie komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów o różnych fenotypach sjalowanych

Zakres badań Grupy Glikoimmunologicznej obejmuje badanie roli glikanów w immunologii w zdrowiu i chorobie człowieka. Badania te mają na celu rozwikłanie mechanizmów biologicznych moderowanych przez glikozylacje oraz odkrycie nowych terapii opartych na glikanach w leczeniu nowotworów i wrodzonych zaburzeń glikozylacji. Skupiliśmy się na sjalylowanych glikanach, które wpływają na funkcję odpowiednich cząsteczek na powierzchni komórki, szczególnie podczas odpowiedzi.

Opracowaliśmy technologie zmiany zawartości kwasu sjalowego oraz multimodalną platformę do wysokoprzepustowego opracowywania białek wiążących glikany, które mogą znaleźć zastosowanie kliniczne. Aby posunąć naprzód badania w tej dziedzinie, wykorzystujemy kilka technologii, takich jak profilowanie glikanów, selekcja lub barwienie przeciwciał, spektrometria mas i immunohistochemia, testy in vitro z liniami komórkowymi jako modelami choroby, manipulacje zawartością kwasu sjalowego za pomocą inżynierii enzymatycznej i metabolicznej. Obecne wyzwania eksperymentalne dotyczą zrozumienia złożonych interakcji między syjologlikanami a lektynami.

Są to mechanizmy i funkcjonalne konsekwencje w kilku odpowiedziach immunologicznych. Kwas sjalowy moduluje siłę działania komórek dendrytycznych i obrót MHC-I. Odkrycie to wskazało nowe mechanizmy biologiczne i patologiczne oraz opracowało innowacyjne terapie.

Zidentyfikowano także nowe szlaki immunologiczne i podejścia do ich modulacji terapeutycznej. Jednym z problemów związanych z produkcją ex vivo ludzkich komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów do celów terapeutycznych jest ich niezdolność do pełnego dojrzewania. Protokół ten pokazuje, że dojrzewanie choroby można osiągnąć poprzez enzymatyczne traktowanie powierzchni komórki sialidazami przy jednoczesnym utrzymaniu żywotności komórek.

Ta metoda jest opłacalna i oszczędza czas. W porównaniu z inhibitorami metabolizmu kwasu sjalowego, leczenie sialidazą oferuje szybką, skuteczną i odporną metodę usuwania kwasów sjalowych z powierzchni komórek, przy jednoczesnym utrzymaniu żywotności komórek. Zrozumienie roli glikanów zawierających kwas sjalowy generuje bezprecedensową świadomość znaczenia tego glikanu w leczeniu nowotworów i przyczyni się do identyfikacji nowych mechanizmów chorobowych i nowych strategii terapeutycznych.

Rozpocznij izolację jednojądrzastych komórek krwi obwodowej, uzyskując dostęp do ludzkiej kożuchy i przenosząc siedem mililitrów do sterylnej stożkowej rurki o pojemności 15 mililitrów. Dodaj sześć mililitrów roztworu PBS do wstępnego mycia. Odwirować probówkę przez 10 minut przy stężeniu 1,100 G w wirówce z wirnikiem obrotowym i wyhamować w temperaturze pokojowej.

Zebrać zawiesinę leukocytów za pomocą pipety Pasteura i przenieść ją do nowej sterylnej 15-mililitrowej stożkowej probówki. Dodaj roztwór PBS do zawiesiny leukocytów, aż osiągnie 10 mililitrów i delikatnie wymieszaj, pipetując w górę iw dół. Następnie przygotuj roztwór gradientu gęstości, umieszczając trzy mililitry pożywki o gradiencie gęstości w nowej sterylnej stożkowej probówce o pojemności 15 mililitrów.

Pozwól mu osiągnąć temperaturę pokojową. Powoli dodaj pięć mililitrów rozcieńczonej zawiesiny leukocytów na stożkowe ścianki rurki zawierające pożywkę o gradiencie gęstości, aby uzyskać separację gradientu gęstości 5:3. Unikaj zakłócania medium.

Przystąpić do rozdzielania gradientowego poprzez odwirowanie zawiesiny obecnej w ośrodku o gradiencie gęstości za pomocą wirówki z wirnikiem wahadłowym i wyłączonym hamulcem. Następnie ostrożnie przenieś do 25 mililitrów cienkiej warstwy PBMC do nowej 50-mililitrowej stożkowej probówki wypełnionej PBS za pomocą pipety Pasteura i dobrze wymieszaj. W celu usunięcia resztek komórek i zanieczyszczeń należy odwirować próbki w temperaturze pokojowej przez 10 minut przy ciśnieniu 600 G z normalnym hamulcem.

Odrzucić supernatant i napełnić próbkę do 10 mililitrów za pomocą PBS. Weź podwielokrotność, aby policzyć komórki. Aby usunąć płytki krwi, odwirować je z normalnym hamulcem i ostrożnie odwrócić probówkę, aby wyrzucić supernatant.

W przypadku izolacji monocytów CD14 + za pomocą sortowania komórek aktywowanych magnetycznie, ponownie zawieś osad komórkowy w buforze mikrokulek i kulkach immunomagnetycznych CD14. Inkubować zawiesinę komórkową przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Aby usunąć niezwiązane kulki, dodaj od jednego do dwóch mililitrów buforu mikrogranulek na jeden razy 10 do siódmych komórek przed odwirowaniem zawiesiny w temperaturze pokojowej przez 10 minut w temperaturze 600 G. Następnie ostrożnie odwróć probówkę, aby wyrzucić supernatant.

Przygotuj kolumnę LS i umieść ją na magnesie przed użyciem. Przepłucz go trzema mililitrami buforu mikrogranulek i natychmiast ponownie zawieś osad komórek w 500 mikrolitrach buforu mikrogranulek na jeden raz od 10 do ósmej komórki. Dodaj zawiesinę komórek do wlotu kolumny LS i zbierz ujemną frakcję komórek w 15-mililitrowej stożkowej rurce poniżej wylotu kolumny.

Umyj kolumnę trzykrotnie trzema mililitrami buforu mikrokulkowego. Po ostatnim umyciu wyjmij kolumnę z magnesu i umieść ją na sterylnej stożkowej rurce o pojemności 15 mililitrów. Odpipetować pięć mililitrów buforu mikrogranulek do wlotu kolumny.

Natychmiast włożyć tłok strzykawki wypełniony komórkami docelowymi do wlotu kolumny i dozować komórki w kolumnie. Następnie odwirować frakcje komórek CD14 i CD14 + i odrzucić supernatant. W celu różnicowania monocytów w ludzkie komórki dendrytyczne pochodzące z monocytów należy przygotować zawiesinę komórkową zawierającą 1,3 razy 10 do szóstych komórek na mililitr, dodając odpowiednią objętość pożywki różnicującej do komórek CD14 +.

Zawiesić monocyty przez pipetowanie pipetą Pasteura. Po posianiu 1,3 razy od 10 do szóstych komórek na mililitr zawiesiny na dołek 24-dołkowej płytki, inkubować w inkubatorze hodowli w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla. Zmień pożywkę hodowlaną i uzupełniaj ją świeżymi cytokinami co dwa do trzech dni.

Aby zebrać zróżnicowane komórki, przenieść całą zawiesinę komórek do sterylnej stożkowej probówki za pomocą mikropipety i przemyć kolbę hodowlaną dwukrotnie PBS. Po odwirowaniu stożkowych probówek w temperaturze pokojowej przez 10 minut w temperaturze 180 G, ponownie zawiesić osad w odpowiednim pożywce lub buforze do zestawu doświadczalnego. Podczas różnicowania monocytów stymulacja interleukiny-4 i czynnika stymulującego tworzenie kolonii makrofagów granulocytów zmieniała fenotyp komórki.

Dane wykazały, że ludzkie komórki dendrytyczne pochodzące z monocytów utraciły marker powierzchniowy CD14, wyrażany głównie przez monocyty, i uzyskały znaczną ekspresję CD1a, markera wyrażanego przez ludzkie komórki dendrytyczne. Ludzkie komórki dendrytyczne pochodzące z monocytów uzyskują również wyższą ekspresję MHC-II, HLA-DR, cząsteczki prezentującej antygen wyrażanej przez ludzkie komórki dendrytyczne i inne komórki prezentujące antygen. Zbierz około 10 razy 10 do szóstych ludzkich komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów zróżnicowanych z monocytów z 10 dołków 24-dołkowej płytki, mając 1,3 razy 10 do szóstych komórek na studzienkę.

Przenieś je do nowej sterylnej 15-mililitrowej stożkowej probówki. Po odwirowaniu komórek o stężeniu 300 g przez pięć do siedmiu minut w temperaturze pokojowej przy użyciu normalnego hamulca, należy odrzucić supernatant w celu usunięcia martwych komórek i zanieczyszczeń. Do probówki dodać 10 mililitrów pożywki RPMI 1640 zawierającej 11,1-milimolową glukozę.

Po odwirowaniu w temperaturze pokojowej przez cztery minuty przy ciśnieniu 300 G przy użyciu normalnego hamulca, ponownie odrzucić supernatant. Dodaj dwa mililitry pożywki RPMI 1640 do osadu komórkowego i podziel jeden mililitr zawiesiny komórek na dwie nowe sterylne mikroprobówki, oznaczone jako numer jeden i numer dwa. Do pierwszej mikroprobówki dodaj 500 milijednostek sialidazy z Clostridium perfringens.

Inkubować obie probówki przez 60 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po inkubacji przenieś komórki z obu mikroprobówek do odpowiednich nowych 15-mililitrowych stożkowych probówek, oznaczonych jako numer jeden i numer dwa. Następnie dodaj około czterech mililitrów kompletnej pożywki RPMI 1640 zawierającej 10% FBS do każdej stożkowej probówki.

Wirować probówki w temperaturze pokojowej przez cztery minuty przy 300 G przy użyciu normalnego hamulca i dodać pięć mililitrów kompletnej pożywki RPMI 1640 do granulki. Płytka po jednym mililitrze komórek na studzienkę. Skuteczność leczenia sialidazą w zmniejszaniu zawartości kwasu sjalowego na powierzchni ludzkich komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów oceniano za pomocą cytometrii przepływowej i mikroskopii konfokalnej.

Leczenie sialidazą istotnie zmniejszało wiązanie lektyny Maackia amurensis i lektyny Sambucus nigra, jednocześnie zwiększając barwienie lektyny aglutyniny orzeszków ziemnych. Zmniejszenie barwienia lektyny Sambucus nigra po leczeniu sialidazą wykazało znacznie zmniejszone barwienie lektyny Sambucus nigra na powierzchni komórki. Rozpocząć pobieranie nowej próbki komórek będących przedmiotem zainteresowania do barwienia przeciwciałami, myjąc komórki w temperaturze pokojowej przez pięć minut w temperaturze 300 G z normalną hamulcem.

Rozprowadź komórki w mikroprobówkach. Aby przeprowadzić barwienie przy użyciu pożądanych przeciwciał, inkubuj przeciwciała sprzężone z fluorescencją w ciemności przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Umyj komórki jednym mililitrem PBS przed odwirowaniem przez pięć minut w 300 G w temperaturze pokojowej.

Dodaj do 100 mikrolitrów PBS do wszystkich mikroprobówek. Następnie ponownie zawieś komórki w 300 mikrolitrach 2% paraformaldehydu i przechowuj probówki w ciemności w temperaturze czterech stopni Celsjusza do cytometrii przepływowej. Zaobserwowano istotny wzrost ekspresji cząsteczek prezentujących antygen MHC-I i MHC-II oraz ekspresji cząsteczek kostymulujących CD80 i CD86 w wyniku leczenia sialidazą.