Name: Rozwój i charakterystyka funkcjonalna mysich tolerogennych komórek dendrytycznych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-18T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: Poznaj metodę rozwoju i charakteryzacji mysich tolerogennych komórek dendrytycznych w celu zastosowania w immunoterapii chorób autoimmunologicznych. Standardizowany protokół umożliwia ocenę skuteczności komórek TolDC.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy Reata Pharmaceuticals za dostarczenie CDDO-DFPA. Dziękujemy również za wsparcie ze strony Katedry Innowacji w Nowotworach Dziecięcych im. Jane i Lee Seidmanów (John Letterio). Prace te były wspierane przez Departament Obrony [W81XWH-12-1-0452]; Angie Fowler Inicjatywa Badań nad Rakiem Młodzieży i Młodych Dorosłych w Case Comprehensive Cancer Center; oraz Callahan Graduate Scholar Award dla Hsi-Ju Wei od Fundacji F.J. Callahana.

Wszystkie badania zostały przeprowadzone zgodnie z procedurami zatwierdzonymi przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Case Western Reserve University School of Medicine.
1. Przygotowanie komórek dendrytycznych pochodzących ze szpiku kostnego (BMDC)
<ol>
	<li>Wysterylizuj wszystkie narzędzia chirurgiczne za pomocą autoklawowania i przeprowadź eksperyment w komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy II z odpowiednimi procedurami bezpieczeństwa.</li>
	<li>Eutanazja myszy C57BL/6 w wieku 8 - 10 tygodni za pomocą komory CO2. Umieść mysz na desce sekcyjnej i spłucz 70% etanolem. Wyciąć kości piszczelowo-strzałkowe i udowe za pomocą nożyczek chirurgicznych i umieścić je z 70% etanolem w naczyniu hodowlanym o średnicy 10 cm.</li>
	<li>Użyj ostrzy chirurgicznych i kleszczy, aby wyciąć tkankę w jak największym stopniu na pokrywie 10-centymetrowej płytki hodowlanej i odizoluj piszczele i kości udowe, aby umieścić je z 70% etanolem w naczyniu hodowlanym o średnicy 6 cm.</li>
	<li>Użyj ostrzy chirurgicznych, aby przyciąć oba końce piszczeli i kości udowych. Użyć 3 ml PBS w strzykawce o pojemności 3 ml z igłą 23G, aby przepłukać zawartość szpiku kostnego z jednego końca kości do stożkowej probówki zawierającej 12 ml PBS. Powtórz ten krok 3 razy dla każdego końca kości.</li>
	<li>Odwirować zawiesinę komórkową o sile 300 x g przez 5 min.</li>
	<li>Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy z 1 ml buforu lizującego ACK na 5 minut w celu usunięcia czerwonych krwinek.</li>
	<li>Dodać 9 ml PBS do rozcieńczenia buforu lizującego ACK i odwirować przy 300 x g przez 5 minut.</li>
	<li>Usunąć supernatant i ponownie zawiesić z 10 ml pożywki hodowlanej (RPMI-1640 plus L-glutamina, 10% FBS, 1% aminokwas endogenny (100x), 10 mM HEPES, 50 nM β-merkaptoetanolu i 5% penicylina/streptomycyna). 
	UWAGA: Poziom endotoksyny musi być mniejszy niż 0,1 EU/ml w FBS.</li>
	<li>Przepuścić zawiesinę komórek przez sitko o wielkości 40 μm i pobrać 20 μl zawiesiny komórek, wymieszać z 80 μl błękitu trypanowego, aby policzyć liczbę żywych komórek za pomocą cytometru.</li>
	<li>Dostosuj liczbę komórek do 1 x 106 komórek/ml z 15 ng/ml GM-CSF i 10 ng/ml IL-4.</li>
	<li>Umieścić 3 ml 1 x 106 komórek/ml w każdym dołku na płytce 6-dołkowej i inkubować komórki w temperaturze 37°C, 5% CO2 i wilgotności 95% w inkubatorze CO2. 
	UWAGA: Komórki szpiku kostnego z jednej myszy mają około 3 - 5 x 107 komórek, co wskazuje, że można je umieścić od 2 do 3 płytek 6-dołkowych.</li>
	<li>W dniu 3 usuń wszystkie 3 ml pożywki hodowlanej z każdej studzienki, dodaj 2 ml świeżego PBS do każdej studzienki, a następnie delikatnie zakręć płytką, aby upewnić się, że usunięto wszystkie nieprzylegające komórki.</li>
	<li>Zastąp 3 ml świeżej pożywki hodowlanej 15 ng/ml GM-CSF i 10 ng/ml IL-4 w każdym dołku. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C, 5% CO2 i wilgotności 95% w inkubatorze CO2 .</li>
	<li>W dniu 5 należy bezpośrednio dodać kolejne 3 ml świeżej pożywki hodowlanej z 15 ng/ml GM-CSF i 10 ng/ml IL-4 do każdej studzienki. Inkubować komórki w temperaturze 37°C, 5% CO2 i wilgotności 95% w inkubatorze CO2. 
	UWAGA: Całkowita objętość w każdym dołku wynosi teraz 6 ml.</li>
	<li>W dniu 7 połóż cały talerz na lodzie na 10 minut. Delikatnie odpipetować pożywkę hodowlaną w każdym dołku, aby usunąć luźno przylegające BMDC jako iDC do zawiesiny. 
	UWAGA: Przylegające makrofagi są nadal przymocowane do płytki. Niska temperatura i delikatne procedury są kluczem do uniknięcia aktywacji prądu stałego, która wpływa na dalsze eksperymenty.</li>
	<li>Odwirować zawiesinę komórkową o sile 300 x g przez 5 minut i ponownie zawiesić ze świeżą pożywką hodowlaną do dalszych eksperymentów. 
	UWAGA: BMDC można zidentyfikować za pomocą znakowanego fluorescencyjnie przeciwciała CD11c za pomocą cytometrii przepływowej, a my pokazaliśmy naszą strategię bramkowania BMDC do dalszych eksperymentów w <silna klasa="xfig">Rysunek 1.</li>
</ol>
2. Scharakteryzuj profil genu i białka TolDC
<ol>
	<li>Płytka 2 ml 1 x 106 BMDCs/ml na basenik na płytce 6-dołkowej z pożywką w obecności lub bez 100-400 nM CDDO-DFPA do inkubacji przez 1 godzinę w temperaturze 37°C, 5% CO2 i wilgotności 95% w inkubatorze CO2. 
	UWAGA: CDDO-DFPA, syntetyczny triterpenoid, jest induktorem czynnika jądrowego (pochodzącego z erytroidu 2)-podobnego do czynnika 2 (Nrf2) i inhibitorem czynnika jądrowego κB (NF-κB). Zastosuj inne środki do indukcji TolDC z iDC, takie jak IL-10, witamina D3, deksametazon lub BAY 11-7085 i zmodyfikuj ten krok do optymalnych warunków dla każdego środka.</li>
	<li>Dodaj 10 lub 100 ng / ml LPS do inkubacji 4-24 godzin w celu indukcji mDC (czas inkubacji jest inny ze względu na pomiar mRNA lub białka).</li>
	<li>Delikatnie odpipetować pożywkę hodowlaną w każdym dołku i zebrać zawiesinę komórek za pomocą pipety o pojemności 1 ml. Wirować przy 300 x g przez 5 minut, aby zebrać odpowiednio komórki i supernatant.</li>
	<li>Analizuj ligandy powierzchniowe z osadów komórkowych za pomocą cytometrii przepływowej, takie jak ligandy stymulujące: CD40, CD80, CD86, MHC-II, OX40L, ICOSL lub ligandy hamujące: PD-L1, PD-L2, ILT3, ILT4.</li>
	<li>Wyizoluj RNA z osadów komórkowych i przeanalizuj próbki RNA i supernatantu pod kątem profilu cytokin oraz poziomów genów i białek za pomocą ilościowego PCR w czasie rzeczywistym (qRT-PCR) i ELISA, odpowiednio. 
	UWAGA: Na przykład cytokiny zapalne: TNF-α, IFNγ, EDN-1, IL-6, IL-12 i IL-23 lub cytokiny przeciwzapalne: IL-4, IL-10, IL-15, TGF-β1 i HO-1.</li>
</ol>
3. Oceń funkcję TolDC in vitro i in vivo
<ol>
	<li>Test proliferacji syngenicznej komórek T
	<ol>
		<li>Wysterylizuj wszystkie narzędzia chirurgiczne za pomocą autoklawowania i przeprowadź eksperyment w komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy II z odpowiednimi procedurami bezpieczeństwa.</li>
		<li>Przygotować bufor MACS przy użyciu 0,5% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) i 2 mM EDTA w 500 ml PBS. Wysterylizuj bufor, filtrując przez filtr 0,2 μm. 
		UWAGA: Trzymaj bufor na lodzie podczas następującego eksperymentu.</li>
		<li>Aby uzyskać limfocyty T CD4 +, należy poddać eutanazji transgeniczne myszy z receptorem komórek T OT-II (TCR) w wieku 8-10 tygodni za pomocą komoryCO2. Umieść mysz na desce sekcyjnej i spłucz 70% etanolem. Odizoluj śledzionę od lewej strony brzucha za pomocą nożyczek chirurgicznych i kleszczy.</li>
		<li>Umieścić śledzionę z 2 ml PBS w naczyniu hodowlanym o średnicy 6 cm i użyć grzbietu popychacza ze strzykawki o pojemności 3 ml do rozdrobnienia śledziony, przepuszczając sitko do komórek o wielkości 40 μm.</li>
		<li>Zebrać zawiesinę komórkową i wirować przy 300 x g przez 5 minut.</li>
		<li>Zawiesić osad komórkowy w 400 μl buforu MACS.</li>
		<li>Dodaj 100 μl koktajlu biotyny i przeciwciał biotynowych CD4+ z limfocytów T w temperaturze 4°C przez 5 minut. 
		UWAGA: Koktajl przeciwciał wiąże się z innymi typami komórek z wyjątkiem limfocytów T CD4 +, takich jak CD8a, CD11b, CD11c, CD19, CD25, CD45R (B220), CD49b (DX5), CD105, Anti-MHC klasa II, Ter-119 i TCRγ / δ.</li>
		<li>Dodać 300 μl buforu MACS i 200 μl kulek antybiotyny (tabela materiałów) w temperaturze 4°C przez 10 minut.</li>
		<li>Umieścić kolumnę złożoną z kulek ferromagnetycznych (tabela materiałów) i filtra do wstępnej separacji w polu magnetycznym i przepłukać ją 3 ml buforu MACS.</li>
		<li>Dodać 9 ml buforu MACS do komórek i odwirować przy 300 x g przez 5 minut.</li>
		<li>Zawiesić osad komórkowy w 3 ml buforu MACS i nałożyć na kolumnę. Zbierz przepływowe limfocyty T CD4 +.</li>
		<li>Przepłukać kolumnę kolejnymi 3 ml buforu MACS, a także zebrać przepływ.</li>
		<li>Aby uzyskać DC śledziony, należy poddać eutanazji myszy C57BL/6 w wieku 8-10 tygodni za pomocą komory CO2. Umieść mysz na desce sekcyjnej i spłucz 70% etanolem. Odizoluj śledzionę od lewej strony brzucha za pomocą nożyczek chirurgicznych i kleszczy. Umieść śledzionę w 6-milimetrowym naczyniu hodowlanym zawierającym 2 ml roztworu kolagenazy D (2 mg/ml kolagenazy D rozpuszczonej w HBSS zawierającej wapń, magnez).</li>
		<li>Wstrzyknąć 1 ml roztworu kolagenazy D do śledziony dwa razy za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml i igły 25G. Pokrój śledzionę na małe kawałki małymi nożyczkami.</li>
		<li>Wstrząśnij i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 25 minut.</li>
		<li>Dodaj 500 μl 0,5 M EDTA w temperaturze pokojowej przez 5 minut. 
		UWAGA: Kroki z 3.1.13-3.1.14 mają kluczowe znaczenie dla zwiększenia wydajności DC.</li>
		<li>Teraz użyj tylnej części popychacza strzykawki o pojemności 3 ml, aby zmielić zawiesinę śledziony, przepuszczając sitko do komórek o wielkości 40 μm i zebrać zawiesinę komórkową przez odwirowanie przy 300 x g przez 5 minut.</li>
		<li>Zawiesić osad komórkowy w 350 μl buforu MACS, 50 μl odczynnika blokującego FcR i 100 μl koktajlu biotyny i przeciwciał z komórek dendrytycznych Pan Dendritic w temperaturze 4°C przez 10 minut. 
		UWAGA: Koktajl przeciwciał przeciwko antygenom, które nie są eksprymowane przez DC.</li>
		<li>Przemyć komórki, dodając 9 ml buforu MACS i odwirować przy 300 x g przez 5 minut.</li>
		<li>Zawiesić osad komórkowy w 800 μl buforu MACS i dodać 200 μl kulek antybiotyny w temperaturze 4°C na 10 minut.</li>
		<li>Powtórz kroki z 3.1.9-3.1.11, aby zebrać kontrolery domeny.</li>
		<li>Przemyć kolumnę kolejnymi 3 ml buforu MACS dwa razy, a także zebrać przepływ.</li>
		<li>Traktować 2 x 105 DC/ml w obecności lub bez 100-400 nM CDDO-DFPA w temperaturze 37°C przez 1 godzinę. Oddzielnie oznaczyć limfocyty T CD4 + (1 x 107 / ml) 1 μM CFSE w temperaturze 37 ° C przez 15 minut, przemyć PBS i ponownie dostosować objętość, aby uzyskać końcowe stężenie na poziomie 2 x 106 limfocytów T / ml.</li>
		<li>Następnie, na 96-dołkowej płytce, należy wspólnie wyhodować 100 μl traktowanych komórek dendrytycznych z tą samą objętością limfocytów T CD4 + znakowanych CFSE, oba zebrane z powyższych kroków, aby uzyskać stosunek 1:10. Teraz dodaj 100 ng / ml peptydu albuminy jaja kurzego (OVA) 323-329 na dołek i zmierz intensywność CFSE limfocytów T za pomocą cytometrii przepływowej po 2-3 dniach inkubacji. 
		UWAGA: Liczba komórek i stosunek komórek DC i T zostały zoptymalizowane w stosunku do naszego poprzedniego work37.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Indukuj pasywne EAE poprzez wstrzykiwanie BMDC pulsowanych glikoproteiną oligodendrocytów mieliny (MOG) (35-55)
	<ol>
		<li>Płytka 2 ml 1 x 106 BMDC/ml na basenik na płytce 6-dołkowej z pożywką w obecności lub bez 100-400 nM CDDO-DFPA do inkubacji przez 1 godzinę.</li>
		<li>Dodać 10 ng/ml LPS do inkubacji przez 24 godziny.</li>
		<li>Dodać 100 μg/ml MOG (35-55) do inkubacji przez 4 godziny.</li>
		<li>Zebrać zawiesinę komórkową i odwirować przy 300 x g przez 5 minut.</li>
		<li>Ponownie zawiesić osad komórkowy za pomocą PBS i policzyć komórki.</li>
		<li>Podskórnie wstrzyknąć 200 μl 2 x 106 komórek 8-10 tygodniowym samicom myszy C57BL/6 (100 μl do każdej tylnej nogi).</li>
		<li>W dniu wstrzyknięcia BMDC i 48 godzin później wstrzyknij 200 ng toksyny krztuścowej (PTX) każdej myszy.</li>
		<li>Kroki 3.2.6-3.2.7 powtarzaj raz w tygodniu przez 4 kolejne tygodnie.</li>
		<li>Oceniaj objawy kliniczne EAE codziennie, korzystając ze standardowych kryteriów37 (0,5-bezwładny koniec ogona, 1-utykający ogon, 2-umiarkowane osłabienie kończyn tylnych, 3-ciężkie osłabienie kończyn tylnych, 4-całkowity paraliż kończyn tylnych, 5-porażenie czterokończynowe lub stan agonalny, 6-śmierć).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

W artykule opisano skuteczny protokół, który może być wykorzystany do powtarzalnego generowania iDC, a następnie różnicowania ich w TolDC, i proponujemy, że można go zastosować do oceny zdolności nowych molekularnych środków docelowych do indukowania fenotypu TolDC. Jak opisano w tym raporcie, postępowaliśmy zgodnie z sekwencją, w której najpierw przeanalizowaliśmy ekspresję ligandów powierzchniowych TolDC za pomocą cytometrii przepływowej, a następnie dokonaliśmy oceny profilu cytokin DC mierzonego za pomocą qRT-PCR i E...

Komórki dendrytyczne (DC) są integralną częścią wrodzonego układu odpornościowego i zostały po raz pierwszy odkryte i scharakteryzowane przez Ralpha Steinmana i Zanvila Cohna w 1973 roku jako podstawowe profesjonalne komórki prezentujące antygen1. Wykazano, że DC odgrywają ważną rolę w aktywacji immunologicznej poprzez prezentowanie przetworzonych antygenów limfocytom T i limfocytom B za pośrednictwem głównych kompleksów zgodności tkankowej (MHC) w wtórnych narządach limfatycznych w celu połączenia wrodzonego i adaptacyjnego układu odpornościowego2. W układzie odpornościowym ssaków istnieją co najmniej dwie kategorie DC, które zostały opisane jako mieloidalne DC i plazmocytoidalne DC (pDCs)3. Mieloidalne DC, znane również jako konwencjonalne DC (cDC), charakteryzują się ekspresją CD11c i mogą być różnicowane jako niedojrzałe DC (iDC) in vitro z komórek progenitorowych szpiku kostnego lub monocytów krwi obwodowej przy użyciu czynnika stymulującego tworzenie kolonii granulocytów makrofagów (GM-CSF) i IL-4 odpowiednio u gatunków mysich lub ludzkich4.
Aktywacja sygnałów 'niebezpieczeństwa', takich jak wzorce molekularne związane z patogenami (PAMP) lub wzorce molekularne związane z uszkodzeniem (DAMP), przyspieszy dojrzewanie iDC w kierunku immunogennych DC jako dojrzałych DC (mDCs) poprzez wiązanie różnych receptorów rozpoznawania wzorców na powierzchni DC5. Immunogenne DC dodatkowo inicjują proliferację i różnicowanie naiwnych limfocytów T poprzez regulację w górę MHCII2, ligandów kostymulujących (CD80, CD86 i CD40)6, cytokin i innych rozpuszczalnych mediatorów7. Kaskada produkcji mediatorów prozapalnych z immunogennych DC jest niezbędna do różnicowania limfocytów T za pośrednictwem cytokin. Na przykład zarówno IFN-γ, jak i IL-12 są niezbędne do różnicowania Th18, a IL-1, IL-6 i IL-23 są krytyczne dla naiwnej polaryzacji limfocytów T w kierunku komórek Th179. Chociaż dojrzałe DC reagują na obce antygeny, niekontrolowana aktywacja DC przez własne antygeny może powodować ablację tolerancji i sprzyjać rozwojowi chorób autoimmunologicznych poprzez generowanie autoreaktywnych limfocytów T, których aktywacja prowadzi do zniszczenia tkanek10.
Ostatnie raporty dostarczyły wyraźnych dowodów na plastyczność DC, czego przykładem jest ich zdolność do interakcji z różnymi sygnałami w mikrośrodowisku tkanek i różnicowania się na odrębne podzbiory DC efektorowe/tłumiące. Wykazano, że mediatory przeciwzapalne, takie jak IL-1011, TGF-β12 i HO-113 odgrywają ważną rolę w supresji immunologicznej poprzez indukowanie tolerogennych DC (TolDCs). Te TolDC przejmują funkcje regulacyjne i hamują proliferację limfocytów T14. Co więcej, brak kostymulacji przez DC i produkcja mediatorów przeciwzapalnych z TolDC przyczyniają się do indukcji regulatorowych limfocytów T (Treg), a także skutecznie hamują różnicowanie i ekspansję zarówno Th1, jak i Th1715. W ciągu ostatnich dwóch dekad potencjał terapeutyczny TolDC został zgłoszony przez kilku badaczy. W tych badaniach podawanie TolDC generowanych ex vivo nie tylko złagodziło objawy patologiczne w różnych przedklinicznych modelach chorób autoimmunologicznych16, ale także doprowadziło do rozwoju tolerancji immunologicznej u pacjentów17,18. Co ciekawe, obecnie terapia TolDCs została uznana za alternatywne lub wspomagające podejście do chorób autoimmunologicznych w kilku badaniach klinicznych, w tym w cukrzycy typu 119, reumatoidalne zapalenie stawów20,21, stwardnienie rozsiane (MS)22,23,24 oraz choroba Leśniowskiego-Crohna25.
Istnieje wiele protokołów, które zostały wykorzystane do opracowania TolDC, a kilka laboratoriów zgłosiło metody generowania i charakterystyki fenotypowej TolDC. Metody te mogą być wykorzystywane do powtarzalnego generowania TolDC in vitro z hematopoetycznych komórek progenitorowych i stabilnego utrzymywania ich w stanie tolerogennym in vivo26,27,28,29. iDC mogą zostać przekształcone w TolDC poprzez ekspozycję na różne immunomodulujące środki farmakologiczne lub cytokiny przeciwzapalne. Na przykład witamina D3 jest dobrze znanym środkiem farmakologicznym, o którym wiadomo, że zwiększa produkcję IL-10 i hamuje wydzielanie IL-12 z DC, a tym samym zwiększa ich funkcję immunosupresyjną30. Ponadto, gdy DC są narażone na silne bodźce zapalne, takie jak lipopolisacharydy (LPS), wykazano, że kilka środków farmakologicznych, takich jak deksametazon31, rapamycin32 i kortykosteroidy33 indukują fenotyp TolDC poprzez zmniejszenie ekspresji powierzchniowej DC CD40, CD80, CD86 i MHCII34. IL-10 i TGF-β są najczęściej badanymi cytokinami przeciwzapalnymi indukującymi tolerancję DC35, a jednoczesna ekspozycja na obie te cytokiny indukuje tolerogenny fenotyp w DCs36.
Ponieważ tolerogenne DC jest definiowane przez cechy funkcjonalne, a nie przez markery fenotypowe, istnieje wielka potrzeba opracowania spójnej metody komórkowej i funkcjonalnej charakterystyki TolDC. Co więcej, należy ustanowić rygorystyczny i spójny protokół dla spójnej oceny i charakterystyki tolerogennego fenotypu DC, jeśli mamy skutecznie i powtarzalnie porównać zdolność nowych czynników do indukowania fenotypu TolDC w laboratorium. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół z metodami krok po kroku do izolacji iDC od hematopoetycznych komórek progenitorowych myszy, a następnie do analizy skuteczności nowych czynników poddawanych ocenie pod kątem ich zdolności do przekształcania iDC w TolDC, zapewniając solidną charakterystykę funkcjonalną i fenotypową TolDC zarówno in vitro, jak i in vivo. Opis ten obejmuje rozbudowaną metodę charakteryzowania TolDC na podstawie ich ligandów powierzchniowych, profilu cytokin i funkcji immunosupresyjnych in vitro. Podajemy również przykład metody badania potencjalnego zastosowania terapeutycznego tych TolDC w przedklinicznym modelu stwardnienia rozsianego, eksperymentalnym autoimmunologicznym zapaleniu mózgu i rdzenia kręgowego (EAE). Ten ustalony protokół pomoże badaczom ocenić zdolność nowych środków do promowania indukcji TolDC i ułatwi wysiłki na rzecz poszerzenia zakresu rozwoju terapeutycznego TolDC.

<table><tbody><tr><td>CDDO-DFPA (RTA-408)</td><td>Reata Pharmaceuticals</td><td>do syntezy własnej</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>myszy GM-CSF</td><td>Peprotech Inc.</td><td>315-03</td> Mysz <td>różnicująca BMDC</td></tr><tr><td>IL-4</td><td>Peprotech Inc.</td><td>214-14</td><td>Różnicowanie BMDC</td></tr><tr><td>Lipopolisacharydy (LPS)</td><td>Sigma Aldrich Inc.</td><td>L2880</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr> <tr><td>i beta;-merkaptoetanol</td><td>Sigma Aldrich Inc.</td><td>516732</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>Toksyna krztuścowa (PTX)</td><td>R& Systemy D</td><td>3097</td><td>EAE indukcyjne</td></tr><tr><td>MOG (35&ndash; 55) peptyd</td><td>21stCentury Biochemicals</td><td>w syntezie domowej</td><td>Indukcja EAE</td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>15250-061</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>RPMI-1640 plus L-glutamina</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11875-093</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>Aminokwas endogenny (100X)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11140050</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15630080</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>penicylina/streptomycyna</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15140122</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>40 &#956; m Sitko do komórek</td><td>Corning</td><td>352340</td><td>Izolacja komórek</td></tr><tr><td>CD80 sprzężona z PE</td><td>Biosciences</td><td>557227</td><td>Cytometria przepływowa Cytometria</td></tr><tr><td>PE sprzężona z CD86</td><td>BD Biosciences</td><td>555665</td><td>Cytometria przepływowa</td></tr><tr><td>PD-L1 sprzężona z PE</td><td>BioLegend</td><td>124307</td><td>Cytometria przepływowa</td></tr><tr><td>Sprzężona z APC MHCII</td><td>Miltenyi Biotec Inc.</td><td>130-112-388</td><td>Cytometria przepływowa</td></tr><tr><td>CD11c sprzężona z APC BD</td><td>Biosciences</td><td>340544</td><td>Cytometria przepływowa</td></tr><tr><td>Dopasowany izotyp PE</td><td>Miltenyi Biotec Inc.</td><td>130-091-835</td><td>Cytometria przepływowa</td></tr><tr><td>Dopasowany izotyp APC</td><td>Miltenyi Biotec Inc.</td><td>130-091-836</td><td>Cytometria przepływowa</td></tr><tr><td>CFSE</td><td>BioLegend</td><td>423801</td><td>Test proliferacji limfocytów T</td></tr><tr><td>Zestaw do izolacji komórek dendrytycznych</td><td>Miltenyi Biotec Inc.</td><td>130-100-875</td><td>Test proliferacji limfocytów T</td></tr><tr><td>Odczynnik blokujący FcR</td><td>Miltenyi Biotec Inc.</td><td>130-100-875</td><td>Test proliferacji limfocytów</td></tr><tr><td>T Koktajl biotynowo-przeciwciałowy z komórek dendrytycznych</td><td>Miltenyi Biotec Inc.</td><td>130-100-875</td><td>Test proliferacji limfocytów T</td></tr><tr><td>Mikrogranulki antybiotyny</td><td>Miltenyi Biotec Inc.</td><td>130-100-875</td><td>Test proliferacji limfocytów T</td></tr><tr><td>CD4 + Zestaw do izolacji limfocytów</td><td>T Miltenyi Biotec Inc.</td><td>130-104-454</td><td>Test proliferacji limfocytów</td></tr><tr><td>T CD4 + Koktajl biotyny-przeciwciała z limfocytów</td><td>T Miltenyi Biotec Inc.</td><td>130-104-454</td><td>Test proliferacji limfocytów T</td></tr><tr><td>Mikrogranulki antybiotyny</td><td>Miltenyi Biotec Inc.</td><td>130-104-454</td><td>Test proliferacji limfocytów</td></tr><tr><td>T Bufor lizujący ACK</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A1049201</td><td>Różnicowanie BMDC</td></tr><tr><td>1 ml strzykawka</td><td>BD Biosciences</td><td>309626</td><td>Test proliferacji limfocytów T</td></tr><tr><td>Strzykawka 3 ml</td><td>BD Biosciences</td><td>309588</td><td>Igła różnicowania BMDC</td></tr><tr><td></td><td>Test proliferacji limfocytów T</td> <td>309626</td> BD <td>Biosciences</td></tr><tr><td>Igła 23G</td><td>BD Biosciences</td><td>309588</td><td>różnicowanie BMDC,</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma, Aldrich, Inc.</td>Test <td>proliferacji limfocytów T</td> <td>A2058</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15575020</td><td>Test proliferacji limfocytów T</td></tr><tr><td>Kolumna LS</td><td>Miltenyi Biotec Inc.</td><td>130-042-401</td><td>Test proliferacji limfocytów T</td></tr><tr><td>Filtr wstępnej separacji</td><td>Miltenyi Biotec Inc.</td><td>130-095-823</td><td>Test proliferacji limfocytów T</td></tr><tr><td>kolagenaza D</td><td>Sigma Aldrich Inc.</td><td>Test</td><td>proliferacji limfocytów T</td></tr><tr><td>11088858001 HBSS</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14025076</td><td>Test proliferacji limfocytów</td></tr><tr><td>T peptyd albuminy jaja kurzego (OVA) 323&ndash; 329</td><td>Sigma Aldrich Inc.</td><td>Test proliferacji limfocytów T</td> <td>O1641</td></tr><tr><td>Mysz IFN-&gamma; Sonda TaqMan</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Mm01168134_m1</td><td>mysz qRT-PCR</td></tr><tr><td>IL-12a Sonda TaqMan</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Mm00434165</td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>Mysz IL-12 p70 DuoSet ELISA</td><td>R& Systemy D</td><td>DY419-05</td><td>ELISA</td></tr><tr><td>Mysz EDN-1 ELISA</td><td>RayBiotech</td><td>ELM-EDN1-1</td><td>ELISA</td></tr><tr><td>TNF-&alfa; Sonda TaqMan</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Mm00443258</td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>Mysz TNF-&alpha; Zestaw Quantikine ELISA R</td><td>& D systems</td><td>MTA00B</td><td>ELISA</td></tr><tr><td>IL-6 Sonda TaqMan</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Mm00446190</td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>Mysz IL-6 Quantikine ELISA Kit</td><td>R& D systems</td><td>M6000B</td><td>ELISA</td></tr><tr><td>IL-23a Sonda TaqMan</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Mm01160011</td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>Mysz IL-23 DuoSet ELISA</td><td>R& Systemy D</td><td>DY1887-05</td><td>Sonda ELISA</td></tr><tr><td>IL-4 TaqMan</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Mm99999154_m1</td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>IL-10 Sonda TaqMan</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Mm01288386_m1</td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>TGF-&beta; Sonda TaqMan</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Mm01178820_m1</td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-hemowej oksygenazy 1</td><td>Abcam</td><td>ab13248</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-&beta-aktynowe</td><td>Abcam</td><td>ab8226</td><td>Western blotting</td></tr><tr><td>CFX96 Dotykowy system wykrywania PCR w czasie rzeczywistym</td><td>Bio-Rad Inc.</td><td></td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>BD FACSCalibur Analizator komórek</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>Cytometria przepływowa</td></tr></tbody></table>

rozwój i charakterystyka funkcjonalna mysich tolerogennych komórek dendrytycznych

Development and Functional Characterization of Murine Tolerogenic Dendritic Cells

Układ odpornościowy działa poprzez utrzymywanie ścisłej równowagi między koordynacją odpowiedzi przeciwko obcym antygenom a utrzymywaniem stanu braku reakcji na własne antygeny, jak również antygeny pochodzące z organizmów komensalnych. Zakłócenie tej homeostazy immunologicznej może prowadzić do przewlekłego stanu zapalnego i rozwoju autoimmunizacji. Komórki dendrytyczne (DC) to profesjonalne komórki wrodzonego układu odpornościowego prezentujące antygen, zaangażowane w aktywację naiwnych limfocytów T w celu zainicjowania odpowiedzi immunologicznej przeciwko obcym antygenom. Jednak DC można również różnicować w TolDC, które działają w celu utrzymania i promowania tolerancji limfocytów T oraz tłumienia komórek efektorowych, przyczyniając się do rozwoju autoimmunologicznych lub przewlekłych stanów zapalnych. Niedawny postęp w naszym zrozumieniu TolDC sugeruje, że tolerancję DC można osiągnąć poprzez modulację warunków ich różnicowania. Zjawisko to doprowadziło do ogromnego wzrostu w rozwoju terapii TolDC dla wielu zaburzeń immunologicznych spowodowanych przerwaniem tolerancji immunologicznej. Udane badania na przedklinicznych mysich modelach autoimmunologicznych dodatkowo potwierdziły immunoterapeutyczną przydatność TolDC w leczeniu chorób autoimmunologicznych. Obecnie TolDC stały się obiecującym narzędziem immunoterapeutycznym w praktyce klinicznej do przywracania tolerancji immunologicznej w różnych zaburzeniach immunologicznych poprzez celowanie w patogenne odpowiedzi autoimmunologiczne przy jednoczesnym pozostawieniu nienaruszonej odporności ochronnej. Chociaż wiele laboratoriów zaproponowało szereg strategii indukcji TolDC, nie ma spójności w charakteryzowaniu komórkowego i funkcjonalnego fenotypu tych komórek. Protokół ten zawiera przewodnik krok po kroku dotyczący rozwoju DC pochodzących ze szpiku kostnego w dużych ilościach, unikalnej metody stosowanej do różnicowania ich w TolDC za pomocą syntetycznego triterpenoidu 2-cyjano-3,12-dioksooleana-1,9-dien-28-oes-difluoro-propyloamidu (CDDO-DFPA) oraz technik stosowanych do potwierdzania ich fenotypu, w tym analizy podstawowych sygnatur molekularnych TolDC. Na koniec pokazujemy metodę oceny funkcji TolDC poprzez testowanie ich odpowiedzi immunosupresyjnej in vitro i in vivo w przedklinicznym modelu stwardnienia rozsianego.

Różnicowanie i selekcja BMDC:
Komórki progenitorowe szpiku kostnego hodowano w pełnym medium RPMI w obecności GM-CSF i IL-4 w celu różnicowania w iDC przez 7 dni (Rysunek 1A). W 1. dniu komórki były małe i wykazywały sferyczną morfologię. Przemycie PBS przed wymianą świeżego medium w 3. dniu pomogło komórkom tworzyć skupiska i zwiększyło populację komórek CD1c+. W 4. dniu...

Tutaj prezentujemy protokół rozwoju i charakterystyki tolerogennych komórek dendrytycznych (TolDCs) oraz oceny ich immunoterapeutycznej użyteczności.

Rozwój i charakterystyka funkcjonalna mysich tolerogennych komórek dendrytycznych

The immune system operates by maintaining a tight balance between coordinating responses against foreign antigens and maintaining an unresponsive state ...

Ogólnym celem tego protokołu jest opracowanie i scharakteryzowanie mysich tolerogennych komórek dendrytycznych w celu oceny ich użyteczności immunoterapeutycznej w leczeniu chorób autoimmunologicznych, takich jak stwardnienie rozsiane. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie terapii tolerogennych komórek dendrytycznych, zapewniając znormalizowaną metodę rozwoju i funkcjonalnej charakterystyki tolerogennych komórek dendrytycznych. Głównymi zaletami tej techniki jest to, że można ją wykorzystać do skutecznego rozwoju tolerogennych komórek dendrytycznych oraz do funkcjonalnego testowania skuteczności tolerogennych komórek dendrytycznych.Implikacje tej techniki są znaczące. Rozszerzają się one w kierunku rozwoju immunoterapii komórkowej w chorobach autoimmunologicznych, ponieważ tolerogenne komórki dendrytyczne mogą zresetować nieprawidłową odpowiedź immunologiczną, pozostając jednocześnie przedmiotem wewnętrznych mechanizmów regulacji immunologicznej. Po pobraniu kości tylnych nóg od ośmio- do 10-tygodniowych myszy C57BL/6, zgodnie ze standardowymi protokołami, użyj ostrzy chirurgicznych i kleszczy, aby wypreparować jak najwięcej tkanki i umieść czyste piszc

development-functional-characterization-murine-tolerogenic-dendritic

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

W niniejszym filmie przedstawiono procedurę różnicowania myeloidnych komórek dendrytycznych z szpiku kostnego myszy. Zaprezentowano izolację kości piszczelowej i udowej myszy oraz przetwarzanie szpiku kostnego. Pokazano zdjęcia obrazujące morfologię komórek przed i po różnicowaniu, a także schematy przedstawiające fenotyp komórek oraz produkcję IL-12 po dojrzewaniu z użyciem CpG.

Hodowla mieloidalnych komórek dendrytycznych z prekursorów szpiku kostnego

Prezentacja antygenu w wtórnych narządach limfatycznych przez komórki dendrytyczne jest kluczowa dla inicjacji adaptacyjnej odpowiedzi immunologicznej pośredniczonej przez limfocyty T. W niniejszej pracy demonstrujemy hodowlę mysich komórek dendrytycznych pochodzących z szpiku kostnego, ich aktywację oraz znakowanie do obrazowania dwufotonowego.

Generowanie mysich komórek dendrytycznych pochodzących z szpiku kostnego do zastosowań w obrazowaniu dwufotonowym

Ten film pokazuje wytwarzanie niedojrzałych, dojrzałych i tolerogennych komórek dendrytycznych (DC) z ludzkich monocytów. Inkubacja monocytów z czynnikami wzrostu i cytokinami prowadzi do produkcji niedojrzałych DC. W odpowiedzi na cząsteczki regulatora immunologicznego niedojrzałe DC różnicują się w tolerogenne i dojrzałe DC.

Wytwarzanie niedojrzałych, dojrzałych i tolerogennych komórek dendrytycznych z monocytów

Ten film demonstruje metodę przekształcania komórek dendrytycznych (DC) w tolerogenne DC (TolDCs) za pomocą immunomodulującego środka farmakologicznego. Konwersja ta jest potwierdzana przez ocenę funkcji TolDC poprzez ich immunosupresyjne działanie na limfocyty T CD4 +.

Wpływ immunomodulującego środka farmakologicznego na interakcję między komórkami dendrytycznymi a limfocytami T CD4+

Ten protokół opisuje eksperymentalne procedury oceny różnicowania plazmocytoidalnych komórek dendrytycznych w plastrze Peyera od typowych komórek progenitorowych komórek dendrytycznych, przy użyciu technik obejmujących izolację komórek za pośrednictwem FACS, hydrodynamiczny transfer genów i analizę przepływu podzbiorów immunologicznych w plastrze Peyera.

Ocena rozwoju mysich plazmocytoidalnych komórek dendrytycznych w łatach Peyera z wykorzystaniem adoptywnego transferu przodków hematopoetycznych

W tym badaniu prezentujemy system hodowli in vitro, który może efektywnie generować pDC poprzez kokulturę pospolitych komórek progenitorowych limfoidalnych z komórkami zasilającymi AC-6 w obecności ligandu Flt3.

In vitro Generowanie mysich plazmocytoidalnych komórek dendrytycznych ze wspólnych progenitorów limfoidalnych przy użyciu systemu AC-6 Feeder

Odrębne podzbiory komórek dendrytycznych istnieją jako rzadkie populacje w narządach limfoidalnych, dlatego są trudne do wyizolowania w wystarczającej liczbie i czystości do eksperymentów immunologicznych. W tym miejscu opisujemy metodę o wysokiej skuteczności i wysokiej wydajności do izolacji wszystkich obecnie znanych głównych podzbiorów komórek dendrytycznych śledziony myszy.

Wydajna i wysokowydajna metoda izolacji podzbiorów komórek dendrytycznych myszy

Niedojrzałe komórki dendrytyczne mogą być selektywnie różnicowane w tolerogenne lub dojrzałe komórki dendrytyczne, aby regulować równowagę między odpornością a tolerancją. W pracy przedstawiono sposób generowania z niedojrzałych komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów (moDC), tolerogennych in vitro i dojrzałych moDC, które różnią się fenotypami metabolicznymi.

Wytwarzanie niedojrzałych, dojrzałych i tolerogennych komórek dendrytycznych o różnych fenotypach metabolicznych

Tutaj udostępniamy protokół do badania potencjalnych czynników transkrypcyjnych zaangażowanych w rozwój komórek dendrytycznych (DC) za pomocą lentiwirusowej transdukcji shRNA w celu uzyskania stabilnych linii komórkowych knockdown do różnicowania DC in vitro.

Badanie rozwoju komórek dendrytycznych przez knockdown genów za pośrednictwem krótkiej spinki do włosów za pośrednictwem RNA w linii komórek hematopoetycznych i progenitorowych in vitro

Tutaj prezentujemy ekonomiczną i efektywną metodę izolowania i generowania komórek dendrytycznych pochodzących ze szpiku kostnego o wysokiej czystości od myszy po 7 dniach hodowli z 10 ng/mL GM-CSF/IL-4.

Ekonomiczny i wydajny protokół izolacji i hodowli komórek dendrytycznych pochodzących ze szpiku kostnego od myszy

Opisujemy procedurę oceny zdolności środków farmakologicznych do generowania tolerogennych komórek dendrytycznych z naiwnych komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów in vitro i walidacji ich siły poprzez autologiczne generowanie regulatorowych limfocytów T.

Prosta i skuteczna metoda testowania środków immunomodulujących do wytwarzania tolerogennych komórek dendrytycznych z ludzkich monocytów CD14+

Poznaj metodę rozwoju i charakteryzacji mysich tolerogennych komórek dendrytycznych w celu zastosowania w immunoterapii chorób autoimmunologicznych. Standardizowany protokół umożliwia ocenę skuteczności komórek TolDC.

Rozwój i charakterystyka funkcjonalna mysich tolerogennych komórek dendrytycznych

Przeglądaj więcej filmów