Rozwój i charakterystyka funkcjonalna mysich tolerogennych komórek dendrytycznych

Ogólnym celem tego protokołu jest opracowanie i scharakteryzowanie mysich tolerogennych komórek dendrytycznych w celu oceny ich użyteczności immunoterapeutycznej w leczeniu chorób autoimmunologicznych, takich jak stwardnienie rozsiane. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie terapii tolerogennych komórek dendrytycznych, zapewniając znormalizowaną metodę rozwoju i funkcjonalnej charakterystyki tolerogennych komórek dendrytycznych. Głównymi zaletami tej techniki jest to, że można ją wykorzystać do skutecznego rozwoju tolerogennych komórek dendrytycznych oraz do funkcjonalnego testowania skuteczności tolerogennych komórek dendrytycznych.

Implikacje tej techniki są znaczące. Rozszerzają się one w kierunku rozwoju immunoterapii komórkowej w chorobach autoimmunologicznych, ponieważ tolerogenne komórki dendrytyczne mogą zresetować nieprawidłową odpowiedź immunologiczną, pozostając jednocześnie przedmiotem wewnętrznych mechanizmów regulacji immunologicznej. Po pobraniu kości tylnych nóg od ośmio- do 10-tygodniowych myszy C57BL/6, zgodnie ze standardowymi protokołami, użyj ostrzy chirurgicznych i kleszczy, aby wypreparować jak najwięcej tkanki i umieść czyste piszczele i kości udowe w sześciocentymetrowym naczyniu hodowlanym zawierającym 70% etanolu.

Przytnij oba końce kości ostrzem chirurgicznym i użyj trzymililitrowej strzykawki, wyposażonej w igłę o rozmiarze 23, aby przepłukać szpik z pierwszej kości trzema mililitrami PBS do stożkowej rurki o pojemności 15 mililitrów. Po zebraniu całego szpiku należy odwirować zawiesinę komórek i ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze buforu do lizy czerwonych krwinek. Po pięciu minutach przerwij lizę dziewięcioma mililitrami PBS i zbierz komórki przez odwirowanie.

Zawiesić osad białych komórek szpiku kostnego w 10 mililitrach pożywki hodowlanej i przefiltrować komórki przez sitko do komórek o średnicy 40 mikrometrów do nowej probówki. Dostosuj komórki do stężenia od jednego do 10 do szóstego komórek na mililitr w pożywce hodowlanej uzupełnionej GM-CSF i IL-4. I umieść trzy mililitry komórek w każdym dołku 6-dołkowej płytki na trzydniową inkubację w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.

Trzeciego dnia umyj komórki w każdej studzience dwoma mililitrami PBS i delikatnie mieszaj, aby usunąć nieprzylegające komórki. Następnie nakarm komórki trzema mililitrami świeżej pożywki hodowlanej uzupełnionej GM-CSF i IL-4 i wróć komórki do inkubatora do hodowli komórkowych, dodając trzy kolejne mililitry świeżej pożywki hodowlanej, uzupełnionej cytokinami do każdego dołka po dwóch dniach. W siódmym dniu hodowli połóż talerz na lodzie.

Po 10 minutach delikatnie odpipetować pożywkę hodowlaną w każdym dołku, aby usunąć luźno przylegające, niedojrzałe komórki dendrytyczne pochodzące ze szpiku kostnego do zawiesiny. Następnie połączyć komórki do zebrania przez odwirowanie i ponownie zawiesić osad w odpowiedniej objętości świeżej pożywki hodowlanej do dalszej analizy. Aby zmierzyć proliferację syngenicznych limfocytów T, najpierw użyj tylnego końca tłoka strzykawki o pojemności trzech mililitrów, aby zetrzeć śledzionę z ośmio- do 10-tygodniowej myszy OT2 C57BL/6 przez sitko o wielkości 40 mikrometrów i przepłukać sitko PBS.

Zawiesinę komórek z pulą zawiesić przez odwirowanie i ponownie zawiesić osad w 400 mikrolitrach bufora do sortowania komórek magnetycznych i 100 mikrolitrach koktajlu biotyny i przeciwciał CD4 dodatnich limfocytów T w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pięć minut. Pod koniec inkubacji dodaj 300 mikrolitrów buforu sortującego i 200 mikrolitrów kulek antybiotyny do komórek na 10 minut inkubacji w czterech stopniach Celsjusza i umieść kolumnę z kulkami magnetycznymi i filtr wstępnej separacji w magnesie do separacji komórek o odpowiedniej wielkości. Przepłukać kolumnę trzema mililitrami buforu sortującego i dodać dziewięć mililitrów buforu sortującego do komórek.

Po odwirowaniu ponownie zawieś komórkę i osad perełkowy w trzech mililitrach buforu sortującego i dodaj zawiesinę komórek do kolumny, aby zebrać eluat komórek T CD4 dodatnich w odpowiednim pojemniku. Następnie umyj kolumnę kolejnymi trzema mililitrami buforu sortującego, zbierając przepływ i umieść limfocyty T na lodzie. W celu izolacji komórek dendrytycznych syngenicznej śledziony należy umieścić śledzionę od ośmio- do dziesięciotygodniowej myszy C57BL/6 w sześciocentymetrowym naczyniu hodowlanym i użyć jednomililitrowej strzykawki, wyposażonej w igłę o rozmiarze 25, aby dwukrotnie wstrzyknąć jeden mililitr roztworu kolagenazy D do śledziony.

Następnie za pomocą nożyczek pokrój śledzionę na małe kawałki i inkubuj kawałki, potrząsając w temperaturze pokojowej przez 25 minut. Pod koniec inkubacji dodać 500 mikrolitrów 0,5-molowego EDTA do zawiesiny tkankowej na ostatnie pięć minut inkubacji w temperaturze pokojowej. Pod koniec inkubacji użyj tylnego końca tłoka strzykawki o pojemności trzech mililitrów, aby rozgnieść zawiesinę śledziony przez sitko do komórek o średnicy 40 mikrometrów i zebrać komórki przez odwirowanie.

Zawiesić osad w 350 mikrolitrach magnetycznego buforu do sortowania komórek, 50 mikrolitrach odczynnika blokującego receptor Fc i 100 mikrolitrach koktajlu biotyny i przeciwciał z komórek dendrytycznych na 10-minutową inkubację w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Pod koniec inkubacji umyć komórki w dziewięciu mililitrach buforu sortującego i ponownie zawiesić osad w 800 mikrolitrach świeżego buforu sortującego z 200 mikrolitrami kulek antybiotyny w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut w celu odizolowania populacji komórek dendrytycznych śledziony przez sortowanie magnetyczne, jak właśnie pokazano. Ponownie zawiesić komórki w stężeniu dwa razy 10 do piątego komórek dendrytycznych na mililitr i traktować je odpowiednim eksperymentalnym stężeniem interesującego triterpenoidu przez jedną godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Podczas ostatniej trzeciej części inkubacji ponownie zawieś limfocyty T w stężeniu od jednego razy 10 do siódmego na mililitr w jednym mikromolowym CFSE przez 15 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie umyj komórki PBS i ponownie dostosuj objętość do końcowego stężenia dwa razy 10 do szóstych limfocytów T na mililitr. Współhodowla 100 mikrolitrów traktowanych komórek dendrytycznych ze 100 mikrolitrami komórek T CD4 dodatnich znakowanych CFSE w każdym dołku 96-dołkowej płytki i dodanie 100 nanogramów na mililitr peptydu OVA 323-329 do komórek, mierząc intensywność CFSE limfocytów T za pomocą cytometrii przepływowej po dwóch do trzech dniach inkubacji.

Komórki progenitorowe szpiku kostnego hodowane w kompletnej pożywce, w obecności GM-CSF i IL-4, wykazują niedojrzałą morfologię komórek dendrytycznych po sześciu dniach hodowli. Analiza niedojrzałych komórek dendrytycznych pochodzących ze szpiku kostnego siódmego dnia ujawnia silną ekspresję CD11c, specyficznego mysiego markera komórek dendrytycznych, przez większość hodowanych komórek. Pomimo braku wpływu na ekspresję markerów dojrzewania indukowanych przez LPS, komórki dendrytyczne pochodzące ze szpiku kostnego wykazują tolerogenny profil komórek dendrytycznych w odpowiedzi na leczenie CDDO-DFPA, o czym świadczy znaczne zmniejszenie ekspresji genów prozapalnych i zwiększona ekspresja genów cytokin przeciwzapalnych, nawet po stymulacji LPS.

Ponadto obserwuje się znaczne zmniejszenie proliferacji limfocytów T specyficznych dla syngenicznej OVA w kokulturach in vitro, w których komórki dendrytyczne traktowane CDDO-DFPA prezentują OVA oraz in vivo, o czym świadczy opóźniona progresja do eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia po wstrzyknięciu komórek dendrytycznych traktowanych MOG-DFPA, co dodatkowo potwierdza tolerogenny fenotyp tych komórek. Po opanowaniu tej techniki, tolerogenne komórki dendrytyczne mogą zostać opracowane w ciągu ośmiu dni, jeśli eksperymenty zostaną przeprowadzone prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że tolerogenne komórki dendrytyczne nie są jednorodne.

Ich fenotyp komórkowy zależy od charakteru środków stosowanych do indukcji ich tolerancji. Po tej procedurze można przeprowadzić inne metody, takie jak szczegółowa analiza cytometrii przepływowej, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące tolerogennej energii lub apoptozy komórek T indukowanej przez komórki dendrytyczne swoiste antygenowo lub zdolności różnicowania limfocytów T. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak rozwijać funkcjonalnie aktywne tolerogenne komórki dendrytyczne przy użyciu znanych środków lub jak testować zdolność nowych substancji do indukowania tych komórek.