Badanie histologiczne morfologii mitochondriów w modelu choroby Parkinsona
23 czerwca 2023
To badanie przedstawia metodę analizy morfologii mitochondriów na podstawie barwienia immunologicznego i analizy obrazu w tkance mózgowej myszy in situ. Opisano również, w jaki sposób pozwala to na wykrycie zmian w morfologii mitochondriów wywołanych przez agregację białek w modelach choroby Parkinsona.
Nasze laboratorium bada mechanizm komórkowy związany z agregacją białek w kontekście choroby Parkinsona. Ponadto wykorzystujemy modele komórkowe i zwierzęce do testowania potencjalnych metod leczenia choroby Parkinsona. W artykule zaproponowano protokół badania morfologii mitochondriów in situ jako wskaźnika ich zdrowia w oparciu o barwienie immunologiczne i analizę obrazu w skrawkach tkanek zatopionych w parafinie.
Morfologia mitochondriów została szeroko przebadana w chorobie Parkinsona i innych chorobach in vitro. Niemniej jednak nadal brakuje protokołów do badania morfologii mitochondriów in vivo. Protokół ten zapewnia solidną metodę barwienia mitochondriów w tkance mózgowej i szczegółowo wyjaśnia, jak przeprowadzić analizę morfologiczną.
Badanie to pokazuje, że barwienie immunologiczne w połączeniu z analizą obrazu jest wiarygodną metodą zrozumienia morfologii mitochondriów. W rzeczywistości pozwala to na ilościowe określenie liczby mitochondriów, a także innych parametrów morfologicznych, takich jak proporcje zarówno w hodowli komórkowej, jak i tkance. Co ważne, ponieważ metoda ta opiera się na immunofluorescencji, możliwe jest odniesienie morfologii z powrotem do określonych populacji komórkowych.
W tym miejscu przedstawiamy protokół badania morfologii mitochondriów w chorobie Parkinsona, ale protokół ten można zastosować do dowolnego modelu choroby in vivo. Ponadto może pomóc w badaniach przesiewowych związków ołowiu w leczeniu nie tylko choroby Parkinsona, ale także każdej innej choroby charakteryzującej się rozregulowaniem mitochondriów. Na początek weźmy parafinowe skrawki mózgu sześciu czarnych myszy C57, którym wstrzyknięto PFF.
Odwoskuj szkiełka, zanurzając je w substytucie ksylenu i inkubując przez dwie minuty. W celu nawodnienia zanurz szkiełka w 100%95% i 70% etanolu, a następnie dwa razy w wodzie dejonizowanej. Przenieść próbki do pojemnika nadającego się do kuchenki mikrofalowej wraz z wodą podwójnie destylowaną.
Ogrzej 100-krotny bufor cytrynianu o pH sześć w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie przygotuj 350 mililitrów świeżego buforu cytrynianu. Wlej przygotowany bufor cytrynianu do plastikowego pojemnika z pokrywką.
Umieść szkiełka w pojemniku buforowym z cytrynianem i zabezpiecz pokrywę. Podgrzewaj próbki w kuchence mikrofalowej o mocy 700 watów przez cztery minuty, a następnie odczekaj pięć minut na odpoczynek. Podgrzewaj w kuchence mikrofalowej przez kolejne 1,5 minuty, a następnie pięciominutowy okres odpoczynku i uzupełnij bufor cytrynianu.
Kuchenka mikrofalowa przez 1,5 minuty i odstaw na pięć minut. Następnie schłodzić próbki i bufor cytrynianu na lodzie przez 20 minut i przemyć je wodą podwójnie destylowaną. Osusz szkiełka podstawowe za pomocą ręcznika papierowego, nie dotykając chusteczki.
Za pomocą pisaka narysuj prostokąty wokół kawałków tkanki. Teraz przenieś wszystkie szkiełka do pudełka do barwienia immunologicznego szkiełka. Delikatnie umyj je wiele razy za pomocą TBS-T, upewniając się, że krople TBS-T pozostają w prostokątach wstrzykiwacza.
Stuknij slajdy w ręcznik papierowy, aby usunąć TBS-T. Dodaj 50 mikrolitrów bloku do każdego prostokąta i inkubuj przez godzinę w temperaturze pokojowej. Pod koniec inkubacji, za pomocą ręcznika papierowego, usunąć roztwór blokujący z próbek.
Delikatnie odpipetować 50 mikrolitrów mieszaniny przeciwciał pierwszorzędowych w TBS-T do każdego prostokąta i inkubować próbki przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie umyj szkiełka za pomocą TBS-T. Wyjmij TBS-T, stukając w ręcznik papierowy.
Powtórz ten proces trzy razy. Następnie dodaj 50 mikrolitrów mieszaniny przeciwciał wtórnych w rozcieńczeniu od jednego do 1000 w TBS-T do każdego prostokąta i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę w ciemności. Następnie umyj próbkę trzykrotnie TBS-T.
Następnie inkubować próbkę z DAPI w stężeniu dwóch mikrogramów na mililitr i TBS-T przez jedną minutę. Usuń roztwór DAPI, stukając w ręcznik papierowy i umyj trzy razy TBS-T. Aby zamontować szklane szkiełko nakrywkowe, dodaj dwie krople odczynnika montażowego na szkiełko do próbek.
Delikatnie dociśnij szkiełko nakrywkowe, aby usunąć pęcherzyki powietrza, i pozostaw próbki do wyschnięcia na godzinę w temperaturze pokojowej. Zobrazuj co najmniej 50 komórek w różnych polach za pomocą systemu obrazowania fluorescencyjnego z oświetleniem strukturalnym, wyposażonego w 60-krotny obiektyw olejowy lub technologię konfokalną. Aby przeanalizować komórki, wyizoluj obszar zainteresowania, rysując kontur wokół komórki dodatniej lub ujemnej i używając funkcji przycinania.
Następnie aktywuj deskryptory kształtów i ogranicz do opcji progowych w ustawionej funkcji pomiaru. Dostosuj poziom progu, wybierając funkcję progu w menu regulacji. Na koniec użyj narzędzia do analizy cząstek i ustaw odpowiedni rozmiar, aby uchwycić mitochondria.
Na przykład ustaw rozmiar na 25 nieskończoności, a następnie aktywuj jednostki pikseli i wybierz pokaż maski. Pokazano substantia nigra pars compacta myszy z wstrzykniętą PFF, które są barwione immunologicznie na obecność hydroksylazy tyrozyny, VDAC1, alfa-synukleiny PS129 i DAPI. Barwienie alfa-synukleiną anty PS129 pozwoliło odróżnić komórki, które zawierały zmiany PS129 od zdrowych komórek.
Analiza obrazu barwienia VDAC1 neuronów dodatnich z hydroksylazą tyrozynową ujawniła zmniejszenie zarówno liczby mitochondriów, jak i proporcji między neuronami noszącymi uszkodzenia PS129 a neuronami bez nich.
Przegląd
To badanie przedstawia protokół do analizy morfologii mitochondriów in situ za pomocą immunobarwienia i analizy obrazów na tkankach mózgu myszy. Skupia się na wykrywaniu zmian morfologicznych wywołanych agregacją białek w modelach choroby Parkinsona.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Badania nad chorobą Parkinsona
Tło
- Morfologia mitochondriów jest krytyczna dla zrozumienia zdrowia komórkowego.
- Agregacja białek jest kluczową cechą w patologii choroby Parkinsona.
- Istniejące protokoły badań mitochondrialnych in vivo są niewystarczające.
- Immunobarwienie może powiązać zdrowie mitochondriów ze specyficznymi populacjami komórek.
Cel badania
- Dostarczyć niezawodnej metody oceny morfologii mitochondriów.
- Umożliwić ilościową ocenę parametrów mitochondrialnych w tkance mózgowej.
- Zbadać wpływ agregacji białek na mitochondria w modelu chorobowym.
Zastosowanie metod
- Wykorzystanie barwienia immunofluorescencyjnego na parafinowych sekcjach tkankowych.
- Skupienie się na parafinowych sekcjach mózgu od myszy C57 black six poddanych iniekcji PFF.
- Badanie obejmuje szczegółowe kroki przygotowania, barwienia i analizy obrazów próbek.
- Analiza obrazów została przeprowadzona w celu ilościowej oceny morfologii mitochondriów.
Główne wyniki
- Obserwowano zmniejszenie liczby mitochondriów i zmianę morfologii w neuronach z występowaniem zmian PS129 w porównaniu z zdrowymi neuronami.
- Metoda pomyślnie rozróżniła zdrową i dotkniętą populację neuronów.
- Ilościowa ocena parametrów morfologicznych wykazała znaczące różnice związane ze stanem chorobowym.
Wnioski
- To badanie ustanawia solidny protokół analizy mitochondrialnej w modelach chorobowych, co może ułatwić przesiewowe badania kandydatów do leczenia.
- Metoda dostarcza informacji na temat zdrowia mitochondrialnego związanego z chorobą Parkinsona.
- Wyniki mogą zwiększyć zrozumienie mechanizmów komórkowych zaangażowanych w neurodegenerację.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Quantitative assessment of mitochondrial morphology in situ enables early detection of neurodegenerative pathology and supports mechanistic de-risking in CNS drug discovery. This protocol provides a robust workflow for linking mitochondrial health to disease-relevant neuronal populations, informing target validation and lead prioritization in Parkinson's disease models. Integrating high-content morphological analysis strengthens predictive confidence at the discovery and preclinical interface.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of mitochondrial dysfunction as a mechanistic driver in neurodegeneration.
- Supports functional target validation by quantifying morphological changes in disease-relevant neurons.
- Facilitates biological de-risking by distinguishing affected from healthy cell populations.
- Provides quantitative endpoints for hypothesis-driven portfolio triage.
Screening & Assay Development
- Prepares validated tissue-based systems for downstream compound screening.
- Delivers reproducible, quantitative morphological outputs for assay standardization.
- Enables high-content screening readiness for evaluating lead compounds affecting mitochondrial health.
- Supports platform reuse across neurodegenerative disease models with mitochondrial involvement.
Translational & Preclinical Research
- Aligns morphological readouts with disease-relevant biomarkers in preclinical models.
- Ensures continuity from discovery-stage findings to in vivo validation of therapeutic hypotheses.
- Informs risk-adjusted advancement decisions by linking cellular pathology to functional outcomes.
- Provides predictive de-risking for translational biomarker strategies in CNS portfolios.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum, bridging early mechanistic studies with in vivo validation in Parkinson's disease models.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on mitochondrial dysfunction and its role in neurodegeneration.
- Screening: Provides quantitative, reproducible morphological metrics for compound evaluation.
- Analytics: Enables statistical comparison of mitochondrial parameters across experimental conditions.
- Translational Research: Connects cellular pathology to disease-relevant endpoints in animal models.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized, scalable workflow adaptable to other models of mitochondrial dysregulation.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in neurodegenerative target validation.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable tissue-based morphological analysis.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by providing robust quantitative endpoints.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of CNS therapeutic candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in immunostaining, fluorescence imaging, and image analysis.
- Needs access to structured illumination or confocal microscopy platforms.
- Demands cross-team standardization of antibody selection and image quantification parameters.
- Adaptable to various in vivo disease models with mitochondrial involvement.
- Potential limitations include antibody specificity and tissue heterogeneity affecting measurement accuracy.
