Badanie histologiczne morfologii mitochondriów w modelu choroby Parkinsona

Nasze laboratorium bada mechanizm komórkowy związany z agregacją białek w kontekście choroby Parkinsona. Ponadto wykorzystujemy modele komórkowe i zwierzęce do testowania potencjalnych metod leczenia choroby Parkinsona. W artykule zaproponowano protokół badania morfologii mitochondriów in situ jako wskaźnika ich zdrowia w oparciu o barwienie immunologiczne i analizę obrazu w skrawkach tkanek zatopionych w parafinie.

Morfologia mitochondriów została szeroko przebadana w chorobie Parkinsona i innych chorobach in vitro. Niemniej jednak nadal brakuje protokołów do badania morfologii mitochondriów in vivo. Protokół ten zapewnia solidną metodę barwienia mitochondriów w tkance mózgowej i szczegółowo wyjaśnia, jak przeprowadzić analizę morfologiczną.

Badanie to pokazuje, że barwienie immunologiczne w połączeniu z analizą obrazu jest wiarygodną metodą zrozumienia morfologii mitochondriów. W rzeczywistości pozwala to na ilościowe określenie liczby mitochondriów, a także innych parametrów morfologicznych, takich jak proporcje zarówno w hodowli komórkowej, jak i tkance. Co ważne, ponieważ metoda ta opiera się na immunofluorescencji, możliwe jest odniesienie morfologii z powrotem do określonych populacji komórkowych.

W tym miejscu przedstawiamy protokół badania morfologii mitochondriów w chorobie Parkinsona, ale protokół ten można zastosować do dowolnego modelu choroby in vivo. Ponadto może pomóc w badaniach przesiewowych związków ołowiu w leczeniu nie tylko choroby Parkinsona, ale także każdej innej choroby charakteryzującej się rozregulowaniem mitochondriów. Na początek weźmy parafinowe skrawki mózgu sześciu czarnych myszy C57, którym wstrzyknięto PFF.

Odwoskuj szkiełka, zanurzając je w substytucie ksylenu i inkubując przez dwie minuty. W celu nawodnienia zanurz szkiełka w 100%95% i 70% etanolu, a następnie dwa razy w wodzie dejonizowanej. Przenieść próbki do pojemnika nadającego się do kuchenki mikrofalowej wraz z wodą podwójnie destylowaną.

Ogrzej 100-krotny bufor cytrynianu o pH sześć w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie przygotuj 350 mililitrów świeżego buforu cytrynianu. Wlej przygotowany bufor cytrynianu do plastikowego pojemnika z pokrywką.

Umieść szkiełka w pojemniku buforowym z cytrynianem i zabezpiecz pokrywę. Podgrzewaj próbki w kuchence mikrofalowej o mocy 700 watów przez cztery minuty, a następnie odczekaj pięć minut na odpoczynek. Podgrzewaj w kuchence mikrofalowej przez kolejne 1,5 minuty, a następnie pięciominutowy okres odpoczynku i uzupełnij bufor cytrynianu.

Kuchenka mikrofalowa przez 1,5 minuty i odstaw na pięć minut. Następnie schłodzić próbki i bufor cytrynianu na lodzie przez 20 minut i przemyć je wodą podwójnie destylowaną. Osusz szkiełka podstawowe za pomocą ręcznika papierowego, nie dotykając chusteczki.

Za pomocą pisaka narysuj prostokąty wokół kawałków tkanki. Teraz przenieś wszystkie szkiełka do pudełka do barwienia immunologicznego szkiełka. Delikatnie umyj je wiele razy za pomocą TBS-T, upewniając się, że krople TBS-T pozostają w prostokątach wstrzykiwacza.

Stuknij slajdy w ręcznik papierowy, aby usunąć TBS-T. Dodaj 50 mikrolitrów bloku do każdego prostokąta i inkubuj przez godzinę w temperaturze pokojowej. Pod koniec inkubacji, za pomocą ręcznika papierowego, usunąć roztwór blokujący z próbek.

Delikatnie odpipetować 50 mikrolitrów mieszaniny przeciwciał pierwszorzędowych w TBS-T do każdego prostokąta i inkubować próbki przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie umyj szkiełka za pomocą TBS-T. Wyjmij TBS-T, stukając w ręcznik papierowy.

Powtórz ten proces trzy razy. Następnie dodaj 50 mikrolitrów mieszaniny przeciwciał wtórnych w rozcieńczeniu od jednego do 1000 w TBS-T do każdego prostokąta i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę w ciemności. Następnie umyj próbkę trzykrotnie TBS-T.

Następnie inkubować próbkę z DAPI w stężeniu dwóch mikrogramów na mililitr i TBS-T przez jedną minutę. Usuń roztwór DAPI, stukając w ręcznik papierowy i umyj trzy razy TBS-T. Aby zamontować szklane szkiełko nakrywkowe, dodaj dwie krople odczynnika montażowego na szkiełko do próbek.

Delikatnie dociśnij szkiełko nakrywkowe, aby usunąć pęcherzyki powietrza, i pozostaw próbki do wyschnięcia na godzinę w temperaturze pokojowej. Zobrazuj co najmniej 50 komórek w różnych polach za pomocą systemu obrazowania fluorescencyjnego z oświetleniem strukturalnym, wyposażonego w 60-krotny obiektyw olejowy lub technologię konfokalną. Aby przeanalizować komórki, wyizoluj obszar zainteresowania, rysując kontur wokół komórki dodatniej lub ujemnej i używając funkcji przycinania.

Następnie aktywuj deskryptory kształtów i ogranicz do opcji progowych w ustawionej funkcji pomiaru. Dostosuj poziom progu, wybierając funkcję progu w menu regulacji. Na koniec użyj narzędzia do analizy cząstek i ustaw odpowiedni rozmiar, aby uchwycić mitochondria.

Na przykład ustaw rozmiar na 25 nieskończoności, a następnie aktywuj jednostki pikseli i wybierz pokaż maski. Pokazano substantia nigra pars compacta myszy z wstrzykniętą PFF, które są barwione immunologicznie na obecność hydroksylazy tyrozyny, VDAC1, alfa-synukleiny PS129 i DAPI. Barwienie alfa-synukleiną anty PS129 pozwoliło odróżnić komórki, które zawierały zmiany PS129 od zdrowych komórek.

Analiza obrazu barwienia VDAC1 neuronów dodatnich z hydroksylazą tyrozynową ujawniła zmniejszenie zarówno liczby mitochondriów, jak i proporcji między neuronami noszącymi uszkodzenia PS129 a neuronami bez nich.