Name: Wydajna edycja bazy bez PAM do modelowania chorób genetycznych człowieka u danio pręgowanego za pomocą zSpRY-ABE8e (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-17T13:15:00.000+00:00
Duration: 7 min 31 s
Description: Odkryj edycję bazy zSpRY-ABE8e bez ograniczeń PAM w danio pręgowanym. Ta metoda umożliwia tworzenie precyzyjnych modeli chorób genetycznych człowieka związanych z wariantami jednonukleotydowymi.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy dr Barbarze Garbers z Liwen Bianji (Edanz) za edycję angielskiego tekstu szkicu tego rękopisu. Prace te były wspierane przez Program Badawczo-Rozwojowy Obszaru Kluczowego Prowincji Guangdong (2019B030335001), Narodowy Kluczowy Program Badawczo-Rozwojowy Chin (2019YFE0106700), Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (32070819, 31970782) oraz Program Funduszu Badawczego Kluczowego Laboratorium Biologii Chorobotwórczej i Epidemiologii Patogenów Prowincji Guangdong dla Wodnych Zwierząt Ekonomicznych (PBEA2020YB05).

To badanie zostało przeprowadzone w ścisłej zgodności z wytycznymi Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Uniwersytetu Normalnego w Chinach Południowych.
1. Przygotowanie syntetycznie zmodyfikowanego gRNA i mRNA zSpRY-ABE8e
<ol>
	<li>Zaprojektuj gRNA zgodnie z wcześniejszymi publikacjami37,38.
	<ol>
		<li>Preferencyjnie wybierz NRN jako sekwencję PAM, ponieważ zSpRY-ABE8e wykazuje wyższą preferencję dla NRN PAM niż NYN PAM (gdzie R to A lub G, a Y to C lub T)18. Upewnij się, że docelowy nukleotyd adeninowy znajduje się w wysoce aktywnym oknie edycji (trzeci do dziewiątego nukleotydu wzdłuż protospacery).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zamów EasyEdit sgRNA (EE gRNA) zmodyfikowane 2′-O-metylo-3′-fosforanianem (MS) na obu końcach (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1). 
	UWAGA: EE gRNA należy rozpuścić w wodzie wolnej od RNaz i przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Linearyzuj plazmid zSpRY-ABE8e 18.
	<ol>
		<li>Linearyzować 6 μg plazmidu enzymem XbaI (tabela materiałów) w kąpieli metalowej w temperaturze 37 °C przez 3 godziny.</li>
		<li>Oczyść zlinearyzowany plazmid za pomocą zestawu do oczyszczania DNA (patrz tabela materiałów) zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dokonaj transkrypcji mRNA za pomocą zestawu do transkrypcji in vitro (tabela materiałów).
	<ol>
		<li>Transkrybuj mRNA zSpRY-ABE8e ze zlinearyzowanym plazmidem jako matrycą zgodnie z instrukcjami producenta. 
		UWAGA: Wszystkie operacje z udziałem mRNA i gRNA wymagają użycia materiałów laboratoryjnych wolnych od RNaz.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Użyj zestawu do oczyszczania RNA (Tabela materiałów), aby oczyścić mRNA zgodnie z instrukcjami producenta. 
	UWAGA: Przed elucją, etanol musi zostać wysuszony, aby uniknąć cytotoksyczności, a mRNA powinno być przechowywane w temperaturze -80 °C, jeśli nie zostanie natychmiast zużyte.</li>
</ol>
2. Przygotowanie szklanych kapilar do mikroiniekcji
<ol>
	<li>Ustaw system ściągacza do mikropipet i podgrzewaj przez co najmniej 30 minut.</li>
	<li>Przeprowadź test rampowy, aby określić wartość ciepła potrzebną do stopienia kapilar ze szkła borokrzemianowego (o średnicy zewnętrznej 1 mm i średnicy wewnętrznej 0,58 mm) zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Wybierz program i kliknij liczbę na klawiaturze, aby wprowadzić wartości parametrów. Ustaw następujące parametry, aby wyciągnąć szklane kapilary: ciepło = wartość testu rampy, ciągnięcie = 50, prędkość = 100, czas = 50 i ciśnienie = 30.</li>
	<li>Zamontuj rurkę kapilarną, upewniając się, że znajduje się w rowku. Naciśnij przycisk PULL START/STOP, aby uruchomić program.</li>
	<li>Zachowaj naciągnięte naczynia włosowate, wkładając je do pianki, która zawiera szczeliny, utrzymując igłę zawieszoną.</li>
</ol>
3. Mikroiniekcja mieszaniny mRNA zSpRY-ABE8e i gRNA EE do zarodków danio pręgowanego
<ol>
	<li>Ustaw zbiorniki hodowlane na noc przed wstrzyknięciem. Włóż przegrodę, umieść dwie samice i jednego samca zebry odmiany AB (w wieku 3-18 miesięcy) w każdym zbiorniku i przykryj pokrywką. Zapoznaj się z wcześniejszymi publikacjami, aby zapoznać się z rozróżnieniem płci39. 
	UWAGA: Aby uzyskać więcej zarodków, wybierz ryby, które nie rozmnażały się przez co najmniej 1 tydzień.</li>
	<li>Następnego ranka przed wstrzyknięciem rozmrozić mRNA zSpRY-ABE8e i gRNA EE na lodzie. Wymieszaj mRNA i gRNA do końcowych stężeń odpowiednio 400 ng/μL i 200 ng/μL.
	<ol>
		<li>Całą procedurę należy wykonać na lodzie za pomocą końcówek i rurek wolnych od RNaz oraz obsługiwać w rękawiczkach.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Skonfiguruj mikrowtryskiwacz pneumatyczny. Zamknij zawór ciśnienia cząstkowego pompy powietrza i najpierw otwórz zawór główny, odkręć butlę z gazem i wyreguluj ciśnienie zaworu ciśnienia cząstkowego na 0,2 MPa/29 psi.
	<ol>
		<li>Włącz mikrowtryskiwacz pneumatyczny, ustaw tryb na TIMER i ustaw początkową wartość ciśnienia parametru na 20.0 psi, a wartość TIMER na 0.040 s.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Użyj cienkich kleszczyków, aby ostrożnie rozbić igły naciągniętych szklanych naczyń włosowatych pod mikroskopem stereoskopowym, upewniając się, że igły są przycięte pod kątem, aby ułatwić przekłucie kosmówki i jaja. 
	UWAGA: Punkt złamania igły musi znajdować się we właściwym miejscu i być wystarczająco mocny, aby przebić jajko, a jednocześnie wystarczająco cienki, aby zminimalizować uszkodzenie jajka.</li>
	<li>Dodaj mieszaninę mRNA i gRNA zSpRY-ABE8e do końcówki szklanej kapilary za pomocą końcówki pipety z mikroładowarką, unikając pęcherzyków w kapilarze. Przymocuj igłę do mikromanipulatora i skonfiguruj ciśnienie i wartość TIMER wtryskiwacza, aby zapewnić wytworzenie 2 nl mieszaniny na wstrzyknięcie za pomocą mikronasadki.</li>
	<li>Odłącz przegrody zbiorników hodowlanych i pozwól rybom rozmnażać się przez 10-15 minut. Zbierz jaja za pomocą sitka i zbadaj stadium komórkowe i jakość jaj pod mikroskopem stereoskopowym. Wybierz jaja w stanie jednokomórkowym do wstrzyknięcia, aby poprawić wydajność edycji.</li>
	<li>Wyłóż jaja na 1,5% płytce do wstrzykiwań agarozy i wstrzyknij 2 nl mieszaniny do komórki, a nie do żółtka zarodków pod mikroskopem, aby poprawić wydajność edycji. Zachowaj co najmniej 15 jaj jako grupę kontrolną.</li>
	<li>Użyj 1x bufor E3, aby zebrać jaja na szalkach Petriego i umieścić je w inkubatorze w temperaturze 28 °C. Usuń martwe jaja i zmieniaj bufor kulturowy co 12 godzin do 48 godzin po zapłodnieniu (hpf).</li>
</ol>
4. Analiza efektywności edycji bazowej za pomocą EditR
<ol>
	<li>W temperaturze 48 hpf zbierz trzy pule po sześć losowo wybranych zarodków, którym wstrzyknięto zarodki i sześć losowo wybranych zarodków kontrolnych, odpowiednio do probówek PCR. Za pomocą pipety odessać resztki buforu E3.</li>
	<li>Dodać 40 μl 50 mM NaOH do probówek PCR. Umieścić probówki w metalowej kąpieli w temperaturze 95 °C na 20 minut, a następnie wirować przez 15 sekund.</li>
	<li>Dodać 4 μl 1 M Tris·HCl (pH 8,0) do każdej probówki, aby zneutralizować NaOH. Krótko odwirować przy 2 000 x g przez 10 s w temperaturze pokojowej w celu usunięcia kropelek ze ścianki probówki. Zebrać supernatant do nowych probówek do PCR i przechowywać je w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Zaprojektuj odpowiednie startery przed i za miejscami docelowymi gRNA. Użyć 1 μl powyższego supernatantu jako matrycy do reakcji PCR o objętości 50 μl. Startery używane do PCR w tym badaniu są wymienione w Tabeli Uzupełniającej 1.</li>
	<li>Wykonaj elektroforezę w żelu agarozowym DNA, aby zapewnić prawidłowe i specyficzne prążki, a następnie sekwencjonowanie Sangera, jak opisano wcześniej40.</li>
	<li>Przeanalizuj dane sekwencjonowania Sangera za pomocą programu EditR (1.0.10) class41.
	<ol>
		<li>Prześlij plik sekwencjonowania (format ab1) w polu "Prześlij plik .ab1".</li>
		<li>Wprowadź sekwencję gRNA 20 pz w orientacji 5′-3′ w polu "Wprowadź sekwencję gRNA".</li>
		<li>Otwórz plik sekwencjonowania (format ab1) i potwierdź pozycje podstawowe, w których zaczyna się i kończy sekwencja gRNA 20 pz. Wprowadź odpowiednią pozycję bazową w polach "Początek 5′" i "Koniec 3′".</li>
		<li>Kliknij Przewidywaną edycję, aby uzyskać podstawową wydajność edycji. Sprawdź jakość danych sekwencjonowania w pobliżu sekwencji docelowej gRNA, aby uniknąć nieuporządkowanych pików lub indeli. 
		UWAGA: Ogólnie rzecz biorąc, nieuporządkowane piki można skutecznie usunąć, dostosowując temperaturę wyżarzania PCR.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Eichler, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Completing+the+map+of+human+genetic+variation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Completing the map of human genetic variation.</a> Nature. 447 (7141), 161-165 (2007).</li>
<li>Koukouli, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nicotine+reverses+hypofrontality+in+animal+models+of+addiction+and+schizophrenia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Nicotine reverses hypofrontality in animal models of addiction and schizophrenia.</a> Nature Medicine. 23 (3), 347-354 (2017).</li>
<li>Kalueff, A. V., Stewart, A. M., Gerlai, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+as+an+emerging+model+for+studying+complex+brain+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Pharmacological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Zebrafish as an emerging model for studying complex brain disorders.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 35 (2), 63-75 (2014).</li>
<li>Anzalone, A. V., Koblan, L. W., Liu, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing+with+CRISPR-Cas+nucleases%2C+base+editors%2C+transposases+and+prime+editors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Genome editing with CRISPR-Cas nucleases, base editors, transposases and prime editors.</a> Nature Biotechnology. 38 (7), 824-844 (2020).</li>
<li>Sander, J. D., Joung, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas+systems+for+editing%2C+regulating+and+targeting+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes.</a> Nature Biotechnology. 32 (4), 347-355 (2014).</li>
<li>Komor, A. C., Kim, Y. B., Packer, M. S., Zuris, J. A., Liu, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmable+editing+of+a+target+base+in+genomic+DNA+without+double-stranded+DNA+cleavage%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage.</a> Nature. 533 (7603), 420-424 (2016).</li>
<li>Nishida, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+nucleotide+editing+using+hybrid+prokaryotic+and+vertebrate+adaptive+immune+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Targeted nucleotide editing using hybrid prokaryotic and vertebrate adaptive immune systems.</a> Science. 353 (6305), (2016).</li>
<li>Gaudelli, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+of+adenine+base+editors+with+increased+activity+and+therapeutic+application%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Directed evolution of adenine base editors with increased activity and therapeutic application.</a> Nature Biotechnology. 38 (7), 892-900 (2020).</li>
<li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+RNA-guided+base+editing+in+rabbit%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Highly efficient RNA-guided base editing in rabbit.</a> Nature Communications. 9, 2717(2018).</li>
<li>Levy, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytosine+and+adenine+base+editing+of+the+brain%2C+liver%2C+retina%2C+heart+and+skeletal+muscle+of+mice+via+adeno-associated+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Cytosine and adenine base editing of the brain, liver, retina, heart and skeletal muscle of mice via adeno-associated viruses.</a> Nature Biomedical Engineering. 4 (1), 97-110 (2020).</li>
<li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+mouse+models+of+human+diseases+via+ABE-+and+BE-mediated+base+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of mouse models of human diseases via ABE- and BE-mediated base editing.</a> Nature Communications. 9, 2338(2018).</li>
<li>Landrum, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ClinVar%3A+Public+archive+of+interpretations+of+clinically+relevant+variants%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">ClinVar: Public archive of interpretations of clinically relevant variants.</a> Nucleic Acids Research. 44, 862-868 (2016).</li>
<li>Qin, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+A%E2%80%A2T+to+G%E2%80%A2C+base+editing+in+the+zebrafish+genome%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">Precise A•T to G•C base editing in the zebrafish genome.</a> BMC Biology. 16 (1), 139(2018).</li>
<li>Tanaka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+targeted+single-nucleotide+editing+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">In vivo targeted single-nucleotide editing in zebrafish.</a> Scientific Reports. 8, 11423(2018).</li>
<li>Carrington, B., Weinstein, R. N., Sood, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BE4max+and+AncBE4max+are+efficient+in+germline+conversion+of+C%3AG+to+T%3AA+base+pairs+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">BE4max and AncBE4max are efficient in germline conversion of C:G to T:A base pairs in zebrafish.</a> Cells. 9 (7), 1690(2020).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmable+base+editing+of+zebrafish+genome+using+a+modified+CRISPR-Cas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Programmable base editing of zebrafish genome using a modified CRISPR-Cas9 system.</a> Nature Communications. 8, 118(2017).</li>
<li>Rosello, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+base+editing+for+the+in+vivo+study+of+developmental+signaling+and+human+pathologies+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Precise base editing for the in vivo study of developmental signaling and human pathologies in zebrafish.</a> eLife. 10, 65552(2021).</li>
<li>Liang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SpG+and+SpRY+variants+expand+the+CRISPR+toolbox+for+genome+editing+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">SpG and SpRY variants expand the CRISPR toolbox for genome editing in zebrafish.</a> Nature Communications. 13, 3421(2022).</li>
<li>Qin, W., Lu, X., Lin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmable+base+editing+in+zebrafish+using+a+modified+CRISPR-Cas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Programmable base editing in zebrafish using a modified CRISPR-Cas9 system.</a> Methods. 150, 19-23 (2018).</li>
<li>Feng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+CRISPR%2FCas9+genome+editing+capacity+in+zebrafish+using+SaCas9%5BTitle%5D)+AND+%22G3%22%5BJournal%5D)">Expanding CRISPR/Cas9 genome editing capacity in zebrafish using SaCas9.</a> G3. 6 (8), 2517-2521 (2016).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing+in+zebrafish+by+ScCas9+recognizing+NNG+PAM%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Genome editing in zebrafish by ScCas9 recognizing NNG PAM.</a> Cells. 10 (8), 2099(2021).</li>
<li>Kleinstiver, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+CRISPR-Cas9+nucleases+with+altered+PAM+specificities%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Engineered CRISPR-Cas9 nucleases with altered PAM specificities.</a> Nature. 523 (7561), 481-485 (2015).</li>
<li>Liu, K., Petree, C., Requena, T., Varshney, P., Varshney, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+the+CRISPR+toolbox+in+zebrafish+for+studying+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Expanding the CRISPR toolbox in zebrafish for studying development and disease.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 13(2019).</li>
<li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li>
<li>Hu, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolved+Cas9+variants+with+broad+PAM+compatibility+and+high+DNA+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Evolved Cas9 variants with broad PAM compatibility and high DNA specificity.</a> Nature. 556 (7699), 57-63 (2018).</li>
<li>Nishimasu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+CRISPR-Cas9+nuclease+with+expanded+targeting+space%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Engineered CRISPR-Cas9 nuclease with expanded targeting space.</a> Science. 361 (6408), 1259-1262 (2018).</li>
<li>Endo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing+in+plants+by+engineered+CRISPR-Cas9+recognizing+NG+PAM%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Plants%22%5BJournal%5D)">Genome editing in plants by engineered CRISPR-Cas9 recognizing NG PAM.</a> Nature Plants. 5, 14-17 (2019).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+genome+editing+using+xCas9+with+expanded+PAM+compatibility%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Genetics+and+Genomics%22%5BJournal%5D)">Plant genome editing using xCas9 with expanded PAM compatibility.</a> Journal of Genetics and Genomics. 46 (5), 277-280 (2019).</li>
<li>Ren, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PAM-less+plant+genome+editing+using+a+CRISPR-SpRY+toolbox%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Plants%22%5BJournal%5D)">PAM-less plant genome editing using a CRISPR-SpRY toolbox.</a> Nature Plants. 7, 25-33 (2021).</li>
<li>Xu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SpRY+greatly+expands+the+genome+editing+scope+in+rice+with+highly+flexible+PAM+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">SpRY greatly expands the genome editing scope in rice with highly flexible PAM recognition.</a> Genome Biology. 22 (1), 6(2021).</li>
<li>Walton, R. T., Christie, K. A., Whittaker, M. N., Kleinstiver, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unconstrained+genome+targeting+with+near-PAMless+engineered+CRISPR-Cas9+variants%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Unconstrained genome targeting with near-PAMless engineered CRISPR-Cas9 variants.</a> Science. 368 (6488), 290-296 (2020).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing+mediated+by+SpCas9+variants+with+broad+non-canonical+PAM+compatibility+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant%22%5BJournal%5D)">Genome editing mediated by SpCas9 variants with broad non-canonical PAM compatibility in plants.</a> Molecular Plant. 14 (2), 352-360 (2021).</li>
<li>Vicencio, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing+in+animals+with+minimal+PAM+CRISPR-Cas9+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Genome editing in animals with minimal PAM CRISPR-Cas9 enzymes.</a> Nature Communications. 13, 2601(2022).</li>
<li>Rosello, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease+modeling+by+efficient+genome+editing+using+a+near+PAM-less+base+editor+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Disease modeling by efficient genome editing using a near PAM-less base editor in vivo.</a> Nature Communications. 13, 3435(2022).</li>
<li>Cornean, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+in+vivo+functional+analysis+of+DNA+variants+with+base+editing+using+ACEofBASEs+target+prediction%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Precise in vivo functional analysis of DNA variants with base editing using ACEofBASEs target prediction.</a> eLife. 11, 72124(2022).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+silencing+by+adenine+base+editor-mediated+start+codon+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Efficient gene silencing by adenine base editor-mediated start codon mutation.</a> Molecular Therapy. 28 (2), 431-440 (2020).</li>
<li>Hanna, R. E., Doench, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+analysis+of+CRISPR-Cas+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Design and analysis of CRISPR-Cas experiments.</a> Nature Biotechnology. 38 (7), 813-823 (2020).</li>
<li>Doench, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+sgRNA+design+to+maximize+activity+and+minimize+off-target+effects+of+CRISPR-Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9.</a> Nature Biotechnology. 34 (2), 184-191 (2016).</li>
<li>Kossack, M. E., Draper, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+regulation+of+sex+determination+and+maintenance+in+zebrafish+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Genetic regulation of sex determination and maintenance in zebrafish (Danio rerio).</a> Current Topics in Developmental Biology. 134, 119-149 (2019).</li>
<li>Crossley, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+Sanger+sequencing+and+molecular+assay+monitoring%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Veterinary+Diagnostic+Investigation%22%5BJournal%5D)">Guidelines for Sanger sequencing and molecular assay monitoring.</a> Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 32 (6), 767-775 (2020).</li>
<li>Kluesner, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EditR%3A+A+method+to+quantify+base+editing+from+Sanger+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22The+CRISPR+Journal%22%5BJournal%5D)">EditR: A method to quantify base editing from Sanger sequencing.</a> The CRISPR Journal. 1 (3), 239-250 (2018).</li>
<li>Gripp, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diamond-Blackfan+anemia+with+mandibulofacial+dystostosis+is+heterogeneous%2C+including+the+novel+DBA+genes+TSR2+and+RPS28%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Medical+Genetics+Part+A%22%5BJournal%5D)">Diamond-Blackfan anemia with mandibulofacial dystostosis is heterogeneous, including the novel DBA genes TSR2 and RPS28.</a> American Journal of Medical Genetics Part A. 164 (9), 2240-2249 (2014).</li>
<li>Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+RNA-guided+genome+editing+in+human+cells+via+delivery+of+purified+Cas9+ribonucleoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins.</a> Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).</li>
<li>Ramakrishna, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+disruption+by+cell-penetrating+peptide-mediated+delivery+of+Cas9+protein+and+guide+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Gene disruption by cell-penetrating peptide-mediated delivery of Cas9 protein and guide RNA.</a> Genome Research. 24 (6), 1020-1027 (2014).</li>
<li>Fu, Y., Reyon, D., Joung, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+genome+editing+in+human+cells+using+CRISPR%2FCas+nucleases+and+truncated+guide+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Targeted genome editing in human cells using CRISPR/Cas nucleases and truncated guide RNAs.</a> Methods in Enzymology. 546, 21-45 (2014).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Protokół ten opisuje budowę modelu choroby danio pręgowanego przy użyciu edytora bazowego zSpRY-ABE8e. W porównaniu z tradycyjną ścieżką HDR do podstawiania zasad, protokół ten może osiągnąć bardziej wydajną edycję zasad i zmniejszyć występowanie indeli. Jednocześnie protokół ten zakłada wdrożenie niedawno zaproponowanej strategii nokautu genów i-Silence u danio pręgowanego. Reasumując, projekt zSpRY-ABE8e przyczyni się do zwiększenia zastosowania modeli danio pręgowanego w badaniach nad chorobami.
<p class="jove_con...

Warianty pojedynczych nukleotydów (SNV), które powodują mutacje typu missense lub nonsense, są najczęstszym źródłem mutacji w ludzkim genomie1. Aby określić, czy dany SNV jest patogenny i rzucić światło na jego patogenezę, potrzebne są precyzyjne modele zwierzęce2. Danio pręgowany jest dobrym modelem choroby człowieka, wykazując wysoki stopień fizjologicznej i genetycznej homologii z ludźmi, krótki cykl rozwojowy i silną zdolność reprodukcyjną, co jest korzystne dla badań nad cechami i mechanizmami patogennymi, a także badań przesiewowych leków3.
System CRISPR/Cas9 (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas9 jest szeroko stosowany w edycji genomu różnych gatunków, w tym danio pręgowanego4. Dzięki naprowadzaniu gRNA, system CRISPR/Cas9 może generować dwuniciowe pęknięcia DNA (DSB) w miejscu docelowym, co następnie umożliwia substytucję pojedynczej zasady poprzez rekombinację miejsca docelowego z matrycami DNA dawcy za pośrednictwem szlaku naprawy ukierunkowanej na homologię (HDR). Jednak skuteczność tej metody zastępowania zasad jest dość niska, ponieważ proces naprawy DNA komórkowego odbywa się głównie przez niehomologiczny szlak łączenia końców (NHEJ), któremu zwykle towarzyszą mutacje insercji i delecji (indel) 5. Na szczęście technologia edycji pojedynczej bazy oparta na CRISPR/Cas9 znacznie łagodzi ten problem dzięki zastosowaniu edytorów podstawowych, które umożliwiają bardziej wydajną edycję pojedynczej bazy bez wywoływania DSB. Dwie główne klasy edytorów bazowych, edytory zasad adeninowych (ABE) i edytory zasad cytozyny (CBE), zostały opracowane w celu implementacji edycji podstawiania zasad odpowiednio dla A·T do G·C i C·G do T·A6,7,8,9,10,11. Te cztery typy podstawień zasad obejmują 30% wariantów patogenu ludzkiego12. Obie klasy edytorów bazowych, w tym PmCDA1, system BE, CBE4max, ABE7.10 i ABE8e, zostały zgłoszone do pracy u danio pręgowanego, przy czym BE4max i ABE8e szczególnie osiągnęły wysoką aktywność edycyjną13,14,15,16,17,18,19.
Białka Cas9 różnych gatunków, w tym Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes i S. canis, zostały zaimplementowane w edycji genów danio pręgowanego, przy czym Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9) jest najczęściej stosowany20,21,22,23. Jednak SpCas9 może rozpoznawać miejsca docelowe tylko z motywem sąsiadującym z protospacerem NGG (PAM), co ogranicza jego edytowalny zakres i może spowodować, że w pobliżu patogennego miejsca zainteresowania nie zostanie znaleziona odpowiednia sekwencja24. Aby rozszerzyć zakres docelowy, zaprojektowano różne warianty SpCas9 w celu rozpoznawania różnych PAM poprzez ukierunkowaną ewolucję i projektowanie oparte na strukturze. Jednak niewiele wariantów jest skutecznych u zwierząt, zwłaszcza u danio pręgowanego, co ogranicza zastosowanie danio pręgowanego w badaniach nad chorobami związanymi z SNV25,26,27,28. Ostatnio doniesiono, że dwa warianty SpCas9, SpG i SpRY, z mniej rygorystycznymi ograniczeniami PAM (NGN dla SpG i NNN dla SpRY z wyższą preferencją dla NRN niż NYN) wykazują wysoką aktywność edycyjną w ludzkich komórkach i roślinach29,30,31,32. Następnie doniesiono, że SpG i SpRY, a także szereg ich edytorów bazowych, takich jak CBE za pośrednictwem SpRY i ABE, w których pośredniczy SpRY, działają również u danio pręgowanego, co zwiększy zastosowanie modeli danio pręgowanego w badaniach mechanistycznych i badaniach przesiewowych leków związanych z chorobami związanymi z SNV18,33,34,35. Co więcej, i-Silence został zaproponowany jako skuteczna i dokładna strategia nokautu genów poprzez konwersję kodonów start za pośrednictwem ABE z ATG na GTG lub ACG36. Połączenie strategii i-Silence i edytora bazowego zSpRY-ABE8e za pośrednictwem SpRY zapewnia nową metodę modelowania chorób18. Protokół ten pokazuje, jak przeprowadzić edycję genów przy użyciu zSpRY-ABE8e u danio pręgowanego w celu skonstruowania modelu tsr2 (M1V) przy użyciu strategii i-Silence. Oceniono i przeanalizowano efektywność edycji i fenotypy, które pojawiają się w modelach danio pręgowanego.

<table><tbody><tr><td>Agaroza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539</td><td>1,5% Agaroza używana do produkcji płytki iniekcyjnej</td></tr><tr><td>Kapilary ze szkła borokrzemianowego&nbsp;</td><td>Aparat Harvarda</td><td>BS4 30-0016</td><td></td></tr><tr><td>Naczynia do hodowli komórkowych&nbsp;</td><td>Falcon</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>ClonExpress Ultra One Step Klon</td> Zestaw <td>Vazyme</td><td>C115</td><td>do klonowania infuzyjnego&nbsp;</td></tr><tr><td>Usługa optymalizacji kodonów</td><td>Sangon Biotech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Drummond Microcaps</td><td>Drummond Microcaps</td><td>P1299-1PAK</td><td>Długość: 32 mm, pojemność: 0,5 &mu; L</td></tr><tr><td>EasyEdit gRNA service</td><td>GenScript</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fine Kleszcze</td><td>Fine Scientific Instrument</td><td>11254-20</td><td>Służy do łamania meedle</td></tr><tr><td>Flaming/Brown Micropipette Puller&nbsp;</td><td>Instrument do jąkania</td><td>P-97</td><td>Służy do wyciągania szklanych naczyń włosowatych</td></tr><tr><td>HotStart Taq PCR StarMix Genstar</td><td></td><td>A033-101</td><td>Używany do reakcji PCR</td></tr><tr><td>Inteligentna skrzynka do sztucznego klimatu</td><td>TENLIN</td><td>PRX-1000A</td><td>Służy do hodowli zarodków danio pręgowanego</td></tr><tr><td>Metyloceluloza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0512</td><td>Służy do mocowania danio pręgowanego podczas fotografowania</td></tr><tr><td>końcówek do pipet mikroładowarki i nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td></td></tr><tr><td>zestaw mMACHINE&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mut Express II Zestaw do szybkiej mutagenezy V2</td><td>Vazyme</td><td>C214-01</td><td>Zestaw do mutagenezy ukierunkowanej</td></tr><tr><td>na miejsce Mikrowtryskiwacz pneumatyczny</td><td>ZGene Biotech</td><td>ZGPCP-1500 PLUS</td><td></td></tr><tr><td>pT3TS-zSpCas9</td><td>Addgene</td><td>46757</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw RNeasy FFPE&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>73504</td><td>Zestaw do oczyszczania RNA</td></tr><tr><td>Sanger Usługa sekwencjonowania</td><td>Sangon Biotech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu, granulowany</td><td>Sangon</td><td>A100173-0500</td><td>NaOH używany do ekstrakcji genomu</td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td>Olympus&nbsp;</td><td>SZX10</td><td>Służy do fotografowania fenotypu</td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy Zoom serii SZ</td><td>CNOPTEC</td><td>SZ650</td><td></td></tr><tr><td>T3 mMESSAGE</td><td>Ambion</td><td>AM1348</td><td>Zestaw do transkrypcji in vitro&nbsp;</td></tr><tr><td>TIANprep Mini Plasmid Kit</td><td>TIANGEN</td><td>DP103-03</td><td>Zestaw do ekstrakcji plazmidu</td></tr><tr><td>TIANquick Mini Purification Kit</td><td>TIANGEN</td><td>DP203-02</td><td>Zestaw do oczyszczania linearyzowanego plazmidu</td></tr><tr><td>Tricaine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td>Służy do znieczulania danio pręgowanego</td></tr><tr><td>Tris (hydroksymetylo)aminometanu</td><td>Sangon</td><td>A600194-0500</td><td>Składnik Tris i middot; HCl używany do ekstrakcji genomu</td></tr><tr><td>XbaI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0145S</td><td>Endonukleaza restrykcyjna stosowana do linearyzacji plazmidu</td></tr></tbody></table>

wydajna edycja bazy bez pam do modelowania chorób genetycznych człowieka u danio pręgowanego za pomocą zspry-abe8e

Efficient PAM-Less Base Editing for Zebrafish Modeling of Human Genetic Disease with zSpRY-ABE8e

Technologia CRISPR/Cas9 zwiększyła wartość danio pręgowanego do modelowania ludzkich chorób genetycznych, badania patogenezy chorób i badań przesiewowych leków, ale ograniczenia związane z motywem sąsiadującym z protospacerem (PAM) są główną przeszkodą w tworzeniu dokładnych modeli zwierzęcych ludzkich zaburzeń genetycznych spowodowanych wariantami pojedynczych nukleotydów (SNV). Do tej pory niektóre warianty SpCas9 o szerokiej kompatybilności z PAM wykazywały skuteczność u danio pręgowanego. Zastosowanie zoptymalizowanego edytora zasad adeninowych (ABE), zSpRY-ABE8e za pośrednictwem SpRY i syntetycznie zmodyfikowanego gRNA u danio pręgowanego, umożliwiło wydajną konwersję zasady adeninowo-guaninowej bez ograniczeń PAM. Opisano tutaj protokół do wydajnej edycji zasady adeninowej bez ograniczeń PAM u danio pręgowanego przy użyciu zSpRY-ABE8e. Poprzez wstrzyknięcie mieszaniny mRNA zSpRY-ABE8e i syntetycznie zmodyfikowanego gRNA do zarodków danio pręgowanego, skonstruowano model choroby danio pręgowanego z precyzyjną mutacją, która symulowała patogenne miejsce czynnika dojrzewania rybosomów TSR2 (tsr2). Metoda ta stanowi cenne narzędzie do tworzenia dokładnych modeli chorób do badania mechanizmów chorobowych i metod leczenia.

Zgłoszono, że mutacja genu TSR2 powoduje anemię Diamond-Blackfan (DBA)42. W niniejszej pracy, przy użyciu strategii i-Silence, stworzono model ryby zebrafish z anemią DBA posiadający mutację tsr2 (M1V). Adenina w kodonie startowym genu tsr2 u ryby zebrafish została pomyślnie przekształcona w guaninę przy użyciu zSpRY-ABE8e (Rysunek 3).
Analiza wyników sekwencjonowania metodą Sangera za pomocą programu EditR wykaza...

Ten protokół opisuje, jak przeprowadzić efektywną edycję zasady adeninowej bez ograniczeń PAM, aby zbudować precyzyjny model choroby danio pręgowanego za pomocą zSpRY-ABE8e.

Wydajna edycja bazy bez PAM do modelowania chorób genetycznych człowieka u danio pręgowanego za pomocą zSpRY-ABE8e

CRISPR/Cas9 technology has increased the value of zebrafish for modeling human genetic diseases, studying disease pathogenesis, and drug screening, but ...

Protokół ten pozwala naukowcom na zbudowanie szeregu wcześniej niedostępnych modeli danio pręgowanego dla wariantów pojedynczego nukleotydu istotnych z punktu widzenia choroby. Ograniczenia PAM są główną przeszkodą w tworzeniu dokładnych modeli zwierzęcych, a zSpRY-ABE8e umożliwia wydajną konwersję zasady adeniny do guaniny z niską intermutacją i złagodzonym ograniczeniem PAN. Narzędzie to może być wykorzystane do konstruowania dokładnych modeli danio pręgowanego do badania cech patogennych, mechanizmów chorobowych związanych z pojedynczymi nukleotydami morskimi, a także do badań przesiewowych leków w kierunku tej choroby.Aby rozpocząć, ustaw system ściągacza do mikropipet i podgrzewaj przez co najmniej 30 minut. Aby wyciągnąć szklane kapilary, wybierz program, ustaw wartość testu rampy jako ciepło, 50 jako ciągnięcie, prędkość na 100, czas na 50, a ciśnienie na 30. Następnie zainstaluj rurkę kapilarną, upewniając się, że znajduje się w rowku.Naciśnij pull start/stop"aby uruchomić program. Aby zachować naciągnięte kapilary, włóż je do pianki zawierającej szczeliny, utrzymując igłę zawieszoną. Do eksperymentów użyj mRNA zSpRY-ABE8e opisanego w manuskrypcie i łatwego do edycji sgRNA zmodyfikowanego fosforianem 2'O-metylu na obu końcach.Do projektu gRNA preferencyjnie wybierz NRN jako sekwencję PAM, ponieważ zSpRY-ABE8e wykazuje wyższą preferencję dla NRN PAM niż NYN PAM. Wprowadź docelowy nukleotyd adeninowy znajduje się w wysoce aktywnym oknie edycji od trzeciego do dziewiątego nukleotydu wzdłuż protospaceru. Ustaw zbiorniki hodowlane na noc przed wstrzyknięciem.Włóż przegrodę, umieszczając dwie samice i jednego samca danio pręgowanego w każdym zbiorniku. Umieść pokrywę na każdym zbiorniku. Następnego ranka, używając końcówek, probówek i rękawiczek wolnych od RNaz, wymieszaj rozmrożone mRNA i EEgRNA na lodzie do końcowego stężenia odpowiednio 400 i 200 nanogramów na mikrolitr.Aby skonfigurować mikrowtryskiwacz pneumatyczny, najpierw zamknij zawór ciśnienia cząstkowego pompy powietrza. Następnie otwórz główny zawór, odkręć butlę z gazem i wyreguluj ciśnienie zaworu ciśnienia cząstkowego na 0,2 megapaskala. Teraz włącz mikrowtryskiwacz i ustaw tryb na timer.Dostosuj parametr zawór ciśnieniowy do 20 funtów na cal kwadratowy, a wartość timera na 0.040 sekundy. Za pomocą cienkich kleszczy rozbij kątowo igły wyciągniętych szklanych naczyń włosowatych pod mikroskopem stereoskopowym. Za pomocą końcówki pipety do mikroładowarki dodaj mieszaninę mRNA/gRNA do końcówki szklanej kapilary i przymocuj igłę do mikromanipulatora.Skonfiguruj ciśnienie i wartość timera, aby wytworzyć mieszaninę dwóch nanolitrów na wstrzyknięcie za pomocą mikronasadki. Po rozmnażaniu ryb przez 10 do 15 minut zbierz jaja do sitka. Zbadaj stadium komórkowe i jakość jaj pod mikroskopem stereoskopowym.Wybierz jednokomórkowe komórki jajowe do wstrzyknięcia, aby poprawić wydajność edycji. Ułóż jaja na 1,5% płytce do wstrzykiwań agarozy i wstrzyknij dwa nanolitry mieszaniny RNA do komórki zarodków za pomocą mikroskopu. Zbierz jaja na szalkach Petriego z buforem E3 i inkubuj je w temperaturze 28 stopni Celsjusza.Usuń martwe jaja i zmieniaj bufor kulturowy co 12 godzin przez 48 godzin po zapłodnieniu. Po 48 godzinach od zapłodnienia zbierz trzy pule sześciu losowo wybranych zarodków, którym wstrzyknięto zarodki, do probówki PCR. Po pobraniu sześciu losowo wybranych zarodków kontrolnych należy użyć pipety do odessania resztek buforu E3.Dodaj 40 mikrolitrów 50-milimolowego wodorotlenku sodu do zarodków. Umieść probówki w metalowej kąpieli w temperaturze 95 stopni Celsjusza na 20 minut, a następnie wiruj przez 15 sekund. Dodać cztery mikrolitry jednego molowego chlorowodorku Tris o pH osiem do każdej probówki.Odwirować probówki o masie 2000 g przez 10 sekund w temperaturze pokojowej. Przenieść supernatant do nowej probówki do PCR. Usunąć jeden mikrolitr supernatantu z probówki PCR i użyć go do sekwencjonowania Sangera.Następnie przechowuj pozostały supernatant w temperaturze 20 stopni Celsjusza. Aby przeanalizować dane sekwencjonowania Sanger, zacznij od przesłania pliku sekwencjonowania do pola Prześlij plik ab1. Wprowadź sekwencję gRNA z 20 parami zasad w orientacji od 5' do 3' w polu sekwencji wprowadzania gRNA.Wprowadź odpowiednią pozycję bazową w polach 5' początek i 3' koniec. Uzyskaj podstawową wydajność edycji, klikając na edycję predykcyjną" i sprawdzając jakość danych sekwencjonowania. Model danio pręgowanego z niedokrwistością czarnego wentylatora diamentowego został skonstruowany poprzez konwersję adeniny kodonu start Tsr2 na guaninę.Analiza danych sekwencji EditR wykazała nakładanie się AG na zasadę adeninową kodonu start Tsr2. Fenotyp dwudniowych zarodków Tsr2 wykazywał mniejsze oczy w porównaniu z zarodkami kontrolnymi. W zmutowanych zarodkach zaobserwowano również obrzęk osierdzia.Aby osiągnąć efektywną edycję bazy, należy ściśle przestrzegać wspomnianej wcześniej zasady projektowania wytycznych, która jest warunkiem wstępnym powodzenia eksperymentu. Dokładne modele są niezbędne do badania chorób związanych z wariantami pojedynczych nukleotydów. Opracowanie SprY-ABE8e zapewnia skuteczne narzędzie do dokładnego modelowania, co pomaga promować badania nad mechanizmami chorobowymi i terapiami.

efficient-pam-less-base-editing-for-zebrafish-modeling-human-genetic

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Tutaj prezentujemy systematyczne podejście do opracowywania fizjologicznie istotnych, czułych i specyficznych testów in vivo do interpretacji zmienności w ludzkiej patologii. Przejściowa manipulacja genetyczna poprzez mikrowstrzyknięcie WT i zmutowanych ludzkich oligonukleotydów antysensownych mRNA i morfoliny (MO) wykorzystuje podatność rozwijającego się zarodka danio pręgowanego do szybkiego oznaczania mutacji patogennych, zwłaszcza, ale nie wyłącznie, w kontekście zaburzeń rozwojowych...

In vivo (in vivo) Modelowanie chorobliwego genomu ludzkiego przy użyciu Danio rerio

Danio pręgowany jest doskonałym modelem do badań genetycznych i rozwojowych. Implantacja kulek jest cenną techniką manipulacji tkankami, którą można wykorzystać do badania mechanizmów rozwojowych poprzez wprowadzanie zmian w lokalnych środowiskach komórkowych. Protokół ten opisuje, w jaki sposób przeprowadzić implantację mikrogranulek w zarodku danio pręgowanego.

Implantacja mikrogranulek w zarodku danio pręgowanego

Transgeniczne manipulacje i edycja genomu są kluczowe dla funkcjonalnego testowania ról genów i elementów cis-regulatorowych. W tym miejscu przedstawiono szczegółowy protokół mikroiniekcji w celu generowania modyfikacji genomowych (w tym fluorescencyjnych konstruktów transgenów reporterowych za pośrednictwem Tol2, TALEN-ów i CRISPR) dla wyłaniającej się ryby modelowej, ciernika trójkolcowego.

Mikroiniekcja do transgenezy i edycji genomu u cierników trójgrzbietowych

Mitoza jest niezbędna dla każdego żywego organizmu, a defekty często prowadzą do raka i zaburzeń rozwojowych. Korzystając z tego protokołu obrazowania i danio pręgowanego jako systemu modelowego, naukowcy mogą wizualizować mitozę w żywym organizmie kręgowców i mnogość defektów, które powstają, gdy procesy mitotyczne są wadliwe.

Obserwacja podziału i dynamiki mitotycznej w żywym zarodku danio pręgowanego

Ten protokół przedstawia podejście do analizy całego transkryptomu z zarodków danio pręgowanego, larw lub posortowanych komórek. Obejmuje izolację RNA, analizę szlaku danych RNASeq oraz walidację zmian ekspresji genów opartą na qRT-PCR.

Przygotowanie próbki i analiza danych dotyczących ekspresji genów opartych na RNASeq od danio pręgowanego

Danio pręgowany był używany jako wiarygodne modele genetyczne w badaniach biomedycznych, zwłaszcza wraz z pojawieniem się technologii edycji genów. Gdy spodziewane są fenotypy larw, ekstrakcja DNA i identyfikacja genotypu może być trudna. W tym miejscu opisujemy skuteczną procedurę genotypowania larw danio pręgowanego, poprzez obcinanie ogonów, już po 72 godzinach od zapłodnienia.

Wysokoprzepustowa ekstrakcja DNA i genotypowanie larw danio pręgowanego 3dpf poprzez obcinanie płetw

Opisujemy podejścia do manipulacji genami w systemie modelu ewolucyjnego Astyanax mexicanus. Opisano trzy różne techniki: transgenezę za pośrednictwem Tol2, ukierunkowaną manipulację genomem za pomocą CRISPR/Cas9 oraz knockdown ekspresji za pomocą morpholinos. Narzędzia te powinny ułatwić bezpośrednie badanie genów leżących u podstaw zmienności między formami zamieszkującymi powierzchnię i jaskinie.

Manipulacja funkcją genów u meksykańskich ryb jaskiniowych

Ten protokół opisuje podejście ułatwiające precyzyjną edycję w zarodkach danio pręgowanego przy użyciu technologii CRISPR-Cas9. Przedstawiono proces fenotypowania, aby zademonstrować możliwość zastosowania tych technik do modelowania wariantu genu związanego z zespołem wydłużonego odstępu QT.

Precyzyjne edycje Knock-In za pośrednictwem CRISPR-Cas9 w sercach danio pręgowanego

Technologie CRISPR-Cas zrewolucjonizowały dziedzinę edycji genomu. Jednak znalezienie i wyizolowanie pożądanej edycji linii zarodkowej pozostaje głównym wąskim gardłem. Dlatego protokół ten opisuje solidną metodę szybkiego badania przesiewowego nasienia danio pręgowanego wstrzykniętego za pomocą F0 CRISPR pod kątem edycji linii zarodkowej przy użyciu standardowych technik PCR, trawienia restrykcyjnego i elektroforezy żelowej.

Badania przesiewowe plemników w celu szybkiej izolacji zmian linii zarodkowej u danio pręgowanego

Tutaj prezentujemy protokół oznaczania białek znacznikiem białka fluorescencyjnego u larw danio pręgowanego, nowo opracowany i zmodyfikowany system in vivo, szczególnie przydatny do wizualizacji białek o niskiej obfitości u danio pręgowanego.

Znakowanie fluorescencyjne w celu wizualizacji białek o niskiej ekspresji u danio pręgowanego

RASopatie to wielosystemowe zespoły genetyczne wywołane hiperaktywacją szlaku RAS-MAPUK. Potencjalnie patogenne warianty oczekujące na walidację pojawiają się nieustannie, podczas gdy słabe dowody przedkliniczne ograniczają terapię. Tutaj opisujemy nasz protokół in vivo polegający na testowaniu i krzyżowej weryfikacji poziomów aktywacji ERK związanych z RASopatią oraz jego modulacji farmakologicznej podczas embrigenezy za pomocą obrazowania FRET na żywo u danio danio młodego typu Teen-reporter.

Efektywny protokół oceny modulacji aktywności ERK w wczesnych modelach zespołu Noonana u danio danio za pomocą mikroskopii na żywo FRET i immunofluorescencji

Odkryj edycję bazy zSpRY-ABE8e bez ograniczeń PAM w danio pręgowanym. Ta metoda umożliwia tworzenie precyzyjnych modeli chorób genetycznych człowieka związanych z wariantami jednonukleotydowymi.

Wydajna edycja bazy bez PAM do modelowania chorób genetycznych człowieka u danio pręgowanego za pomocą zSpRY-ABE8e

Przeglądaj więcej filmów