Wydajna edycja bazy bez PAM do modelowania chorób genetycznych człowieka u danio pręgowanego za pomocą zSpRY-ABE8e

Protokół ten pozwala naukowcom na zbudowanie szeregu wcześniej niedostępnych modeli danio pręgowanego dla wariantów pojedynczego nukleotydu istotnych z punktu widzenia choroby. Ograniczenia PAM są główną przeszkodą w tworzeniu dokładnych modeli zwierzęcych, a zSpRY-ABE8e umożliwia wydajną konwersję zasady adeniny do guaniny z niską intermutacją i złagodzonym ograniczeniem PAN. Narzędzie to może być wykorzystane do konstruowania dokładnych modeli danio pręgowanego do badania cech patogennych, mechanizmów chorobowych związanych z pojedynczymi nukleotydami morskimi, a także do badań przesiewowych leków w kierunku tej choroby.

Aby rozpocząć, ustaw system ściągacza do mikropipet i podgrzewaj przez co najmniej 30 minut. Aby wyciągnąć szklane kapilary, wybierz program, ustaw wartość testu rampy jako ciepło, 50 jako ciągnięcie, prędkość na 100, czas na 50, a ciśnienie na 30. Następnie zainstaluj rurkę kapilarną, upewniając się, że znajduje się w rowku.

Naciśnij pull start/stop"aby uruchomić program. Aby zachować naciągnięte kapilary, włóż je do pianki zawierającej szczeliny, utrzymując igłę zawieszoną. Do eksperymentów użyj mRNA zSpRY-ABE8e opisanego w manuskrypcie i łatwego do edycji sgRNA zmodyfikowanego fosforianem 2'O-metylu na obu końcach.

Do projektu gRNA preferencyjnie wybierz NRN jako sekwencję PAM, ponieważ zSpRY-ABE8e wykazuje wyższą preferencję dla NRN PAM niż NYN PAM. Wprowadź docelowy nukleotyd adeninowy znajduje się w wysoce aktywnym oknie edycji od trzeciego do dziewiątego nukleotydu wzdłuż protospaceru. Ustaw zbiorniki hodowlane na noc przed wstrzyknięciem.

Włóż przegrodę, umieszczając dwie samice i jednego samca danio pręgowanego w każdym zbiorniku. Umieść pokrywę na każdym zbiorniku. Następnego ranka, używając końcówek, probówek i rękawiczek wolnych od RNaz, wymieszaj rozmrożone mRNA i EEgRNA na lodzie do końcowego stężenia odpowiednio 400 i 200 nanogramów na mikrolitr.

Aby skonfigurować mikrowtryskiwacz pneumatyczny, najpierw zamknij zawór ciśnienia cząstkowego pompy powietrza. Następnie otwórz główny zawór, odkręć butlę z gazem i wyreguluj ciśnienie zaworu ciśnienia cząstkowego na 0,2 megapaskala. Teraz włącz mikrowtryskiwacz i ustaw tryb na timer.

Dostosuj parametr zawór ciśnieniowy do 20 funtów na cal kwadratowy, a wartość timera na 0.040 sekundy. Za pomocą cienkich kleszczy rozbij kątowo igły wyciągniętych szklanych naczyń włosowatych pod mikroskopem stereoskopowym. Za pomocą końcówki pipety do mikroładowarki dodaj mieszaninę mRNA/gRNA do końcówki szklanej kapilary i przymocuj igłę do mikromanipulatora.

Skonfiguruj ciśnienie i wartość timera, aby wytworzyć mieszaninę dwóch nanolitrów na wstrzyknięcie za pomocą mikronasadki. Po rozmnażaniu ryb przez 10 do 15 minut zbierz jaja do sitka. Zbadaj stadium komórkowe i jakość jaj pod mikroskopem stereoskopowym.

Wybierz jednokomórkowe komórki jajowe do wstrzyknięcia, aby poprawić wydajność edycji. Ułóż jaja na 1,5% płytce do wstrzykiwań agarozy i wstrzyknij dwa nanolitry mieszaniny RNA do komórki zarodków za pomocą mikroskopu. Zbierz jaja na szalkach Petriego z buforem E3 i inkubuj je w temperaturze 28 stopni Celsjusza.

Usuń martwe jaja i zmieniaj bufor kulturowy co 12 godzin przez 48 godzin po zapłodnieniu. Po 48 godzinach od zapłodnienia zbierz trzy pule sześciu losowo wybranych zarodków, którym wstrzyknięto zarodki, do probówki PCR. Po pobraniu sześciu losowo wybranych zarodków kontrolnych należy użyć pipety do odessania resztek buforu E3.

Dodaj 40 mikrolitrów 50-milimolowego wodorotlenku sodu do zarodków. Umieść probówki w metalowej kąpieli w temperaturze 95 stopni Celsjusza na 20 minut, a następnie wiruj przez 15 sekund. Dodać cztery mikrolitry jednego molowego chlorowodorku Tris o pH osiem do każdej probówki.

Odwirować probówki o masie 2000 g przez 10 sekund w temperaturze pokojowej. Przenieść supernatant do nowej probówki do PCR. Usunąć jeden mikrolitr supernatantu z probówki PCR i użyć go do sekwencjonowania Sangera.

Następnie przechowuj pozostały supernatant w temperaturze 20 stopni Celsjusza. Aby przeanalizować dane sekwencjonowania Sanger, zacznij od przesłania pliku sekwencjonowania do pola Prześlij plik ab1. Wprowadź sekwencję gRNA z 20 parami zasad w orientacji od 5' do 3' w polu sekwencji wprowadzania gRNA.

Wprowadź odpowiednią pozycję bazową w polach 5' początek i 3' koniec. Uzyskaj podstawową wydajność edycji, klikając na edycję predykcyjną" i sprawdzając jakość danych sekwencjonowania. Model danio pręgowanego z niedokrwistością czarnego wentylatora diamentowego został skonstruowany poprzez konwersję adeniny kodonu start Tsr2 na guaninę.

Analiza danych sekwencji EditR wykazała nakładanie się AG na zasadę adeninową kodonu start Tsr2. Fenotyp dwudniowych zarodków Tsr2 wykazywał mniejsze oczy w porównaniu z zarodkami kontrolnymi. W zmutowanych zarodkach zaobserwowano również obrzęk osierdzia.

Aby osiągnąć efektywną edycję bazy, należy ściśle przestrzegać wspomnianej wcześniej zasady projektowania wytycznych, która jest warunkiem wstępnym powodzenia eksperymentu. Dokładne modele są niezbędne do badania chorób związanych z wariantami pojedynczych nukleotydów. Opracowanie SprY-ABE8e zapewnia skuteczne narzędzie do dokładnego modelowania, co pomaga promować badania nad mechanizmami chorobowymi i terapiami.