Name: Określanie relacji samo(nie)zgodności i między (nie)zgodnością w cytrusach za pomocą ręcznego zapylania, mikroskopii i analiz genotypu S (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-30T14:50:00.000+00:00
Duration: 7 min 12 s
Description: Poznaj metodę identyfikacji genotypu S i niezgodności własnej u cytrusów Citrus maxima za pomocą mikroskopii i analizy DNA. Technika ta wspomaga hodowców w selekcji odpowiednich drzew zapylających.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ten projekt był wspierany finansowo przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (32122075, 32072523).

1. Przygotowanie do barwienia na niebiesko anilinowe
<ol>
	<li>Przygotuj następujące odczynniki i narzędzia do eksperymentu: szczotkę do zapylaczy, pęsetę, ołówek, papier siarczanowy, worek do zapylania, woreczki z zamkiem błyskawicznym, spinacze do papieru, formaldehyd, lodowaty kwas octowy, absolutny etanol, probówki wirówkowe, kleszcze, zakraplacze kleju, szkiełka podstawowe, szkiełka nakrywkowe, skalpele i glikol polietylenowy.</li>
	<li>Przygotować pożywkę do kiełkowania in vitro zawierającą 0,02%MgSO4, 0,01% KNO3, 0,03% Ca(NO3)2, 0,01% H3BO3, 20% PEG-4000 i 15% sacharozy. Dostosuj pH do 6,0-6,2 za pomocą KOH. Użyj mieszadła magnetycznego, ponieważ PEG-4,000 jest trudny do rozpuszczenia.</li>
	<li>Przygotuj roztwór utrwalający Carnoya, który jest absolutnym etanolem i lodowatym kwasem octowym zmieszanymi w stosunku 3:1. Przygotuj roztwór utrwalający FAA, który składa się w 40% z formaldehydu, w 80% z etanolu i lodowatego kwasu octowego (1:8:1). Przygotować 4 M roztwór wodorotlenku sodu (NaOH) i błękitu anilinowego, który składa się z 0,1% błękitu anilinowego w 0,1 M K3PO4 . Użyj bursztynowej butelki do przechowywania roztworu błękitu anilinowego, ponieważ jest on wrażliwy na światło.</li>
</ol>
2. Zbieranie pyłku
<ol>
	<li>Poznaj z wyprzedzeniem okres kwitnienia drzew doświadczalnych (Ma jia pummelo w tym badaniu). Zbierz dojrzałe, nieotwarte kwiaty od początku okresu kwitnienia do szczytowej fazy kwitnienia i umieść je w torbie z zamkiem błyskawicznym. Kwiaty można przechowywać w lodówce w temperaturze 4 °C przez 24 godziny.</li>
	<li>Zanieś kwiaty do laboratorium. Użyj pęsety, aby zebrać pylniki i umieść je na szalce Petriego zawierającej bibułę filtracyjną. Zbierz pylniki od 20 do 30 kwiatów.</li>
	<li>Umieścić szalkę Petriego zawierającą pylniki w piekarniku o temperaturze 28 °C na 24 godziny, aż ziarna pyłku wyschną. Aby uzyskać szczegółową organizację kwiatów, zobacz Hu et al.9.</li>
	<li>Wysuszony pyłek należy umieścić w probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml. Przechowuj pyłek w hermetycznej torbie z zamkiem błyskawicznym zawierającej zmieniający kolor żel krzemionkowy (środek osuszający). Zamknij worek i oznacz go nazwą odmiany pyłku i datą przechowywania. Suszony pyłek można przechowywać w lodówce w temperaturze -20 °C przez 96 tygodni16.</li>
</ol>
3. Test kiełkowania pyłku in vitro 
<ol>
	<li>Wlać 300 μl płynnej pożywki do naczynia do hodowli komórkowych lub nakrętki probówki wirówkowej o pojemności 2 ml i równomiernie rozsypać pyłek za pomocą pędzla do zapylania. Pyłek należy inkubować w temperaturze 28 °C w wilgotnym, ciemnym otoczeniu przez 12 godzin.</li>
	<li>Zdejmij górny 1 mm końcówki końcówki pipety o pojemności 1 000 μl. Za pomocą pipety wchłonąć pyłek niewielką ilością roztworu hodowlanego i przesunąć go na środek szkiełka mikroskopowego. Przykryj go szkiełkiem nakrywkowym. Obserwuj preparat za pomocą odwróconego mikroskopu za pomocą obiektywu 10x.</li>
	<li>Wykonaj trzy niezależne powtórzenia, używając w przybliżeniu tej samej gęstości pyłku dla każdej kontrpróby17. Wizualnie zarządzaj ilością pyłku, upewniając się, że cała szalka Petriego jest pokryta pyłkiem i że każda szalka Petriego ma prawie równą ilość pyłku.</li>
	<li>Kiełkujący pyłek wytwarza łagiewkę pyłkową o długości około dwukrotnie większej od średnicy. Oblicz szybkość kiełkowania na podstawie 20 pól wizualnych, co daje procentową zawartość kiełkującego pyłku we wszystkich polach pyłku.</li>
</ol>
4. Zapylanie
<ol>
	<li>Wybierz słoneczny dzień bez wiatru do zapylania. Wybierz 10 w pełni rozwiniętych pąków, które mają się otworzyć, ostrożnie oderwij płatki i uważaj, aby ich nie posiniaczyć.</li>
	<li>Użyj pędzla do zapylania, aby rozprowadzić wystarczającą ilość żywego pyłku na powierzchni znamienia i uważaj, aby nie uszkodzić słupka. Do samozapylenia należy użyć pyłku z tej samej rośliny/odmiany. Do zapylenia krzyżowego użyj pyłku z rośliny o innym genotypie.</li>
	<li>Przykryj zapylone kwiaty papierową torbą siarczanową. Użyj spinacza do papieru, aby uszczelnić worek i zapobiec zapyleniu przez genotypowo odrębne pyłki.</li>
	<li>Na etykiecie napisz nazwę gatunku oraz liczbę i czas zapylenia. Zawieś etykietę na gałęziach w pobliżu zapylanych kwiatów.</li>
</ol>
5. Pobieranie próbek, utrwalanie i konserwacja
<ol>
	<li>Usuń worki do zapylania około 3-4 dni po zapyleniu i zbierz zapylone kwiaty w torebkach z zamkiem błyskawicznym.</li>
	<li>Natychmiast usuń płatki, pojemniki i jajniki z kwiatów i zanurz znamiona zrośnięte ze stylami w probówce wirówkowej zawierającej świeżo przygotowany roztwór utrwalający. Inkubować znamiona i style w roztworze utrwalającym przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Następnego dnia wyrzuć roztwór utrwalający i umyj znamiona i fryzury dwa do trzech razy w 95% etanolu.</li>
	<li>Przenieś style do 70% roztworu etanolu. Upewnij się, że próbka jest całkowicie zanurzona w roztworze. Modele na tym etapie można przechowywać w temperaturze 4 °C przez 1-2 miesiące.</li>
</ol>
6. Barwienie błękitem anilinowym
<ol>
	<li>Próbki stylu przechowywane w 70% etanolu należy umyć wodą destylowaną trzy do czterech razy. Zanurzyć w 4 M roztworze NaOH, zamknąć i inkubować w łaźni wodnej o temperaturze 65 °C przez 60 minut. Na tym etapie kolor stylu zmienia się z żółto-białego na pomarańczowo-czerwony.</li>
	<li>Namocz style w wodzie destylowanej przez 30 minut. Wylej wodę destylowaną i umyj je wodą destylowaną trzy do czterech razy lub do momentu, gdy kolor stylu stanie się żółty.</li>
	<li>Umieść próbkę w probówce o pojemności 10 ml, dodaj błękit anilinowy, aż próbka zostanie zanurzona, i farbuj przez 12 godzin w ciemności.</li>
	<li>Obserwuj wzrost łagiewki pyłkowej za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.</li>
</ol>
7. Mikroskopia fluorescencyjna
<ol>
	<li>Przed obserwacją próbek umieść szkiełko na płaskim stole i dodaj dwie do trzech kropli glikolu polietylenowego na powierzchnię szkiełka.</li>
	<li>Umyj styl, który ma być obserwowany, wodą destylowaną. Za pomocą skalpela podziel go na dwie połówki wzdłuż osi podłużnej. Umieść połowę stylu na szkiełku podstawowym i przykryj szkiełkiem nakrywkowym.</li>
	<li>Umieść szkiełko na stoliku mikroskopu nad aperturą i wizualizuj za pomocą obiektywu 10x. Stosować filtr DAPI (wzbudzenie: 325-375 nm; emisja: 435-485 nm). Obserwuj pięć stylów dla każdego rodzaju zapylania. Obserwuj wzrost łagiewki pyłkowej.</li>
</ol>
8. Identyfikacja genotypu S na podstawie PCR
<ol>
	<li>Wyodrębnij genomowe DNA z próbki znamienia za pomocą metody CTAB18.
	<ol>
		<li>Zebrane liście należy umieścić w probówce wirówkowej o pojemności 2 ml i zamknąć w ciekłym azocie. Przygotować bufor HCl:EDTA:NaCl:H2O w stosunku 1:1:3:5 i mieszaninę alkoholu izoamylowego chloroformu w stosunku 24:1</li>
		<li>Dodać 10 ml przygotowanego buforu, 0,2 g CTAB i 200 μl merkaptoetanolu do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml i umieścić w łaźni wodnej o temperaturze 65 °C na 5 minut, aż roztwór stanie się klarowny i przezroczysty.</li>
		<li>Włóż ostrza do moździerza, dodaj zamrożone próbki, dodaj ciekły azot i zmielić. Zmieloną próbkę umieścić w probówce wirówkowej o pojemności 2 ml, dodać 600 μl mieszaniny CTAB, umieścić w łaźni wodnej o temperaturze 65 °C na 60 minut i mieszać do góry nogami co 30 minut.</li>
		<li>Dodać 700 μl mieszaniny alkoholu izoamylowego z chloroformem (24:1) i mieszać do góry nogami przez 10 minut. Odwirować w temperaturze 24 °C przy 12 000 x g przez 10 minut, odpipetować supernatant i przenieść do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml.</li>
		<li>Dodać 60 μl 5 M roztworu NaCl i 1 ml absolutnego etanolu i wymieszać do góry nogami. Zamrażać w temperaturze -20 °C przez 30 minut, a następnie odwirowywać w temperaturze 24 °C i 9 000 x g przez 5 minut.</li>
		<li>Odrzucić sklarowany sklarant, dodać 1 ml 70% roztworu etanolu i pozostawić w temperaturze pokojowej na 1-2 godziny. Odwirować w temperaturze 24 °C, 9 000 x g przez 5 minut, odrzucić supernatant, odessać nadmiar roztworu etanolu i suszyć na powietrzu przez 5 minut.</li>
		<li>Dodać 100 μl sterylnej wody do rozpuszczenia, zmierzyć stężenie DNA za pomocą spektrofotometru i zamrozić w zamrażarce o temperaturze -4 °C do długotrwałego przechowywania.</li>
		<li>Skonfiguruj system reakcji RT-PCR. Przygotować następującą mieszaninę reakcyjną na 10 μl zawierającą 5 μl 2x PCRMix, po 0,25 μl startera do przodu i do tyłu, 1 μl DNA (100 ng / μl) i 3,5 μl H2O.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Skonfiguruj program PCR zgodnie z tabelą 1. Program PCR dla wszystkich izoform wynosił 95 °C przez 5 min 32x (95 °C przez 30 s, 55 °C przez 30 s i 72 °C przez 1 min) i 72 °C przez 5 min. Rozdziel produkty na 1,5% żelach agarozowych TAE i sfotografuj9. Zweryfikuj określony genotyp S za pomocą genomowego DNA.</li>
</ol>

<ol><li>Matsumoto, D., Tao, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+of+S-RNases+by+an+S+locus+F-box+like+protein+and+an+S+haplotype-specific+F-box+like+protein+in+the+Prunus-specific+self-incompatibility+system%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Recognition of S-RNases by an S locus F-box like protein and an S haplotype-specific F-box like protein in the Prunus-specific self-incompatibility system.</a> Plant Molecular Biology. 100 (4-5), 367-378 (2019).</li>
<li>Goldberg, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Species+selection+maintains+self-incompatibility%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Species selection maintains self-incompatibility.</a> Science. 330 (6003), 493-495 (2010).</li>
<li>Zhang, L., Wang, R., Zhao, G., Wang, A., Lin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+on+fruit+quality+of+Guangfeng+Ma+jia+pummelo+and+Pinghe+red+pummelo%5BTitle%5D)+AND+%22China+Agricultural+Science+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Comparative study on fruit quality of Guangfeng Ma jia pummelo and Pinghe red pummelo.</a> China Agricultural Science Bulletin. 37 (22), 126-130 (2021).</li>
<li>Min, H. E., Chao, G. U., Juyou, W. U., Shaoling, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+on+self-incompatibility+mechanism+in+fruit+trees%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Horticulturae+Sinica%22%5BJournal%5D)">Recent advances on self-incompatibility mechanism in fruit trees.</a> Acta Horticulturae Sinica. 48 (4), 759-777 (2021).</li>
<li>Fujii, S., Kubo, K., Takayama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-self-+and+self-recognition+models+in+plant+self-incompatibility%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Plants%22%5BJournal%5D)">Non-self- and self-recognition models in plant self-incompatibility.</a> Nature Plants. 2 (9), 2-9 (2016).</li>
<li>Meng, X., Sun, P., Kao, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S-RNase-based+self-incompatibility+in+Petunia+inflata%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Botany%22%5BJournal%5D)">S-RNase-based self-incompatibility in Petunia inflata.</a> Annals of Botany. 108 (4), 637-646 (2011).</li>
<li>Liang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+self-compatibility+by+a+mutant+Sm-RNase+in+citrus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Plants%22%5BJournal%5D)">Evolution of self-compatibility by a mutant Sm-RNase in citrus.</a> Nature Plants. 6 (2), 131-142 (2020).</li>
<li>Thomas, S. G., Franklin-Tong, V. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-incompatibility+triggers+programmed+cell+death+in+Papaver+pollen%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Self-incompatibility triggers programmed cell death in Papaver pollen.</a> Nature. 429, 305-309 (2004).</li>
<li>Hu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Downregulated+expression+of+S2-RNase+attenuates+self-incompatibility+in+%26%2334%3BGuiyou+No.+1%26%2334%3B+pummelo%5BTitle%5D)+AND+%22Horticulture+Research%22%5BJournal%5D)">Downregulated expression of S2-RNase attenuates self-incompatibility in &#34;Guiyou No. 1&#34; pummelo.</a> Horticulture Research. 8 (1), 199(2021).</li>
<li>Guo, H., Halitschke, R., Wielsch, N., Gase, K., Baldwin, I. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mate+selection+in+self-compatible+wild+tobacco+results+from+coordinated+variation+in+homologous+self-Incompatibility+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Mate selection in self-compatible wild tobacco results from coordinated variation in homologous self-Incompatibility genes.</a> Current Biology. 29 (12), 2020-2030 (2019).</li>
<li>Sun, P., Li, S., Lu, D., Williams, J. S., Kao, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pollen+S-locus+F-box+proteins+of+petunia+involved+in+S-RNase-based+self-incompatibility+are+themselves+subject+to+ubiquitin-mediated+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Pollen S-locus F-box proteins of petunia involved in S-RNase-based self-incompatibility are themselves subject to ubiquitin-mediated degradation.</a> The Plant Journal. 83 (2), 213-223 (2015).</li>
<li>Hua, Z., Kao, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+components+of+a+putative+petunia+S-locus+F-box-containing+E3+ligase+complex+involved+in+S-RNase-based+self-incompatibility%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of components of a putative petunia S-locus F-box-containing E3 ligase complex involved in S-RNase-based self-incompatibility.</a> Plant Cell. 18 (10), 2531-2553 (2006).</li>
<li>Entani, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin-proteasome-mediated+degradation+of+S-RNase+in+a+solanaceous+cross-compatibility+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin-proteasome-mediated degradation of S-RNase in a solanaceous cross-compatibility reaction.</a> The Plant Journal. 78 (6), 1014-1021 (2014).</li>
<li>Abdallah, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+self-incompatibility+and+genetic+diversity+in+diploid+and+hexaploid+plum+genotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Analysis of self-incompatibility and genetic diversity in diploid and hexaploid plum genotypes.</a> Frontiers in Plant Science. 10, 896(2019).</li>
<li>Herrera, S., Lora, J., Hormaza, J. I., Herrero, M., Rodrigo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+production+in+the+new+generation+of+apricot+cultivars%3A+self-incompatibility%2C+S-RNase+allele+identification%2C+and+incompatibility+group+assignment.+%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Optimizing production in the new generation of apricot cultivars: self-incompatibility, S-RNase allele identification, and incompatibility group assignment. </a> Frontiers in Plant Science. 9, 527(2018).</li>
<li>Yuan, S. C., Chin, S. W., Lee, C. Y., Chen, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phalaenopsis+pollinia+storage+at+sub-zero+temperature+and+its+pollen+viability+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Botanical+Studies%22%5BJournal%5D)">Phalaenopsis pollinia storage at sub-zero temperature and its pollen viability assessment.</a> Botanical Studies. 59 (1), 1(2018).</li>
<li>Liang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+evolution+of+genes+related+to+self-incompatibility+in+citrus%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Identification and evolution of genes related to self-incompatibility in citrus.</a> , Huazhong Agricultural University. Wu'han, China. PhD Thesis (2019).</li>
<li>Cheng, Y. J., Guo, W. W., Yi, H. L., Pang, X. M., Deng, X. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+protocol+for+genomic+DNA+extraction+from+Citrus+species%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Molecular+Biology+Reporter%22%5BJournal%5D)">An efficient protocol for genomic DNA extraction from Citrus species.</a> Plant Molecular Biology Reporter. 21 (2), 177-178 (2003).</li>
<li>Wei, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+S-genotypes+of+63+pummelo+germplasm+resources%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Horticulturae+Sinica%22%5BJournal%5D)">Identification of S-genotypes of 63 pummelo germplasm resources.</a> Acta Horticulturae Sinica. 49 (5), 1111-1120 (2021).</li>
<li>de Nettancourt, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incompatibility+in+angiosperms%5BTitle%5D)+AND+%22Sexual+Plant+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Incompatibility in angiosperms.</a> Sexual Plant Reproduction. 10, 185-199 (1997).</li>
<li>Igic, B., Lande, R., Kohn, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+self-incompatibility+and+its+evolutionary+consequences%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Plant+Sciences%22%5BJournal%5D)">Loss of self-incompatibility and its evolutionary consequences.</a> International Journal of Plant Sciences. 169 (1), 93-104 (2008).</li>
<li>Guerrero, B. I., Guerra, M. E., Rodrigo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+pollination+requirements+in+Japanese+plum+by+phenological+monitoring%2C+hand+pollinations%2C+fluorescence+microscopy+and+molecular+genotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Establishing pollination requirements in Japanese plum by phenological monitoring, hand pollinations, fluorescence microscopy and molecular genotyping.</a> Journal of Visualized Experiments. (165), e61897(2020).</li>
<li>Herrera, S., Lora, J., Hormaza, J. I., Rodrigo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+self-+and+inter-%28in%29compatibility+relationships+in+apricot+combining+hand-pollination%2C+microscopy+and+genetic+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Determination of self- and inter-(in)compatibility relationships in apricot combining hand-pollination, microscopy and genetic analyses.</a> Journal of Visualized Experiments. (160), e60241(2020).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają nic do ujawnienia.

W uprawach owocowych zarówno partenokarpia, jak i SI są ważnymi cechami, ponieważ torują drogę do owoców bezpestkowych - cecha ta jest bardzo ceniona przez konsumentów. Samoniezgodność sprzyja odrzuceniu własnego pyłku, a tym samym zapobiega chowowi wsobnemu20. Wśród cytrusów pummelo jest odmianą niekompatybilną7. Prawie 40% wszystkich gatunków okrytozalążkowych wykazuje SI21. Ta cecha zapobiega zawiązywaniu się owoców, obniża plony i przynosi hodowc...

Niezgodność (SI) jest genetycznie kontrolowanym mechanizmem obecnym u około 40% gatunków roślin okrytozalążkowych. W tym procesie słupek odrzuca pyłek z rośliny o tym samym genotypie SI, a tym samym zapobiega samozapłodnieniu1,2. Ma jia pummelo to lokalna odmiana w prowincji Jinagsu w Chinach, o doskonałych właściwościach dużych, różowych owoców, bogatej zawartości soku, słodko-kwaśnym smaku i grubej skórce3. Chociaż SI sprzyja krzyżowaniu zewnętrznemu, negatywnie wpływa na plon i jakość owoców4 i wymaga odpowiednich drzew zapylających o różnych genotypach SI w celu uzyskania niezawodnych wskaźników zawiązywania owoców i wysokich plonów. Obecnie istnieją dwa główne typy SI: samoniezgodność sporofityczna (SSI), reprezentowana przez Brassicaceae, oraz samoniezgodność gametofityczna (GSI), reprezentowana przez Rosaceae, Papaveraceae, Rutaceae i Solanaceae5,6,7,8.
Cytrusy to jedna z najważniejszych upraw owocowych na świecie. System GSI oparty na S-RNazie znajduje się w wielu odmianach cytrusów i negatywnie wpływa na szybkość zawiązywania owoców9. W tym systemie SI jest kontrolowany przez locus S, pojedynczy polimorficzny locus z dwoma złożonymi allelami, które przenoszą determinanty słupka S i determinanty S pyłku7. Żeńskim wyznacznikiem jest rybonukleaza S (S-RNaza), a wyznacznikiem męskim jest locus S F-box (SLF)7. Komórki słupka wydzielają białka S-RNazy. Nie-własne S-RNazy są rozpoznawane przez białka SLF, co prowadzi do ubikwitynacji i degradacji nie-własnych S-RNaz przez szlak proteasomu 26S. W przeciwieństwie do tego, własne S-RNazy są w stanie gromadzić i hamować wzrost łagiewki pyłkowej (PT), ponieważ unikają białek SLF, a zatem są chronione przed ubikwitynizacją10,11,12,13.
Tutaj opisujemy technikę in vivo, która jest przydatna do identyfikacji genotypów S oraz stopni zgodności i niezgodności pyłku. Protokół polega na ekstrakcji całkowitego DNA z liści i przewidywaniu genotypu S za pomocą starterów specyficznych dla S. Co więcej, barwienie błękitem anilinowym i mikroskopia fluorescencyjna, a następnie zapylanie ręczne, dostarczają dowodów na stopień zgodności i niezgodności. Procedura zapylania semi in vivo, która polega na ręcznym zapylaniu kwiatów w laboratorium14,15, została również dostosowana do oceny stopnia samozgodności i niezgodności. Zastosowaliśmy jednak również zapylanie w terenie, a następnie pakowanie kwiatów w worki, aby uniknąć zanieczyszczenia niepożądanym pyłkiem, aby umożliwić rozwój łagiewki pyłkowej w warunkach naturalnych. Protokół ten jest prosty i nieskomplikowany i dostarcza informacji niezbędnych do pomyślnego wyboru odpowiednich drzew zapylających.

<table><tbody><tr><td>etanol absolutny</td><td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td><td>10009218</td><td></td></tr><tr><td>Błękit anilinowy</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kwas borowy, H3BO3</td><td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td><td>10004818</td><td></td></tr><tr><td>Brązowa butelka</td><td>Labgic Technology Co., Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Azotan wapnia tetrahydrat, Ca(NO3 )2</td><td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td><td>80029062</td><td></td></tr><tr><td>Rurka odśrodkowa</td><td>Labgic Technology Co., Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>probówki wirówkowe</td><td>Labgic Technology Co., Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CTAB</td><td>GEN-VIEW SCIENTIFIC INC</td><td>57-09-0(CAS)</td><td></td></tr><tr><td>Upuszczanie</td><td>Jiangsu Songchang Sprzęt medyczny Co., Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kwas etylenodiaminotetraoctowy, EDTA</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10009617</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td>LUXIANZI Biotechnology Co., Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>formaldehyd</td><td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td><td>10010018</td><td></td></tr><tr><td>W pełni automatyczny szybki młynek do próbek</td><td>Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd</td><td>Tissuelyser-96</td><td></td></tr><tr><td>lodowaty kwas</td> <td>octowySinopharm Chemical ReodagentCo., Ltd</td><td>10000218</td><td></td></tr><tr><td>Rura szlifierska</td><td>Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alkohol izoamylowy</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10003218</td><td></td></tr><tr><td>Alkohol izopropylowy</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>80109218</td><td></td></tr><tr><td>etykieta</td><td>M& G Chenguang Stationery Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica DMi8</td><td>Shanghai Leica Co., Ltd</td><td>21903797</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan magnezu siedmiowodny, MgSO4</td><td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td><td>10013018</td><td></td></tr><tr><td>MIKROSKOP Szkło osłonowe</td><td>Zhejiang Shitai Industrial Co., Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10019318</td><td></td></tr><tr><td>spinacze do papieru</td><td>M& G Chenguang Stationery Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ołówek</td><td>M& G Chenguang Stationery Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr>szczotka <td>do zapylania</td><td>Shanghai Yimei Plastics Co., Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glikol polietylenowy, PEG 6000</td><td>Pekin Dingguo Changsheng Biotechnology Co., Ltd</td><td>DH229-1</td><td></td></tr><tr><td>Glikol polietylenowy, PEG-4000</td><td>Guangzhou saiguo biotech Co., Ltd</td><td>1521GR500</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek potasu, KOH</td><td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td><td>10017008</td><td></td></tr><tr><td>Azotan potasu, KNO3</td><td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td><td>10017218</td><td></td></tr><tr><td>Skalpel</td><td>Jiangsu Songchang Medical Equipment Co., Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Slide</td><td>Zhejiang Shitai Industrial Co., Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu, NAOH</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10019718</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td><td></td><td></td>10021418</tr><tr><td>papier siarczanowy</td> Łaźnia wodna <td>termostatu Taizhou Jinnong Mesh Factory</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Shanghai Jinghong Experimental Equipment Co., Ltd</td><td>L-909193</td><td></td></tr><tr><td>Trichlorometan</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10006818</td><td></td></tr><tr><td>Trójwodny fosforan tripotasowy, K3PO4</td><td>Shanghai Lingfeng Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>20032318</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>GEN-VIEW SCIENTIFIC INC</td><td>1185-53-1</td><td></td></tr><tr><td>torby z zamkiem błyskawicznym</td><td>M& G Chenguang Stationery Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Merkaptoetanol</td><td>GEN-VIEW SCIENTIFIC INC</td><td>60-24-2(CAS)</td><td></td></tr></tbody></table>

określanie relacji samo(nie)zgodności i między (nie)zgodnością w cytrusach za pomocą ręcznego zapylania, mikroskopii i analiz genotypu s

Determination of Self-(In)compatibility and Inter-(In)compatibility Relationships in Citrus Using Manual Pollination, Microscopy, and S-Genotype Analyses

Citrus wykorzystuje samoniezgodność opartą na S-RNazie do odrzucania własnego pyłku i dlatego wymaga pobliskich drzew zapylających do udanego zapylania i nawożenia. Jednak identyfikacja odpowiednich odmian, które mogą służyć jako zapylacze, jest czasochłonnym procesem. Aby rozwiązać ten problem, opracowaliśmy szybką metodę identyfikacji odmian cytrusów kompatybilnych z zapylaniem, która wykorzystuje elektroforezę w żelu agarozowym i barwienie błękitem anilinowym. Zgodność pyłków określa się na podstawie identyfikacji genotypów S poprzez ekstrakcję całkowitego DNA i przeprowadzenie testów genotypowania opartych na PCR ze specyficznymi starterami. Dodatkowo style zbiera się 3-4 dni po ręcznym zapyleniu i wykonuje się barwienie na niebiesko aniliną. Na koniec stan wzrostu łagiewek pyłkowych obserwuje się za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Zgodność i niezgodność pyłków można ustalić, obserwując, czy wzrost łagiewki pyłkowej jest odpowiednio normalny, czy stłumiony. Ze względu na swoją prostotę i opłacalność metoda ta jest skutecznym narzędziem do określania zgodności i niezgodności pyłku różnych odmian cytrusów w celu ustalenia grup niezgodności i relacji niezgodności między różnymi odmianami. Metoda ta dostarcza informacji niezbędnych do pomyślnego wyboru odpowiednich drzew zapylających, a tym samym ułatwia zakładanie nowych sadów i wybór odpowiednich rodziców do programów hodowlanych.

Do przeprowadzonych tutaj doświadczeń wybrano dojrzałe kwiaty, zebrano pręciki, wysuszono je w piekarniku, a następnie kiełkowano pyłek w temperaturze 28°C przez 12 h. Żywotność i wskaźniki kiełkowania pyłku określono ilościowo, zgodnie z przedstawieniem na Rysunku 1.
Cytrusy zostały zapylone ręcznie, a kompatybilność i niekompatybilność pyłku oceniono za pomocą barwienia błękitem anilinowym i mikroskopii fluorescencyjnej. Kompatybilny pyłek mógł kiełkować na powi...

Ten protokół zapewnia szybką metodę określania zgodności i niezgodności pyłków w odmianach cytrusowych.

Określanie relacji samo(nie)zgodności i między (nie)zgodnością w cytrusach za pomocą ręcznego zapylania, mikroskopii i analiz genotypu S

Citrus uses S-RNase-based self-incompatibility to reject self-pollen and, therefore, requires nearby pollinizer trees for successful pollination and ...

https://cloudfront.jove.com/CDNSource/teasers/65056.jpg

Technika ta może skutecznie zidentyfikować genotyp S i dokładnie zidentyfikować samoniezgodność cytrusów, dostarczając niezbędnych informacji do wyboru odpowiednich drzew zapylających. Jest to efektywna czasowo, prosta i niezawodna technika wyboru odpowiednich drzew rodzicielskich w programach hodowlanych. Ta technika jest prosta i łatwa do wykonania, a eksperymentowanie po raz pierwszy wymaga cierpliwości i troski.Identyfikacja genotypu S i projektowanie starterów specyficznych dla S wymaga większej uwagi i troski. Procedurę zademonstruje Yu Hu, doktorant z mojego laboratorium. Rozpocznij zbieranie pyłku, zabierając kwiaty Majia pomelo, Citrus maxima, do laboratorium.Zbierz pylniki za pomocą pęsety i umieść je na szalce Petriego zawierającej bibułę filtracyjną. Wysuszyć ziarna pyłku, umieszczając szalkę Petriego zawierającą pylniki w piekarniku o temperaturze 28 stopni Celsjusza na 24 godziny. Po wyschnięciu zachowaj pyłek w hermetycznej torbie Micro Centron z zamkiem błyskawicznym zawierającej zmieniający kolor żel krzemionkowy.Zamknij worek i oznacz go nazwą odmiany pyłku oraz datą przechowywania. Wlej 300 mikrolitrów płynnego podłoża do nakrętki dwumililitrowej probówki wirówkowej i równomiernie rozsyp pyłek za pomocą pędzla do zapylania. Umieść pyłek w nawilżonym czarnym pudełku i inkubuj w temperaturze 28 stopni Celsjusza przez 12 godzin.Po inkubacji odetnij górną jednomilimetrową końcówkę z końcówki pipety o pojemności 1 000 mikrolitrów i odessaj pyłek niewielką ilością roztworu hodowlanego. Umieść pyłek na środku szkiełka mikroskopowego i przykryj go szkiełkiem nakrywkowym. Po zakończeniu obserwuj próbkę za pomocą odwróconego mikroskopu za pomocą obiektywu 10X.Wykonać trzy niezależne powtórzenia, stosując w przybliżeniu tę samą gęstość pyłku dla każdej kontrpróby. Do zapylania użyj pędzla do zapylania, aby rozprowadzić wystarczającą ilość żywego pyłku na powierzchni znamienia, upewniając się, że nie uszkodzisz słupka. Przykryj zapylone kwiaty papierową torbą siarczanową i zapobiegaj zapylaniu przez genotypowo odrębne pyłki, uszczelniając torebkę za pomocą spinacza do papieru.Na etykiecie napisz nazwę gatunku oraz liczbę i czas zapylenia. Zawieś etykietę na gałęziach w pobliżu zapylanych kwiatów. Usuń worki do zapylania około trzech do czterech dni po zapyleniu i zbierz zapylone kwiaty w torebkach z zamkiem błyskawicznym.Natychmiast usuń płatki, pojemniki i jajniki z kwiatów i zanurz znamię połączone w celu stylizacji w probówce wirówkowej zawierającej świeżo przygotowany roztwór utrwalający. Inkubuj znamię i styl w roztworze utrwalającym przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego dnia wyrzuć roztwór utrwalający przed umyciem znamienia i ułóż dwa do trzech razy w 95% etanolu.Następnie dodaj 70% roztwór etanolu do fryzury, upewniając się, że próbka jest całkowicie zanurzona w roztworze. Style na tym etapie można przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez jeden do dwóch miesięcy. W przypadku barwienia błękitem anilinowym należy umyć próbki stylu przechowywane w 70% etanolu wodą destylowaną trzy do czterech razy.Zanurz go w czteromolowym roztworze wodorotlenku sodu i zamknij przed inkubacją w łaźni wodnej o temperaturze 65 stopni Celsjusza przez 60 minut. Na tym etapie kolor stylu zmienia się z żółto-białego na pomarańczowo-czerwony. Następnie namocz style w wodzie destylowanej.Po 30 minutach wylej wodę destylowaną i umyj style wodą destylowaną trzy do czterech razy lub do momentu, gdy kolor stylu stanie się żółty. Następnie dodaj błękit anilinowy, aż próbka zostanie zanurzona i inkubuj przez 12 godzin w ciemności. Obserwuj wzrost łagiewki pyłkowej pod mikroskopem fluorescencyjnym.Umieść szkiełko na płaskim stole. Podziel styl na dwie połówki wzdłuż osi podłużnej za pomocą skalpela. Umieść połowę stylu na szkiełku podstawowym i dodaj dwie do trzech kropli glikolu polietylenowego na powierzchnię szkiełka.Następnie przykryj go szkiełkiem nakrywkowym. Po zakończeniu umieść szkiełko na stoliku mikroskopu nad aperturą i wizualizuj za pomocą obiektywu 10X. Użyj filtra DAPI i obserwuj wzrost łagiewki pyłkowej.Obserwuj pięć stylów dla każdego rodzaju zapylania. Żywotność pyłku Citrus maxima i szybkość kiełkowania określono ilościowo za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Zgodny pyłek z powodzeniem wykiełkował na powierzchni znamienia i wytworzył normalną łagiewkę pyłkową, która rosła i ostatecznie doprowadziła do zapłodnienia w jajniku.W przeciwieństwie do tego, niekompatybilne łagiewki pyłkowe rosły przez około 2/3 stylu, a następnie przestały rosnąć. Elektroforeza w żelu agarozowym wykryła produkt DNA amplifikowany przy użyciu starterów specyficznych dla locus S. Wykazał on amplifikację produktu DNA między 500 a 1000 par zasad.Zidentyfikowano odpowiadający mu genotyp S. Za pomocą tej metody zidentyfikowano 21 haplotypów S w różnych gatunkach cytrusów. Etap zapylania ma kluczowe znaczenie.Tylko udane zapylenie może zapewnić późniejszą obserwację łagiewki pyłkowej. Technika ta została wykorzystana do analizy cech samoniezgodności oraz do zbadania i zidentyfikowania żeńskich determinantów samoniezgodności. Ta metoda jest ważna dla badań nad samoniezgodnością i programów hodowlanych.Może również ułatwić społeczności rolniczej wybór drzew zapylających do ich sadów.

determination-self-compatibility-inter-compatibility-relationships

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opracowaliśmy metodologię przeprowadzania krzyżówek w Setaria viridis (S. viridis).  Metoda polega na przycięciu wiechy przed zabiegiem gorącej wody w celu zabicia żywotnego pyłku.  Krzyżówki są wykonywane zgodnie z dobrze kontrolowanym reżimem wzrostu i zazwyczaj skutkują odzyskaniem od 1 do 7 nasion zapylonych krzyżowo na wiechę.

Metody wykonywania krzyżówek w Setaria viridis, nowym systemie modelowym dla traw

Aby odkryć skuteczność zapylaczy danego gatunku roślin, opracowano wiele metod eksperymentów polowych. W pracy przedstawiono podstawowe metody eksperymentów terenowych w ekologii zapylania na przykładzie Lycoris sanguinea var. sanguinea oraz nowego mechanizmu zapylania, zapylania przez pękające pąki.

Eksperymenty terenowe ekologii zapylania: przypadek Lycoris sanguinea var. sanguinea

W tym protokole, metody przeprowadzania krzyżówek wsobnych i oceny sukcesu tych krzyżówek, są opisane dla mrówki Vollenhovia emeryi. Protokoły te są ważne dla eksperymentów mających na celu zrozumienie genetycznych podstaw systemów determinacji płci u błonkoskrzydłych.

Indukcja i ocena krzyżówek wsobnych z wykorzystaniem mrówki, Vollenhovia emeryi

Tutaj prezentujemy protokół wymuszający kwitnienie drzew mandarynkowych w warunkach fitotronu. Stres wodny, wysokie natężenie oświetlenia i symulowany wiosenny fotoperiod pozwoliły na uzyskanie żywotnych kwiatów w krótkim czasie. Ta metodologia pozwala naukowcom na kilka okresów kwitnienia w ciągu 1 roku.

Wymuszone kwitnienie drzew mandarynkowych w warunkach fitotronowych

Pokazujemy metodę określania udanego lub nieudanego zapłodnienia na podstawie morfologii jądra plemnika w podwójnym zapłodnieniu Arabidopsis za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego.

Ocena stanu zapłodnienia poprzez śledzenie morfologii jądra plemnika w podwójnym zapłodnieniu Arabidopsis

Przedstawiamy metodologię ustalania wymagań dotyczących zapylania odmian moreli (Prunus armeniaca L.), łącząc określenie samo(nie)zgodności za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z identyfikacją genotypu S za pomocą analizy PCR.

Określenie relacji między sobą i między (nie)zgodnością w moreli za pomocą zapylania ręcznego, mikroskopii i analiz genetycznych

Opisano metodologię określania wymagań dotyczących zapylania w mieszańcach japońskich śliwek, która łączy polowe i laboratoryjne zapylenia oraz obserwacje łagiewek pyłkowych pod mikroskopią fluorescencyjną z identyfikacją genotypów S metodą PCR i monitorowaniem kwitnienia w celu wyboru zapylaczy.

Ustalenie wymagań dotyczących zapylania śliwki japońskiej poprzez monitorowanie fenologiczne, zapylanie ręczne, mikroskopię fluorescencyjną i genotypowanie molekularne

W tej pracy opisana jest solidna metoda ilościowego oznaczania efektywności krycia drożdży Saccharomyces cerevisiae. Metoda ta jest szczególnie przydatna do ilościowego oznaczania barier przedzygotycznych w badaniach specjacji.

Oznaczanie efektywności krycia haploidów u Saccharomyces cerevisiae

Ulepszona metoda pomiaru profili nawodnienia pyłku u Arabidopsis thaliana jest opisana tutaj. Nowa metoda oferuje wyższą rozdzielczość, jest nieinwazyjna i wysoce odtwarzalna. Protokół stanowi nowe narzędzie do dokładniejszej analizy procesów regulujących wczesne etapy zapylania.

Jednoziarnisty test biologiczny uwodnienia pyłku in vivo o wysokiej rozdzielczości dla Arabidopsis thaliana

W niniejszym opracowaniu opisano procedurę stosowaną w Grupie Biologii Strukturalnej i Funkcjonalnej Białek Błonowych Caffreya w celu ręcznego przygotowania prób krystalizacji białek błonowych w mezofazach lipidowych.

Krystalizacja białek błonowych do wyznaczania struktury z wykorzystaniem mezofaz lipidowych

Poznaj metodę identyfikacji genotypu S i niezgodności własnej u cytrusów Citrus maxima za pomocą mikroskopii i analizy DNA. Technika ta wspomaga hodowców w selekcji odpowiednich drzew zapylających.

Określanie relacji samo(nie)zgodności i między (nie)zgodnością w cytrusach za pomocą ręcznego zapylania, mikroskopii i analiz genotypu S (Wideo) | JoVE Journal

Określanie relacji samo(nie)zgodności i między (nie)zgodnością w cytrusach za pomocą ręcznego zapylania, mikroskopii i analiz genotypu S

Przeglądaj więcej filmów