Określanie relacji samo(nie)zgodności i między (nie)zgodnością w cytrusach za pomocą ręcznego zapylania, mikroskopii i analiz genotypu S

Technika ta może skutecznie zidentyfikować genotyp S i dokładnie zidentyfikować samoniezgodność cytrusów, dostarczając niezbędnych informacji do wyboru odpowiednich drzew zapylających. Jest to efektywna czasowo, prosta i niezawodna technika wyboru odpowiednich drzew rodzicielskich w programach hodowlanych. Ta technika jest prosta i łatwa do wykonania, a eksperymentowanie po raz pierwszy wymaga cierpliwości i troski.

Identyfikacja genotypu S i projektowanie starterów specyficznych dla S wymaga większej uwagi i troski. Procedurę zademonstruje Yu Hu, doktorant z mojego laboratorium. Rozpocznij zbieranie pyłku, zabierając kwiaty Majia pomelo, Citrus maxima, do laboratorium.

Zbierz pylniki za pomocą pęsety i umieść je na szalce Petriego zawierającej bibułę filtracyjną. Wysuszyć ziarna pyłku, umieszczając szalkę Petriego zawierającą pylniki w piekarniku o temperaturze 28 stopni Celsjusza na 24 godziny. Po wyschnięciu zachowaj pyłek w hermetycznej torbie Micro Centron z zamkiem błyskawicznym zawierającej zmieniający kolor żel krzemionkowy.

Zamknij worek i oznacz go nazwą odmiany pyłku oraz datą przechowywania. Wlej 300 mikrolitrów płynnego podłoża do nakrętki dwumililitrowej probówki wirówkowej i równomiernie rozsyp pyłek za pomocą pędzla do zapylania. Umieść pyłek w nawilżonym czarnym pudełku i inkubuj w temperaturze 28 stopni Celsjusza przez 12 godzin.

Po inkubacji odetnij górną jednomilimetrową końcówkę z końcówki pipety o pojemności 1 000 mikrolitrów i odessaj pyłek niewielką ilością roztworu hodowlanego. Umieść pyłek na środku szkiełka mikroskopowego i przykryj go szkiełkiem nakrywkowym. Po zakończeniu obserwuj próbkę za pomocą odwróconego mikroskopu za pomocą obiektywu 10X.

Wykonać trzy niezależne powtórzenia, stosując w przybliżeniu tę samą gęstość pyłku dla każdej kontrpróby. Do zapylania użyj pędzla do zapylania, aby rozprowadzić wystarczającą ilość żywego pyłku na powierzchni znamienia, upewniając się, że nie uszkodzisz słupka. Przykryj zapylone kwiaty papierową torbą siarczanową i zapobiegaj zapylaniu przez genotypowo odrębne pyłki, uszczelniając torebkę za pomocą spinacza do papieru.

Na etykiecie napisz nazwę gatunku oraz liczbę i czas zapylenia. Zawieś etykietę na gałęziach w pobliżu zapylanych kwiatów. Usuń worki do zapylania około trzech do czterech dni po zapyleniu i zbierz zapylone kwiaty w torebkach z zamkiem błyskawicznym.

Natychmiast usuń płatki, pojemniki i jajniki z kwiatów i zanurz znamię połączone w celu stylizacji w probówce wirówkowej zawierającej świeżo przygotowany roztwór utrwalający. Inkubuj znamię i styl w roztworze utrwalającym przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego dnia wyrzuć roztwór utrwalający przed umyciem znamienia i ułóż dwa do trzech razy w 95% etanolu.

Następnie dodaj 70% roztwór etanolu do fryzury, upewniając się, że próbka jest całkowicie zanurzona w roztworze. Style na tym etapie można przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez jeden do dwóch miesięcy. W przypadku barwienia błękitem anilinowym należy umyć próbki stylu przechowywane w 70% etanolu wodą destylowaną trzy do czterech razy.

Zanurz go w czteromolowym roztworze wodorotlenku sodu i zamknij przed inkubacją w łaźni wodnej o temperaturze 65 stopni Celsjusza przez 60 minut. Na tym etapie kolor stylu zmienia się z żółto-białego na pomarańczowo-czerwony. Następnie namocz style w wodzie destylowanej.

Po 30 minutach wylej wodę destylowaną i umyj style wodą destylowaną trzy do czterech razy lub do momentu, gdy kolor stylu stanie się żółty. Następnie dodaj błękit anilinowy, aż próbka zostanie zanurzona i inkubuj przez 12 godzin w ciemności. Obserwuj wzrost łagiewki pyłkowej pod mikroskopem fluorescencyjnym.

Umieść szkiełko na płaskim stole. Podziel styl na dwie połówki wzdłuż osi podłużnej za pomocą skalpela. Umieść połowę stylu na szkiełku podstawowym i dodaj dwie do trzech kropli glikolu polietylenowego na powierzchnię szkiełka.

Następnie przykryj go szkiełkiem nakrywkowym. Po zakończeniu umieść szkiełko na stoliku mikroskopu nad aperturą i wizualizuj za pomocą obiektywu 10X. Użyj filtra DAPI i obserwuj wzrost łagiewki pyłkowej.

Obserwuj pięć stylów dla każdego rodzaju zapylania. Żywotność pyłku Citrus maxima i szybkość kiełkowania określono ilościowo za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Zgodny pyłek z powodzeniem wykiełkował na powierzchni znamienia i wytworzył normalną łagiewkę pyłkową, która rosła i ostatecznie doprowadziła do zapłodnienia w jajniku.

W przeciwieństwie do tego, niekompatybilne łagiewki pyłkowe rosły przez około 2/3 stylu, a następnie przestały rosnąć. Elektroforeza w żelu agarozowym wykryła produkt DNA amplifikowany przy użyciu starterów specyficznych dla locus S. Wykazał on amplifikację produktu DNA między 500 a 1000 par zasad.

Zidentyfikowano odpowiadający mu genotyp S. Za pomocą tej metody zidentyfikowano 21 haplotypów S w różnych gatunkach cytrusów. Etap zapylania ma kluczowe znaczenie.

Tylko udane zapylenie może zapewnić późniejszą obserwację łagiewki pyłkowej. Technika ta została wykorzystana do analizy cech samoniezgodności oraz do zbadania i zidentyfikowania żeńskich determinantów samoniezgodności. Ta metoda jest ważna dla badań nad samoniezgodnością i programów hodowlanych.

Może również ułatwić społeczności rolniczej wybór drzew zapylających do ich sadów.