Name: Krystalizacja białek błonowych do określania struktury przy użyciu mezofaz lipidowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-21T17:00:00.000+00:00
Duration: 22 min
Description: Poznaj metodę krystalizacji białek błonowych w mezofazach lipidowych do badań strukturalnych. Technika ta umożliwia wyznaczanie struktury krystalograficznej kluczowych celów terapeutycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wiele osób przyczyniło się do powstania tej pracy, z czego większość to obecni i byli członkowie grupy Caffrey Membrane Structural and Functional Biology Group. Wszystkim im składamy najserdeczniejsze podziękowania i wyrazy uznania. Praca ta była częściowo finansowana z grantów Science Foundation Ireland (07/IN.1/B1836), National Institutes of Health (GM75915) oraz University of Limerick.

Ważnym obszarem zainteresowań w dziedzinie biologii strukturalnej i funkcjonalnej jest błona biologiczna (Rysunek 1). Błona, która otacza komórkę oraz obecne w niej organella subkomórkowe, jest strukturą o grubości molekularnej, składającą się z zaledwie dwóch warstw cząsteczek lipidów i usianą białkami. Interesująca jest struktura i funkcja zarówno lipidów, jak i białek. Niniejszy artykuł koncentruje się jednak wyłącznie na białkach błonowych.
Lepszego zrozumienia sposobu, w jaki białka błonowe funkcjonują na poziomie molekularnym, poszukuje się z dwóch powodów. Po pierwsze, daje to satysfakcję intelektualną z wiedzy o tym, jak one działają. Po drugie, znajomość mechanizmu działania białka zawsze stwarza perspektywę możliwości naprawy w przypadku jego nieprawidłowego funkcjonowania, a także poprawy lub nawet modyfikacji pod kątem konkretnych zastosowań. Projektowanie leków jest oczywistym rezultatem tego rodzaju prac. Jednym z podejść do ustalenia, jak białko błonowe działa na poziomie molekularnym, jest wyznaczenie jego struktury. Wiąże się to z ustaleniem położenia w przestrzeni trójwymiarowej wszystkich atomów, lub przynajmniej wszystkich atomów poza wodorem, które tworzą białko. Metodą, której używamy w tym celu, jest makromolekularna krystalografia rentgenowska (MX). Rycina 2 przedstawia przykład białka błonowego, którego struktura została wyznaczona za pomocą MX. Do przeprowadzenia MX wymagany jest kryształ białka o jakości dyfrakcyjnej.
Krystalografia makromolekularna obejmuje wiele etapów niezbędnych do wyznaczenia struktury, co zilustrowano na Ryc. 3. Typowo obejmują one identyfikację docelowego białka błonowego, a następnie jego produkcję, oczyszczanie i krystalizację. Pomiary dyfrakcyjne kryształu wykonuje się przy użyciu laboratoryjnego źródła promieniowania rentgenowskiego lub synchrotronu. Dane dyfrakcyjne są przetwarzane w celu uzyskania mapy gęstości elektronowej, do której następnie dopasowuje się model molekularny. Model po doprecyzowaniu może służyć do badania mechanizmu działania białka oraz do projektowania leków w oparciu o strukturę.
Celem niniejszego artykułu jest pokazanie, w jaki sposób otrzymujemy kryształy białek błonowych o jakości dyfrakcyjnej z wykorzystaniem mezofaz lipidowych, stosując tzw. metodę in meso. Niedawny przegląd tej metody oraz zakresu jej zastosowań znajduje się w Literaturze 1 (Caffrey, 2009). Szczegółowy protokół krok po kroku, który tutaj zastosujemy, opisano w Literaturze 2 (Caffrey i Cherezov, 2009).
Schemat blokowy podsumowujący etapy oraz czas wymagany do przygotowania próby krystalizacji białek błonowych in meso przedstawiono na Rysunku 4. Niniejszy artykuł obejmuje etapy ujęte w czerwonych liniach przerywanych.
Część 1: Przygotowanie płytek do krystalizacji
<ol>
 <li>Umieść zylanizowane szkiełko mikroskopowe na blacie roboczym.</li>
 <li>Zdejmij papierową warstwę ochronną z jednej strony paska perforowanej, dwustronnej taśmy dystansowej (dostępnej w handlu, patrz Tabela specyficznych odczynników i sprzętu poniżej).</li>
 <li>Przyklej taśmę stroną klejącą do powierzchni szkiełka.</li>
 <li>Docisnąć taśmę do szkiełka za pomocą wałka lub rolki. Aby chronić dno studni, między taśmę a wałek można włożyć folię aluminiową.</li>
 <li>Zdejmij drugą papierową warstwę ochronną z taśmy, aby odsłonić jej górną powierzchnię klejącą.</li>
 <li>Umieść poszczególne zylanizowane szkiełka nakrywki w bliskiej odległości od płytki, aby umożliwić szybkie i efektywne zamknięcie studni natychmiast po zakończeniu ich napełniania.</li>
</ol>
Część 2: Przygotowanie strzykawki z lipidami
<ol>
 <li>Umieścić lipid (najczęściej monooleinę) w bloku grzewczym w temperaturze 45 °C na 3 minuty, aby go stopić.</li>
 <li>Podczas topnienia lipidu przygotować dwie szczelne strzykawki Hamiltona o pojemności 100 μL do etapu mieszania lipidu z białkiem. Zdjąć teflonową tulejkę ze strzykawki, która będzie zawierać roztwór białka. Obok niej ustawić strzykawkę przeznaczoną do lipidu (pozostawiając na niej tulejkę).</li>
 <li>Podłączyć sprzęgało (patrz poniższa Tabela specyficznych odczynników i sprzętu oraz literatura 3 (Cheng et al., 1998)) do strzykawki z lipidem. Dokręcić sprzęgało do strzykawki palcami, unikając nadmiernego dokręcenia. Wyjąć tłok z korpusu strzykawki z lipidem.</li>
 <li>Należy pamiętać, że przed przejściem do kolejnego kroku lipid musi być stopiony. Ustawić pipetę na 30 μL i powoli pobrać około 30 μL stopionego lipidu. Powoli wprowadzić jak największą ilość stopionego lipidu do otwartego końca strzykawki, dbając o to, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza.</li>
 <li>Włożyć tłok do korpusu w taki sposób, aby stykał się ze stopionym lipidem, a następnie powoli przesuwać tłok w górę korpusu, trzymając strzykawkę pionowo, zgodnie z instrukcją w materiale wideo. Pęcherzyki powietrza, które mogły zostać przypadkowo uwięzione, powinny w tym procesie wypłynąć na powierzchnię i zostać usunięte.</li>
 <li>Starannie określić objętość lipidu w strzykawce, odczytując wartości z podziałki na korpusie strzykawki.</li>
 <li>Nasunąć tulejkę na igłę wystającą ze sprzęgała. Za pomocą tłoka wtłoczyć stopiony lipid w górę korpusu, a następnie powoli i delikatnie do igły znajdującej się wewnątrz sprzęgała.</li>
</ol>
Część 3: Przygotowanie strzykawki z białkiem
<ol>
 <li>Przed przystąpieniem do prób krystalizacji roztwór białka należy wirować z prędkością 14,000 g przez 5 do 10 minut w temperaturze 4 °C w celu usunięcia dużych agregatów. Należy wyjąć roztwór białka z lodu i pozwolić mu wyrównać temperaturę do temperatury pokojowej.</li>
 <li>Należy obliczyć objętość roztworu białka niezbędną do utworzenia fazy kubicznej przy pełnym uwodnieniu lub w bliskim mu stanie. Dla monooleiny w temperaturze 20 °C pełne uwodnienie wodą występuje przy wartości bliskiej 40 % wody (masowo), zgodnie z wykresem fazowym5 (Rysunek 5).</li>
 <li>Za pomocą strzykawki Hamiltona o pojemności 25 lub 50 μL należy pobrać wymaganą objętość roztworu białka. Następnie należy przenieść roztwór na teflonową końcówkę tłoka w cylindrze strzykawki z białkiem, dbając o uniknięcie pęcherzyków powietrza.</li>
 <li>Należy ostrożnie wyciągnąć igłę i zmierzyć objętość roztworu białka w strzykawce. Powinna ona odpowiadać wartości pobranej w poprzednim kroku.</li>
 <li>Należy powoli przesuwać roztwór białka w górę cylindra, aż zrówna się on z jego otwartym końcem.</li>
 <li>Strzykawkę z białkiem należy wkręcić w otwarty koniec sprzęgła przymocowanego do strzykawki z lipidem. Kluczowe jest, aby nie dokręcać urządzenia zbyt mocno. Zbyt silne dokręcenie zmontowanego urządzenia do mieszania na tym etapie uszkodzi tuleje i spowoduje wycieki. Zbyt słabe dokręcenie również doprowadzi do wycieków.</li>
</ol>
Część 4: Mieszanie roztworu białka z lipidem: tworzenie mezofazy
<ol>
 <li>Aby wymieszać zawartość, przesuń tłok po stronie białka w zmontowanym urządzeniu mieszającym do końca, używając kciuka lub palca wskazującego, aby wtłoczyć roztwór białka ze strzykawki z białkiem, przez sprzęgacz do strzykawki z lipidami.</li>
 <li>Następnie użyj tłoka po stronie lipidów, aby wtłoczyć zawartość strzykawki z lipidami z powrotem przez sprzęgacz do strzykawki z białkiem.</li>
 <li>Proces ten powtarzaj wielokrotnie; czasami wymagane jest nawet sto lub więcej przejść, aby uzyskać jednorodną mezofazę. Na początku mieszania ruch materiału w przód i w tył przez sprzęgacz może być nierównomierny, a czasami konieczne jest użycie dodatkowej siły, aby wymieszać zawartość. Początkowe mieszanie zazwyczaj wiąże się z pojawieniem się niejednorodnego zmętnienia w próbce. W miarę postępu homogenizacji tekstura staje się bardziej jednolita i charakterystyczna dla lepkiej fazy kubicznej, podobnie jak wygląd wizualny powstającej mezofazy kubicznej.</li>
 <li>Jeśli warunki są odpowiednie i utworzy się faza kubiczna, dyspersja w cylindrze strzykawki powinna wydawać się optycznie przezroczysta. W związku z tym oznaczenia na cylindrze strzykawki powinny być wyraźnie widoczne przez znajdującą się w nim mezofazę.</li>
 <li>Bardzo delikatne schłodzenie próbki podczas mieszania poprzez umieszczenie mieszadła strzykawkowego na krótki czas na lodzie może przyspieszyć homogenizację i uzyskanie przezroczystości. Należy jednak uważać, aby nie schłodzić próbki zbyt mocno.</li>
 <li>Należy unikać ekstremalnie intensywnego mieszania, ponieważ może to spowodować wzrost temperatury próbki z powodu grzania tarcia3.</li>
</ol>
Część 5: Napełnianie dozownika
<ol>
 <li>Wyjmij igłę oraz tłok z 10-μL Strzykawka Hamiltona. Pozostaw zamontowaną tulejkę teflonową.</li>
 <li>Za pomocą małej monety zdejmij nakrętkę mocującą z dozownika.</li>
 <li>Przy całkowicie wycofanym ramieniu zapadkowym należy wsunąć strzykawkę – bez tłoka i igły – przez pierścień mocujący dozownika.</li>
 <li>Założyć nakrętkę mocującą, stroną z uszczelką w kierunku strzykawki, i mocno przykręcić ją do otwartego końca strzykawki. 
 Należy zadbać o to, aby strzykawka była odpowiednio wycentrowana w pierścieniu mocującym, a jej korpus znajdował się równolegle do ramienia zapadkowego. Oba parametry można ocenić wizualnie. Spełnienie tych dwóch warunków jest kluczowe dla uniknięcia wycieków.</li>
 <li>Przełożyć tłok przez pierścień zaciskowy, odkręcając nakrętkę zaciskową o kilka obrotów, a następnie wprowadzić tłok do otwartego końca strzykawki. W pełni docisnąć ramię zapadki. Wsunąć tłok do cylindra i sprawdzić, czy porusza się on swobodnie i osiowo wewnątrz cylindra. Aby ułatwić swobodne przemieszczanie się tłoka, można poluzować śrubę na prowadnicy. Należy upewnić się, że tłok porusza się bez oporu. Docisnąć tłok, aż jego teflonowa końcówka wyrówna się z punktem zero. μL skalowanie na tulei. Jeśli śruba na prowadnicy została poluzowana, należy ją ponownie dokręcić i sprawdzić, czy tłok porusza się swobodnie.</li>
 <li>Przesuń tłok po jednej stronie złożonej jednostki mieszającej do pozycji zero μL znacznika graduacji w celu przeniesienia mezofazy do drugiej strzykawki i łącznika.</li>
 <li>Odłącz pustą strzykawkę (z założonym tuleją) od jednostki mieszającej i natychmiast podłącz załadowaną strzykawkę – z dołączonym sprzęgaelem – do gwintowanego zakończenia 10-μL strzykawka dozująca. Stopień szczelności połączenia jest krytyczny, co zostało już zaznaczone.</li>
 <li>Napełnij strzykawkę dozującą, naciskając tłok strzykawki 100-μL strzykawkę w taki sposób, aby mezofaza przeszła przez sprzęgacz.</li>
 <li>Przymocuj krótką igłę o płaskim zakończeniu do stalowego zakończenia strzykawki dozującej i ostrożnie dokręć ją.</li>
 <li>Zaciśnij tłok w ramieniu zapadkowym, dokręcając nakrętkę w pierścieniu zaciskowym. Należy uważać, aby nie dokręcić nakrętki zbyt mocno, ponieważ może to spowodować zarysowanie i odkształcenie tłoka, co uczyni go niezdatnym do użytku. Ważne jest, aby zakres ruchu ramienia zapadkowego w pozycji zaciśniętej był ograniczony do maksymalnie jednej cala, tak jak pokazano w filmie. Po przekroczeniu tej wartości tłok może ulec wygięciu, co może doprowadzić do niepowodzenia podania.</li>
 <li>Kilkakrotnie naciśnij bęben zapadkowy, aby przesunąć tłok w cylindrze, wypełniając w ten sposób wolną przestrzeń igły i przygotowując ją do podania. Krok ten należy powtarzać (do dziesięciu razy), aż z końcówki igły zacznie wydostawać się ciągła nić mezofazy.</li>
 <li>Próby krystalizacji należy rozpocząć niezwłocznie, ponieważ niektóre białka są niestabilne w fazie kubicznej bez dodatku czynnika wytrącającego.</li>
</ol>
Część 6: Przygotowanie płytek do krystalizacji
<ol>
 <li>Aby ułatwić napełnianie, umieść wielodołkową płytkę krystalizacyjną oraz szkiełko nakrywkowe na powierzchni podwyższonej o kilka cali nad blatem roboczym. Optymalny kontrast i lepsza widoczność są osiągane, gdy powierzchnia jest lekko ciemna.</li>
 <li>Zhomogenizuj roztwory precypitantu i odkręć fiolki. Ustaw pipetę do dozowania precypitantu na 1 μL.</li>
 <li>Trzymając strzykawkę dozującą pionowo w jednej ręce, za pomocą wolnej ręki ustaw końcówkę igły w centrum i bezpośrednio nad dnem dołka numer 1. Naciśnij przycisk w dozowniku powtarzalnym, aby wycisnąć kroplę mezofazy na powierzchnię szkła. Objętość kropli wynosi 200 nL przy użyciu standardowego dozownika powtarzalnego ze strzykawką 10 μL. Końcówka igły powinna znajdować się nie więcej niż kilkaset mikrometrów nad dnem dołka, aby zapewnić prawidłowe dozowanie.</li>
 <li>Po napełnieniu 4 sąsiednich dołków mezofazą, nanieś 1 μL roztworu precypitantu na każdą kroplę mezofazy, używając pipety 2 μL i standardowych końcówek jednorazowych.</li>
 <li>Jak najszybciej nałóż szkiełko nakrywkowe równo nad napełnione dołki, aby pokryć je jednorodnie. W celu zapewnienia szczelności wodnej, użyj szpatułki, aby docisnąć szkiełko nakrywkowe w miejscu jego styku z odsłoniętą lepką powierzchnią taśmy dystansowej.</li>
 <li>Proces dozowania mezofazy i precypitantu można powtarzać, aż wszystkie dołki na płytce zostaną napełnione i zamknięte.</li>
 <li>Wyraźnie opisz płytkę w celu śledzenia próbek. Białka światłoczułe są zazwyczaj zabezpieczane poprzez owinięcie płytek folią aluminiową przed umieszczeniem ich w komorze inkubacyjnej.</li>
 <li>Umieść płytki w komorze z kontrolowaną temperaturą, zazwyczaj w 20 °C.</li>
 <li>Zgodnie z ustalonym harmonogramem sprawdzaj wzrost kryształów w dołkach za pomocą mikroskopu w świetle spolaryzowanym z obiektywem 10- lub 20-krotnym. Harmonogram stosowany w laboratorium autora jest następujący: dzień 0, 1, 2, 3, 5, 7, 14, 21, 30 i 60 po przygotowaniu. Uważnie obejrzyj kroplę mezofazy, regulując głębię ostrości w próbce o grubości 0,14 mm. Badanie należy przeprowadzić zarówno w świetle normalnym, jak i między skrzyżowanymi polaryzatorami.</li>
</ol>
Część 7: Reprezentatywne wyniki
Wygląd otrzymanych kryształów będzie się różnić w zależności od naturalnego koloru białka błonowego, polaryzacji światła użytego do inspekcji (lub jej braku) oraz metody i jakości oświetlenia. Rysunek 6 przedstawia kilka możliwych wariantów wyglądu kryształów. Naturalnie ubarwione białka błonowe rosnące in meso w świetle zwykłym mogą wyglądać tak, jak na Rysunku 6 (Panele b i d). Bezbarwne kryształy białek błonowych rosnące w fazie kubicznej w świetle zwykłym mogą wyglądać tak, jak na Rysunku 6 (Panel e). Wreszcie, bezbarwne kryształy białek błonowych rosnące in meso obserwowane w świetle spolaryzowanym mogą wyglądać tak, jak na Rysunku 6 (Panele a i c).
Kolejne etapy całego procesu wyznaczania struktury polegają na zbiorze i szybkim mrożeniu kryształów oraz na rejestracji i analizie dyfrakcji promieni Rentgena z nich uzyskanej. Tematy te zostaną omówione w osobnych artykułach JoVE.
<img src="/files/ftp_upload/1712/1712fig1.jpg" alt="Schemat struktury dwuwarstwy lipidowej z białkami i węglowodanami, ilustrujący skład błony komórkowej." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
 Rysunek 1. Schematyczne przedstawienie błony biologicznej ukazujące dwuwarstwę lipidową, w której oraz na której znajdują się różne rodzaje białek.
<img src="/files/ftp_upload/1712/1712fig2.jpg" alt="Oddziaływanie białko-ligand, model molekularny, wizualizacja, analiza struktury, badania biochemiczne." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
 Rysunek 2. Struktura witaminy B12 białko transportowe, BtuB, rozwiązane przy użyciu krystalografii rentgenowskiej (MX), a kryształy otrzymane metodą in meso metoda6 przedstawione w niniejszym artykule JoVE.
<img src="/files/ftp_upload/1712/1712fig3.jpg" alt="Schemat cyklu struktura-funkcja; oczyszczanie białek, krystalizacja, mechanizm działania leku." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 3"> 
 Rysunek 3. Cykl struktura-funkcja przedstawia wiele etapów związanych z pozyskiwaniem i wykorzystaniem pełnych informacji strukturalnych o białku.
<img src="/files/ftp_upload/1712/1712fig4.jpg" alt="Schemat procesu krystalizacji; przygotowanie mezofazy białko-lipid; ustawienie eksperymentu." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 4"> 
 Rycina 4. Schemat blokowy podsumowujący etapy produkcji kryształów białek błonowych metodą in meso. W niniejszym artykule JoVE omówiono wyłącznie kroki otoczone czerwoną przerywaną linią. Źródło: Reference 2.
<img src="/files/ftp_upload/1712/1712fig5.jpg" alt="Wykres fazowy monooleiny i wody, roztwór lipid-białko, wykres zależności temperatury od składu." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 5"> 
 Rysunek 5. Uproszczony wykres fazowy temperatura-skład dla układu lipid (monooleina)/woda. Próby krystalizacji przeprowadzono w 20 °C, gdzie lipid nasyca się wodą przy 40 % hydratacji. Szczegółowy wykres fazowy znajduje się w publikacji 5.
<img src="/files/ftp_upload/1712/1712fig6.jpg" alt="Mikroskopia kryształów; różnorodne formacje kryształów; obrazy mikroskopowe; pasek skali; analiza materiałowa." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 6"> 
 Rysunek 6. Kryształy białek błonowych rosnące w mezofazie lipidowej. 
 (a) białko transportujące witaminę B12, BtuB6, (b) kompleks zbierający światło II7, (c) adhezyna/inwazyna OpcA8, (d) bakteriorodopsyna9, (e) transporter węglowodanów z Pseudomonas. Obrazy zarejestrowane w świetle normalnym (b,d,e) oraz między skrzyżowanymi polaryzatorami (a,c).

<ol><li>Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallizing+membrane+proteins+for+structure+determination.+Use+of+lipidic+mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biophys%22%5BJournal%5D)">Crystallizing membrane proteins for structure determination. Use of lipidic mesophases.</a> Annu. Rev. Biophys. 38, 29-51 (2009).</li>
<li>Caffrey, M., Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallising+membrane+proteins+in+lipidic+mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Crystallising membrane proteins in lipidic mesophases.</a> Nat. Protoc. 4, 706-731 (2009).</li>
<li>Cheng, A., Hummel, B., Qiu, H., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+mechanical+mixer+for+small+viscous+lipid-containing+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Phys.+Lipids%22%5BJournal%5D)">A simple mechanical mixer for small viscous lipid-containing samples.</a> Chem. Phys. Lipids. 95, 11-21 (1998).</li>
<li>Cherezov, V., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nano-volume+plates+with+excellent+optical+properties+for+fast%2C+inexpensive+crystallization+screening+of+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Cryst%22%5BJournal%5D)">Nano-volume plates with excellent optical properties for fast, inexpensive crystallization screening of membrane proteins.</a> J. Appl. Cryst. 36, 1372-1377 (2003).</li>
<li>Qiu, H., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+phase+diagram+of+the+monoolein%2Fwater+system%3A+metastability+and+equilibrium+aspects%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The phase diagram of the monoolein/water system: metastability and equilibrium aspects.</a> Biomaterials. 21, 223-234 (2000).</li>
<li>Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+meso+structure+of+the+cobalamin+transporter%2C+BtuB%2C+at+1.95+A+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">In meso structure of the cobalamin transporter, BtuB, at 1.95 A resolution.</a> J. Mol. Biol. 364, 716-734 (2006).</li>
<li>Cherezov, V., Clogston, J., Papiz, M. Z., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Room+to+move%3A+crystallizing+membrane+proteins+in+swollen+lipidic+mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Room to move: crystallizing membrane proteins in swollen lipidic mesophases.</a> J. Mol. Biol. 357, 1605-1618 (2006).</li>
<li>Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+meso+crystal+structure+and+docking+simulations+suggest+an+alternative+proteoglycan+binding+site+in+the+OpcA+outer+membrane+adhesin%5BTitle%5D)+AND+%22Proteins%22%5BJournal%5D)">In meso crystal structure and docking simulations suggest an alternative proteoglycan binding site in the OpcA outer membrane adhesin.</a> Proteins. 71, 24-34 (2008).</li>
<li>Cherezov, V., Peddi, A., Muthusubramaniam, L., Zheng, Y. F., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robotic+system+for+crystallizing+membrane+and+soluble+proteins+in+lipidic+mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr.+D+Biol.+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">A robotic system for crystallizing membrane and soluble proteins in lipidic mesophases.</a> Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 60, 1795-1807 (2004).</li>
</ol>

Faza kubiczna jest delikatnym i dynamicznym środowiskiem, które może drastycznie zmieniać się pod wpływem modyfikacji szeregu zmiennych. W instrukcji trybu ręcznego nie jest możliwe opisanie konfiguracji prób krystalizacji in meso w sposób obejmujący wszystkie potencjalne problemy. Jednak wielu trudności można uniknąć, ćwicząc tę technikę przed zastosowaniem jej do kosztownych roztworów białek oraz zachowując umiar w nacisku przykładanym do strzykawek podczas mieszania. Prawidłowo wykonana metoda in meso może przynieść kryształy szerokiej gamy białek, których liczba stale rośnie. Przedstawiony tutaj opis przygotowania prób krystalizacji in meso koncentruje się na trybie ręcznym. Proces ten może być, a często jest modyfikowany w celu ułatwienia zautomatyzowanego przygotowania płytek krystalizacyjnych w przypadkach wymagających wielkoskalowego przesiewu warunków krystalizacji.

<table><tbody><tr><td>Roztwór białka</td><td>Odczynnik</td><td>Różne</td><td>Różne</td><td></td></tr><tr><td>Lipid (monooleina)</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Różne</td><td></td></tr><tr><td>Roztwory wytręcające</td><td>Odczynnik</td><td>Różne</td><td>Różne</td><td></td></tr><tr><td>Woda oczyszczona</td><td>Odczynnik</td><td>EMD Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Urządzenia do pipetowania</td><td>Narzędzie</td><td>Pipetman</td><td>Różne</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowe końcówki do pipet</td><td>Jednorazowe</td><td>Pipetman</td><td>Różne</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawki szczelne dla gazów</td><td>Narzędzie</td><td>Hamilton Co</td><td>80265 (25-&amp;#181;l)</td><td></td></tr><tr><td>Igły do strzykawek</td><td>Narzędzie</td><td>Hamilton Co</td><td>7770-020 (rozmiar 22 G)</td><td></td></tr><tr><td>Złącze o wąskim przekroju*</td><td>Narzędzie</td><td>Hamilton Co</td><td>różne/EBS-LCP-2</td><td></td></tr><tr><td>Dozownik wielokrotny</td><td>Narzędzie</td><td>Hamilton Co</td><td>83700</td><td></td></tr><tr><td>Silanizowane szklane lamki do mikroskopu</td><td>Jednorazowe</td><td>Gold Seal</td><td>3010</td><td></td></tr><tr><td>Przedszkiełka do mikroskopu</td><td>Jednorazowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-548C</td><td></td></tr><tr><td>Perforowana dwustronna taśma dystansowa</td><td>Jednorazowe</td><td>Saunders Corporation (dziurkowana)</td><td>ND</td><td></td></tr><tr><td>Pinceta</td><td>Narzędzie</td><td>Różne</td><td>ND</td><td></td></tr><tr><td>Wałek (brayer)</td><td>Narzędzie</td><td>Fisher Scientific</td><td>50820937</td><td></td></tr><tr><td>Kruszony lód</td><td>Kontrola temperatury</td><td>ND</td><td>ND</td><td></td></tr><tr><td>Chusteczki</td><td>Jednorazowe</td><td>ND</td><td>ND</td><td></td></tr><tr><td>Kalkulator</td><td>Narzędzie</td><td>Różne</td><td>ND</td><td></td></tr><tr><td>Notatnik laboratoryjny</td><td>Narzędzie</td><td>Różne</td><td>ND</td><td></td></tr><tr><td colspan="5">&lt;p class=&quot;jove_content">* Szczegółowe informacje dotyczące samodzielnego wykonania złącza o wąskim przekroju znajdują się w referencji 3.&lt;/p&gt;</td></tr></tbody></table>

krystalizacja białek błonowych do wyznaczania struktury z wykorzystaniem mezofaz lipidowych

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

Opisano szczegółowy protokół krystalizacji białek błonowych z wykorzystaniem mezofaz lipidowych. Metoda ta była określana różnie jako metoda lipidowej fazy kubicznej lub metoda in meso. Wykazano, że metoda ta jest bardzo wszechstronna, ponieważ została wykorzystana do rozwiązania struktur krystalograficznych rentgenowskich białek prokariotycznych i eukariotycznych, białek monomerowych, homo- i hetero-multimerycznych, zawierających i niezawierających chromoforów, a także białek o strukturze alfa-helikalnej i beta-beczułkowej. Ostatnimi sukcesami w zastosowaniu krystalizacji in meso są ludzkie zmodyfikowane genetycznie receptory beta2-adrenergiczne oraz adenozynowe A2a sprzężone z białkiem G. Przedstawiono protokoły rekonstytucji białka błonowego w mezofazie opartej na monooleinie oraz przygotowania krystalizacji w trybie manualnym. Dodatkowe kroki w całym procesie, takie jak pozyskiwanie kryształów, zostaną omówione w przyszłych artykułach wideo. Czas wymagany do przygotowania mezofazy z białkiem i manualnego ustawienia płytki do krystalizacji wynosi około jednej godziny.

W niniejszym opracowaniu opisano procedurę stosowaną w Grupie Biologii Strukturalnej i Funkcjonalnej Białek Błonowych Caffreya w celu ręcznego przygotowania prób krystalizacji białek błonowych w mezofazach lipidowych.

Krystalizacja białek błonowych do wyznaczania struktury z wykorzystaniem mezofaz lipidowych

Opisano szczegółowy protokół krystalizacji białek błonowych z wykorzystaniem mezofaz lipidowych. Metoda ta była określana na różne sposoby jako...

Witajcie w Grupie Biologii Strukturalnej i Funkcjonalnej Membran. Nazywam się Martin Caffery. Przedmiotem naszych badań jest błona biologiczna, której schemat przedstawiono na pierwszym slajdzie; błona otaczająca komórkę oraz obecne w niej organella podkomórkowe jest strukturą cienką w skali molekularnej, o grubości zaledwie dwóch cząsteczek lipidów, w którą wbudowane są białka.Interesujemy się strukturą i funkcjami stosowanymi zarówno w odniesieniu do lipidów, jak i białek. Jednakże, w ramach tej serii JO, ograniczę skupienie uwagi do białek błonowych. Dążymy do zrozumienia, w jaki sposób białka błonowe funkcjonują na poziomie molekularnym, z dwóch powodów.Po pierwsze, istnieje satysfakcja intelektualna z wiedzy o tym, jak coś działa. Po drugie, znając zasadę działania – podobnie jak w przypadku roweru czy samochodu – pojawia się możliwość naprawy w razie awarii. Projektowanie leków jest oczywistym rezultatem tego rodzaju pracy.Podejście, które przyjmujemy w celu zrozumienia mechanizmu działania białka błonowego na poziomie molekularnym, polega na wyznaczeniu jego struktury krystalograficznej. Wiąże się to z ustaleniem położenia w przestrzeni trójwymiarowej wszystkich atomów, lub przynajmniej wszystkich atomów poza wodorem, które tworzą białko. Metoda, której używamy w tym celu, nazywa się krystalografią rentgenowską makrocząsteczek, w skrócie MX.Tutaj widzimy przykład białka błonowego, którego struktura została określona za pomocą MX; do przeprowadzenia mx wymagany jest kryształ białka o określonej jakości. Jak można sobie wyobrazić, proces określania struktury z wykorzystaniem krystalografii makromolekularnej składa się z wielu etapów, co zostało tutaj zilustrowane. Zazwyczaj obejmują one identyfikację białka błonowego jako celu, a następnie jego produkcję, oczyszczanie i krystalizację.Pomiary dyfrakcyjne kryształu wykonuje się przy użyciu laboratoryjnego źródła promieniowania rentgenowskiego lub synchrotronu. Dane dyfrakcyjne są przetwarzane w celu uzyskania mapy gęstości elektronowej, do której następnie dopasowuje się model molekularny. Po udoskonaleniu model ten może służyć do badania mechanizmu działania białka oraz do projektowania leków w oparciu o strukturę.Celem niniejszego artykułu JoVE jest pokazanie, w jaki sposób uzyskujemy kryształy białek błonowych o wysokiej jakości z wykorzystaniem mezofaz lipidowych, stosując tzw. metodę in meso. Niedawny przegląd tej metody oraz zakresu jej zastosowań znajduje się w pozycji pierwszej w bibliografii. Protokół krok po kroku, który będziemy tutaj realizować, opisano w pozycji drugiej, a schemat blokowy podsumowujący poszczególne etapy oraz czas wymagany do przygotowania próby krystalizacji białka błonowego metodą in meso przedstawiono tutaj.Niniejszy materiał wideo obejmuje kroki ujęte w przerywane czerwone linie. Przedstawiono tutaj czynności niezbędne do przeprowadzenia krystalizacji w fazie mezo w trybie ręcznym. Obejmują one przygotowanie stężonego roztworu oczyszczonego białka membranowego z lipidem w celu utworzenia fazy mezo, zazwyczaj z dodatkiem monooleiny, aby lipid był bardziej widoczny.W tym filmie wykorzystano roztwory precypitacyjne z czerwonym barwnikiem, urządzenia do pipetowania z wodą oczyszczoną, końcówki jednorazowe oraz zestaw szczelnych strzykawek Hamiltona, niektóre z nich z wymiennymi igłami, a także łącznik o wąskiej średnicy używany do mieszania roztworu białka z lipidami w celu przygotowania mease. Rozdzielacz wielokrotny firmy Hamilton, szkiełka przedmiotowe i nakrywkowe. Idealnie silikonizowaną, perforowaną, dwustronną taśmę dystansową do tworzenia studzienek, pęsetę, kruszony lód, chusteczki, kalkulator i co najważniejsze, dziennik laboratoryjny.Poniższa procedura służy do przygotowania szklanej płytki krystalizacyjnej typu „sandwich”. W celu przygotowania, należy położyć zylaryzowany szkiełko mikroskopowe na blacie. Z jednej powierzchni paska perforacyjnej dwustronnej taśmy dystansowej należy usunąć papierową osłonę ochronną.Przyklej taśmę lepką stroną do powierzchni szkiełka przedmiotowego, dociskając ją. Uszczelnij taśmę na szkiełku. Aby chronić dno dołków, między taśmą a brayerem lub wałkiem można umieścić folię aluminiową.Oderwij drugą papierową osłonkę od taśmy, aby odsłonić jej górną lepką powierzchnię. Procedura ta pozwala uzyskać płytkę szklaną gotową do napełniania i późniejszego zapieczętowania; natychmiast po zakończeniu napełniania należy ją zapieczętować. Poszczególne zapięte szkiełka nakrywkowe należy umieścić w bliskim sąsiedztwie płytki, aby umożliwić szybkie i wydajne zapieczętowanie studzienek.Umieść lipid w bloku z kontrolą temperatury w 45 °C przez trzy minuty, aby go stopić. Należy pamiętać, że stosowany lipid to zazwyczaj mono land. W tym filmie do lipidu dodano czerwony barwnik, aby umożliwić obserwację procesu topnienia.Przygotować dwie szczelne strzykawki Hamiltona o pojemności 100 µL do użycia w etapie mieszania lipidów z białkiem. Ze strzykawki, która będzie zawierać roztwór białka, usunąć olej teflonowy. Obok niej umieścić strzykawkę, w której znajdą się lipidy. W tym przypadku olej pozostaje wewnątrz.Umieść złączkę o wąskim prześwicie pomiędzy dwiema strzykawkami, a następnie połącz złączkę z końcem strzykawki z lipidami. Dokręć złączkę do strzykawki, ale nie rób tego zbyt mocno. Wyjmij tłok z cylindra strzykawki z lipidami.Upewnij się, że lipid jest w stanie ciekłym. Ustaw pipetę na 30 µL i powoli pobierz 30 µL ciekłego lipidu z górnej warstwy. Fiolka z lipidem.Lipid należy przechowywać w atmosferze azotu lub argonu w temperaturze -80 °C. Powoli wprowadź do otwartego końca strzykawki taką ilość stopionego lipidu, jaka się zmieści, dbając o to, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza.Wprowadź tłok do cylindra w taki sposób, aby stykał się z roztopionym lipidem, a następnie powoli przesuwaj tłok w górę cylindra, trzymając strzykawkę pionowo. Jak pokazano, przypadkowo uwięziony pęcherzyk powietrza unosi się w trakcie tego procesu i zostaje usunięty. W cylindrze znajduje się teraz korek z roztopionego lipidu, którego objętość należy dokładnie wyznaczyć.Można to zrobić, odczytując oznaczenia na tulei strzykawki. W tym przypadku objętość wynosi 23 µL, co należy zapisać w dzienniku laboratoryjnym. Nasuń futro na igłę wystającą z łącznika.Użyj tłoka, aby wypchnąć stopione lipidy w górę cylindra i powoli oraz ostrożnie wprowadzić je do igły znajdującej się w centrum sprzęgła. Jeśli igła zostanie lekko przepełniona, lipidy będą wypływać z jej otwartego końca. Przesuwając tłok nieco w tył, można wciągnąć nadmiar lipidów z powrotem do sprzęgła, aż znajdą się one na poziomie końcówki igły sprzęgła.W tym przypadku zespół łącznika strzykawki jest w pełni załadowany i gotowy do połączenia ze strzykawką z białkiem. Roztwór należy wirować przy 14 000 G przez 10 min, a następnie od 5 do 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby usunąć duże agregaty. Przed przystąpieniem do prób krystalizacji należy wyjąć roztwór białka z wiaderka z lodem i doprowadzić go do temperatury pokojowej.Oblicz objętość roztworu białka niezbędną do utworzenia fazy kubicznej przy pełnym lub zbliżonym do pełnego uwodnieniu dla oleanu w temperaturze 20 °C. Pełne uwodnienie wodą występuje przy zawartości wody bliskiej 40% wagowo, zgodnie z wykresem fazowym. Należy pamiętać, że strzykawka z lipidem została napełniona 23 µL mono o gęstości 0,94 mg/µL.Odpowiada to 21,6 miligramom lipidów, zatem wymagane jest 21,6 razy cztery podzielone przez sześć, czyli 14,4 miligrama lub 14,4 mikrolitra roztworu białka. Za pomocą strzykawki Hamiltona o objętości 25 lub 50 mikrolitrów pobierz wymaganą objętość roztworu białka, przenieś roztwór na teflonową końcówkę tłoka w cylindrze strzykawki. Uważając, aby nie dopuścić do powstania pęcherzyków powietrza, ostrożnie wycofaj igłę i zmierz objętość roztworu białka w strzykawce. Powinna ona odpowiadać wartości wyznaczonej w poprzednim kroku.W ramach przygotowania do połączenia z strzykawką wypełnioną lipidami, ostrożnie przesuń roztwór białka w górę cylindra, tak aby znalazł się na równi z jego otwartym końcem. Można to sprawdzić, patrząc przez koniec cylindra.Roztwór białka lipiny oraz napełnione strzykawki są teraz gotowe do połączenia. Aby to zrobić, wkręć strzykawkę z białkiem w otwarty koniec łącznika przymocowanego do strzykawki z lipidami. Po połączeniu dwóch strzykawek za pomocą łącznika powinna powstać ciągła objętość cieczy, prowadząca od lipidów w jednej strzykawce, przez łącznik, aż do roztworu białka w drugiej strzykawce.W ramach przygotowania do mieszania, zmontowany układ trzyma się obiema rękami, z jedną strzykawką w prawej i drugą w lewej dłoni. Moment obrotowy przykłada się do obu cylindrów poprzez sprzęgacz, używając palców i kciuków obu rąk, aby upewnić się, że uszczelnienie w rowkach sprzęgacza pozostaje nienaruszone podczas dokręcania. Uszkodzenie urządzenia do mieszania na tym etapie uszkodzi ALS i spowoduje wyciek; nadmierne dokręcanie również doprowadzi do wycieku.Jest to kwestia doświadczenia, nieuchronnych prób i błędów oraz okazjonalnej utraty próbki. Dlatego warto poćwiczyć z lipidami i wodą lub roztworem buforowym, aby zapoznać się z działaniem układu przed użyciem cennego roztworu białka. Aby przeprowadzić mieszanie, należy przesunąć tłok po stronie białka w zmontowanym module mieszającym do jego ogranicznika kciukiem lub palcem wskazującym, wypychając roztwór białka z strzykawki z białkiem przez sprzęgacz do strzykawki z lipidami. Jeśli moduł został skutecznie uszczelniony, czynność ta spowoduje równy i przeciwny ruch tłoka po stronie lipidów.Tłok po stronie lipidowej jest teraz wykorzystywany do przepompowania zawartości strzykawki z lipidami z powrotem przez chłodnicę do strzykawki z białkiem. Proces ten jest powtarzany wielokrotnie. Czasami wymaganych jest sto lub więcej przejść, aby uzyskać jednorodną fazę mieszaną.Na początku mieszania ruch materiału w przód i w tył przez sprzęgacz może być nierównomierny i czasami wymagane jest użycie dodatkowej siły, aby doprowadzić do wymieszania. Jest to zjawisko oczekiwane. Pierwszemu etapowi mieszania zazwyczaj towarzyszy powstanie niejednorodnego zmętnienia w próbce, co również jest zjawiskiem oczekiwanym.W miarę postępu homogenizacji tekstura, odczuwalna jako siła potrzebna do przesuwania tłoków w przód i w tył, staje się bardziej jednorodna i charakterystyczna dla lepkiej fazy kubicznej, podobnie jak wygląd wizualny powstającej fazy kubicznej. Jeśli warunki są odpowiednie i dojdzie do utworzenia fazy kubicznej, dyspersja w cylindrze strzykawki powinna stać się optycznie przejrzysta.Zatem oznaczenia na korpusie strzykawki powinny być wyraźnie widoczne przez fazę mezo wewnątrz korpusu. W przypadku białek barwionych faza mezo będzie miała kolor białka, lecz pozostanie optycznie przezroczysta. Bardzo delikatne schłodzenie próbki podczas mieszania poprzez krótkotrwałe umieszczenie mieszadła strzykawkowego w lodzie może przyspieszyć homogenizację i uzyskanie przezroczystości.Należy jednak pamiętać, aby nie mieszać próbki zbyt intensywnie; należy zachować ostrożność, by uniknąć gwałtownego mieszania, ponieważ może ono doprowadzić do wzrostu temperatury próbki na skutek ciepła tarcia. Na tym etapie uformowała się sześcienna faza mezofazowa, a białko zostało wbudowane w lipidową dwuwarstwę. Faza mezofazowa jest teraz gotowa do naniesienia do poszczególnych dołków płytek krystalizacyjnych.Najpierw jednak fazę mezo należy przenieść do strzykawki Hamiltona o pojemności 10 µL zamontowanej na dozowniku powtarzalnym. Rozpocznij ten proces od połączenia strzykawki z dozownikiem. Napełnij strzykawkę fazą mezo o strukturze sześciennej.Wyjmij igłę i tłok ze strzykawki. Pozostaw uszczelkę teflonową na miejscu. Odkręć nakrętkę mocującą z dozownika przy użyciu małej monety.Przy całkowicie wycofanym ramieniu zapadki, włóż strzykawkę bez tłoka i igły przez pierścień mocujący dozownika. Nałóż uszczelkę węzła mocującego stroną uszczelki w stronę strzykawki i mocno przykręć ją do otwartego końca strzykawki.Należy zadbać o to, aby strzykawka była odpowiednio wycentrowana w pierścieniu mocującym, a tłok znajdował się równolegle do ramienia zapadki. Oba te warunki można ocenić wizualnie. Wymagania te są istotne, ponieważ jeśli tłok nie będzie poruszał się swobodnie, podczas ładowania w strzykawce źródłowej wzrośnie ciśnienie, co może doprowadzić do wycieku. Przeciągnij tłok przez pierścień zaciskowy z nakrętką zaciskową odkręconą o kilka obrotów, a następnie wprowadź tłok do otwartego końca strzykawki.Naciśnij całkowicie ramię zapadki, aby przesunąć tłok do wnętrza cylindra i sprawdź, czy porusza się on swobodnie i w pełni w cylindrze. Jeśli śruba i prowadnica zostały poluzowane, dokręć je ponownie i sprawdź ponownie, czy tłok porusza się swobodnie. Strzykawka dozująca jest teraz gotowa do napełnienia.Przesuń tłok z jednej strony zmontowanego modułu mieszającego do kreski graduacji zero mikrolitrów. Aby przenieść fazę mezo do drugiej strzykawki i złączki, odłącz pustą strzykawkę z zamontowanym elementem UL z modułu mieszającego i niezwłocznie podłącz napełnioną strzykawkę z przymocowaną złączką do gwintowanego zakończenia strzykawki dozującej o objętości 10 mikrolitrów.Kluczowe jest stopień szczelności wykonanego połączenia. Jak już wspomniano, napełniono strzykawkę dozującą, naciskając tłok strzykawki 100 µL w taki sposób, aby faza mezomorficzna przeszła przez sprzęgacz. Jeśli połączenie jest szczelne, a tłok w strzykawce dozującej porusza się swobodnie, to w miarę napełniania strzykawki dozującej tłok ten powinien zacząć przesuwać się w kierunku ruchu tłoka ładującego.Odłącz strzykawkę ładującą z przymocowanym sprzęgiem od strzykawki dozującej. Do stalowego zakończenia strzykawki dozującej przymocuj krótką igłę o ściętym czubku i ostrożnie ją dokręć. Przymocuj tłok do ramienia zapadkowego, zaciskając węzeł w pierścieniu chwytnym.Należy uważać, aby nie zawiązać węzła zbyt mocno, ponieważ może to spowodować zarysowanie i odkształcenie tłoka, czyniąc go niezdatnym do użytku. Ważne jest, aby zakres ruchu ramienia zapadkowego w stanie zaciśniętym był ograniczony do maksymalnie jednego cala.Jak pokazano dalej, tłok może mieć tendencję do wyginania się, co może doprowadzić do niepowodzenia podawania. Kilkakrotnie naciśnij bęben zapadkowy, aby przesunąć tłok w cylindrze, wypełniając tym samym pustą przestrzeń igły i ładując ją. Krok ten należy powtórzyć do 10 razy, aż z końcówki igły zacznie wydostawać się ciągła nić fazy mesa.Igła jest teraz gotowa do użycia w przygotowaniu prób krystalizacji, które należy rozpocząć niezwłocznie. Nie zaleca się przechowywania fazy sześcianowej z załadowanym białkiem przez zbyt długi czas przed przystąpieniem do prób krystalizacji. Ponieważ niektóre białka są niestabilne w fazie sześcianowej bez dodatku precypitantu, należy umieścić wielodołkową płytkę krystalizacyjną oraz szkiełko nakrywowe na powierzchni wyniesionej o kilka cali nad blat, aby ułatwić proces ładowania.Optymalny kontrast i zwiększona widoczność są osiągane, gdy powierzchnia jest lekko ciemna. Zhomogenizować roztwory precypitantu i zdjąć zakrętki z fiolek. Ustawić dozownik precypitantu na 1 µL; trzymając strzykawkę dozującą pionowo w jednej ręce, drugą ręką ustawić końcówkę igły w centrum, bezpośrednio nad dnem dołka.Krok pierwszy. Naciśnij przycisk w dozowniku powtarzalnym, aby wycisnąć bolusy molasy na powierzchnię szklaną. Objętość bolusa wynosi 200 nanolitrów.Podczas korzystania ze standardowego dozownika wielokrotnego z strzykawką 10 µL, końcówka igły powinna znajdować się nie więcej niż kilkaset µm nad dnem dołka. Aby zapewnić prawidłowe i powtarzalne dozowanie, należy poświęcić chwilę na wprawę. Po napełnieniu czterech sąsiednich dołków medium mease, należy nanieść 1 µL roztworu precypitanta na wierzch każdego bolusa mease.Używając końcówek jednorazowych o pojemności 2 µL na próbkę i działając jak najszybciej, należy umieścić szkiełko podstawowe dokładnie nad wypełnionymi dołkami, aby pokryły one powierzchnię równomiernie i zapewniły wodoszczelną izolację. Za pomocą szpatułki należy wywrzeć nacisk na szkiełko w miejscach jego styku z odsłoniętą lepką powierzchnią taśmy dystansowej. Proces dozowania odczynników i precypitatu można powtarzać do momentu wypełnienia i zamknięcia wszystkich dołków na płytce.Płytka jest teraz gotowa do inspekcji oraz inkubacji. Oznacz płytkę w sposób czytelny w celu śledzenia próbek. Białka światłoczułe zazwyczaj obsługuje się poprzez owinięcie płytek folią aluminiową przed umieszczeniem ich w komorze inkubacyjnej.Można je wyjąć i zbadać pod mikroskopem w przygaszonym lub odpowiednio kolorowym świetle. Płytki należy umieścić w komorze z kontrolowaną temperaturą, zazwyczaj w temperaturze około 20°C. W regularnych odstępach czasu należy sprawdzać obecność kryształów na ściankach, używając mikroskopu w świetle spolaryzowanym z powiększeniem 10- lub 20-krotnym.Cel, harmonogram stosowany w laboratorium autora jest następujący: dzień 0, 1, 2, 3, 5, 7, 14, 21, 30 po ustawieniu. Dokładnie obejrzyj bolusy mease. Dostosuj głębię ostrości w obrębie próbki o grubości 140 micron.Badanie należy przeprowadzić zarówno w świetle normalnym, jak i między skrzyżowanymi polaryzatorami; bezbarwne kryształy białek błonowych rosnące w fazie sześciennej w świetle normalnym wyglądają tak. Bezbarwne kryształy białek błonowych rosnące w fazie meso w świetle spolaryzowanym wyglądają tak lub tak, natomiast naturalnie kolorowe białka błonowe rosnące w fazie meso w świetle normalnym wyglądają tak lub tak.Kolejnymi krokami w całym procesie wyznaczania struktury są zbieranie i schładzanie kryształów metodą krioletowania oraz rejestracja i przetwarzanie obrazów dyfrakcji rentgenowskiej z nich uzyskanych. Tematy te są omówione w oddzielnych artykułach JoVE z tej serii.

crystallizing-membrane-proteins-for-structure-determination-using

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Krystalizacja białek błonowych do określania struktury z wykorzystaniem faz płytkowych lipidów

Ocena prób krystalizacji dwuwymiarowej (2D) w celu utworzenia uporządkowanych macierzy białek błonowych jest niezwykle istotnym i trudnym zadaniem w krystalografii elektronowej. Opisujemy tutaj nasze podejście do przesiewania i identyfikacji kryształów 2D, głównie małych białek błonowych o masie w zakresie 15 – 90kDa.

Ocena prób krystalizacji dwuwymiarowej małych białek błonowych do badań biologii strukturalnej metodą krystalografii elektronowej

Protokoły opisują kluczowe etapy otrzymywania kryształów białka błonowego o jakości dyfrakcyjnej, począwszy od rekonstytucji białka w lipidowej fazie kubicznej (LCP), poprzez wyznaczanie warunków wstępnych za pomocą testów prekrystalizacyjnych LCP-FRAP, aż po przygotowanie prób krystalizacji w LCP i pozyskiwanie kryształów.

Krystalizacja białek błonowych w mezofazach lipidowych

Bicele są mieszaninami lipidów i amfifili, które utrzymują białka błonowe (MPs) w obrębie dwuwarstwy lipidowej, lecz wykazują unikalne zachowanie fazowe, co ułatwia wysokoprzepustowe przesiewy za pomocą robotów krystalizacyjnych. Technika ta pozwoliła na uzyskanie wielu struktur o wysokiej rozdzielczości pochodzących zarówno z organizmów prokariotycznych, jak i eukariotycznych. Niniejszy film opisuje protokoły przygotowania lipidowej mieszaniny bicel, wprowadzania białek błonowych do mieszaniny...

Wysokoprzepustowa krystalizacja białek błonowych z wykorzystaniem metody lipidowych biceli

W niniejszym opracowaniu opisano zrobotyzowane podejście do wysokoprzepustowej krystalizacji białek błonowych w mezofazach lipidowych, przeznaczone do wyznaczania struktur za pomocą makromolekularnej krystalografii rentgenowskiej. Przedstawiono trzy roboty zdolne do pracy z lepką i kleistą mezofazą zawierającą białka, która jest nieodzownym elementem tej metody.

Wykorzystanie robota do wysokoprzepustowej krystalizacji białek błonowych w mezofazach lipidowych

W niniejszym opracowaniu opisano procedury wdrożone w Grupie Biologii Strukturalnej i Funkcjonalnej Membran Caffreya w celu zbioru i kriochłodzenia kryształów białek błonowych hodowanych w lipidowych fazach kubicznych i gąbczastych, przeznaczonych do wyznaczania struktur metodą makromolekularnej krystalografii rentgenowskiej.

Pozyskiwanie i mrożenie kryształów białek błonowych hodowanych w mezofazach lipidowych w celu wyznaczenia struktury metodą krystalografii makromolekularnej

Opisano procedury całkowitego odtworzenia prototypu kanału potasowego bramkowanego napięciem do błon lipidowych. Odtworzone kanały nadają się do testów biochemicznych, zapisów elektrycznych, badań przesiewowych ligandów i badań krystalograficznych elektronów. Metody te mogą mieć ogólne zastosowanie w badaniach strukturalnych i funkcjonalnych innych białek błonowych.

Rekonstytucja kanału Kv do błon lipidowych w badaniach strukturalnych i funkcjonalnych

β-beczkowate białka błony zewnętrznej (OMP) pełnią wiele funkcji w zewnętrznych błonach bakterii Gram-ujemnych, mitochondriów i chloroplastów. W tym miejscu mamy nadzieję złagodzić znane wąskie gardło w badaniach strukturalnych poprzez przedstawienie protokołów produkcji β-beczkowych OMP w ilościach wystarczających do określenia struktury za pomocą krystalografii rentgenowskiej lub spektroskopii NMR.

Od konstruktów do kryształów – w kierunku określania struktury β-baryłkowych białek błony zewnętrznej

Opisujemy procedury przygotowania i dostarczania mikrokryształów białek błonowych w lipidowej fazie sześciennej do krystalografii szeregowej w laserach rentgenowskich na swobodnych elektronach i źródłach synchrotronowych. Protokoły te mogą być również stosowane do wprowadzania i dostarczania rozpuszczalnych mikrokryształów białek, co prowadzi do znacznego zmniejszenia zużycia próbki w porównaniu z wstrzykiwaniem cieczy.

Otrzymywanie i dostarczanie mikrokryształów białkowych w lipidowej fazie sześciennej do seryjnej krystalografii femtosekundowej

Monowarstwy lipidowe były używane jako podstawa do tworzenia dwuwymiarowych (2D) kryształów białkowych do badań strukturalnych przez dziesięciolecia. Są stabilne na granicy faz powietrze-woda i mogą służyć jako cienki materiał nośny do obrazowania elektronów. Poniżej przedstawiamy sprawdzone etapy przygotowania monowarstw lipidowych do badań biologicznych.

Przygotowanie próbki metodą monowarstwową lipidów do badań krystalografii elektronowej

Ten protokół opisuje konfigurację do krystalizacji transportera steroli ABCG5/G8. ABCG5/G8 jest odtwarzany w postaci wodoroceli w celu krystalizacji w kropli wiszącej. Protokół nie wymaga specjalistycznych materiałów ani podłoży, dzięki czemu jest dostępny i łatwy do adaptacji w każdym laboratorium w celu określenia struktury białka za pomocą krystalografii rentgenowskiej.

Krystalizacja ABCG5/G8 w lipidowym środowisku bicelle do krystalografii rentgenowskiej

Poznaj metodę krystalizacji białek błonowych w mezofazach lipidowych do badań strukturalnych. Technika ta umożliwia wyznaczanie struktury krystalograficznej kluczowych celów terapeutycznych.

Krystalizacja białek błonowych do wyznaczania struktury z wykorzystaniem mezofaz lipidowych

Przeglądaj więcej filmów