Krystalizacja białek błonowych do określania struktury przy użyciu mezofaz lipidowych

Witam w Grupie Biologii Strukturalnej i Funkcjonalnej Błon. Nazywam się Martin Caffery. Przedmiotem naszych badań jest błona biologiczna, której schemat pokazano na pierwszym slajdzie, błona, która otacza komórkę i organelle subkomórkowe, gdy jest obecna, jest molekularnie cienką strukturą, zaledwie dwiema cząsteczkami lipidów w poprzek i wysadzanymi białkami.

Interesuje nas budowa i funkcje stosowane zarówno w odniesieniu do lipidów, jak i białek. Jednak na potrzeby tej serii JO ograniczę się do białek błonowych. Staramy się zrozumieć, w jaki sposób te białka błonowe funkcjonują na poziomie molekularnym z dwóch powodów.

Po pierwsze, istnieje intelektualna satysfakcja z wiedzy o tym, jak coś działa. Po drugie, wiedząc, jak to działa, podobnie jak rower lub samochód, istnieje perspektywa naprawienia go, jeśli działa nieprawidłowo. Projektowanie leków jest oczywistym rezultatem tego typu prac.

Podejście, które przyjmujemy, aby dowiedzieć się, jak działa białko błonowe na poziomie molekularnym, polega na określeniu jego struktury krystalograficznej. Polega to na ustaleniu położenia w przestrzeni trójwymiarowej wszystkich atomów, a przynajmniej wszystkich atomów niebędących atomami wodoru, które składają się na białko. Metoda, którą stosujemy w tym celu, nazywa się w skrócie makromolekularną krystalografią rentgenowską MX.

Tutaj widzimy przykład białka błonowego, którego struktura została określona za pomocą MX przy jakości ułamkowej kryształu białka wymaganej do wykonania mx. Jak można sobie wyobrazić, istnieje wiele etapów związanych z ustrukturyzowanym oznaczaniem za pomocą krystalografii makromolekularnej, jak pokazano na ilustracji. Tu. Zazwyczaj obejmują one identyfikację docelowego białka błonowego, a następnie jego wytwarzanie, oczyszczanie i krystalizację.

Pomiary dyfrakcyjne są wykonywane na krysztale przy użyciu domowego lub synchrotronowego źródła promieniowania rentgenowskiego. Dane dyfrakcyjne są przetwarzane, w wyniku czego powstaje mapa gęstości elektronów, która jest następnie dopasowywana do modelu molekularnego. Model po udoskonaleniu może być wykorzystany do zbadania mechanizmu działania białka i do projektowania leków w oparciu o strukturę.

Celem tego artykułu jest pokazanie, w jaki sposób wytwarzamy kryształy białek błonowych o jakości ułamkowej za pomocą mezofaz lipidowych za pomocą tzw. metody in mezo. Niedawny przegląd metody i jej zakresu jest dostępny w piśmiennictwie pierwszym. Protokół krok po kroku, który będziemy tutaj stosować, jest opisany w odniesieniu do schematu blokowego podsumowującego kroki i czas wymagany do skonfigurowania próby krystalizacji białek z błoną mezo, pokazano tutaj.

W tym filmie omówiono te kroki otoczone przerywanymi czerwonymi liniami. Elementy, które będziesz musiał wykonać w krystalizacji mezo w trybie ręcznym, są pokazane tutaj. Zawierają one stężony roztwór oczyszczonego lipidu białka błonowego do tworzenia białka gospodarza, zwykle mono ole, aby lipid był bardziej widoczny

W tym filmie został domieszkowany roztworami strącającymi czerwony barwnik, oczyszczonymi urządzeniami do głaskania fajki wodnej i jednorazowymi końcówkami oraz asortymentem szczelnych strzykawek Hamiltona, niektóre z wyjmowanymi igłami, łącznikiem o wąskim otworze używanym do mieszania roztworu białka z lipidem w celu wytworzenia drożdży. Powtarzalny dozownik ze szkła Hamilton Mikroskop Szkiełka podstawowe i szkiełka nakrywkowe. Idealnie silosowa, perforowana, podwójna taśma dystansowa do tworzenia studni, pęsety, rozdrobnionych chusteczek lodowych, kalkulatora i, co najważniejsze, notatnika laboratoryjnego.

Poniższa procedura służy do przygotowania szklanej płytki krystalizacyjnej typu sandwich. Do załadunku umieść na stole silosowe szkiełko mikroskopowe. Zdejmij papierową osłonę ochronną z jednej powierzchni paska perforowanej podwójnej taśmy dystansowej.

Umieść taśmę lepką stroną do dołu w kontakcie z powierzchnią docisku suwaka. Przymocuj taśmę do szkiełka. Za pomocą brayera lub rolki folię aluminiową można umieścić między taśmą a rolką, aby chronić podstawę studni.

Zdejmij drugą papierową osłonę z taśmy, aby odsłonić jej górną lepką powierzchnię. Ta procedura generuje szklaną płytę, która jest gotowa do załadunku, a następnie sufitu, gdy tylko załadunek zostanie zakończony. Indywidualne silosowe szkiełka nakrywkowe w bliskiej odległości od płyty do szybkiego i wydajnego stropu studni.

Umieść lipid w bloku o kontrolowanej temperaturze 45 stopni Celsjusza na trzy minuty, aby się stopił. Należy pamiętać, że używany lipid jest zazwyczaj mono land. W tym filmie lipid ma dodany czerwony barwnik dla widoczności podczas topnienia lipidu.

Przygotuj dwie 100-mikrolitrowe gazoszczelne strzykawki Hamilton do użycia Na etapie mieszania białek lipidowych usuń olej teflonowy z futra ze strzykawki, która będzie zawierać roztwór białka. Umieść obok niego strzykawkę, która będzie trzymać lipid. W takim przypadku fal pozostawia się na miejscu.

Umieścić łącznik o wąskim otworze między dwiema strzykawkami, a następnie podłączyć łącznik do palca strzykawki lipidowej. Dokręcić łącznik do strzykawki, ale nie należy go dokręcać zbyt mocno. Wyjąć tłok z cylindra strzykawki lipidowej.

Upewnij się, że lipid jest stopiony. Ustaw pipetę na 30 mikrolitrów i powoli nabierz 30 mikrolitrów stopionej nasadki lipidowej. Fiolka z lipidami.

Lipid powinien być przechowywany pod azotem lub argonem w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Powoli dostarczyć jak najwięcej stopionego lipidu do otwartego końca strzykawki. Uważając, aby nie wprowadzać szczelin powietrznych.

Umieścić tłok w lufie w kontakcie ze stopionym lampartem i powoli przesuwać tłok w górę lufy ze strzykawką trzymaną pionowo. Jak pokazano, uwięziony pęcherzyk powietrza przypadkowo unosi się w tym procesie i jest uwalniany. Mamy teraz w beczce korek stopionego lipidu, którego objętość musisz dokładnie określić.

Można to zrobić, odczytując oznaczenia na cylindrze strzykawki. W tym przypadku objętość wynosi 23 mikrolitry, co jest zapisywane w zeszycie laboratoryjnym. Wsuń futro na igłę wystającą ze złączki.

Za pomocą tłoka wtłoczyć stopiony lipid w górę cylindra i powoli i delikatnie do igły w rdzeniu łącznika. Jeśli igła jest lekko przepełniona, lipid będzie widoczny na jej otwartym końcu. Poprzez lekkie cofnięcie tłoka, nadmiar lipidu może zostać wycofany do łącznika, aż zrówna się z końcówką igły łącznika.

W takim przypadku łącznik strzykawki jest w pełni załadowany i gotowy do połączenia ze strzykawką białkową. Roztwór należy wirować w temperaturze 14 000 g przez 10 minut, pięć do 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby usunąć duże kruszywa. Przed rozpoczęciem prób krystalizacji należy pobrać roztwór białka z wiadra na lód i zrównoważyć go w temperaturze pokojowej.

Obliczyć objętość białka, a więc roztwór do użycia do utworzenia fazy sześciennej w temperaturze lub bliskiej pełnego uwodnienia dla oleanu a 20 stopni Celsjusza. Pełne nawodnienie wodą następuje przy blisko 40% masy wody, jak na schemacie fazowym. Przypomnijmy, że załadowaliśmy do strzykawki lipidowej 23 mono o gęstości 0,94 miligrama na mikrolitr.

Odpowiada to 21,6 miligramom lipidów, a zatem 21,6 razy cztery podzielone przez sześć lub 14,4 miligramów lub 14,4 mikrolitrów roztworu białkowego za pomocą 25 lub 50 mikrolitrowej strzykawki Hamiltona należy pobrać wymaganą objętość roztworu białkowego, przenieść roztwór na teflonową końcówkę tłoka w cylindrze roztworu białkowego. Uważając, aby uniknąć pęcherzyków powietrza, ostrożnie wyjąć igłę i zmierzyć objętość roztworu białkowego w strzykawce. Powinna być zgodna z wartością dostarczoną w poprzednim kroku.

W ramach przygotowań do połączenia ze strzykawką wypełnioną lipidami. Ostrożnie wciśnij roztwór białka w górę beczki, aby zrównał się z jego otwartym końcem. Można to zaobserwować, patrząc w dół przez końcówkę lufy.

Roztwór białka wargowego, załadowane strzykawki są teraz gotowe do połączenia w ramach przygotowań do Mex, aby to zrobić, wkręć strzykawkę białkową w otwarty koniec łącznika przymocowanego do strzykawki lipidowej. Po połączeniu dwóch strzykawek za pomocą łącznika. Powinna istnieć ciągła objętość płynu od lipidu w jednej strzykawce przez łącznik do roztworu białkowego w drugiej strzykawce.

W ramach przygotowań do mieszania, zmontowane urządzenie jest trzymane w jednej strzykawce w prawej ręce, a drugiej w lewej. Moment obrotowy jest przykładany do obu luf aż do łącznika, używając palców i kciuków obu rąk, aby upewnić się, że uszczelnienie do bruzd w sprzęgu pozostaje nienaruszone po dokręceniu. Zmontowane urządzenie mieszające na tym etapie uszkodzi ALS i spowoduje wyciek podczas dokręcania, co również doprowadzi do wycieku.

Jest to kwestia doświadczenia z nieuniknionymi próbami i błędami oraz sporadycznymi stratami próbki. Dlatego warto poćwiczyć z roztworem lipidów i wody lub roztworem buforowym, aby wyczuć system przed rozpoczęciem stosowania cennego roztworu białkowego w celu wpłynięcia na mieszanie, przesuń tłok po stronie białka zmontowanej jednostki mieszającej do jej granic za pomocą kciuka lub palca wskazującego, wypychając roztwór białka ze strzykawki białkowej przez łącznik do strzykawki lipidowej. Jeśli urządzenie zostało skutecznie uszczelnione, działanie to spowoduje równy i przeciwny ruch tłoka po stronie lipidowej.

Tłok po stronie lipidowej jest teraz używany do wprowadzania zawartości strzykawki lipidowej z powrotem przez strzykawkę z białkiem do strzykawki. Ten proces powtarza się wiele razy. Czasami potrzeba stu lub więcej pasaży, aby wytworzyć jednorodną fazę misa.

Na początku mieszania ruch materiału tam iz powrotem przez łącznik może być nierównomierny, a czasami potrzebna jest dodatkowa siła, aby uzyskać mieszanie. Można się tego spodziewać. Początkowemu mieszaniu zwykle towarzyszy rozwój nierównomiernego zmętnienia próbki i oczekuje się ponownego zmętnienia.

W miarę postępu homogenizacji. Tekstura wyczuwana przez siłę potrzebną do przesuwania tłoków do przodu i do tyłu staje się bardziej jednolita i charakterystyczna dla fazy sześciennej lepka, podobnie jak wizualny wygląd wyłaniającej się fazy sześciennej. Jeśli warunki są odpowiednie i tworzy się faza sześcienna, dyspersja powinna wydawać się optycznie przezroczysta w cylindrze strzykawki.

W związku z tym oznaczenia na cylindrze strzykawki powinny być wyraźnie czytelne przez fazę mezo w cylindrze. W przypadku białek barwionych faza mezo będzie miała barwę białka, ale będzie optycznie przezroczysta. Bardzo lekkie schłodzenie próbki podczas mieszania poprzez umieszczenie mieszalnika strzykawkowego na krótki czas na lodzie może przyspieszyć homogenizację i osiągnięcie przezroczystości.

Ważne jest jednak, aby nie przesadzać z próbką, należy zachować ostrożność, aby uniknąć bardzo energicznego mieszania, ponieważ może to spowodować wzrost temperatury próbki z powodu ogrzewania tarciowego. W tym momencie utworzyła się sześcienna faza misa, a białko jest odtwarzane w lipid blay. Faza misa jest teraz gotowa do dozowania do poszczególnych dołków płytek krystalizacyjnych.

Najpierw jednak faza mezo musi zostać przeniesiona do 10-mikrolitrowej strzykawki Hamiltona zamontowanej na powtarzalnym dozowniku. Rozpocznij ten proces od sprzężenia strzykawki z cienkim dozownikiem. Załadować do strzykawki mease sześcienną.

Wyjąć igłę i tłok ze strzykawki. Pozostaw teflon fal na miejscu. Odkręć nakrętkę mocującą z dozownika za pomocą małej monety.

Przy całkowicie wycofanym ramieniu zapadkowym. Wprowadzić strzykawkę bez tłoka i igły przez pierścień mocujący dozownika. Założyć uszczelkę węzła mocującego od strony skierowanej w stronę strzykawki i mocno przykręcić ją do otwartego końca strzykawki.

Należy zwrócić uwagę, aby upewnić się, że strzykawka jest prawidłowo wyśrodkowana w pierścieniu mocującym i że lufa jest ustawiona równolegle do ramienia grzechotki. Te dwa wymagania są ważne, ponieważ jeśli tłok nie będzie działał swobodnie i przelotowo, ciśnienie w strzykawce źródłowej wzrośnie podczas ładowania i może dojść do wycieku. Przepuścić tłok przez pierścień zaciskowy z nakrętką chwytaka, odkręcić kilka obrotów i wprowadzić tłok do otwartego końca strzykawki.

Do końca wciśnij ramię grzechotki, wsuń tłok do lufy i sprawdź, czy porusza się swobodnie i na wylot w lufie. Jeśli śruba i prowadnica zostały poluzowane, dokręć je ponownie i ponownie sprawdź, czy tłok porusza się swobodnie. I Strzykawka dozująca jest teraz gotowa do załadunku.

Przesunąć tłok po jednej stronie zmontowanego mieszalnika do znaku podziałki zero mikrolitrów. Aby przenieść fazę mezo do drugiej strzykawki i łącznika. Odłączyć pustą strzykawkę z założonym UL od mieszalnika i natychmiast połączyć załadowaną strzykawkę ze złączką przymocowaną do gwintowanego zakończenia strzykawki dozującej o pojemności 10 mikrolitrów.

Stopień szczelności, z jaką odbywa się sprzężenie, ma kluczowe znaczenie. Jak już wspomniano, załadowano strzykawkę dozującą, naciskając tłok strzykawki o pojemności 100 mikrolitrów, aby faza mezo przeszła przez łącznik. Jeśli złącze jest szczelne, a tłok w strzykawce dozującej porusza się swobodnie, wówczas tłok powinien zacząć poruszać się w kierunku ruchu tłoka ładującego w miarę napełniania strzykawki dozującej.

Odłączyć strzykawkę ładującą od złącza dołączonego do strzykawki dozującej. Przymocować krótką, płaską końcówkę igły do stalowego zakończenia strzykawki dozującej i ostrożnie ją dokręcić. Zacisnąć tłok na ramieniu grzechotki, zaciskając węzeł w pierścieniu chwytającym.

Należy uważać, aby nie zacisnąć zbyt mocno węzła. Ponieważ może to spowodować nacięcie i deformację tłoka, czyniąc go bezużytecznym. Ważne jest, aby zakres ruchu zapewniony ramieniu grzechotki w stanie zaciśniętym był ograniczony do nie więcej niż jednego cala.

Jak pokazano poza tym, tłok będzie miał tendencję do wyginania się, a dostawa może się nie powieść. L wciśnij kilkakrotnie bęben zapadkowy, aby przesunąć tłok w cylindrze, wypełniając w ten sposób pustą objętość igły i ładując igłę. Ten krok należy powtarzać do 10 razy, aż z końcówki igły wyłoni się ciągły sznurek fazy mesa.

Igła jest teraz gotowa do użycia w przygotowaniu prób krystalizacji, które powinny rozpocząć się natychmiast. Nie zaleca się utrzymywania fazy sześciennej naładowanej białkiem zbyt długo przed rozpoczęciem prób krystalizacji. Ponieważ niektóre białka są niestabilne w fazie sześciennej bez dodatku środka strącającego, umieść wielodołkową płytkę krystalizacyjną i szkiełko nakrywkowe na powierzchni podniesionej kilka cali nad ławkę, aby ułatwić ładowanie.

Optymalny kontrast i lepszą widoczność uzyskuje się, gdy powierzchnia jest lekko ciemna. Homogenizować roztwory strącające i odkorkować fiolki. Ustaw propyslet dozujący środek strącający na jeden mikrolitr ze strzykawką dozującą trzymaną pionowo w jednej ręce, wolną ręką umieść końcówkę igły pośrodku i bezpośrednio nad podstawą studni.

Numer jeden. Naciśnij przycisk na dozowniku powtarzalnym, aby wyrzucić bolus mease na szklaną powierzchnię. Objętość bolusa wynosi 200 nanolitrów.

Gdy standardowy dozownik powtarzalny jest używany ze strzykawką o pojemności 10 mikrolitrów, końcówka igły nie powinna znajdować się więcej niż kilkaset mikrometrów nad podstawą studzienki Aby zapewnić prawidłowe dostarczanie, łatwo jest osiągnąć powtarzalne dostarczanie. Wymaga to tylko odrobiny wprawy. Po załadowaniu czterech sąsiednich studzienek mease, umieść jeden mikrolitr roztworu strącającego na wierzchu każdego bolusa mease.

Używając dwóch mikrolitrów na patent i standardowych jednorazowych końcówek tak szybko, jak to możliwe, umieść szkiełko nakrywkowe prostopadle na wypełnionych studzienkach, aby przykryć je równomiernie, aby uzyskać wodoszczelne uszczelnienie. Za pomocą szpatułki dociśnij szkiełko nakrywkowe w miejscu, w którym styka się ono z odsłoniętą, lepką powierzchnią taśmy dystansowej. Proces dozowania nawozu i środka strącającego można powtarzać, aż wszystkie dołki na płytce zostaną załadowane i uszczelnione.

Płytka jest teraz gotowa do inspekcji i inkubacji. Oznacz tabliczkę wyraźnie w celu śledzenia. Białka wrażliwe na światło są zwykle obsługiwane przez owinięcie płytek w folię aluminiową przed umieszczeniem ich w komorze inkubacyjnej.

Można je usunąć i zbadać pod mikroskopem w stonowanym lub odpowiednio zabarwionym świetle. Umieść talerze w komorze o kontrolowanej temperaturze, zwykle w temperaturze 20 stopni Celsjusza lub mniej więcej według regularnego harmonogramu. Sprawdź ścianki pod kątem wzrostu kryształów za pomocą mikroskopu światła spolaryzowanego o 10 lub 20-krotnym mianie.

Obiektywny, harmonogram używany w laboratorium autora jest następujący, dzień 0 1 2 3 5 7 14 21 30 po zestawie. Dokładnie sprawdź bolus mease. Regulacja głębokości ostrości w próbce o grubości 140 mikronów.

Badanie powinno być wykonywane zarówno w normalnym świetle, jak i pomiędzy skrzyżowanymi polaryzatorami, bezbarwnymi kryształami białka błonowego rosnącymi w fazie sześciennej, gdy są oglądane w normalnym świetle. Wyglądaj tak. Bezbarwne kryształy białek błonowych rosnące w mezo, gdy są oglądane w świetle spolaryzowanym, wyglądają tak lub inaczej, naturalnie zabarwione białka błonowe rosnące w mezo, gdy są oglądane w normalnym świetle, wyglądają tak lub tak.

Kolejnymi krokami w ogólnym procesie oznaczania strukturalnego są zbieranie i chłodzenie kriogeniczne kryształów oraz rejestrowanie i przetwarzanie dyfrakcji promieniowania rentgenowskiego z nich. Tematy te są omówione w osobnych artykułach JoVE w tej serii.