Formulacja i charakterystyka czynnika bioaktywnego zawierającego nanodyski

Protokół ten dostarcza praktycznej wiedzy, przydatnej do formułowania cząstek w nanoskali, tj. nanodysków, które stabilnie zawierają szeroki zakres hydrofobowych cząsteczek bioaktywnych. Ta metoda ma wiele praktycznych zastosowań.

Zdolność do nadawania rozpuszczalności w wodzie związkom bioaktywnym, które w inny sposób byłyby nierozpuszczalne, pozwala na stosowanie nanodysków w zastosowaniach związanych z dostarczaniem leków. Opisana metoda jest prosta. Preferowane jest przeprowadzanie badań w opisanej skali, pięć miligramów fosfolipidu, dwa miligramy białka rusztowania, tak aby tworzenie się nanodysków było łatwo monitorowane przez oględziny.

Procedurę zademonstrują Michael Karo i Matthew Swackhammer, studenci studiów licencjackich w laboratorium Ryana. Aby przygotować podwielokrotność fosfolipidową, należy zważyć pięć miligramów DMPC i przenieść go do szklanej probówki. Rozpuść fosfolipid, dodając 300 mikrolitrów chloroformu i 100 mikrolitrów metanolu w stosunku trzy do jednego.

Odparować rozpuszczalnik organiczny, umieszczając szklaną probówkę pod delikatnym strumieniem azotu na 10 do 15 minut, tak aby wzdłuż ścianek dolnej części probówki utworzyła się cienka warstwa wysuszonego fosfolipidu. Aby sformułować amfoterycynę B lub AmpB-Nanodyski, odpipetuj 450 mikrolitrów PBS do liofilizowanej podwielokrotności fosfolipidów i wiruj przez 30 sekund w celu rozproszenia lipidu. Odpipetować 50 mikrolitrów po 20 miligramów na mililitr podstawowego roztworu AmpB do zdyspergowanej próbki fosfolipidów i wiru.

Dodaj 500 mikrolitrów po cztery miligramy na mililitr białka rusztowania ApoE4 NT do szklanej probówki zawierającej zdyspersjonowany fosfolipid i AmpB. Kąpiel sonikować próbkę w temperaturze 24 stopni Celsjusza, aż roztwór się klaruje. W przypadku dializy AmpB-Nanodisk należy przygotować odcinek rurki do dializy, dokładnie mocząc ją w destylowanej wodzie dejonizowanej przez 10 minut.

Używając rurki do dializy clamp, zaciśnij jeden koniec namoczonego przewodu dializacyjnego, upewniając się, że płyn nie może się wydostać. Włożyć wąski lejek z szyjką do otwartego końca rurki do dializy i przenieść próbkę AmpB-Nanodisk do rurki dializy. Wyjąć lejek i zacisnąć koniec rurki dializacyjnej za pomocą innego zacisku rurki do dializy.

Umieścić piankowy pływak do dializy na jednym z uszczelnionych końców rurki do dializy i umieścić zmontowany przewód do dializy w zlewce zawierającej świeżo przygotowany bufor PBS o pojemności jednego litra. Umieść mieszadło magnetyczne na dnie zlewki i ustaw regulator mieszania na niski poziom, uważając, aby nie wytworzyć wiru. Pozwól dializie kontynuować się przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Włącz spektrofotometr, przestawiając przełącznik zasilania i połącz się z odpowiednim komputerem pomocniczym, naciskając przycisk sterowania PC. Na komputerze pomocniczym otwórz oprogramowanie oznaczone UVProbe 2.61 i połącz się ze spektrofotometrem, klikając połącz"w lewym dolnym rogu. Kliknij spektrum, a następnie kliknij metodę"na górnym pasku narzędzi.

Kliknij kartę pomiaru i wprowadź 500 w polu startowym"pole tekstowe znajdujące się pod zakresem długości fali, a 300 na końcu"pole tekstowe. Kliknij menu rozwijane obok zakładki oznaczonej prędkość skanowania" i ustaw ją na średnią. Przygotuj próbkę ślepej próbki, przenosząc jeden mililitr DMSO do dwóch kuwet kwarcowych.

Załaduj obie kuwety do odpowiednich portów próbki spektrofotometru. Kliknij automatyczne puste"i nagraj widmo od 300 do 500 nanometrów, klikając start"w lewym dolnym rogu. W przypadku standardowej analizy spektralnej AmpB wyjmij kuwetę z przedniego portu próbki i dodaj 20 mikrolitrów jednego miligrama na mililitr roztworu podstawowego AmpB.

Załaduj kuwetę z powrotem do płytki próbki i kliknij start", aby zapisać absorbancję próbki. Po zarejestrowaniu absorbancji próbki wyjąć kuwetę i zdekantować zawartość płynu do pojemnika na odpady. Dokładnie wypłucz kuwetę trzema płukaniami wody dejonizowanej, a następnie trzema praniami 70% etanolem.

Do analizy spektralnej zakłóconego AmpB-Nanodisk należy przygotować próbkę, pipetując 20 mikrolitrów jednego miligrama na mililitr materiału AmpB-Nanodisk do jednego mililitra DMSO i inkubować przez minutę przed zapisaniem widma. Załaduj kuwetę do przedniego portu próbki i kliknij start", aby zarejestrować absorbancję próbki. Do analizy spektralnej ślepej próby buforowej PBS należy przygotować ślepą próbę, przenosząc jeden mililitr PBS do dwóch kuwet kwarcowych.

Załaduj kuwety do portu próbki. Kliknij automatyczne puste "i nagraj widmo od 300 do 500 nanometrów. W celu analizy spektralnej niezakłóconej próbki AmpB-Nanodisk należy wyjąć kuwetę z przedniego portu próbki i dodać 20 mikrolitrów jednego miligrama na mililitr próbki AmpB-Nanodisk do bufora PBS.

Załaduj kuwetę z powrotem do płytki próbki. Kliknij start" i nagraj sample spektrum. Reakcję formulacji AmpB-Nanodisk uważa się za zakończoną, gdy wygląd próbki przechodzi od mętnego do klarownego.

Pokazano spektroskopię absorpcyjną w zakresie widzialnym UV próbek AmpB w DMSO i PBS. W DMSO zaobserwowano trzy charakterystyczne maksima absorbancji na 372, 392 i 415 nanometrach, piki wskazujące na AmpB. Widma absorbancji AmpB-Nanodysków w PBS wykazały pojedynczy główny pik absorbancji przy krótszej długości fali.

Dla porównania, widma absorbancji AmpB-Nanodysków w DMSO wydawały się podobne do widm standardowego AmpB. Aktywność biologiczną AmpB-Nanodysków przeprowadzono poprzez ocenę testów hamowania wzrostu drożdży. Próbki kontrolne, takie jak PBS, DMSO i odtworzone lipoproteiny o wysokiej gęstości, wykazały, że składniki nanodysków inne niż AmpB nie mają zauważalnego wpływu na wzrost drożdży.

Kontrola pozytywna potwierdziła, że AmpB jest skutecznym inhibitorem wzrostu drożdży. W przypadku AmpB-Nanodysków zaobserwowano zależną od stężenia aktywność hamowania wzrostu. Nie wszystkie preparaty nanodysków są takie same.

Niektóre mogą wymagać więcej czasu, różnych lipidów lub różnych białek rusztowania. Są one tylko niewyraźne} jest wyjaśnienie próbki nanodysku. Technika ta doprowadziła do powstania nowych nanocząstek wykorzystywanych do badania kardiotoksyczności indukowanej doksorubicyną, apoptozy, interakcji ligandów i dostarczyła wielu nierozpuszczalnych w wodzie cząsteczek bioaktywnych, w tym luteiny i kurkuminy.