Name: Multimodalne hierarchiczne obrazowanie odcinków szeregowych w celu znalezienia określonych celów komórkowych w dużych objętościach (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-20T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: Poznaj multimodalne hierarchiczne obrazowanie odcinków szeregowych w celu identyfikacji celów komórkowych w dużych objętościach tkankowych. Ta metoda łączy mikroskopię świetlną z SEM wysokiej rozdzielczości.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez grant FKZ 13GW0044 z niemieckiego Federalnego Ministerstwa Edukacji i Badań, projekt MorphiQuant-3D. Dziękujemy Carolin Bartels za wsparcie techniczne.

<ol><li>Peddie, C. J., Collinson, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+third+dimension%3A+Volume+electron+microscopy+comes+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Micron%22%5BJournal%5D)">Exploring the third dimension: Volume electron microscopy comes of age.</a> Micron. 61, 9-19 (2014).</li>
<li>Wanner, A. A., Kirschmann, M. A., Genoud, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+of+microtome-based+serial+block-face+scanning+electron+microscopy+in+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">Challenges of microtome-based serial block-face scanning electron microscopy in neuroscience.</a> J Microsc. 259 (2), 137-142 (2015).</li>
<li>Kizilyaprak, C., Daraspe, J., Humbel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focused+ion+beam+scanning+electron+microscopy+in+biology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">Focused ion beam scanning electron microscopy in biology.</a> J Microsc. 254 (3), 109-114 (2014).</li>
<li>Wacker, I., Schröder, R. R. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/jmi.12087/full">Array tomography.</a> J Microsc. 252 (2), 93-99 (2013).</li>
<li>Tapia, J. C., Kasthuri, N., Hayworth, K. J., Schalek, R., Lichtman, J. W., Smith, S. J., Buchanan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-contrast+en+bloc+staining+of+neuronal+tissue+for+field+emission+scanning+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+protoc%22%5BJournal%5D)">High-contrast en bloc staining of neuronal tissue for field emission scanning electron microscopy.</a> Nat protoc. 7 (2), 193-206 (2012).</li>
<li>Lucas, M. S., Günthert, M., Gasser, P., Lucas, F., Wepf, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bridging+Microscopes%3A+3D+Correlative+Light+and+Scanning+Electron+Microscopy+of+Complex+Biological+Structures%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Bridging Microscopes: 3D Correlative Light and Scanning Electron Microscopy of Complex Biological Structures.</a> Methods Cell Biol. 111, 325-356 (2012).</li>
<li>De Boer, P., Hoogenboom, J. P., Giepmans, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlated+light+and+electron+microscopy%3A+ultrasructure+lights+up%21%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Correlated light and electron microscopy: ultrasructure lights up!</a> Nat Methods. 12 (6), 503-513 (2015).</li>
<li>Verkade, P., Müller-Reichert, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aVerkade%2C+P+%22Methods+in+Cell+Biology+Correlative+Light+and+Electron+Microscopy+III%22">Methods in Cell Biology Correlative Light and Electron Microscopy III</a>. 140, 1st ed, Elsevier. 1-352 (2017).</li>
<li>Gibson, K. H., Vorkel, D., Meissner, J., Verbavatz, J. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescing+the+Electron%3A+Strategies+in+Correlative+Experimental+Design%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescing the Electron: Strategies in Correlative Experimental Design.</a> Methods Cell Biol. 124, 23-54 (2014).</li>
<li>Wacker, I., Schröder, R. R., Schroeder, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathology+goes+3D%3A+Exploring+the+potential+of+array+tomography+versus+FIB+nanotomography+for+a+CADASIL+sample%5BTitle%5D)+AND+%22Ultrastruct+Pathol%22%5BJournal%5D)">Pathology goes 3D: Exploring the potential of array tomography versus FIB nanotomography for a CADASIL sample.</a> Ultrastruct Pathol. 41 (1), 114-115 (2017).</li>
<li>Wacker, I., Spomer, W., Hofmann, A., Thaler, M., Hillmer, S., Gengenbach, U., Schröder, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hierarchical+imaging%3A+a+new+concept+for+targeted+imaging+of+large+volumes+from+cells+to+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Hierarchical imaging: a new concept for targeted imaging of large volumes from cells to tissues.</a> BMC Cell Biol. 17 (1), 38(2016).</li>
<li>Hayworth, K. J., Morgan, J. L., Schalek, R., Berger, D. R., Hildebrand, D. G. C., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+ATUM+ultrathin+section+libraries+with+WaferMapper%3A+a+multi-scale+approach+to+EM+reconstruction+of+neural+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">Imaging ATUM ultrathin section libraries with WaferMapper: a multi-scale approach to EM reconstruction of neural circuits.</a> Front Neural Circuits. 8, Article 68 (2014).</li>
<li>Micheva, K. D., O'Rourke, N., Busse, B., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Array+Tomography%3A+Production+of+Arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Array Tomography: Production of Arrays.</a> Cold Spring Harb Protoc. 11, 1267-1269 (2010).</li>
<li>Fahrenbach, W. H. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/jemt.1060010407/abstract">Continuous serial thin sectioning for electron microscopy.</a> J. Elec. Microsc. Tech. 1 (4), 387-398 (1984).</li>
<li>Harris, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uniform+serial+sectioning+for+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Uniform serial sectioning for transmission electron microscopy.</a> J Neurosci. 26 (47), 12101-12103 (2006).</li>
<li>Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., Frise, E., Kaynig, V., Longair, M., Pietzsch, T., Preibisch, S., Rueden, C., Saalfeld, S., Schmid, B., Tinevez, J. -Y., White, D. J., Hartenstein, V., Eliceiri, K., Tomancak, P., Cardona, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Cardona, A., Saalfeld, S., Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., Preibisch, S., Longair, M., Tomancak, P., Hartenstein, V., Douglas, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TrakEM2+software+for+neural+circuit+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">TrakEM2 software for neural circuit reconstruction.</a> PLoS ONE. 7 (6), e38011(2012).</li>
<li>Micheva, K. D., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Array+Tomography%3A+A+new+tool+for+imaging+the+molecular+architecture+and+ultrastructure+of+neural+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Array Tomography: A new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits.</a> Neuron. 55 (1), 25-36 (2007).</li>
</ol>

KIT otrzymał zwrot kosztów od Boeckeler Instruments za dostarczenie funkcjonalnego modelu uchwytu podłoża. Marlene Thaler jest pracownikiem firmy ZEISS Microscopy GmbH, producenta systemów mikroskopowych, o których mowa w tym artykule. Ponadto ZEISS oferuje pewne rozwiązania, takie jak pakiety rozwiązań ZEISS Atlas do szerokiego zakresu zastosowań w obrazowaniu 3D dużych obszarów dla instrumentów SEM i FIB-SEM. Wszyscy pozostali autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Zademonstrowano przepływ pracy do celowania w określone komórki w tkance za pomocą multimodalnego hierarchicznego AT: próbka zanurzona w żywicy jest krojona na tablice szeregowych sekcji, które są umieszczane na podłożu przewodzącym za pomocą specjalnie zaprojektowanego uchwytu podłoża. Po znakowaniu fluoroforem i zobrazowaniu w FLM, zrekonstruowana objętość jest wykorzystywana do selekcji komórek docelowych. Po dodatkowym barwieniu metalami ciężkimi w celu wprowadzenia kontrastu, cele te są obrazowane na kilkuset odcinkach w rozdzielczości nanoskali w SEM przy użyciu zautomatyzowanej platformy oprogramowania.
Do produkcji gęsto upakowanych macierzy z kilkoma długimi wstęgami niezbędny jest uchwyt podłoża podobny do opisanego tutaj. Wprawna i cierpliwa osoba może być w stanie przymocować kilka taśm do podłoża silikonowego, częściowo zanurzonego w łodzi z nożem, i odzyskać matrycę, stopniowo obniżając poziom wody, aż wstążki osiądą na podłożu. Jednak z naszego doświadczenia wynika, że istnieje tendencja do pękania, gdy podłoże dotyka jakiejkolwiek części łodzi nożowej (por. uwaga w 1.3.2 w protokole). Ponadto procedura ta jest znacznie trudniejsza w przypadku podłoży pokrytych ITO: (1) ze względu na przezroczystość szkła ITO trudno jest dostrzec krawędź wody, do której należy przymocować końce wstążek; oraz (2) ponieważ powierzchnia pokryta ITO jest znacznie bardziej szorstka niż wysoce wypolerowana płytka krzemowa, wstęgi mają tendencję do pękania podczas podnoszenia, a mniejsze fragmenty składające się z kilku sekcji mogą unosić się na wodzie, niszcząc w ten sposób kolejność sekcji.
Cały przepływ pracy jest również możliwy do zrealizowania bez korelacji z danymi FLM. W takim przypadku może być konieczne zebranie danych w SEM w kilku sesjach. Wstępna rekonstrukcja 3D lub przynajmniej ocena danych o niskiej lub średniej rozdzielczości może być konieczna do zidentyfikowania celów. Ponadto można stosować konwencjonalne barwienia histologiczne dla LM jasnego pola (niewymagające FLM). Oczywiście, inne opcje 6,7,8 to znakowanie przeciwciał na matrycach, jak już wykazano w początkowym artykule na temat AT18, lub genetycznie kodowane białka fluorescencyjne (XFP) lub wstępne osadzanie znakowania z zachowaniem fluorescencji podczas przygotowywania próbki.
Ogólnym ograniczeniem omawianej metody jest użycie przekrojów o określonej grubości i wynikające z tego dyskretne próbkowanie objętości 3D: Rozdzielczość w Z może być tylko tak dobra, jak grubość przekrojów, ponieważ SEM zbiera tylko dane z powierzchni przekroju (w zależności od wybranej energii pierwotnej/energii lądowania). Oznacza to, że uzyskana objętość 3D ma woksele anizotropowe, np. 5 x 5 x 100 nm3 jeśli użyte są odcinki 100 nm i rozmiar piksela obrazu 5 nm. W przypadku bardzo małych jednostek w zakresie rozmiarów poniżej 1 μm może to nie wystarczyć do prawdziwego opisu ultrastrukturalnego. Bardziej technicznym ograniczeniem jest dokładność etapu używanego w SEM do automatycznego obrazowania. Z tego powodu konieczne jest wybranie zwrotu z inwestycji większego niż specyfikacja dokładności stolika, aby zagwarantować, że obrazowany jest cały obszar docelowy.
W porównaniu z SBF-SEM i FIB-SEM jako metodami obrazowania blokowego, korelacyjny AT ma ostateczną wadę w postaci wokseli anizotropowych, jak opisano powyżej. Dzięki FIB-SEM można uzyskać woksele izotropowe o wymiarach 5 x 5 x 5 nm3 przy odpowiedniej korekcie dryftu.
Luki w zrekonstruowanej objętości spowodowane utratą sekcji podczas przygotowywania macierzy mogą być również problemem, który nie występuje w przypadku SBF-SEM lub FIB-SEM. Przy dobrej stabilizacji wstążki za pomocą kleju zwykle stanowi to problem tylko w przypadku ostatniego odcinka wstążki: może ona zostać uszkodzona podczas zdejmowania jej z krawędzi noża za pomocą rzęsy. Jednak z naszego doświadczenia wynika, że utrata jednej sekcji na 20–50 sekcji nie ma wpływu na rejestrację obrazu.
Z drugiej strony, możliwość post-stainingu zapewnia dobry sygnał i kontrast dla obrazowania SEM, nawet w przypadku słabo zmetalizowanych próbek, takich jak pokazane tutaj zamrożone końcówki korzeni pod wysokim ciśnieniem. W związku z tym nie jest konieczne rezygnowanie z optymalnej ochrony ultrastrukturalnej poprzez liczne etapy chemicznego utrwalania i metalizacji. Również rutynowe próbki z laboratorium patomorfologicznego o średnim stopniu metalizacji dostarczają doskonałych danych10. Takie wzmocnienie kontrastu po osadzeniu nie jest możliwe w przypadku SBF-SEM i FIB-SEM w ogóle. Ponadto, ponieważ metody te są destrukcyjne, tj. konsumpcja próbki podczas obrazowania, obrazowanie hierarchiczne w różnych rozdzielczościach i miejscach lub wielokrotne obrazowanie w późniejszych momentach jest niemożliwe. Zasadniczo nieograniczone objętości, składające się z dużych pól widzenia (np. do kilku milimetrów dla całych mózgów myszy w konektomice) utworzonych przez zszywanie mozaik, oraz ogromna liczba sekcji mogą być uzyskane przez AT, podczas gdy w FIB-SEM pola widzenia powyżej 100 μm x 100 μm są trudne do osiągnięcia za pomocą rutynowych instrumentów.
Dalsza automatyzacja opisanego przepływu pracy AT byłaby niewątpliwą zaletą, ponieważ wyżej wymienione metody SBF-SEM i FIB-SEM wykonują zarówno sekcje, jak i obrazowanie w tym samym instrumencie w sposób w pełni zautomatyzowany. Istnieje jeden rodzaj automatyzacji sekcji: ATUMtome12 może generować i zbierać tysiące sekcji, ale użycie taśmy kaptonowej jako podłoża sprawia, że takie tablice są trudne do zobrazowania w FLM. Na stosowanych tutaj szkiełkach nakrywkowych z powłoką ITO powinno być możliwe nawet obrazowanie w super rozdzielczości. Kolejnym, bardzo pożądanym celem automatyzacji byłoby rejestrowanie stosów danych FLM. Z drugiej strony, automatyzacja może być kosztowna i z wyjątkiem uchwytu na podłoże, przedstawiony tutaj przepływ pracy opiera się (pod względem sprzętu) tylko na oprzyrządowaniu zwykle dostępnym w rutynowym laboratorium EM lub głównym obiekcie, co sprawia, że dostęp do niego jest niski.

Do rekonstrukcji dużych objętości tkanek w ultrastrukturalnej rozdzielczości użyto wielu różnych podejść do obrazowania opartych na SEM1: Dostępne są kompleksowe recenzje, np. dla SBF-SEM2, FIB-SEM3, oraz Array Tomography (AT)4. Podczas gdy w przypadku tej drugiej metody materiał próbki jest zachowywany jako tablica szeregowych przekrojów na podłożu, SBF-SEM i FIB-SEM są metodami destrukcyjnymi, działającymi na bloku próbki i zużywającymi go podczas obrazowania. Ze względu na ładunek żywicy w SEM, są one również zależne od silnie metalizowanych bloków próbki5.
Z drugiej strony, identyfikacja pewnych komórek lub struktur będących przedmiotem zainteresowania w próbce tkanki może przynieść korzyści szczególnie dzięki korelacyjnej mikroskopii świetlnej i elektronowej (CLEM)6,7,8. Użycie FLM do celowania wyklucza zastosowanie dużych ilości metali ciężkich, ponieważ spowodowałoby to wygaszenie sygnału fluorescencji9. W przypadku takich tylko nieznacznie zmetalizowanych próbek, AT jest metodą z wyboru, ponieważ matryce mogą być łatwo wybarwione metalem ciężkim po obrazowaniu LM. Co więcej, prawie każdy rodzaj próbki może być użyty do AT, nawet rutynowe próbki ze skrzyni skarbów patologa10.
Kolejną dużą zaletą AT jest potencjał do hierarchicznego11 lub obrazowania wielorozdzielczego12: Nie jest konieczne obrazowanie wszystkiego w wysokiej rozdzielczości, ponieważ cele mogą być wybrane w innym trybie (np. FLM) lub na obrazach SEM o niskiej rozdzielczości. Obrazowanie tylko interesujących obszarów populacji tkanek lub komórek w wysokiej rozdzielczości oszczędza miejsce do przechowywania danych cyfrowych i tworzy mniejsze zestawy danych obrazowych, które są łatwiejsze w obsłudze. W tym przypadku przepływ pracy AT jest demonstrowany przy użyciu dość słabo zmetalizowanej próbki: zamrożonych pod wysokim ciśnieniem korzeni roślin (Arabidopsis thaliana) zatopionych w żywicy hydrofilowej.
Jak tablice są przygotowywane, barwione i obrazowane zarówno w FLM, jak i SEM, oraz jak rejestrowane są stosy obrazów. Zilustrowano również, w jaki sposób rekonstrukcja 3D objętości FLM może być wykorzystana do wyboru określonych komórek do obrazowania w SEM w rozdzielczości nanoskali.

<table><tbody><tr><td>Oprzyrządowanie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultramicrotome</td><td>RMC</td><td>PT-PC</td><td>Alternatywa: Leica UC7</td></tr><tr><td>Uchwyt podłoża</td><td>RMC</td><td>ASH-100</td><td>Alternatywa: domowy</td></tr><tr><td>odkurzacz plazmowy</td><td>Diener</td><td>Zepto 40kHz</td><td>Alternatywy: Ted Pella Pelco lub inny stacjonarny odkurzacz plazmowy Przykładowe parametry dla Diener Zepto z generatorem 40kHz (0-100W); 0,5 mbar, 5 sccm (powietrze), 10% wydajności&nbsp;</td></tr><tr><td>Szerokokątny mikroskop fluorescencyjny</td><td>Zeiss</td><td>Axio Observer.Z1</td><td>Alternatywy: Leica, Nikon, Olympus</td></tr><tr><td>Zestaw filtrów fluorescencyjnych</td><td>Zeiss</td><td>43 HE (Cy3/DsRed)</td><td></td></tr><tr><td>Soczewka obiektywowa</td><td>Zeiss</td><td>Zeiss Neofluar 40x</td><td>&nbsp; 0.75 NA</td></tr><tr><td>Przyzwoita stacja robocza zdolna do obsługi danych</td><td></td><td></td><td></td>obrazu o rozmiarze GB</tr><tr><td>FESEM</td><td>Zeiss</td><td>Ultra 55</td><td>Alternatywy: FEI, Jeol, Hitachi, TESCAN</td></tr><<tr><td>strong>Nazwa</td><td>Company</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Sectioning</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Żyletki</td><td>Plano</td><td>T585-V</td><td></td></tr><tr><td>Nóż diamentowy do przycinania 45&deg;</td><td>Diatome</td><td>DTB45</td><td></td></tr><tr><td>Nóż diamentowy do przycinania 90&deg;</td><td>Diatome</td><td>DTB90</td><td></td></tr><tr><td>Nóż diamentowy Jumbo do cięcia</td><td>Diatome</td><td>DUJ3530</td><td></td></tr><tr><td>Wafel silikonowy (kawałki)</td><td>Si-Mat</td><td>Custom Made</td><td>Doping: P / Bor, orientacja: < 100>, grubość: 525 &plusmn; 25 &mikro; m, rezystywność: 1-30 &Omega;-cm http://si-mat.com/silicon-wafers.html</td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe z powłoką ITO</td><td>Balzers</td><td>Typ Z</td><td>22 &krotnie; 22 &razy; 0,17 mm https://www.opticsbalzers.com/de/produkte/deckglas-fenster/corrslide.html</td></tr><tr><td>Nośnik aluminiowy</td><td>Custom Made</td><td></td><td>76 & razy; 26 mm</td></tr><tr><td>Kleszczyki waflowe</td><td>Ideal-tek</td><td>34A.SA</td><td></td></tr><tr><td>Kciaki kleszcze</td><td>Dumont</td><td>0103-2E1/2-PO-1</td><td>Dumoxel-H 2E 1/2</td></tr><tr><td>Rysik diamentowy</td><td>Plano</td><td>T5448</td><td></td></tr><tr><td>Rzęsy/bardzo miękka sierść kota</td><td>Własna</td><td></td><td>alternatywa:</td></tr><tr><td>Plano Brush</td><td>Selfmade</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Klej kontaktowy</td><td>Pattex Pattex</td><td>PCL3C</td><td>Kraftkleber Classic (żółtawy)</td></tr><tr><td>Fixogum</td><td>Marabu</td><td>290110001</td><td>do mocowania podłoża do nośnika</td></tr><tr><td>Taśma klejąca</td><td>3M</td><td>851</td><td>do mocowania podłoża do nośnika</td></tr><tr><td>Izopropanol</td><td>Bernd Kraft</td><td>07029.4000</td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Carl Roth</td><td>4436</td><td>rozcieńczalnik do mieszanki klejowej</td></tr><tr><td>Rotihistol</td><td>Carl Roth</td><td>6640</td><td>alternatywa, rozcieńczalnik na bazie limonenu</td></tr><tr><td><mocny>Imię i nazwisko</td><td>Company</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Przetwarzanie obrazu</td><td>Open source</td><td>Fidżi (http://fiji.sc/#download)</td><td></td></tr><tr><td>Akwizycja obrazu</td><td>Zeiss</td><td>Atlas 5 AT (moduł dla Zeiss SEM)</td><td>Alternatywa dla automatycznego pozyskiwania obrazów: WaferMapper: https://software.rc.fas.harvard.edu/lichtman/LGN/WaferMapper.html</td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</strong</td></tr><tr><td>>Staining</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Propidiumjodek</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4170</td><td>Roztwór podstawowy: 1,5 mM w 0,1% azydku sodu</td></tr><tr><td>Octan uranyoctanu</td><td></td><td>E22400</td><td></td></tr><tr><td>Azotan ołowiu(II)</td><td>Merck</td><td>107398</td><td></td></tr><tr><td>Cytrynian trisodu Dihydrat</td><td>Merck</td><td>106448</td> Granulki NaOH Merck 106469 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1M</td><td>Bernd Kraft</td><td>01030.3000</td><td></td></tr><tr><td>Szklana szalka</td><td>Petriego Duran</td><td>23 755 56</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Uwagi</td></tr><tr><td>Montaż</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stubs</td><td>Plano</td><td>G301F</td><td></td></tr><tr><td>Klocki węglowe</td><td>Plano</td><td>G3347</td><td></td></tr><tr><td>Taśma miedziana</td><td>Plano</td><td>G3397</td><td>dwustronny klej, przewodząca</td></tr><tr><td>Farba srebrna</td><td>Plano</td><td>G3692</td><td>Acheson Elektrodag 1415M</td></tr><tr><td><silny>Nazwa</mocny></td><td><silny>Firma</silny></td><td><silny>Numer katalogowy</td><td>Uwagi</td></tr><tr><td>Roztwory/mieszaniny</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mieszanina klejowa do bloków</td><td></td><td></td> powlekających <td>Klej kontaktowy Pattex / ksylen jako rozcieńczalnik, stosunek 1:3, (Alternatywa dla ksylenu: Rotihistol)</td></tr><tr><td>Reynolds cytrynian</td><td></td><td></td> ołowiu <td>50 ml: Rozpuść 1,33 g azotanu ołowiu(II) w 10 ml dH2O. Rozpuść 1,76 g dwuwodnego cytrynianu trisodu w 10 ml mieszanki dH2O. oba i dodać 1 M wodorotlenku sodu, aż roztwór będzie klarowny. Napełnić dH2O do 50 ml.</td></tr><tr>Roztwór <td></td><td></td><td>barwiący jodku propidyny</td><td>Przygotować rozcieńczenie 1:1500 z zapasu w wirze dH2O. w celu odpowiedniego wymieszania.</td></tr><tr><td>Wodny octan</td><td></td><td></td> uranylu <td>Rozpuścić 3 % octanu uranylu w dH2O (dokładnie wymieszać).</td></tr></tbody></table>

multimodalne hierarchiczne obrazowanie odcinków szeregowych w celu znalezienia określonych celów komórkowych w dużych objętościach

Multimodal Hierarchical Imaging of Serial Sections for Finding Specific Cellular Targets within Large Volumes

Celowanie w konkretne komórki w ultrastrukturalnej rozdzielczości w mieszanej populacji komórek lub tkance można osiągnąć poprzez hierarchiczne obrazowanie za pomocą kombinacji światła i mikroskopii elektronowej. Próbki zatopione w żywicy są dzielone na układy składające się z wstęg o setkach ultracienkich odcinków i osadzane na kawałkach płytki krzemowej lub szkiełkach nakrywkowych pokrytych przewodząco. Matryce są obrazowane w niskiej rozdzielczości za pomocą cyfrowego odbiornika, takiego jak aparat w smartfonie lub mikroskop świetlny (LM) w celu szybkiego przeglądu dużego obszaru, lub mikroskopu fluorescencyjnego o szerokim polu widzenia (mikroskopia światła fluorescencyjnego (FLM)) po znakowaniu fluoroforami. Po barwieniu metalami ciężkimi matryce są obrazowane w skaningowym mikroskopie elektronowym (SEM). Wybór celów jest możliwy z rekonstrukcji 3D wygenerowanych przez FLM lub z rekonstrukcji 3D wykonanych ze stosów obrazów SEM w rozdzielczości pośredniej, jeśli nie są dostępne markery fluorescencyjne. W przypadku analizy ultrastrukturalnej wybrane cele są ostatecznie rejestrowane w SEM w wysokiej rozdzielczości (kilka nanometrów pikseli obrazu). Zademonstrowano narzędzie do obsługi wstęgi, które można zamontować w każdym ultramikrotomie. Pomaga w produkcji tablicy i usuwaniu substratu z noża do sekcji. Omówiono platformę programową, która umożliwia automatyczne obrazowanie macierzy w SEM. W porównaniu z innymi metodami generującymi duże ilości danych EM, takimi jak szeregowy blok SEM (SBF-SEM) lub skupiona wiązka jonów SEM (FIB-SEM), podejście to ma dwie główne zalety: (1) Próbka zanurzona w żywicy jest konserwowana, choć w wersji pokrojonej. Można go barwić na różne sposoby i obrazować w różnych rozdzielczościach. (2) Ponieważ skrawki mogą być barwione po wybarwieniu, nie jest konieczne stosowanie próbek silnie barwionych blokami metali ciężkich w celu wprowadzenia kontrastu do obrazowania SEM lub nadania blokom tkanki przewodzenia. To sprawia, że metoda ta ma zastosowanie do szerokiej gamy materiałów i zagadnień biologicznych. Materiały z prefiksami, np. z banków biopsji i laboratoriów patologicznych, mogą być bezpośrednio osadzane i rekonstruowane w 3D.

Opisany tutaj schemat postępowania (Rysunek 1) rozpoczyna się od próbki zatopionej w bloku żywicy. Podczas przygotowania próbki do tkanki należy wprowadzić niektóre metale ciężkie, jednak nie jest konieczne stosowanie protokołów zoptymalizowanych pod kątem silnej metalizacji. Rysunek 1A przedstawia korzeń rośliny (rzeżuchy) barwiony konwencjonalnie w bloku przy użyciu 1% OsO4 i 1% octanu uranylu, podczas gdy korzeń Arabidopsis na Rysunku 1B jest jedynie słabo zmetalizowany z użyciem 0,5% octanu uranylu. Ten drugi typ próbki najlepiej nadaje się do podejść korelacyjnych, ponieważ niektóre metale ciężkie mają tendencję do gaszenia fluorescencji. Przy użyciu dedykowanego uchwytu na podłoże (Rysunek 2) można przygotować serie składające się z kilkuset przekrojów (Rysunek 1C). Po znakowaniu fluorescencyjnym takie serie są obrazowane w standardowym szerokopolowym mikroskopie fluorescencyjnym FLM (Rysunek 1D), a następnie barwione roztworami metali ciężkich i obrazowane w SEM przy różnych rozdzielczościach (Rysunek 1E-G).
Ważnymi narzędziami zapewniającymi powtarzalność generowania macierzy, zwłaszcza podczas przenoszenia kilku wstęg z rynienki noża mikrotomu na podłoże, są uchwyt do podłoża (Rycina 2A, zaprojektowany na zamówienie w laboratorium autorów) oraz diamentowy nóż Jumbo z rynienką wystarczająco dużą, aby pomieścić szkiełka przedmiotowe (Rycina 2B). Niezbędny jest płaski menisk, który umożliwia dobrą obserwację wstęg; można go uzyskać poprzez czyszczenie podłoża plazmą: mała kropla wody destylowanej nie powinna tworzyć struktury soczewkowatej na podłożu, jak na Rycynie 2C (podłoże niepotraktowane), lecz cienkiego filmu (Rycina 2D, podłoże aktywowane plazmą). W tych warunkach wstęgi przytwierdzone do suchej części szkiełka nakrywkowe powlekanego ITO są łatwo widoczne (Rycina 2E) i mogą być obserwowane oraz kontrolowane podczas wyciągania podłoża z wody.
Przykładem są matryce barwione jodkiem propidyny w celu oznakowania ścian komórkowych roślin, które obrazowano za pomocą standardowego szerokopolowego mikroskopu fluorescencyjnego FLM (Rycina 3A). Ponieważ sekcje mają grubość zaledwie 100 nm, nawet nadmierne barwienie, jak pokazano tutaj, wprowadza niewielkie rozmycie. Po rejestracji, ze stosu obrazów wybrano dwie komórki całkowicie zamknięte w zrekonstruowanej objętości (Rycina 3B) do obrazowania 3D o wysokiej rozdzielczości (patrz również Dodatkowy Film S1). Po dodatkowym barwieniu octanem uranylu i cytrynianem ołowiu matryce obrazowano w SEM. Rycina 3C przedstawia widok ogólny, zarejestrowany przy rozmiarze piksela obrazu 60 nm; ciemny kwadrat w centrum obrazu wskazuje miejsce, w którym wykonano funkcje autofokusu, a dodatkowa dawza doprowadziła do niewielkiego zanieczyszczenia. Następnie odpowiednie obszary zainteresowania (ROI) w tych sekcjach seryjnych (przekroje od 51 do 248 z łącznie 435 przekrojów) zawierające dwie komórki docelowe wybrane w stosie FLM zostały zarejestrowane przy rozmiarze piksela obrazu 5 nm (Rycina 3D; patrz również Dodatkowy Film S2).
Zautomatyzowane obrazowanie hierarchiczne macierzy w SEM, opisane w niniejszej pracy, przeprowadzono przy użyciu rozwiązania sprzętowo-programowego ZEISS Atlas 5. Najpierw, z wykorzystaniem detektora SE, utworzono przegląd całej macierzy przy bardzo dużych pikselach obrazu (1 000 nm) i bardzo krótkim czasie przebywania wiązki (Ryc. 4A). Na pierwszej sekcji wyznaczono obszar ROI obejmujący wyłącznie tkankę, a następnie przeniesiono go na wszystkie pozostałe sekcje macierzy. Ten zestaw sekcji zarejestrowano przy pikselach obrazu o wielkości 60 nm, stosując dłuższy czas przebywania wiązki (Ryc. 4B). Na koniec ustawiono zestaw miejsc, zawierający dwie komórki docelowe oraz jedną „warstwę” komórek otaczających, aby zniwelować niedokładność pozycjonowania stolika, stosując następujące parametry: detektor ESB (Energy Selective Backscatter), 5 nm piksele obrazu oraz bardzo długi (40 µs) czas przebywania wiązki (Ryc. 4C). Powiększenie takiego obrazu pozwala dostrzec szczegóły subkomórkowe (Ryc. 4D), takie jak wakuole (V), mitochondria (M), jądro komórkowe (N) oraz retikulum endoplazmatyczne (strzałki). Patrz również Supplemental Movie S3, przedstawiające przejście od przeglądu całej macierzy do szczegółów subkomórkowych jednej komórki docelowej.
Przedstawiony tutaj zestaw (200 przekrojów) oraz dodatkowy zestaw 250 przekrojów zajęły około 8 h produkcji, jedną noc na barwienie do LM i jeden dzień na (ręczną) rejestrację przy użyciu FLM. Barwienie docelowe trwa łącznie około 1-2 h, w zależności od liczby poszczególnych zestawów. W przypadku rejestracji SEM wymagane jest kilka godzin na przygotowanie przebiegu Atlas, a zautomatyzowana rejestracja trwała 3–4 h dla zestawu przekrojów o średniej rozdzielczości (rozmiar piksela 60 nm) (200 przekrojów, 450 x 200 µm2) oraz około 5 dni dla ROI o wysokiej rozdzielczości (rozmiar piksela 5 nm) zawierającego dwie komórki docelowe (200 przekrojów, 55 x 30 µm2). Należy zauważyć, że ze względu na niską zawartość metalu w prezentowanej tutaj próbce, aby uzyskać dobry stosunek sygnału do szumu, konieczne było zastosowanie bardzo niskiej prędkości skanowania, co (dla obecnie dostępnego detektora) oznaczało czas przebywania (dwell time) wynoszący 40 µs dla ROI o wysokiej rozdzielczości.
W całym procesie istnieje kilka etapów podatnych na błędy: w idealnym przypadku wstęgi powinny być mniej więcej proste i ułożone w odpowiedniej kolejności (Rysunek 5A). Jednak często powstają wstęgi zagięte (Rysunek 5B), zakrzywione (Rysunek 5D), a nawet przerwane. Może to być wynikiem nieprawidłowego przycinania (krawędzie przednia i tylna nie są dokładnie równoległe) lub nierównomiernego nałożenia kleju, ale także asymetrycznej lub nierównomiernej infiltracji próbki. Szczególnie problematyczne są próbki zawierające komponenty zarówno miękkie, jak i bardzo twarde. Te ostatnie mogą być trudne do zinfiltrowania, jak np. ściana komórkowa korzeni roślin pokazanych tutaj (Rysunek 5C). W takim przypadku zagięcia (groty strzałek) mogą łatwo powstać wskutek zmiennej kompresji i rozprężania podczas skrawania. W przypadku automatycznego obrazowania w SEM zakrzywione wstęgi nie stanowią dużego problemu, ponieważ obszary zainteresowania (ROI) mogą zostać obrócone, aby dostosować je do krzywizny wstęgi.
Kolejnym krytycznym krokiem w protokole jest barwienie: niewystarczające przemywanie może prowadzić do powstania osadów na preparacie (Rysunek 5E, F), a w najgorszym przypadku do zakrycia obszaru najciekawszego (okrąg na jednej z dwóch komórek docelowych na Rysunku 5F). Ponadto kurz (Rysunek 5D, cząstki silnie rozpraszające światło) wprowadzony do łódki nożowej, np. poprzez zanieczyszczony nośnik podłoża, może powodować poważne problemy: w mikroskopii fluorescencyjnej (FLM) kurz może wykazywać tak silną fluorescencję (por. niektóre przekroje w Supplementary Movie S1), że niektóre algorytmy rejestracji przestają działać. Funkcja „align” w programie TrakEM17 jest jednak w stanie przetworzyć takie stosy obrazów, co zaprezentowano w Supplementary Movie S1.
<img alt="Przygotowanie próbki do SEM: zatopienie w żywicy, cięcie, mikroskopia świetlna, sekwencja obrazowania SEM." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57059/57059fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Schemat korelacyjnego obrazowania hierarchicznego. Począwszy od próbki zatopionej w bloku żywicy (A, próbka silnie napylona metalem), próbka jest najpierw przycinana (B, próbka słabo napylona metalem), a następnie za pomocą ultramikrotomu przygotowuje się serie składające się z kilku wstążek przekrojów seryjnych (C), tutaj umieszczonych na szkiełku nakrywkowym powleczonym ITO. Po barwieniu barwnikiem fluorescencyjnym, stosy obrazów są rejestrowane w szerokopolowym FLM (D). Po kolejnych rundach barwienia solami metali ciężkich, stosy są obrazowane w SEM (E-G) przy różnych rozdzielczościach (rozmiarach pikseli obrazu). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57059/57059fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Konfiguracja procesu mikrotomii, ostrze do okrzemek, sekcjonowanie; analiza obrazów z mikroskopii optycznej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57059/57059fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Narzędzia do przygotowania macierzy. Uchwyt podłoża złożony z mikromanipulatorów z siedmioma osiami ruchu przymocowany do standardowego ultramikrotomu (A): śruby, zaznaczone okręgami, służą do ruchu pionowego (1) i poziomego (2) oraz do pochylania (3) nośnika podłoża. Duży nóż diamentowy z powiększoną rynienką w celu pomieszczenia dużych podłoży (strzałka), tutaj z kawałkiem aktywowanej plazmowo płytki krzemowej zamontowanej na aluminiowym nośniku o rozmiarze szkiełka przedmiotowego (B). Krople 20 µL wody destylowanej umieszczone na nieobrobionym podłożu z płytki krzemowej (C) lub na podłożu aktywowanym plazmą (D). Cztery wstęgi pływające w rynience noża, przymocowane dolnymi końcami do szkiełka zakryjącego powlekanego ITO. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57059/57059fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Obrazy mikroskopowe struktury komórek korzenia; mikrografie fluorescencyjne i elektronowe w różnych skalach." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57059/57059fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Korelacja danych LM z danymi SEM. Przeglądy (A, C) oraz komórki docelowe (B, D) zarejestrowane za pomocą FLM (A, B) i SEM (C, D). Obraz (B) jest powiększeniem programowym, a oryginalne dane zarejestrowano przy użyciu obiektywu 40X na matrycy kamery o rozdzielczości 1,388 x 1,040 pikseli, podczas gdy obraz (C) zarejestrowano z rozmiarem piksela obrazu 60 nm, a (D) z rozmiarem 5 nm, co ilustruje rzeczywisty wzrost rozdzielczości w SEM. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57059/57059fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Analiza mikroskopowa nanostruktur; schemat przedstawiający poziomy sekcjonowania i powiększenia obrazowania." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57059/57059fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Hierarchiczne obrazowanie w SEM przy użyciu ZEISS Atlas 5 AT. Przegląd matrycy zarejestrowanej z rozdzielczością piksela 1 000 nm przy użyciu detektora SE (A). Zestawy sekcji z ROI umieszczonym na tkance w każdym przekroju, zarejestrowane z rozdzielczością piksela 60 nm (B). Zestawy obszarów z seryjnym ROI umieszczonym na komórkach docelowych, zarejestrowane z rozdzielczością piksela 5 nm (C). Przy powiększeniu takich obrazów o wysokiej rozdzielczości (D) widoczne stają się wewnątrzkomórkowe przedziały błonowe, takie jak wakuole (V), jądro (N), mitochondria (M) i retikulum endoplazmatyczne (strzałki). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57059/57059fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Powłoki optyczne pod wpływem naprężeń: wzory pęknięć, analiza SEM, schemat integralności mikrostrukturalnej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57059/57059fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5: Typowe problemy. 1. Wynikające z procesu skrawania: Wstęgi umieszczone na szkiełkach zakrywek pokrytych ITO są idealnie proste (A), lecz nieregularna kompresja podczas skrawania może powodować zgięcia (B) lub zakrzywienie wstęg (D), a nawet fałdy (C). 2. Spowodowane kontaktem podłoża i wstęg z wodą, np. podczas skrawania i barwienia: Cząstki rozpraszające światło na podłożu (D), obwódki kropel na skrawku (okrąg w E) lub zanieczyszczenia rozmazane na tkance z powodu niewłaściwego płukania po barwieniu (F). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57059/57059fig5large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Film uzupełniający S1: Stos obrazów FLM. 435 obrazów wyrównanych w programie Fiji16 przy użyciu TrakEM17 i zapisanych jako plik wideo (.avi). <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/57059/WackerJoVE_movieS1.avi">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Dodatkowy film S2: stos obrazów SEM. 210 obrazów wyrównanych w programie Fiji16 przy użyciu TrakEM17. Oryginalny stos (300 obrazów) tego zestawu danych miał rozmiar 15 GB. Aby zmniejszyć rozmiar stosu do 3,3 GB (po wyrównaniu i przycięciu do dwóch docelowych komórek), przeskalowano go w osiach x i y o współczynnik 0,2 za pomocą programu Fiji, a następnie zapisano jako film .avi. <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/57059/WackerJoVE_movieS2.avi">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Film uzupełniający S3: Powiększanie przy różnych poziomach rozdzielczości w SEM. Film utworzony i wyeksportowany z oprogramowania Atlas 5 w formacie .mp4. <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/57059/WackerJoVE_movieS3.mp4">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Ten protokół jest ukierunkowany na konkretne komórki w tkance do obrazowania w rozdzielczości nanoskali za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego (SEM). Duża liczba seryjnych odcinków materiału biologicznego zatopionego w żywicy jest najpierw obrazowana w mikroskopie świetlnym w celu identyfikacji celu, a następnie w sposób hierarchiczny w SEM.

Multimodalne hierarchiczne obrazowanie odcinków szeregowych w celu znalezienia określonych celów komórkowych w dużych objętościach

Targeting specific cells at ultrastructural resolution within a mixed cell population or a tissue can be achieved by hierarchical imaging using a ...

Ogólnym celem tego przepływu pracy jest identyfikacja określonych celów obrazowania ultrastrukturalnego w tkance za pomocą mikroskopii świetlnej, a następnie obrazowania 3D w SEM w bardzo wysokiej rozdzielczości. Przedstawiony tutaj przepływ obrazowania może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące ultrastruktury komórkowej lub tkankowej w wielu dziedzinach, takich jak biologia komórki, biologia rozwojowa, neuronauka, a nawet patologia. Główną zaletą tej techniki, która w rzeczywistości opiera się na tomografii matrycowej, jest to, że krojenie tkanki na tablice szeregowych odcinków ułatwia identyfikację struktur docelowych, nawet jeśli początkowo są one zakopane w oryginalnej objętości próbki.Tomografia matrycowa została pierwotnie wprowadzona w kontekście neurobiologii, ale może być również stosowana do wielu innych systemów, w tym bakterii, roślin, zwierząt, a nawet próbek pacjentów w warunkach patologicznych. Osoby, które są nowicjuszami w tej metodzie, będą miały trudności, ponieważ zbieranie wielu odcinków seryjnych jest bardzo trudne. Praca bez dodatkowego podparcia może spowodować utratę odcinków lub przemieszczenie taśm.Za pomocą maleńkiej szczoteczki utworzonej z kilku włosków przymocowanych do wykałaczki, ostrożnie pokryj przednią i tylną stronę wstępnie przyciętego bloku mieszanką kleju. Wykonaj ten krok szybko, ponieważ rozpuszczalnik tej mieszaniny odparowuje w ciągu kilku sekund. Gdy próbki wyschną, przytnij kawałki wafli krzemowych do rozmiaru, który zmieści się w łodzi z nożem i oznacz je rysikiem diamentowym.Następnie wyczyść płytkę silikonową ręcznie izopropanolem i niestrzępiącą się chusteczką. Przymocuj podłoże do jednego końca płyty nośnej za pomocą usuwalnego kleju. Po związaniu plazma aktywuje podłoże za pomocą wyładowania jarzeniowego powietrzem, aby uzyskać hydrofilową powierzchnię.Gdy zamontowane podłoże znajduje się bliżej krawędzi noża, włóż nośnik do zacisku uchwytu podłoża. Następnie włóż nóż diamentowy jumbo do uchwytu noża i ustaw kąt luzu na zero stopni. Następnie napełnij łódkę z nożem wodą destylowaną.Zbliżyć się do noża tak, aby znajdował się od jednego do dwóch milimetrów od próbki. Następnie opuść podłoże do wody za pomocą od pierwszej do trzeciej uchwytu podłoża. Sprawdź, czy linia wodna znajduje się w górnej jednej trzeciej podłoża.Ponieważ podczas korzystania z płytki krzemowej trudno jest dostrzec prześwit, obniż podłoże, aż poczujesz, że dotyka podłogi. Następnie podnieś niewielką ilość podłoża. Upewnij się, że ani podłoże, ani nośnik nie będą dotykać łodzi noża podczas cięcia.Następnie użyj strzykawki lub pipety, aby wyregulować poziom wody w łodzi. Obserwując przez lornetkę, dodawaj lub usuwaj wodę, aż cały obszar powierzchni wody pokaże jednorodne odbicie górnego oświetlenia świetlnego ultramikrotomu. Po zakończeniu konfiguracji rozpocznij sekcję próbki.Po wycięciu kilku odcinków przerwij proces krojenia i odkręć wstążkę od krawędzi noża, delikatnie głaszcząc krawędź noża rzęsą lub bardzo miękką sierścią kota. Manipuluj taśmą w kierunku podłoża i delikatnie popchnij pierwszą część taśmy, aby przymocować ją do suchej części podłoża. Kontynuuj dzielenie próbki na sekcje i mocowanie wstążek do podłoża.Zacznij od jednej strony podłoża i stopniowo przesuwaj się w kierunku drugiej z każdą nową wstążką. Gdy podłoże jest całkowicie pokryte wstążkami, delikatnie wyjmij podłoże z łodzi nożowej za pomocą mikromanipulatora uchwytu podłoża. Pozostaw matrycę taśmy do wyschnięcia, a następnie przechowuj ją w środowisku wolnym od kurzu.Po wyschnięciu należy jak najszybciej usunąć podłoże mocowane klejem z nośnika. Następnie wybarwić próbkę do mikroskopii świetlnej zgodnie z opisem w dołączonym protokole tekstowym i wykonać obrazowanie. Następnie wybarwić próbkę do mikroskopii elektronowej i zamontować ją na aluminiowych króćcach za pomocą lepkiej podkładki węglowej.Teraz zobrazuj te tablice w skaningowym mikroskopie elektronowym z emisją pola. Aby uniknąć ładowania, należy używać pierwotnych energii elektronów wynoszącej trzy kV lub mniej i prądu wiązki od 50 do 800 pikoamperów. W przypadku korzystania z szkiełek nakrywkowych ze szkła powlekanego ITO, należy połączyć powierzchnię przewodzącą z nośnikiem mikroskopu za pomocą taśmy miedzianej i srebrnej farby.Pierwszym krokiem w kaskadzie obrazowania hierarchicznego jest wygenerowanie przeglądu matrycy w taki sposób, aby można było rozpoznać poszczególne sekcje. Najpierw zdefiniuj cztery rogi swojej tablicy, tworząc wykres obrazu każdego rogu w małym powiększeniu, około 100x, a następnie utwórz ROI obejmujący całą tablicę. Przypisz protokół obrazowania do tego zwrotu z następującymi parametrami.Użyj wtórnego detektora elektronów do szybkiego obrazowania przy użyciu krótkiego czasu przebywania wynoszącego około 0,2 mikrosekundy. Wybierz duży rozmiar obrazu w pikselach i rozmiar kafelka 2000 na 2000 pikseli. Rezultatem jest bardzo zaszumiony obraz, ale nawet w tym przypadku tkanka w przekroju jest widoczna.Następnie wygeneruj zestaw sekcji, tworząc obszar zainteresowania, obrysowując tylko tkankę w pierwszej sekcji. Sklonuj go do wszystkich kolejnych sekcji za pomocą narzędzia stempla. W razie potrzeby obróć obszary zainteresowania, aby uwzględnić wygięte wstążki.Przypisz protokół do sekcji, która najlepiej przedstawia podbudowę tkanki. W tym przypadku zastosowano pośredni rozmiar piksela 60 nanometrów, rozmiar kafelka 12000 na 12000 pikseli i czas przebywania 3,2 mikrosekundy. Ze względu na słabą jakość, utworzono drugą sekcję przedstawiającą kilka wybranych komórek przy użyciu mniejszego rozmiaru piksela i bardziej czułego detektora.Teraz możliwe jest bardzo dobre rozpoznanie dwóch komórek docelowych. Utwórz zestaw lokalizacji w zestawie sekcji zawierającym strukturę docelową dla obrazowania SEM o wyższej rozdzielczości. Obszar zainteresowania powinien być wystarczająco duży, aby uwzględnić precyzję etapowania.Sprawdź i dostosuj pozycje witryn. Automatyczne dostrajanie jest konieczne, gdy obrazowanych jest wiele sekcji. Ważne jest, aby umieścić obszary zainteresowania tak, aby środek nie siedział na pustym materiale bez szczegółów strukturalnych, na przykład wakuoli.Następnie zdefiniuj ustawienia automatycznego ustawiania ostrości i sprawdź wydajność obrazowania na całej długości wstęgi w małym obszarze zainteresowania, który znajduje się w pobliżu miejsca, które zostanie zobrazowane. Następnie zdefiniuj protokół obrazowania dla akwizycji SEM w wysokiej rozdzielczości. Aby wyświetlić przedziały membranowe, wybierz rozmiar piksela obrazu z zakresu od trzech do pięciu nanometrów.Wybierz czas przebywania w zależności od detektora, aby obraz nie był zbyt zaszumiony. Ponieważ stół montażowy musi pokonać dużą odległość między nagrywaniem tej a tej sekcji, zdefiniuj wartości fokusu na co najmniej pierwszej sekcji każdej wstążki, korzystając z opcji sprawdź protokół. Następnie rozpocznij automatyczne obrazowanie SEM na całej serii docelowych obszarów zainteresowania.Po zakończeniu wyeksportuj uzyskane dane jako serię obrazów, najlepiej w formacie TIF. Importuj serie obrazów na Fidżi jako wirtualny stos. Następnie przytnij stos do dalszej obróbki, przycinając obszar jak najbliżej interesującej Cię struktury.Dostosuj także jasność i kontrast i zapisz stos. Po przycięciu i zoptymalizowaniu otwórz nowy TrakEM z menu Plik. Kliknij prawym przyciskiem myszy pole obrazu i zaimportuj stos do TrakEM jako jeden plasterek na warstwę.Kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz opcję Wyrównaj warstwy. Wybierz opcję najmniejszych kwadratów jako tryb, ustaw zakres od pierwszej do ostatniej i wybierz brak jako odniesienie. Następnie wybierz domyślne wartości ustawień i wybierz opcję Sztywny jako żądaną transformację.Gdy rejestracja zostanie zakończona i zakończona i satysfakcjonująca, zapisz wyrównany zestaw danych, klikając prawym przyciskiem myszy i wybierając opcję Eksportuj. Utwórz płaski obraz, ustaw zakres od pierwszego do ostatniego obrazu i pozwól oprogramowaniu wyświetlić wynikowy stos. Po zakończeniu zapisz stos w formacie TIF.Po przygotowaniu tablica sekcji pojawia się jako tablica składająca się z kilku wstęg sekcji szeregowych. W tej sekcji przedstawiono przegląd wierzchołka korzenia rzodkiewnika, zabarwionego jodkiem propidyny. Sekwencyjne sekcje tej próbki zostały wyrównane zgodnie z opisem w protokole i połączone w celu pokazania próbki w 3D jako pojedynczego pliku filmowego.Tutaj można zobaczyć dwie komórki docelowe, które później zostaną zobrazowane w rozdzielczości nanometrowej w SEM. Po dodatkowym barwieniu octanem uranylu i cytrynianem krwi, matryce zostały zobrazowane w mikroskopie elektronowym. Ten statyczny obraz pokazuje wycinek próbki najpierw zobrazowany w rozdzielczości 20 nanometrów, a w drugiej rundzie obrazowania w rozdzielczości pięciu nanometrów.W tym przypadku 210 sekwencyjnych obrazów z mikroskopu elektronowego zostało wyrównanych i przyciętych zgodnie z opisem w protokole. Film skupia się tylko na dwóch komórkach i pokazuje, jak wakuole w komórkach są ułożone, a czasem połączone w 3D. Zautomatyzowane hierarchiczne obrazowanie przedstawionych tutaj macierzy w SEM może zapewnić bezproblemowe mapowanie na różnych poziomach rozdzielczości, od przeglądu całej macierzy po szczegóły subkomórkowe.W największym powiększeniu rozpoznawalne są wakuole, mitochondria, jądro i retikulum endoplazmatyczne. Po opanowaniu, umieszczanie wstęg sekcji obok siebie na typowym podłożu można wykonać w ciągu kilku godzin, jeśli zostanie wykonane prawidłowo. Może to zapewnić setki sekcji na jednym podłożu do obrazowania.Czas obrazowania dla tak dużej liczby sekcji może się różnić w zależności od mikroskopu, tym bardziej, jeśli Twoje ulubione instrumenty do obrazowania mają różne poziomy automatyzacji. Warto zauważyć, że ogólny przepływ pracy można łatwo połączyć z innymi technikami obrazowania, takimi jak standardowe barwienie histo lub nawet kandoluminescencja, lub po prostu można go używać jako samodzielnego narzędzia do obrazowania artostrukturalnego dużych objętości. Kolejnym aspektem tego przepływu pracy jest łatwa dostępność.Wstępne badania są możliwe do wykonania bez dodatkowych narzędzi lub automatyzacji, czyli bez dużych inwestycji. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobre pojęcie o przepływie pracy i o tym, jak obrazowanie multimodalne i hierarchiczne może być wykorzystywane do namierzania i obrazowania interesujących struktur w dużej objętości 3D na różnych poziomach rozdzielczości.

multimodal-hierarchical-imaging-serial-sections-for-finding-specific

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Niniejszy artykuł opisuje zoptymalizowaną sekwencję zdarzeń dla obrazowania multimodalnego przeszczepów komórkowych w mózgu gryzoni z wykorzystaniem: (i) bioluminescencji in vivo i obrazowania rezonansem magnetycznym oraz (ii) pośmiertnej analizy histologicznej. Połączenie tych metod obrazowania u jednego zwierzęcia pozwala na ocenę przeszczepów komórkowych z wysoką rozdzielczością, czułością i swoistością.

Multimodalne obrazowanie implantacji komórek macierzystych w ośrodkowym układzie nerwowym myszy

Złożone masy tkankowe, od organów po guzy, składają się z różnych elementów komórkowych. Wyjaśniliśmy udział fenotypów komórkowych w tkance przy użyciu wieloznakowanych fluorescencyjnych myszy transgenicznych w połączeniu z wieloparametrowym barwieniem immunofluorescencyjnym, a następnie rozmieszaniem widmowym w celu rozszyfrowania pochodzenia komórek, a także cech komórek na podstawie ekspresji białka.

Ilościowa analiza wielospektralna po przeszczepie tkanki fluorescencyjnej w celu wizualizacji pochodzenia, typów i interakcji komórek

Tutaj opisujemy procedurę oczyszczania tkanek, znakowania fluorescencyjnego i wielkoskalowego obrazowania tkanki mózgowej myszy, która umożliwia wizualizację trójwymiarowej organizacji typów komórek w korze nowej.

Wielkoskalowe trójwymiarowe obrazowanie organizacji komórkowej w korze nowej myszy

Tutaj opisujemy prostą i przystępną strategię wizualizacji, kwantyfikacji i mapowania komórek odpornościowych w utrwalonych w formalinie odcinkach tkanki nowotworowej zatopionej w parafinie. Metodologia ta łączy istniejące techniki obrazowania i analizy cyfrowej w celu rozszerzenia możliwości multipleksowania i analizy wieloparametrowej testów obrazowania.

Wizualizacja, kwantyfikacja i mapowanie populacji komórek odpornościowych w mikrośrodowisku guza

Opisujemy przygotowanie wstęg odcinków szeregowych i ich zbieranie na dużym nośniku transferu do użycia jako próbki tomografii matrycowej, wraz z automatycznymi procedurami obrazowania w skaningowym mikroskopie elektronowym. Protokół umożliwia badania przesiewowe, wyszukiwanie i ukierunkowane obrazowanie miejscowych, rzadkich zdarzeń oraz pozyskiwanie dużych ilości danych.

Tomografia matrycowa do ukierunkowanego pozyskiwania informacji objętościowych za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej

Obecny protokół zapewnia krok po kroku procedurę szybkiego i jednoczesnego oczyszczania optycznego, wieloetapowego znakowania i wolumetrycznej rekonstrukcji 3D dziesiątek pośmiertnych odcinków ludzkiego mózgu poprzez połączenie (SWITCH - H2O2 - Pozyskiwanie antygenu R- 2,2'-tiodieetanol [TDE]) KRÓTKA technika transformacji tkankowej z obrazowaniem mikroskopii fluorescencyjnej za pomocą arkusza świetlnego w rutynowym protokole wysokoprzepustowym.

Optyczne oczyszczanie i znakowanie w mikroskopii fluorescencyjnej arkuszy świetlnych w wielkoskalowym obrazowaniu ludzkiego mózgu

Seryjna tomografia dwufotonowa (STPT) to technika obrazowania masy tkanki w jej trójwymiarowym kształcie poprzez połączenie obrazowania dwufotonowego z automatyczną kontrolą etapu i krojeniem mikrotomów. Tutaj opisujemy protokół jego implementacji dla mózgów marmozet, aby lepiej zrozumieć ich cechy strukturalne.

Seryjna tomografia dwufotonowa całego mózgu marmozety do analiz neuroanatomicznych

Ten artykuł opisuje protokół immunofluorescencji multipleksowej zoptymalizowany pod kątem charakterystyki trójwymiarowej architektury przerzutów otrzewnowych.

Trójwymiarowe obrazowanie tkanki nośnej guza przy użyciu iteracyjnego wybielania rozszerza podejście multipleksywalne

Korzystając z platformy multimodalnej łączącej metody obrazowania optycznego bez znaczników, opracowaliśmy protokół do wizualizacji i ilościowego określania dynamiki komórkowej i metabolizmu. Dzięki obrazowaniu za pomocą fluorescencji wielofotonowej, generowania drugiej harmonicznej i wymuszonej mikroskopii rozpraszania Ramana możemy uzyskać całościowy przegląd środowiska komórkowego i molekularnego.

Multimodalna platforma obrazowania optycznego do badania metabolizmu komórkowego

Wprowadziliśmy nowatorską technikę obrazowania zwaną Optical Multilayer Interference Tomography (OMLIT), która umożliwia bezstronne obrazowanie wszystkich komórek w próbkach mózgu na mezoskali i może być płynnie zintegrowana z procesem obrazowania taśmowej szeregowej skaningowej mikroskopii elektronowej na tej samej próbce.

Metoda optycznego obrazowania zgodna z mikroskopią skaningową do mezoskopowego mapowania mózgu w całych komórkach

Poznaj multimodalne hierarchiczne obrazowanie odcinków szeregowych w celu identyfikacji celów komórkowych w dużych objętościach tkankowych. Ta metoda łączy mikroskopię świetlną z SEM wysokiej rozdzielczości.

Multimodalne hierarchiczne obrazowanie odcinków szeregowych w celu znalezienia określonych celów komórkowych w dużych objętościach (Wideo) | JoVE Journal

Multimodalne hierarchiczne obrazowanie odcinków szeregowych w celu znalezienia określonych celów komórkowych w dużych objętościach

Przeglądaj więcej filmów