Multimodalne hierarchiczne obrazowanie odcinków szeregowych w celu znalezienia określonych celów komórkowych w dużych objętościach

Ogólnym celem tego przepływu pracy jest identyfikacja określonych celów obrazowania ultrastrukturalnego w tkance za pomocą mikroskopii świetlnej, a następnie obrazowania 3D w SEM w bardzo wysokiej rozdzielczości. Przedstawiony tutaj przepływ obrazowania może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące ultrastruktury komórkowej lub tkankowej w wielu dziedzinach, takich jak biologia komórki, biologia rozwojowa, neuronauka, a nawet patologia. Główną zaletą tej techniki, która w rzeczywistości opiera się na tomografii matrycowej, jest to, że krojenie tkanki na tablice szeregowych odcinków ułatwia identyfikację struktur docelowych, nawet jeśli początkowo są one zakopane w oryginalnej objętości próbki.

Tomografia matrycowa została pierwotnie wprowadzona w kontekście neurobiologii, ale może być również stosowana do wielu innych systemów, w tym bakterii, roślin, zwierząt, a nawet próbek pacjentów w warunkach patologicznych. Osoby, które są nowicjuszami w tej metodzie, będą miały trudności, ponieważ zbieranie wielu odcinków seryjnych jest bardzo trudne. Praca bez dodatkowego podparcia może spowodować utratę odcinków lub przemieszczenie taśm.

Za pomocą maleńkiej szczoteczki utworzonej z kilku włosków przymocowanych do wykałaczki, ostrożnie pokryj przednią i tylną stronę wstępnie przyciętego bloku mieszanką kleju. Wykonaj ten krok szybko, ponieważ rozpuszczalnik tej mieszaniny odparowuje w ciągu kilku sekund. Gdy próbki wyschną, przytnij kawałki wafli krzemowych do rozmiaru, który zmieści się w łodzi z nożem i oznacz je rysikiem diamentowym.

Następnie wyczyść płytkę silikonową ręcznie izopropanolem i niestrzępiącą się chusteczką. Przymocuj podłoże do jednego końca płyty nośnej za pomocą usuwalnego kleju. Po związaniu plazma aktywuje podłoże za pomocą wyładowania jarzeniowego powietrzem, aby uzyskać hydrofilową powierzchnię.

Gdy zamontowane podłoże znajduje się bliżej krawędzi noża, włóż nośnik do zacisku uchwytu podłoża. Następnie włóż nóż diamentowy jumbo do uchwytu noża i ustaw kąt luzu na zero stopni. Następnie napełnij łódkę z nożem wodą destylowaną.

Zbliżyć się do noża tak, aby znajdował się od jednego do dwóch milimetrów od próbki. Następnie opuść podłoże do wody za pomocą od pierwszej do trzeciej uchwytu podłoża. Sprawdź, czy linia wodna znajduje się w górnej jednej trzeciej podłoża.

Ponieważ podczas korzystania z płytki krzemowej trudno jest dostrzec prześwit, obniż podłoże, aż poczujesz, że dotyka podłogi. Następnie podnieś niewielką ilość podłoża. Upewnij się, że ani podłoże, ani nośnik nie będą dotykać łodzi noża podczas cięcia.

Następnie użyj strzykawki lub pipety, aby wyregulować poziom wody w łodzi. Obserwując przez lornetkę, dodawaj lub usuwaj wodę, aż cały obszar powierzchni wody pokaże jednorodne odbicie górnego oświetlenia świetlnego ultramikrotomu. Po zakończeniu konfiguracji rozpocznij sekcję próbki.

Po wycięciu kilku odcinków przerwij proces krojenia i odkręć wstążkę od krawędzi noża, delikatnie głaszcząc krawędź noża rzęsą lub bardzo miękką sierścią kota. Manipuluj taśmą w kierunku podłoża i delikatnie popchnij pierwszą część taśmy, aby przymocować ją do suchej części podłoża. Kontynuuj dzielenie próbki na sekcje i mocowanie wstążek do podłoża.

Zacznij od jednej strony podłoża i stopniowo przesuwaj się w kierunku drugiej z każdą nową wstążką. Gdy podłoże jest całkowicie pokryte wstążkami, delikatnie wyjmij podłoże z łodzi nożowej za pomocą mikromanipulatora uchwytu podłoża. Pozostaw matrycę taśmy do wyschnięcia, a następnie przechowuj ją w środowisku wolnym od kurzu.

Po wyschnięciu należy jak najszybciej usunąć podłoże mocowane klejem z nośnika. Następnie wybarwić próbkę do mikroskopii świetlnej zgodnie z opisem w dołączonym protokole tekstowym i wykonać obrazowanie. Następnie wybarwić próbkę do mikroskopii elektronowej i zamontować ją na aluminiowych króćcach za pomocą lepkiej podkładki węglowej.

Teraz zobrazuj te tablice w skaningowym mikroskopie elektronowym z emisją pola. Aby uniknąć ładowania, należy używać pierwotnych energii elektronów wynoszącej trzy kV lub mniej i prądu wiązki od 50 do 800 pikoamperów. W przypadku korzystania z szkiełek nakrywkowych ze szkła powlekanego ITO, należy połączyć powierzchnię przewodzącą z nośnikiem mikroskopu za pomocą taśmy miedzianej i srebrnej farby.

Pierwszym krokiem w kaskadzie obrazowania hierarchicznego jest wygenerowanie przeglądu matrycy w taki sposób, aby można było rozpoznać poszczególne sekcje. Najpierw zdefiniuj cztery rogi swojej tablicy, tworząc wykres obrazu każdego rogu w małym powiększeniu, około 100x, a następnie utwórz ROI obejmujący całą tablicę. Przypisz protokół obrazowania do tego zwrotu z następującymi parametrami.

Użyj wtórnego detektora elektronów do szybkiego obrazowania przy użyciu krótkiego czasu przebywania wynoszącego około 0,2 mikrosekundy. Wybierz duży rozmiar obrazu w pikselach i rozmiar kafelka 2000 na 2000 pikseli. Rezultatem jest bardzo zaszumiony obraz, ale nawet w tym przypadku tkanka w przekroju jest widoczna

Następnie wygeneruj zestaw sekcji, tworząc obszar zainteresowania, obrysowując tylko tkankę w pierwszej sekcji. Sklonuj go do wszystkich kolejnych sekcji za pomocą narzędzia stempla. W razie potrzeby obróć obszary zainteresowania, aby uwzględnić wygięte wstążki.

Przypisz protokół do sekcji, która najlepiej przedstawia podbudowę tkanki. W tym przypadku zastosowano pośredni rozmiar piksela 60 nanometrów, rozmiar kafelka 12000 na 12000 pikseli i czas przebywania 3,2 mikrosekundy. Ze względu na słabą jakość, utworzono drugą sekcję przedstawiającą kilka wybranych komórek przy użyciu mniejszego rozmiaru piksela i bardziej czułego detektora.

Teraz możliwe jest bardzo dobre rozpoznanie dwóch komórek docelowych. Utwórz zestaw lokalizacji w zestawie sekcji zawierającym strukturę docelową dla obrazowania SEM o wyższej rozdzielczości. Obszar zainteresowania powinien być wystarczająco duży, aby uwzględnić precyzję etapowania.

Sprawdź i dostosuj pozycje witryn. Automatyczne dostrajanie jest konieczne, gdy obrazowanych jest wiele sekcji. Ważne jest, aby umieścić obszary zainteresowania tak, aby środek nie siedział na pustym materiale bez szczegółów strukturalnych, na przykład wakuoli.

Następnie zdefiniuj ustawienia automatycznego ustawiania ostrości i sprawdź wydajność obrazowania na całej długości wstęgi w małym obszarze zainteresowania, który znajduje się w pobliżu miejsca, które zostanie zobrazowane. Następnie zdefiniuj protokół obrazowania dla akwizycji SEM w wysokiej rozdzielczości. Aby wyświetlić przedziały membranowe, wybierz rozmiar piksela obrazu z zakresu od trzech do pięciu nanometrów.

Wybierz czas przebywania w zależności od detektora, aby obraz nie był zbyt zaszumiony. Ponieważ stół montażowy musi pokonać dużą odległość między nagrywaniem tej a tej sekcji, zdefiniuj wartości fokusu na co najmniej pierwszej sekcji każdej wstążki, korzystając z opcji sprawdź protokół. Następnie rozpocznij automatyczne obrazowanie SEM na całej serii docelowych obszarów zainteresowania.

Po zakończeniu wyeksportuj uzyskane dane jako serię obrazów, najlepiej w formacie TIF. Importuj serie obrazów na Fidżi jako wirtualny stos. Następnie przytnij stos do dalszej obróbki, przycinając obszar jak najbliżej interesującej Cię struktury.

Dostosuj także jasność i kontrast i zapisz stos. Po przycięciu i zoptymalizowaniu otwórz nowy TrakEM z menu Plik. Kliknij prawym przyciskiem myszy pole obrazu i zaimportuj stos do TrakEM jako jeden plasterek na warstwę.

Kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz opcję Wyrównaj warstwy. Wybierz opcję najmniejszych kwadratów jako tryb, ustaw zakres od pierwszej do ostatniej i wybierz brak jako odniesienie. Następnie wybierz domyślne wartości ustawień i wybierz opcję Sztywny jako żądaną transformację.

Gdy rejestracja zostanie zakończona i zakończona i satysfakcjonująca, zapisz wyrównany zestaw danych, klikając prawym przyciskiem myszy i wybierając opcję Eksportuj. Utwórz płaski obraz, ustaw zakres od pierwszego do ostatniego obrazu i pozwól oprogramowaniu wyświetlić wynikowy stos. Po zakończeniu zapisz stos w formacie TIF.

Po przygotowaniu tablica sekcji pojawia się jako tablica składająca się z kilku wstęg sekcji szeregowych. W tej sekcji przedstawiono przegląd wierzchołka korzenia rzodkiewnika, zabarwionego jodkiem propidyny. Sekwencyjne sekcje tej próbki zostały wyrównane zgodnie z opisem w protokole i połączone w celu pokazania próbki w 3D jako pojedynczego pliku filmowego.

Tutaj można zobaczyć dwie komórki docelowe, które później zostaną zobrazowane w rozdzielczości nanometrowej w SEM. Po dodatkowym barwieniu octanem uranylu i cytrynianem krwi, matryce zostały zobrazowane w mikroskopie elektronowym. Ten statyczny obraz pokazuje wycinek próbki najpierw zobrazowany w rozdzielczości 20 nanometrów, a w drugiej rundzie obrazowania w rozdzielczości pięciu nanometrów.

W tym przypadku 210 sekwencyjnych obrazów z mikroskopu elektronowego zostało wyrównanych i przyciętych zgodnie z opisem w protokole. Film skupia się tylko na dwóch komórkach i pokazuje, jak wakuole w komórkach są ułożone, a czasem połączone w 3D. Zautomatyzowane hierarchiczne obrazowanie przedstawionych tutaj macierzy w SEM może zapewnić bezproblemowe mapowanie na różnych poziomach rozdzielczości, od przeglądu całej macierzy po szczegóły subkomórkowe.

W największym powiększeniu rozpoznawalne są wakuole, mitochondria, jądro i retikulum endoplazmatyczne. Po opanowaniu, umieszczanie wstęg sekcji obok siebie na typowym podłożu można wykonać w ciągu kilku godzin, jeśli zostanie wykonane prawidłowo. Może to zapewnić setki sekcji na jednym podłożu do obrazowania.

Czas obrazowania dla tak dużej liczby sekcji może się różnić w zależności od mikroskopu, tym bardziej, jeśli Twoje ulubione instrumenty do obrazowania mają różne poziomy automatyzacji. Warto zauważyć, że ogólny przepływ pracy można łatwo połączyć z innymi technikami obrazowania, takimi jak standardowe barwienie histo lub nawet kandoluminescencja, lub po prostu można go używać jako samodzielnego narzędzia do obrazowania artostrukturalnego dużych objętości. Kolejnym aspektem tego przepływu pracy jest łatwa dostępność.

Wstępne badania są możliwe do wykonania bez dodatkowych narzędzi lub automatyzacji, czyli bez dużych inwestycji. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobre pojęcie o przepływie pracy i o tym, jak obrazowanie multimodalne i hierarchiczne może być wykorzystywane do namierzania i obrazowania interesujących struktur w dużej objętości 3D na różnych poziomach rozdzielczości.